CN112195251B

CN112195251B - 一种用于宫颈癌早筛的分子标志物、引物、方法及试剂盒

Info

Publication number: CN112195251B
Application number: CN202011371456.0A
Authority: CN
Inventors: 李清; 周宏灏; 李书; 陈焱; 安宇航; 杨礼; 朱鹏
Original assignee: Changsha Central South University Xiangya School Of Medicine Inspection Institute; Central South University
Current assignee: Changsha Central South University Xiangya School Of Medicine Inspection Institute; Central South University
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2022-08-05
Anticipated expiration: 2040-11-30
Also published as: CN112195251A

Abstract

本发明公开了一种用于宫颈癌早筛的分子标志物、引物、方法及试剂盒，该分子标志物经EDN3基因甲基化获得，EDN3基因甲基化为SEQ ID NO:4的第339‑351位四个CpG位点的甲基化，引物包括从样本核酸DNA中扩增EDN3基因片段的特异性引物对和对获得核酸片段进行焦磷酸测序的测序引物。进一步的本发明提供一种获得宫颈癌早筛的分子标志物的方法，并开发了检测试剂盒，该方法具有高灵敏度、高特异性特点，间接的为宫颈癌早期诊断提供有用信息，并为宫颈癌早发现早治疗提供一种简单、有效的检测方法。

Description

一种用于宫颈癌早筛的分子标志物、引物、方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及体外诊断分子标志技术领域，特别涉及用于宫颈癌早筛的分子标志物、引物、方法及试剂盒。

背景技术

宫颈癌是威胁女性健康的第四大常见恶性肿瘤。在女性恶性肿瘤中，宫颈癌仅次于乳腺癌，居第二位。现代医学认为，宫颈癌最有效的治疗方法是早发现、早诊断、早治疗。目前我国临床上应用的宫颈癌筛查手段为中国女性健康做出了巨大贡献，同时也存在其不可避免的缺陷。

首先，传统的细胞学筛查手段，包括巴士涂片及液基细胞学（TCT），具有较高特异性和阳性预测值，但始终存在敏感性低、重复性差、诊断主观性等局限性，因而导致漏诊。

宫颈癌是第一个被确定有单一明确病因的癌症，即持续性高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papillomavirus, hrHPV）感染。但hrHPV在一段时间内会自然消退，hrHPV筛查虽然检测结果客观、不依赖细胞学医师，且敏感性高等优点，但特异性较低（19.5%-28.8%），因而导致过度医疗。而市面上未见EDN3基因甲基化检测试剂盒，现有技术中无法以较低成本，快速高效的进行宫颈癌的相关精确检测。

我们前期大量研究表明EDN3基因甲基化程度与宫颈癌前病变及癌密切相关，EDN3基因甲基化检测在宫颈癌早筛中具有很高的灵敏度和特异性。焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）是甲基化检测新的金标准，该技术既可高通量检测多个样本，又可以同时检测多个甲基化位点。检测结果能很好的体现每个CpG位点的甲基化程度，可很好的对样本进行定量或定性检测，为甲基化研究提供了新的途径。发明人期望挖掘出高灵敏度兼顾高特异性的宫颈癌早筛的分子标志物，以弥补目前我国临床应用中宫颈癌筛查手段的不足。

本发明提供了一种新的与宫颈癌发生发展紧密相关的分子标志物，该分子标志物经EDN3基因甲基化获得，并开发了分子标志物的引物、方法及试剂盒。该方法具有低成本、高敏感性、高特异性等特点。为宫颈癌前病变及癌早发现早治疗提供了一种简单、有效的检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种新的与宫颈癌发生发展紧密相关的分子标志物，该分子标志物经EDN3基因甲基化获得，并开发了分子标志物引物、方法及试剂盒，该方法具有高灵敏度、高特异性特点，间接的为宫颈癌早期诊断提供有用信息，并为宫颈癌早发现早治疗提供一种简单、有效的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

经前期研究验证，本发明提供了一种用于宫颈癌早筛的分子标志物，该分子标志物经EDN3基因甲基化获得， EDN3基因甲基化为SEQ ID NO:4的第339-351位四个CpG 位点的甲基化，其中包括四个CpG位点CGGGGCGGCGCG见斜体下划线部分。核苷酸序列为经亚硫酸氢盐转化之前的序列。

AGCCCCTCTGGGGGGCGGGGAGGCGACGGGGGTGGTGCAGAAGCCAGAAAAGCCCGAGCCACAGCCGGCCAGCTCCGCGCAGGGATGGGCAGCGCGCTCTGAAAGTTTATGACCGCCGCAGCCAACTCCTGGCCGGAGCTGGAGACGCAGCGAGCGATCGGCCGGCCTCGAACCCCCACAGCTGGAGGGCGAGGCCAGCTGTACCCGGCCCCAGTGCCCTTTCGCGGCCACAAGCGGCCGTCCTCCTGGTCCGGTGCTCCGGCGCCTGATCTAGGTTCATGGAGCCGGGGCTGTGG CTCCTTTTCGGGCTCACAGTGACCTCCGCCGCAGGTAAGCGCA CGGGGCGGCGCG CCTCTCCTGGCGCGAGCGCAC ACAAAAGGACCCAGGGCGGGGGACCCGAGGCGCGGAGAAGATGTGCGTCGCGGGGAGCAAACTCTTGCCTGGGCTCTGCACTCGTGAAGACGCCTGGGGGAGGGCTGGGGAGCAGAAGCGGCGCGCAACGACTACCCGCACGGGCTCCGGGAGTTGCAGCCCGCGCACTGGCTGGAGACCTGCTGCCTGGGCCGACTTGGTCAATTTTTCATGAAACTGGGGACTTTTCAGAAAGTTTGCGAACTATTCAGAGGCTGTGCCAAACCCTGGCAAAGTTTGCAGAAAGTAT（SEQ ID NO：4）

本发明另一方面提供一种用于宫颈癌早筛的分子标志物的引物，所述引物包括从样本核酸DNA中扩增EDN3基因片段的特异性引物对和对获得核酸片段进行焦磷酸测序的测序引物，从样本核酸DNA中扩增EDN3基因片段的特异性引物对碱基序列为：

EDN3-F：GGAGTAGGGGTTGTGGTTT（SEQ ID NO：1）

EDN3-R：biotin-AATCCCCCCCCCTAAATCCTTT（SEQ ID NO：2）

其中所述引物的扩增产物上（斜体部分）含有SEQ ID NO：4四个CpG位点；

对获得核酸片段进行焦磷酸测序的测序引物为：

EDN3-S：TTTTTTTTAGGGTTTATAGTGATTT（SEQ ID NO：3）

本发明另一面提供一种获得用于宫颈癌早筛的分子标志物的方法，包括：

（1）提取样本中的DNA（2）将提取的DNA进行亚硫酸氢盐转化（3）以（2）中所获得的DNA为模板，使用引物EDN3-F、EDN3-R对EDN3基因启动子区进行扩增，获得PCR扩增产物，所使用的引物序列如下：

EDN3-F：GGAGTAGGGGTTGTGGTTT（SEQ ID NO：1）

EDN3-R：AATCCCCCCCCCTAAATCCTTT（SEQ ID NO：2）

（4）（可选步骤）将（3）中PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测是否扩增成功。（5）对（3）中PCR产物进行单链纯化。（6）利用测序引物EDN3-S对（5）中获得的单链纯化产物进行焦磷酸测序，所使用的测序引物序列为：

EDN3-S：TTTTTTTTAGGGTTTATAGTGATTT（SEQ ID NO：3）

（7）根据（6）的测序结果，得到每个CpG位点的甲基化频率。

进一步的，所述PCR扩增条件为：95℃5分钟；95℃15秒，60℃30秒，40个循环。

本发明再一方面提供一种用于宫颈癌早筛的分子标志物检测的试剂盒，包括以上所述的特异性引物及测序引物。

进一步的，所述试剂盒反应液包括：10×Ex Buffer（含Mg2+）,Ex Taq酶，dNTPs。

进一步的，所述的试剂盒还包括：阳性对照(Caski细胞株gDNA)，阴性对照(C33A细胞株gDNA)。

进一步的，所述的试剂盒反应液包括1~3×Ex Buffer（含Mg2+）；

进一步的，所述的试剂盒反应液包括0.2~0.3mM的dNTPs；

进一步的，所述的试剂盒反应液包括0.5~1.5 U 的Ex Taq酶；

进一步的，所述的试剂盒阳性对照为10~50ng/uL的Caski细胞株gDNA；

进一步的，所述的试剂盒阴性对照为10~50ng/uL的C33A细胞株gDNA。

本发明提供一种用于宫颈癌早筛的分子标志物，其为EDN3基因甲基化，EDN3基因DNA甲基化是检测宫颈癌诊治中的一种分子标志物，具有高敏感性和特异性，本发明为EDN3基因DNA甲基化检测提供思路，利于宫颈癌患者的及时治疗及预后评价。

本发明所采用技术：本发明基于焦磷酸测序技术，在EDN3基因启动子区设计特异性的引物对进行常规扩增，再利用测序引物对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，不仅能检测甲基化改变情况，还能同时得到每个CpG位点的甲基化频率，使检测结果更具体化、直观化，从而为宫颈癌个体化治疗提供有益指导。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果。

1、本发明首次提供了一种用于宫颈癌早筛的分子标志物，其为甲基化基因EDN3含有四个CpG位点的相关核苷酸序列，其可作为宫颈癌诊治中的一种分子标志物，EDN3基因甲基化检测具有高敏感性、高特异性特点。

2、本发明采用焦磷酸测序技术检测EDN3基因甲基化，设计出包含EDN3甲基化位点的特异性PCR扩增引物及测序引物，PCR扩增产物长度为134bp。

3、本发明采用焦磷酸测序技术检测EDN3基因甲基化，可检测出EDN3基因CpG位点甲基化频率，使检测结果更具体化、直观化，从而为宫颈癌个体化治疗提供有益指导。

4、采用焦磷酸测序技术，对EDN3甲基化程度进行检测，所述引物和方法特异性好，准确度高，而且可用于高通量筛查宫颈脱落细胞样本的EDN3基因甲基化程度。

5、本发明提供了EDN3基因与宫颈癌相关的分子标志物，具体的，其为涉及四个CpG位点的核苷酸序列，其为下述核苷酸序列所示，其中包括四个CpG位点CGGGGCGGCGCG见斜体下划线部分。所述核苷酸序列为经亚硫酸氢盐转化之前的序列。AGCCCCTCTGGGGGGCGGGGAGGCGACGGGGGTGGTGCAGAAGCCAGAAAAGCCCGAGCCACAGCCGGCCAGCTCCGCGCAGGGATGGGCAGCGCGCTCTGAAAGTTTATGACCGCCGCAGCCAACTCCTGGCCGGAGCTGGAGACGCAGCGAGCGATCGGCCGGCCTCGAACCCCCACAGCTGGAGGGCGAGGCCAGCTGTACCCGGCCCCAGTGCCCTTTCGCGGCCACAAGCGGCCGTCCTCCTGGTCCGGTGCTCCGGCGCCTGATCTAGGTTCATGGAGCCGGGGCTGTGGCTCCTTTTCGGGCTCACAGTGACCTCCGCCGCAGGTAAGCGCA CGGGGCGGCGCG CCTCTCCTGGCGCGAGCGCACACAAAAGGACCCAGGGCGGGGGACCCGAGGCGCGGAGAAGATGTGCGTCGCGGGGAGCAAACTCTTGCCTGGGCTCTGCACTCGTGAAGACGCCTGGGGGAGGGCTGGGGAGCAGAAGCGGCGCGCAACGACTACCCGCACGGGCTCCGGGAGTTGCAGCCCGCGCACTGGCTGGAGACCTGCTGCCTGGGCCGACTTGGTCAATTTTTCATGAAACTGGGGACTTTTCAGAAAGTTTGCGAACTATTCAGAGGCTGTGCCAAACCCTGGCAAAGTTTGCAGAAAGTAT（SEQ ID NO：4）。

附图说明

附图作为本申请的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1 EDN3 PCR扩增134bp电泳胶图。

图2 正常样本焦磷酸测序演示图。

图3 阴性样本（C33A细胞株）焦磷酸测序演示图。

图4 阳性样本（Caski细胞株）建磷酸测序演示图。

注：图1中1/2/3/4/5分别为样本编号，marker1条带大小从小到大依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp。图2/3/4中方框内为检测的4个CPG位点。

图2-4中E为酶信号，S为底物信号，A1、B1、C7对应分子标志物的相应序列。

需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1一种用于EDN3甲基化检测的特异性引物

本发明的EDN3特异性甲基化的PCR引物与探针，是根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)公开的人类全基因组序列，使用Primer Premier3.0及Methyl Primer Expressv1.0设计，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

从样本核酸DNA中扩增EDN3基因片段的特异性引物对碱基序列为：

EDN3-F：GGAGTAGGGGTTGTGGTTT

EDN3-R：biotin-AATCCCCCCCCCTAAATCCTTT

对获得核酸片段进行焦磷酸测序的测序引物为：

EDN3-S：TTTTTTTTAGGGTTTATAGTGATTT。

实施例2一种用于EDN3甲基化检测试剂盒

EDN3甲基化检测试剂盒包括：PCR反应液、测序引物、阴性对照、阳性对照、空白对照。

其中PCR反应液包括：无核酸酶水、10×Ex Buffer（含Mg2+）、dNTPs、EDN3-F、EDN3-R、Ex Taq酶。各种物质的终浓度PCR buffer（1×）、dNTP（0.25mM）、EDN3-F (0.4uM)、EDN3-R(0.4uM)、Ex Taq酶（1U/反应）。

包括以下引物、探针序列如下：

EDN3-F：GGAGTAGGGGTTGTGGTTT

EDN3-R：biotin-AATCCCCCCCCCTAAATCCTTT

其中测序引物包括：EDN3-S（10uM）。

包括测序引物序列如下：

EDN3-S：TTTTTTTTAGGGTTTATAGTGATTT

其中阴性对照为20ng/uL的C33A细胞株gDNA；

其中阳性对照为20ng/uL的Caski细胞株gDNA；

其中空白对照为无核酸酶水。

实施例3本发明的试剂盒在诊断宫颈癌中的应用

本发明采用的无核酸酶水、10×Ex Buffer、Ex Taq酶、dNTPs购自于宝生物（大连）有限公司；

阳性对照为Caski细胞株gDNA，阴性对照为C33A细胞株gDNA；

DNA提取试剂盒为，HiPure Blood&Tissue DNA Kit(Magen)；

转化试剂盒为，EZ DNA Methylation-Direct TM Kit(ZYMO)。

本发明所采用的生物材料均来自中南大学湘雅医学检验所。

方法：

一、生物样本：

为2019年06月-2020年06月期间在中南大学湘雅医学检验所收集的40例正常人群宫颈脱落细胞及35例宫颈癌人群宫颈脱落细胞。

二、提取宫颈脱落细胞DNA：

1、取1mL宫颈脱落细胞保存液于1.5mL离心中。12000rpm离心1min，弃上清；.

2、加入20uL Proteinase K、200uL Buffer AL，移液器吹打混匀至沉淀均匀悬浮于液体中。65℃水浴15min，期间每5min上下颠倒混匀一次。；

3、取出，冷却至室温，加入200uL无水乙醇，颠倒混匀，瞬时离心收集管盖、管壁上液体。

4、将离心柱插入到收集管中，将3中所得液体全部吸入到离心柱中。

5、12000rpm离心1min，弃流出液。

6、加入500uL Buffer GW1，12000rpm离心1min，弃流出液。

7、加入500uL Buffer GW2，12000rpm离心1min，弃流出液。

8、重复步骤8一次。

9、将离心柱插入到收集管中，12000rpm空转离心2min。

10、将离心管插入到一新的1.5mL EP管中，开盖静止5min挥发乙醇。

11、加入30~50uL Buffer AE，12000rpm离心1min，收集管底液体，即为DNA溶液，于-20±5℃保存，若需长期保存，请至于-80℃。

三、DNA亚硫酸氢盐转化的流程

1、CT Conversion Reagent准备：

取1管CT Conversion Reagen干粉，加入790uL M-Solubilization Buffer和300uL M-Dilution Buffer，震荡混匀10min至固体粉末完全溶解。加入160uL M-ReactionBuffer，混匀1min，待用。

2、将提取的DNA 配置亚硫酸盐转化体系配置（150uL）：

亚硫酸盐转化运行：

3、亚硫酸盐转化后DNA纯化：

3.1、将亚硫酸转化后的产物转移至装有600uL Bingding Buffer的纯化柱中，纯化柱装于收集管中，颠倒混匀，室温静止1min；

3.2、10000rpm，离心30sec，弃流出液。

3.3、加入100uL M-Wash Buffer，10000rpm，离心30sec，弃流出液。

3.4、加入200uL M-Desulphtnation Buffer，室温静止15min。

3.5、10000rpm，离心30sec，弃流出液。

3.6、加入200uL M-Wash Buffer，10000rpm，离心30sec，弃流出液。

3.7、重复步骤3.6一次。

3.8、将纯化柱插入到收集管中，1000rpm空转离心2min。

3.9、将纯化柱插入到一新的EP管中，加入20~50uL M-Elution Buffer，10000rpm，离心30sec，收集管底液体即为M-DNA溶液。于-20±5℃保存，若需长期保存，请至于-80℃。

四、PCR流程

1、使用的PCR仪器为ABI 2720,反应体系为20uL；

2、PCR反应体系配制及条件见如下表1和表2所示：

表1、PCR反应体系的配制

表2、PCR反应程序

五、琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物

取5uL PCR扩增产物，加1uL 6×Loading Buffer，混匀，点样于2%琼脂糖凝胶梳孔中，120V点样20~30min，凝胶成像系统检测电泳结果见附图1。

六、焦磷酸测序获得甲基化频率

焦磷酸测序试剂为：70%无无水乙醇，Denaturation Solution，AnniealingBuffer，Binding Buffer，1×Wash Buffer，Streptavidin Sepharase High Performance（beads），PyroMark Gold Q96 Reagents（E/S/dNTP），DMSO（二甲亚砜），焦磷酸测序引物EDN3-S。其中除焦磷酸测序引物EDN3-S购自于英潍捷基（上海）贸易有限公司，其他试剂均购自于美国QIAGEN公司。

焦磷酸测序：利用焦磷酸测序试剂对步骤五中检测合格的PCR产物进行焦磷酸测序，具体测序步骤参照PyroMark Gold Q96 Reagents（美国QIAGEN公司）说明书操作步骤进行。其中利用测序引物EDN3-S对PCR产物进行反向测序，根据测序结果，测序仪将自动给出每个CPG位点在样本中甲基化百分数，即CpG位点甲基化频率。根据我们对大量正常组样本检测，正常组样本甲基化频率相对较低，从而得出甲基化频率低于10%，认为个体甲基化为阴性。

七、宫颈癌样本与正常组样本间EDN3甲基化频率分布

EDN3基因甲基化在40例正常人样本中均未检出，在35例宫颈癌样本检出35例(占100％，与正常组相比P<0.001)，EDN3基因的甲基化比例随着宫颈癌病程的加重而升高。

表3、宫颈癌样本与正常组样本间EDN3甲基化检测统计结果

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

序列表

<110> 中南大学

长沙中南大学湘雅医学检验所

<120> 一种用于宫颈癌早筛的分子标志物、引物、方法及试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人类基因组片段(Human genome fragment)

<400> 1

ggagtagggg ttgtggttt 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人类基因组片段(Human genome fragment)

<400> 2

aatccccccc cctaaatcct tt 22

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人类基因组片段(Human genome fragment)

<400> 3

ttttttttag ggtttatagt gattt 25

<210> 4

<211> 661

<212> DNA

<213> 人类基因组片段(Human genome fragment)

<400> 4

agcccctctg gggggcgggg aggcgacggg ggtggtgcag aagccagaaa agcccgagcc 60

acagccggcc agctccgcgc agggatgggc agcgcgctct gaaagtttat gaccgccgca 120

gccaactcct ggccggagct ggagacgcag cgagcgatcg gccggcctcg aacccccaca 180

gctggagggc gaggccagct gtacccggcc ccagtgccct ttcgcggcca caagcggccg 240

tcctcctggt ccggtgctcc ggcgcctgat ctaggttcat ggagccgggg ctgtggctcc 300

ttttcgggct cacagtgacc tccgccgcag gtaagcgcac ggggcggcgc gcctctcctg 360

gcgcgagcgc acacaaaagg acccagggcg ggggacccga ggcgcggaga agatgtgcgt 420

cgcggggagc aaactcttgc ctgggctctg cactcgtgaa gacgcctggg ggagggctgg 480

ggagcagaag cggcgcgcaa cgactacccg cacgggctcc gggagttgca gcccgcgcac 540

tggctggaga cctgctgcct gggccgactt ggtcaatttt tcatgaaact ggggactttt 600

cagaaagttt gcgaactatt cagaggctgt gccaaaccct ggcaaagttt gcagaaagta 660

t 661

Claims

1.引物组在制备用于宫颈癌早筛的分子标志物检测的试剂盒中的用途，其特征在于，所述分子标志物的核苷酸序列是以SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为模板，以

EDN3-F：GGAGTAGGGGTTGTGGTTT，

EDN3-R：biotin-AATCCCCCCCCCTAAATCCTTT为引物的扩增产物序列，所述分子标志物含有序列为CGGGGCGGCGCG的四个CpG位点；

所述引物组包括从样本核酸DNA中扩增EDN3基因片段的特异性引物对和对获得核酸片段进行焦磷酸测序的测序引物；从样本核酸DNA中扩增EDN3基因片段的特异性引物对碱基序列为：

EDN3-F：GGAGTAGGGGTTGTGGTTT，

EDN3-R：biotin-AATCCCCCCCCCTAAATCCTTT，

对所获得核酸片段进行焦磷酸测序的测序引物为：

EDN3-S：TTTTTTTTAGGGTTTATAGTGATTT。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒还包括反应液，所述反应液包括含Mg²⁺的1～3×Ex Buffer、0.5～1.5U的Ex Taq酶、0.2～0.3mM的dNTPs。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，阳性对照为10～50ng/uL的Caski细胞株gDNA，阴性对照为10～50ng/uL的C33A细胞株gDNA。