CN112941189A

CN112941189A - 宫颈癌早筛分子标志物znf671基因甲基化检测的引物探针组合物及试剂盒和使用方法

Info

Publication number: CN112941189A
Application number: CN202110489434.2A
Authority: CN
Inventors: 李清; 周宏灏; 朱鹏; 陈焱; 安宇航; 杨礼
Original assignee: Changsha Central South University Xiangya School Of Medicine Inspection Institute; Central South University
Current assignee: Changsha Central South University Xiangya School Of Medicine Inspection Institute; Central South University
Priority date: 2021-05-06
Filing date: 2021-05-06
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2041-05-06
Also published as: CN112941189B

Abstract

本发明公开了宫颈癌早筛分子标志物ZNF671基因甲基化检测的引物探针组合物及试剂盒和方法，该引物探针组合包括检测引物和检测探针；所述检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述检测探针为5’端标记FAM，3’端标记MGB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的序列，针对的靶序列短，扩增效率高，提高了灵敏度和特异性，可准确检出200ng DNA背景下5‰甲基化率，可用于临床诊断宫颈癌，对宫颈癌的早期诊断和治疗具有重要意义。

Description

宫颈癌早筛分子标志物ZNF671基因甲基化检测的引物探针组合物及试剂盒和使用方法

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及用于宫颈癌早筛分子标志物ZNF671基因甲基化检测的引物探针组合物及试剂盒，还涉及使用该试剂盒检测分子标志物ZNF671基因甲基化的方法。

背景技术

由HPV感染引发的宫颈癌是困扰女性的重要的恶性肿瘤之一，其发展由感染、癌前病变到癌变经历几年到十几年的过程，现代医学认为，宫颈癌最有效的治疗方法是早发现、早诊断、早治疗。

据统计70%-80%的女性在其一生中会有至少一次的HPV感染，但大多数感染是一次性感染，超过90%的感染在6到24个月之间可以自行清除。而持续性的高危型HPV感染则是导致宫颈上皮内病变及宫颈癌的主要原因。

目前我国临床上应用的宫颈癌筛查手段为中国女性健康做出了巨大贡献，同时也存在其不可避免的缺陷：首先，传统的细胞学筛查手段，包括巴士涂片及液基细胞学（TCT），因为其整个过程包括取样、抹片制备、观察、结果判读等多个环节受人为因素影响较大，造成漏检几率较高。其次，近年兴起的病原学筛查HPV-DNA检测技术，因其检测的仅是HPV病原存在与否，而HPV病毒的存在大部分是一过性的，也意味着这些被自身免疫清除掉的HPV感染者也会被判定为阳性，从而导致过度医疗。

因此，发明人期望挖掘出能与癌前病变紧密相关的分子指标，以弥补目前我国临床上应用的宫颈癌筛查手段中的不足。

表观遗传学研究表明宫颈癌发展过程伴随着局部基因甲基化异常，基因甲基化改变可以区分早期和晚期宫颈CIN转化病变，可用于宫颈癌筛查诊断和宫颈癌前病变管理。公开号为CN110452984A的中国专利公开了关于宫颈癌甲基化检测的甲基化基因，但是该方法中需要检测FAM19A4、has-miR-124-2和ZNF671共3个标志物，该方法使用的引物和探针数量多，检测的灵敏度较低，5%甲基化率。因此，亟需一种高灵敏度、高特异性的检测宫颈癌的引物探针组合物，为宫颈癌早期诊断提供有用信息，并为宫颈癌早发现早治疗提供一种简单、有效的检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供宫颈癌早筛分子标志物ZNF671基因甲基化检测的组合物；本发明的目的之二在于提供含有所述宫颈癌早筛分子标志物ZNF671基因甲基化检测的组合物的试剂盒；

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、宫颈癌早筛分子标志物ZNF671基因甲基化检测的引物探针组合物，所述甲基化检测的引物探针组合物包括ZNF671基因甲基化检测引物和ZNF671基因甲基化检测探针；所述ZNF671基因甲基化检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述ZNF671基因甲基化检测探针为5’端标记FAM，3’端标记MGB 的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的序列。

优选的，还包括内参基因Actin检测引物和内参基因Actin检测探针，所述内参基因Actin检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述内参基因Actin检测探针为5’端标记VIC，3’端标记MGB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的序列。

本发明优选的，含有所述宫颈癌早筛分子标志物ZNF671基因甲基化检测的引物探针组合的试剂盒。

本发明优选的，还包括由无核酸酶水、含Mg²⁺的10×Ex Buffer、dNTPs和Ex HS Taq酶组成的PCR反应液。

本发明更优选的，各组分终浓度如下：含Mg²⁺的1×Ex Buffer，0.25mM的dNTPs和1U 的Ex HS Taq酶。

本发明更优选的，还包括由CT Conversion Reagen干粉、M-SolubilizationBuffer、M-Dilution Buffer和M-Reaction Buffer 组成的DNA亚硫酸氢盐转化试剂。

本发明更优选的，所述DNA亚硫酸氢盐转化试剂制备过程如下：每管CTConversion Reagen干粉，加入790µL M-Solubilization Buffer和300µL M-DilutionBuffer，震荡混匀10min至固体粉末完全溶解，加入160µL M-Reaction Buffer，混匀1min，待用。

本发明更优选的，还包括阴性对照或阳性对照，所述10~50ng/uL的C33A细胞株gDNA；所述阳性对照为10~50ng/µL的Caski细胞株gDNA。

本发明更优选的，还包括DNA提取试剂。

3、所述试剂盒的使用方法，具体步骤如下：

1）提取宫颈脱落细胞DNA；

2）将提取的DNA进行亚硫酸氢盐转化；

3）纯化亚硫酸氢盐转化的DNA；

4）以步骤3）纯化的DNA为模板，加入PCR反应液，在采集荧光条件下扩增；

5）根据ZNF671基因CT值与内参基因的CT值的差值△CT判断结果，当内参基因的CT≤35，△CT≤9结果为阳性；当内参基因的CT≤35，△CT>9结果为阴性；当内参基因的CT>35，复检。

本发明优选的，PCR扩增条件为在95℃，5min，1个循环；95℃，15sec，60℃，30sec；60℃采集荧光，50个循环；反应体系为PCR反应液18.5µL，纯化的经亚硫酸氢盐转化的DNA加1.5µL。

本发明的有益效果在于：本发明公开了宫颈癌早筛分子标志物ZNF671基因甲基化检测的引物探针组合物，该引物探针组合物包括扩增引物和检测探针，扩增引物针对的靶序列短，扩增效率高，并且检测探针使用MGB作为探针的猝灭基团，提高了灵敏度和特异性，可准确检出200ng DNA背景下5‰甲基化率；本发明还提供了检测宫颈癌早筛分子标志物ZNF671基因甲基化的试剂盒及其使用方法，本发明所述试剂盒内标基因Actin与靶基因ZNF671在同一管内进行PCR扩增，即节省了成本，又可准确质控整个PCR反应过程；同时，本发明所述试剂盒使用方法从提取到PCR检测结束，整个操作过程可在5h内完成，具有快速、便捷等特点，适用于临床检测。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为阴性对照（C33A细胞株）PCR扩增图。

图2为阳性对照（Caski细胞株）PCR扩增图。

图3为正常宫颈细胞PCR扩增图。

图4为宫颈癌组织细胞PCR扩增图。

图5为不同病理级别中ZNF671甲基化分布状况图。

图6为200ngDNA背景下甲基化倍比稀释扩增图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、一种用于检测宫颈癌早筛分子标志物ZNF671基因甲基化的引物探针组合

本发明的ZNF671特异性甲基化的PCR引物与探针，是根据NCBI（美国国立生物技术信息中心）公开的人类全基因组序列，使用Primer Premier3.0及Methyl Primer Expressv1.0设计，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。所述引物探针组合包括：Actin-QF、Actin-QR、Actin-P、ZNF67-QF、ZNF671-QR、ZNF671-P核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~6所示。具体引物序列如表1所示：

表1、ZNF671基因甲基化检测引物探针序列

本实施中ZNF67扩增的靶点序列如SEQ ID NO.7所示：5’-GTCGTTTTCGGTAGTTGTTCGCGTTTACGGTTTTATGGCGGAGTTAACGGATTTCGCGCGGGTGGGTGTTGCGTTTTT-3’，该靶序列与现有的靶序列相比序列更短，缩短了扩增靶点，能够提高扩增效率，增加灵敏度。

实施例2、一种用于检测宫颈癌早筛分子标志物ZNF671基因甲基化的试剂盒

ZNF671甲基化检测试剂盒包括：ZNF671 PCR反应液、阴性对照、阳性对照、空白对照。

ZNF671 PCR反应液包括ZNF671基因甲基化检测的引物探针组合：Actin-QF、Actin-QR、Actin-P、ZNF67-QF、ZNF671-QR、ZNF671-P，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~6所示。各种物质的终浓度为：0.4µM的Actin-QF、0.4µM的Actin-QR、0.4µM的Actin-P、0.45µM的ZNF67-QF、0.45µM的ZNF671-QR、0.45µM的ZNF671-P。

ZNF671 PCR反应液还包括：无核酸酶水、10×Ex Buffer（含Mg²⁺）、dNTPs、Ex HSTaq酶。各种物质的终浓度PCR buffer（1×）、dNTP（0.25mM）、Ex HS Taq酶（1U/反应）。

其中阴性对照为20ng/µL的C33A细胞株gDNA。

其中阳性对照为20ng/µL的Caski细胞株gDNA。

其中空白对照为无核酸酶水。

实施例3、本发明的试剂盒在诊断宫颈癌中的应用

本发明采用的无核酸酶水、10×Ex Buffer、Ex HS Taq酶、dNTPs购自于宝生物（大连）有限公司；阳性对照为Caski细胞株gDNA，阴性对照为C33A细胞株gDNA；DNA提取试剂盒为，HiPure Blood&Tissue DNA Kit(Magen)；转化试剂盒为EZ DNA Methylation-Direct ^TMKit(ZYMO)；本发明所采用的生物材料均来自中南大学湘雅医学检验所。

具体检测方法如下：

1、获取生物样本

为2019年06月-2020年12月期间在中南大学湘雅医学检验所收集的230例宫颈脱落细胞标本，其中健康人群45例，CIN1级标本33例，CIN2级标本50例，CIN3级标本47例，CA标本55例。

2、提取宫颈脱落细胞DNA

1）取1mL宫颈脱落细胞保存液于1.5mL离心中，12000rpm离心1min，弃上清；

2）加入20µL Proteinase K、200µL Buffer AL，移液器吹打混匀至沉淀均匀悬浮于液体中；65℃水浴15min，期间每5min上下颠倒混匀一次；

3）取出，冷却至室温，加入200µL无水乙醇，颠倒混匀，瞬时离心收集管盖、管壁上液体；

4）将离心柱插入到收集管中，将步骤3）中所得液体全部吸入到离心柱中；

5）12000rpm离心1min，弃流出液；

6）加入500µL Buffer GW1，12000rpm离心1min，弃流出液；

7）加入500µL Buffer GW2，12000rpm离心1min，弃流出液；

8）重复步骤8）一次。

9）将离心柱插入到收集管中，12000rpm空转离心2min。

10）将离心管插入到一新的1.5mL EP管中，开盖静止5min挥发乙醇。

11）加入30~50µL Buffer AE，12000rpm离心1min，收集管底液体，即为DNA溶液，于-20±5℃保存，若需长期保存，请至于-80℃。

3、DNA亚硫酸氢盐转化的流程

1）CT Conversion Reagent准备：取1管CT Conversion Reagen干粉，加入790µLM-Solubilization Buffer和300µL M-Dilution Buffer，震荡混匀10min至固体粉末完全溶解；加入160µL M-Reaction Buffer，混匀1min，待用。

2）将提取的DNA 配置亚硫酸盐转化体系配置（150µL）：

成分	反应体积（uL）
		提取的待测DNA	0~20µL
RNAse-free Water	补足150µL
		CT Conversion Reagen	130µL

亚硫酸盐转化运行：

反应温度	反应时间
		98℃	8min
64℃	3.5h
		4℃	不超过20h

3）亚硫酸盐转化后DNA纯化：

a、将亚硫酸转化后的产物转移至装有600uL Bingding Buffer的纯化柱中，纯化柱装于收集管中，颠倒混匀，室温静止1min；

b、10000rpm，离心30sec，弃流出液；

c、加入100µL M-Wash Buffer，10000rpm，离心30sec，弃流出液；

d、加入200µL M-Desulphtnation Buffer，室温静止15min；

e、10000rpm，离心30sec，弃流出液；

f、加入200µL M-Wash Buffer，10000rpm，离心30sec，弃流出液；

g、重复步骤f一次；

h、将纯化柱插入到收集管中，1000rpm空转离心2min；

i、将纯化柱插入到一新的EP管中，加入20~50µL M-Elution Buffer，10000rpm，离心30sec，收集管底液体即为M-DNA溶液；于-20±5℃保存，若需长期保存，请至于-80℃。

4、PCR检测

使用的PCR仪器为ABI 7500，反应体系为20µL；PCR反应体系配制及条件见如下表2和表3所示：

表2、PCR反应体系的配制

成分	反应体积（µL）
		ZNF671 PCR反应液	18.5µL
亚硫酸盐转化后的DNA模板	1.5µL

表3、PCR反应程序

扩增结果如图1~4所示，其中图1为阴性对照（C33A细胞株）PCR扩增图；图2为阳性对照（Caski细胞株）PCR扩增图；图3为正常宫颈细胞PCR扩增图；图4为宫颈癌组织细胞PCR扩增图。结果显示，在阳性对照和宫颈癌组织中CT≤35，且△CT≤9，为阳性。而在阴性对照和正常宫颈组织中CT≤35，△CT>9，为阴性。

5、结果判读

阈值划定：FAM、VIC阈值均划定为0.8。

结果判读（△CT=FAM CT-VIC CT）

6、宫颈癌样本与正常组样本间ZNF671甲基化分布

使用上述方法和引物探针检测宫颈癌样本与正常组样本，结果如表4和图5所示。结果显示，ZNF671基因甲基化在45例正常人样本中均未检出，在55例宫颈癌样本检出55例(占100％，与正常组相比P<0.01)。同时，ZNF671基因的甲基化比例随着宫颈癌病程的加重而升高，在CIN3+敏感性为93.13%，特异性为 89.84%，可为临床宫颈癌早期筛查提供有用指导。

表4、宫颈癌样本与正常组样本间ZNF671甲基化检测统计结果

实施例4、本发明的试剂盒灵敏度实验

采用本发明的试剂盒对200ngDNA背景下不同比例的甲基化率进行检测，评估本发明的试剂盒在200ngDNA背景下的检测灵敏度。

具体实施方法如下：

一、样本选择：细胞株caski视为100%甲基化样本，细胞株C33A视为0%甲基化样本。

二、细胞株DNA提取：详细步骤见实施例三步骤2，提取的DNA经Nanodrop2000检测DNA浓度。

三、DNA亚硫酸盐氢盐转化：详细步骤见实施例三步骤3，DNA投入量按照200ngDNA投入。

四、不同比例甲基化比率参考品倍比稀释（见表5）：采用经亚硫酸氢盐转化后的细胞株caski M-DNA和细胞株C33A M-DNA按照一定比例进行稀释，具体见表5。

表5、不同甲基化比率参考品倍比稀释表

五、PCR检测：详细步骤见实施例三步骤4，扩增结果如图6所示。

六、结果分析：结果判读参照实施例三步骤5，各参考品的Cq值及判读结果如表6所示：

表6、不同甲基化比率参考品Cq值及判读

灵敏度实验结果表明，本发明试剂盒可准确检测出200ngDNA背景下5‰甲基化。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 中南大学

长沙中南大学湘雅医学检验所

<120> 宫颈癌早筛分子标志物ZNF671基因甲基化检测的引物探针组合物及试剂盒和使用方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aggaggtttg gatttttaat tgtgtatag 29

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aactcaccac tacaaaaatc aaacca 26

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tggtagagag gaaggtgg 18

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtcgttttcg gtagttgttc gc 22

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaaaacgcaa cacccaccc 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tttacggttt tatggcgga 19

<210> 15

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtcgttttcg gtagttgttc gcgtttacgg ttttatggcg gagttaacgg atttcgcgcg 60

ggtgggtgtt gcgttttt 78

Claims

1.宫颈癌早筛分子标志物ZNF671基因甲基化检测的引物探针组合物，其特征在于：所述甲基化检测的引物探针组合物包括ZNF671基因甲基化检测引物和ZNF671基因甲基化检测探针；所述ZNF671基因甲基化检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述ZNF671基因甲基化检测探针为SEQ ID NO.6的5’端标记FAM，3’端标记MGB 的序列。

2.根据权利要求1所述宫颈癌早筛分子标志物ZNF671基因甲基化检测的引物探针组合物，其特征在于：还包括内参基因Actin检测引物和内参基因Actin检测探针，所述内参基因Actin检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述内参基因Actin检测探针为SEQ ID NO.3的5’端标记VIC，3’端标记MGB的序列。

3.含有权利要求1或2所述宫颈癌早筛分子标志物ZNF671基因甲基化检测的引物探针组合物的试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还包括由无核酸酶水、含Mg²⁺的10×ExBuffer、dNTPs和Ex HS Taq酶组成的PCR反应液。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：各组分终浓度如下：含Mg²⁺的1×ExBuffer，0.25mM的dNTPs和1 U 的Ex HS Taq酶。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还包括由CT Conversion Reagen干粉、M-Solubilization Buffer、M-Dilution Buffer和M-Reaction Buffer 组成的DNA亚硫酸氢盐转化试剂。

7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述DNA亚硫酸氢盐转化试剂制备过程如下：每管CT Conversion Reagen干粉，加入790µL M-Solubilization Buffer和300µL M-Dilution Buffer，震荡混匀10min至固体粉末完全溶解，加入160µL M-Reaction Buffer，混匀1min，待用。

8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还包括阴性对照或阳性对照，所述阴性对照为10~50ng/µL的C33A细胞株gDNA；所述阳性对照为10~50ng/µL的Caski细胞株gDNA。

9.根据权利要求3~7任一项所述的试剂盒，其特征在于：还包括DNA提取试剂。