CN113846168B

CN113846168B - 一种原发性肝癌的分子标记物的检测试剂及其应用

Info

Publication number: CN113846168B
Application number: CN202111447653.0A
Authority: CN
Inventors: 张玮; 李国强
Original assignee: Suzhou Amison Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Amison Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-01
Filing date: 2021-12-01
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2041-12-01
Also published as: CN113846168A

Abstract

本发明公开了一种原发性肝癌的分子标记物的检测试剂及其应用，涉及肝癌早筛技术领域。本发明发现，Chr2:38960251‑38960600区域或其反向互补序列中的CpG位点的甲基化水平与原发性肝癌相关，通过检测Chr2:38960251‑38960600区域或其反向互补序列中的CpG位点的甲基化水平，可以判断目标样本是否为原发性肝癌。上述区域可以作为原发性肝癌诊断分子标记物。本发明为肝癌早筛提供了良好的分子标志物，具有早筛准确度高、无创、方便、安全、快捷、高通量的优势。

Description

一种原发性肝癌的分子标记物的检测试剂及其应用

技术领域

本发明涉及肝癌早筛技术领域，具体而言，涉及一种原发性肝癌的分子标记物的检测试剂及其应用。

背景技术

由于原发性肝癌早期症状不明显，确诊时往往已经到达中晚期，失去手术机会。因而早期的筛查显得尤为关键，目前的技术大多为影像学检查，存在早筛不准确的问题。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种原发性肝癌的分子标记物的检测试剂及其应用以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种用于检测原发性肝癌的分子标记物甲基化水平的物质在制备原发性肝癌检测产品中的应用，分子标记物为SEQ ID NO.1所示序列中至少包含一个CpG位点的核酸分子，或为SEQ ID NO.2所示序列中至少包含一个CpG位点的核酸分子。

原发性肝癌包括肝细胞癌、肝内胆管癌和肝细胞癌-肝内胆管癌混合型三种。上述分子标记物可以用于上述三种类型的原发性肝癌的早筛检测。

上述分子标记物的区域是以hg38基因组为参比基因组，发明人发现，原发性肝癌组织、血液样本在上述区域的CpG位点存在高甲基化，通过检测这个区域的甲基化水平，即可判断该样本是否为原发性肝癌。

在一种可选的实施方式中，上述区域的CpG位点的甲基化水平可以区分正常样本与原发性肝癌样本，也可以区分原发性肝癌和肝硬化。

上述区域的CpG位点的甲基化对于原发性肝癌的早期筛查具有较好的灵敏度和特异性。本发明为肝癌早筛提供了良好的分子标志物，具有早筛准确度高、无创、方便、安全、快捷、高通量的优势。本发明提供的分子标志物有望提高我国肝细胞癌高风险人群的早诊比例，实现早发现早治疗，降低肝细胞癌发病率与死亡率。

Chr2:38960251-38960600区域其中一条链的序列如下（SEQ ID NO.1）：

AGTCCAGCCTGGACATCTGCTTCCTGCGGCCCGTCAGCTTCGCCATGGAGGCCGAGCGGCCGGAGCACCCGCTGCAGCCGCTGCCCAAGAGCGCTACGTCGCCGGCGGGCAGCAGCAGCGCCTACAAACTGGAGGCGGCGGCGCAGGCGCACGGCAAGGCCAAGCCGCTGAGCCGCTCTCTCAAAGAGTTCCCGCGTGCGCCGCCAGCCGACGGCGTGGCCCCACGCCTCTACAGCACGCGCAGCAGCAGCGGCGGCCGCGCGCCCATCAAGGCCGAGCGCGCCGCGCAGGCGCACGGCCCGGCCGCCGCCGCCGTCGCCGCCCGCGGCGCATCCAGGACCTTCTTCCCC。

SEQ ID NO.2为与SEQ ID NO.1反向互补的序列，其序列如下：GGGGAAGAAGGTCCTGGATGCGCCGCGGGCGGCGACGGCGGCGGCGGCCGGGCCGTGCGCCTGCGCGGCGCGCTCGGCCTTGATGGGCGCGCGGCCGCCGCTGCTGCTGCGCGTGCTGTAGAGGCGTGGGGCCACGCCGTCGGCTGGCGGCGCACGCGGGAACTCTTTGAGAGAGCGGCTCAGCGGCTTGGCCTTGCCGTGCGCCTGCGCCGCCGCCTCCAGTTTGTAGGCGCTGCTGCTGCCCGCCGGCGACGTAGCGCTCTTGGGCAGCGGCTGCAGCGGGTGCTCCGGCCGCTCGGCCTCCATGGCGAAGCTGACGGGCCGCAGGAAGCAGATGTCCAGGCTGGACT。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述分子标记物为位于如下至少一种CpG岛区域内至少包含一个CpG位点的核酸分子：区域1、区域2、区域3、区域4和区域5；

其中，区域1选自Chr2: 38960272-38960352正链，区域2选自Chr2: 38960318-38960424正链，区域3选自Chr2: 38960430-38960591正链，区域4选自Chr2: 38960596-38960407负链，区域5选自Chr2: 38960422-38960267负链。

上述区域1-5对于肝癌组织样本的检测灵敏性达到97%以上，对于健康人白细胞样本的检测特异性为100%，针对肝硬化组织的检测特异性超过83%。

上述区域对原发性肝癌血液样本的检测灵敏性在60%以上，针对肝硬化血浆的检测特异性超过80%，其中针对健康人血浆样本的检测特异性为95%以上。

在一种实施方式中，分子标记物为位于如下至少一种CpG岛区域的全长区域的核酸分子：区域1、区域2、区域3、区域4和区域5。例如区域1+ 4、区域3+4+5的全长区域的核酸分子。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述物质为用于检测原发性肝癌的分子标记物甲基化水平的核酸组合。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述核酸组合选自如下核酸组合中的至少一种：用于检测区域1的核酸组合1、用于检测区域2的核酸组合2、用于检测区域3的核酸组合3、用于检测区域4的核酸组合4和用于检测区域5的核酸组合5；

核酸组合1包括引物组合1，核酸组合2包括引物组合2，核酸组合3包括引物组合3，核酸组合4包括引物组合4，核酸组合5包括引物组合5。

引物组合1的碱基序列与SEQ ID NO.7-8所示的碱基序列具有至少90%（可选的91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）的一致性，引物组合2的碱基序列与SEQID NO.10-11所示的碱基序列具有至少90%的一致性，引物组合3的碱基序列与SEQ IDNO.13-14所示的碱基序列具有至少90%的一致性，引物组合4的碱基序列与SEQ ID NO.16-17所示的碱基序列具有至少90%的一致性，引物组合5的碱基序列与SEQ ID NO.19-20所示的碱基序列具有至少90%的一致性。

核酸组合1还包括探针1，核酸组合2还包括探针2，核酸组合3还包括探针3，核酸组合4还包括探针4，核酸组合5还包括探针5。

探针1的碱基序列与SEQ ID NO.9所示的碱基序列具有至少90%（可选的91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）的一致性，探针2的碱基序列与SEQ ID NO.12所示的碱基序列具有至少90%的一致性，探针3的碱基序列与SEQ ID NO.15所示的碱基序列具有至少90%的一致性，探针4的碱基序列与SEQ ID NO.18所示的碱基序列具有至少90%的一致性，探针5的碱基序列与SEQ ID NO.21所示的碱基序列具有至少90%的一致性。

在一种可选的实施方式中，上述探针的5’端标记有荧光报告基团，在上述探针的3’端标记有荧光猝灭基团。

上述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY。

在一种可选的实施方式中，探针5’端的报告基团为FAM，3’端猝灭基团为MGB。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测产品选自如下产品中的至少一种：试剂、试剂盒、芯片和测序文库。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述甲基化水平通过如下至少一种的方法进行检测：甲基化特异性PCR法、测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化特异性微阵列法、甲基化敏感性限制性内切酶法和flapendonuclease 法。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述测序法选自亚硫酸氢盐测序法、全基因组甲基化测序法或焦磷酸测序法。

本发明还提供了一种试剂，其包括如下至少一种的核酸组合：核酸组合1、核酸组合2、核酸组合3、核酸组合4和核酸组合5。

引物组合1的碱基序列与SEQ ID NO.7-8所示的碱基序列具有至少90%的一致性，引物组合2的碱基序列与SEQ ID NO.10-11所示的碱基序列具有至少90%的一致性，引物组合3的碱基序列与SEQ ID NO.13-14所示的碱基序列具有至少90%的一致性，引物组合4的碱基序列与SEQ ID NO.16-17所示的碱基序列具有至少90%的一致性，引物组合5的碱基序列与SEQ ID NO.19-20所示的碱基序列具有至少90%的一致性。

在一种可选的实施方式中，核酸组合1还包括探针1，核酸组合2还包括探针2，核酸组合3还包括探针3，核酸组合4还包括探针4，核酸组合5还包括探针5。

探针1的碱基序列与SEQ ID NO.9所示的碱基序列具有至少90%的一致性，探针2的碱基序列与SEQ ID NO.12所示的碱基序列具有至少90%的一致性，探针3的碱基序列与SEQID NO.15所示的碱基序列具有至少90%的一致性，探针4的碱基序列与SEQ ID NO.18所示的碱基序列具有至少90%的一致性，探针5的碱基序列与SEQ ID NO.21所示的碱基序列具有至少90%的一致性。

本发明还提供了一种试剂盒，其包括上述的试剂。

在一种可选的实施方式中，上述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、内参基因的检测引物、内参基因的检测探针、DNA聚合酶和缓冲液。

阳性对照可以是正链阳性对照和/或负链阳性对照；阴性对照可以是正链阴性对照和/或负链阴性对照。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒的检测样本为组织样本或血液样本；

血液样本选自血浆样本、血清样本、全血样本或血细胞样本。

术语“甲基化水平”与一般理解相同，指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念，又代表定量的概念。举例来说，如果核酸序列内的胞嘧啶(C)残基为甲基化的，则可将其称为“高甲基化的”或具有“增加的甲基化”在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平，如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较，在一些情况下，可计算出样本中标记物的甲基化比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数）×100，然后再进行比较，在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。

本发明具有以下有益效果：

本发明发现，Chr2:38960251-38960600区域或其反向互补序列中的CpG位点的甲基化水平与原发性肝癌相关，通过检测Chr2:38960251-38960600区域或其反向互补序列中的CpG位点的甲基化水平，可以判断目标样本是否为原发性肝癌。上述区域可以作为原发性肝癌诊断分子标记物。

上述区域的CpG位点的甲基化对于原发性肝癌的早期筛查具有较好的灵敏度和特异性。本发明为肝癌早筛提供了良好的分子标志物，具有早筛准确度高、无创、方便、安全、快捷、高通量的优势。本发明提供的分子标志物可以用于提高我国肝细胞癌高风险人群的早诊比例，实现早发现早治疗，降低肝细胞癌发病率与死亡率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为Chr2:38960251-38960600区域其中一条链的CpG二核苷酸位点分布图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种原发性肝癌诊断试剂。其包括核酸组合1。

核酸组合1包括引物组合1和探针1，引物组合1包括 SEQ ID NO.7-8所示的核苷酸，探针1的碱基序列参照SEQ ID NO.9所示。该核酸组合1可检测Chr2:38960272-38960352区域正链（目的区域1）的甲基化水平。

区域1甲基化特异性PCR的上游引物序列为（5’-3’）：

TTTTGCGGTTCGTTAGTTTCG (SEQ ID NO.7)；

区域1甲基化特异性PCR的下游引物序列为（5’-3’）：

ACGACGTAACGCTCTTAAACAAC (SEQ ID NO.8)；

区域1甲基化特异性PCR的探针1序列为（5’-3’）：

TATGGAGGTCGAGCGGTCGGAGTAT (SEQ ID NO.9)。

实施例2

本实施例提供了一种原发性肝癌诊断试剂。其包括核酸组合2。

核酸组合2包括引物组合2和探针2，引物组合2包括 SEQ ID NO.10-11所示的核苷酸，探针2的碱基序列参照SEQ ID NO.12所示。该核酸组合2可检测Chr2: 38960318-38960424区域正链（目的区域2）的甲基化水平。

区域2甲基化特异性PCR的上游引物序列为（5’-3’）：TTCGTTGTAGTCGTTGTTTAAGAGC(SEQ ID NO.10)；

区域2甲基化特异性PCR的下游引物序列为（5’-3’）：

GACTCAACGACTTAACCTTACCG (SEQ ID NO.11)；

区域2甲基化特异性PCR的探针2序列为（5’-3’）：

AGCGTTTATAAATTGGAGGCGGC (SEQ ID NO.12)。

实施例3

本实施例提供了一种原发性肝癌诊断试剂。其包括核酸组合3。

核酸组合3包括引物组合3和探针3，引物组合3包括 SEQ ID NO.13-14所示的核苷酸，探针3的碱基序列参照SEQ ID NO.15所示。该核酸组合3可检测Chr2: 38960430-38960591区域正链（目的区域3）的甲基化水平。

区域3甲基化特异性PCR的上游引物序列为（5’-3’）：TTTAAAGAGTTTTCGCGTGCGT(SEQ ID NO.13)；

区域3甲基化特异性PCR的下游引物序列为（5’-3’）：

AATCCTAAATACGCCGCGAAC (SEQ ID NO.14)；

区域3甲基化特异性PCR的探针3序列为（5’-3’）：

TCGCGCGTTTATTAAGGTCGAG (SEQ ID NO.15)。

实施例4

本实施例提供了一种原发性肝癌诊断试剂。其包括核酸组合4。

核酸组合4包括引物组合4和探针4，引物组合4包括 SEQ ID NO.16-17所示的核苷酸，探针4的碱基序列参照SEQ ID NO.18所示。该核酸组合4可检测Chr2: 38960596-38960407区域负链（目的区域4）的甲基化水平。

区域4甲基化特异性PCR的上游引物序列为（5’-3’）：AAGAAGGTTTTGGATGCGTCG(SEQ ID NO.16)；

区域4甲基化特异性PCR的下游引物序列为（5’-3’）：

AAACCAAACCGCTAAACCGCT (SEQ ID NO.17)；

区域4甲基化特异性PCR的探针4序列为（5’-3’）：

TCGTCGTTGTTGTTGCGCGTGT (SEQ ID NO.18)。

实施例5

本实施例提供了一种原发性肝癌诊断试剂。其包括核酸组合5。

核酸组合5包括引物组合5和探针5，引物组合5包括 SEQ ID NO.19-20所示的核苷酸，探针5的碱基序列参照SEQ ID NO.21所示。该核酸组合5可检测Chr2: 38960422-38960267区域负链（目的区域5）的甲基化水平。

区域5甲基化特异性PCR的上游引物序列为（5’-3’）：TTTAGCGGTTTGGTTTTGTCGT(SEQ ID NO.19)；

区域5甲基化特异性PCR的下游引物序列为（5’-3’）：

CTACTTCCTACGACCCGTCAACTTC (SEQ ID NO.20)；

区域5甲基化特异性PCR的探针5序列为（5’-3’）：

AGTTTGTAGGCGTTGTTGTTGTTCG(SEQ ID NO.21)。

实施例6

本实施例提供了一种对于样本中Chr2：38960251-38960600区域进行亚硫酸氢盐测序的方法，其包括如下步骤：

1、样本DNA提取。

当样本是福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本时，采用QIAamp DNA FFPE TissueKit提取基因组，具体操作参见试剂盒说明书。

当样本是白细胞样本时，采用天根生化科技（北京）有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（目录号：DP304）提取细胞基因组DNA，具体操作参见试剂盒说明书。

2、亚硫酸盐的转化。

将提取好的基因组进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸纯化试剂（鄂汉械备20500843），具体实验操作参见试剂盒说明书。在转化过程中，未甲基化的胞嘧啶（C）被转化成尿嘧啶（U），甲基化的胞嘧啶不变，尿嘧啶在后续的PCR步骤中与腺嘌呤（A）配对，胞嘧啶与鸟嘌呤（G）配对，以此实现甲基化与未甲基化序列的区分。

3、PCR反应。

使用Taq DNA聚合酶以亚硫酸氢盐转化后的DNA为模板，同时使用甲基化引物对和非甲基化引物对进行PCR扩增，甲基化引物能扩增甲基化模板，非甲基化引物能扩增非甲基化模板。同时使用甲基化引物对和非甲基化引物对进行PCR扩增可以实现整个大区域的甲基化水平初步验证。

甲基化引物对上游引物序列为（5’-3’）： TTTTGCGGTTCGTTAGTTTCGT（SEQ IDNO.3），甲基化引物对下游引物序列为（5’-3’）：TCTAAACCTAAAACCGTCGACGC（SEQ ID NO.4），非甲基化引物对上游引物序列为（5’-3’）：GTTTTGTTATGGAGGTTGAGTGGTT（SEQ ID NO.5），非甲基化引物对下游引物序列为（5’-3’）：TTTACTTTACCCTCCTTACTTCC（SEQ ID NO.6）。

PCR反应体系中各组分的用量如表1所示。

表1 PCR反应体系

PCR扩增程序如表2所示。

表2 PCR扩增程序。

4、测序和分析。

将PCR产物送至测序公司进行Sanger测序，分别以甲基化和非甲基化引物对的上游引物（即SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.5）为测序引物，将峰图清晰完整的上下游测序结果进行拼接，得到Chr2:38960251-38960600区域其中一条链即完整的测序结果，对其中每一个CpG位点的甲基化情况进行分析。

参照图1所示，Chr2:38960251-38960600区域共有53个CpG二核苷酸位点，如果某一CpG二核苷酸位点上的胞嘧啶是部分甲基化的，即测序结果显示在胞嘧啶的位置既有C也有T，则认为该位点是甲基化的，如果某一样本的测序结果显示53个CpG 位点的95%以上（即至少51个）的位点是甲基化的，则认为该样本在这一区域是甲基化的。

计算各类样本中的甲基化阳性数或阴性数，并计算甲基化阳性或阴性比例。

实施例7

本实施例提供了一种用甲基化特异性PCR对Chr2:38960251-38960600区域的甲基化水平进行检测的方法，共对该区域内的5个区域（实施例1-5所示）进行检测，5个区域在染色体上的位置、及检测引物对和探针序列如表3所示。

表3 序列表

（1）血浆DNA提取和转化。

首先将5mL血液在1300×g转速下离心12分钟以分离血浆，血浆应放在-80℃冰箱保存直至使用，用武汉艾米森生命科技有限公司的核酸提取试剂（型号：血浆/血清游离DNA，备案号：鄂汉械备20210740号）提取血浆中DNA，所用血浆的体积为1mL，用EpiTechBisulfite Kit 对提取好的DNA进行亚硫酸氢盐转化，具体操作参见厂家说明书。经过转化，未甲基化的胞嘧啶（C）被转化成尿嘧啶（U），甲基化的胞嘧啶不变，尿嘧啶在后续的PCR步骤中与腺嘌呤（A）配对，胞嘧啶与鸟嘌呤（G）配对，以此实现甲基化与未甲基化序列的区分。

（2）阳性对照、阴性对照制备。

正链/负链的阳性对照和阴性对照均为构建到载体上的人工合成序列，人工合成序列的碱基组成参照Chr2:38960251-38960600区域的序列设计而成，阴性对照中所有胞嘧啶C的位置都设计为T，阳性对照中出CG二核苷酸位置的C为C外，其他位置的C都设计为T，其他位置的核苷酸与Chr2:38960251-38960600区域的序列相同。

正链阳性对照的人工合成序列如下（5’-3’）：

AGTTTAGTTTGGATATTTGTTTTTTGCGGTTCGTTAGTTTCGTTATGGAGGTCGAGCGGTCGGAGTATTCGTTGTAGTCGTTGTTTAAGAGCGTTACGTCGTCGGCGGGTAGTAGTAGCGTTTATAAATTGGAGGCGGCGGCGTAGGCGTACGGTAAGGTTAAGTCGTTGAGTCGTTTTTTTAAAGAGTTTTCGCGTGCGTCGTTAGTCGACGGCGTGGTTTTACGTTTTTATAGTACGCGTAGTAGTAGCGGCGGTCGCGCGTTTATTAAGGTCGAGCGCGTCGCGTAGGCGTACGGTTCGGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTTCGCGGCGTATTTAGGATTTTTTTTTT。

正链阴性对照的人工合成序列如下（5’-3’）：

AGTTTAGTTTGGATATTTGTTTTTTGTGGTTTGTTAGTTTTGTTATGGAGGTTGAGTGGTTGGAGTATTTGTTGTAGTTGTTGTTTAAGAGTGTTATGTTGTTGGTGGGTAGTAGTAGTGTTTATAAATTGGAGGTGGTGGTGTAGGTGTATGGTAAGGTTAAGTTGTTGAGTTGTTTTTTTAAAGAGTTTTTGTGTGTGTTGTTAGTTGATGGTGTGGTTTTATGTTTTTATAGTATGTGTAGTAGTAGTGGTGGTTGTGTGTTTATTAAGGTTGAGTGTGTTGTGTAGGTGTATGGTTTGGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTTGTGGTGTATTTAGGATTTTTTTTTT。

负链阳性对照的人工合成序列如下（5’-3’）：

GGGGAAGAAGGTTTTGGATGCGTCGCGGGCGGCGACGGCGGCGGCGGTCGGGTCGTGCGTTTGCGCGGCGCGTTCGGTTTTGATGGGCGCGCGGTCGTCGTTGTTGTTGCGCGTGTTGTAGAGGCGTGGGGTTACGTCGTCGGTTGGCGGCGTACGCGGGAATTTTTTGAGAGAGCGGTTTAGCGGTTTGGTTTTGTCGTGCGTTTGCGTCGTCGTTTTTAGTTTGTAGGCGTTGTTGTTGTTCGTCGGCGACGTAGCGTTTTTGGGTAGCGGTTGTAGCGGGTGTTTCGGTCGTTCGGTTTTTATGGCGAAGTTGACGGGTCGTAGGAAGTAGATGTTTAGGTTGGATT。

正链阴性对照的人工合成序列如下（5’-3’）：

GGGGAAGAAGGTTTTGGATGTGTTGTGGGTGGTGATGGTGGTGGTGGTTGGGTTGTGTGTTTGTGTGGTGTGTTTGGTTTTGATGGGTGTGTGGTTGTTGTTGTTGTTGTGTGTGTTGTAGAGGTGTGGGGTTATGTTGTTGGTTGGTGGTGTATGTGGGAATTTTTTGAGAGAGTGGTTTAGTGGTTTGGTTTTGTTGTGTGTTTGTGTTGTTGTTTTTAGTTTGTAGGTGTTGTTGTTGTTTGTTGGTGATGTAGTGTTTTTGGGTAGTGGTTGTAGTGGGTGTTTTGGTTGTTTGGTTTTTATGGTGAAGTTGATGGGTTGTAGGAAGTAGATGTTTAGGTTGGATT。

（3）PCR反应。

以β-actin作为内参基因，以PCR反应体系如表4所示。β-actin作为内参基因，其中β-actin上游引物为：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.22)；β-actin下游引物为：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.23)；β-actin探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ IDNO.24)。

设置检测目标区域的探针为Taqman探针。检测目标区域的探针5’端的报告基团为FAM，3’端猝灭基团为MGB，β-actin探针5’端的报告基团为VIC，3’端猝灭基团为BHQ1。

表4 反应体系表。

对每个样本的区域1-5的甲基化状态单独进行检测，即一个PCR管中，只加入一个区域的引物探针，同时加入β-actin的引物探针。每次检测设置三个复孔。

PCR反应条件如下表5所示。

表5 荧光定量扩增条件。

Ct值读取：PCR 完成后，分别调整β-actin和目标区域的基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。

质量控制：在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测，浓度为10³拷贝/微升，阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照三个复孔Ct值的平均值应在26-30之间。样本内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。

结果分析和判读方法：当三个复孔中有至少两个孔的目标区域的Ct值≤40时，则判定该目标区域在该样本中为PCR阳性，否则，则判定为PCR阴性。将样本的甲基化检测结果同病理结果进行对比，计算甲基化检测的敏感性和特异性。

敏感性为病理结果为阳性的样本中PCR阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中PCR阴性的比例。

实验例1

从武汉某医院共收集66例肝癌组织石蜡样本、30例健康人白细胞样本和30例按肝硬化组织石蜡样本，按照实施例中1所述方法对进行基因组提取、亚硫酸氢盐转化，并用转化后的DNA作为模板分别检测区域1-区域5的甲基化状态。分别统计区域1-5在3类样本中的甲基化阳性数/阴性数，并计算如下表6所示：

表6 甲基化阳性和阴性样本统计表。

由表6的结果可知，在66例肝癌组织石蜡样本中，区域2、区域3、区域4和区域5均为甲基化的，甲基化比例为100%，区域1在64例样本中是甲基化的，甲基化比例为97.0%；在30例健康人白细胞样本中，区域1-5均为甲基化阴性，甲基化阴性比例为100%，在30例肝硬化石蜡组织样本中，区域1-5的甲基化阴性比例不低于80%。

以上结果表明区域1-5在肝癌样本中是高甲基化的，在健康人样本和肝硬化样本中是低甲基化的，以区域1-5的甲基化水平为检测靶标，能区分肝癌样本和健康人样本，也能区分肝癌样本和肝硬化样本。

实验例2

从郑州某医院共搜集到118例肝癌患者的血液样本、55例肝硬化患者的血液样本和191例健康人血液样本，按照实施例2中所述方法进行血浆分离、基因组提取、亚硫酸氢盐转化，并用转化后的DNA作为模板分别检测区域1-区域5的甲基化状态。分别统计区域1-5在3类样本中的PCR阳性数/阴性数，并计算敏感性和特异性，结果如下表7所示。

表7 血液样本阳性和阴性样本统计表。

由表7的结果可知，在血浆样本中，区域1-5对肝癌样本的检测灵敏度均在60%以上；在55例肝硬化患者的血浆样本中，区域1-5的检测特异性均在80%以上；在191例健康人血浆样本中，区域1-5的检测特异性均在95%以上。由此可以看出，区域1-5的甲基化对肝癌的检测特异性优异，灵敏性也较好，能用来区分肝癌样本和肝硬化样本，也能区分肝癌样本和健康样本。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州艾米森生物科技有限公司

<120> 一种原发性肝癌的分子标记物的检测试剂及其应用

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 350

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agtccagcct ggacatctgc ttcctgcggc ccgtcagctt cgccatggag gccgagcggc 60

cggagcaccc gctgcagccg ctgcccaaga gcgctacgtc gccggcgggc agcagcagcg 120

cctacaaact ggaggcggcg gcgcaggcgc acggcaaggc caagccgctg agccgctctc 180

tcaaagagtt cccgcgtgcg ccgccagccg acggcgtggc cccacgcctc tacagcacgc 240

gcagcagcag cggcggccgc gcgcccatca aggccgagcg cgccgcgcag gcgcacggcc 300

cggccgccgc cgccgtcgcc gcccgcggcg catccaggac cttcttcccc 350

<210> 2

<211> 350

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggggaagaag gtcctggatg cgccgcgggc ggcgacggcg gcggcggccg ggccgtgcgc 60

ctgcgcggcg cgctcggcct tgatgggcgc gcggccgccg ctgctgctgc gcgtgctgta 120

gaggcgtggg gccacgccgt cggctggcgg cgcacgcggg aactctttga gagagcggct 180

cagcggcttg gccttgccgt gcgcctgcgc cgccgcctcc agtttgtagg cgctgctgct 240

gcccgccggc gacgtagcgc tcttgggcag cggctgcagc gggtgctccg gccgctcggc 300

ctccatggcg aagctgacgg gccgcaggaa gcagatgtcc aggctggact 350

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttttgcggtt cgttagtttc gt 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tctaaaccta aaaccgtcga cgc 23

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gttttgttat ggaggttgag tggtt 25

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tttactttac cctccttact tcc 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttttgcggtt cgttagtttc g 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acgacgtaac gctcttaaac aac 23

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tatggaggtc gagcggtcgg agtat 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttcgttgtag tcgttgttta agagc 25

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gactcaacga cttaacctta ccg 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agcgtttata aattggaggc ggc 23

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tttaaagagt tttcgcgtgc gt 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aatcctaaat acgccgcgaa c 21

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tcgcgcgttt attaaggtcg ag 22

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aagaaggttt tggatgcgtc g 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

aaaccaaacc gctaaaccgc t 21

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tcgtcgttgt tgttgcgcgt gt 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tttagcggtt tggttttgtc gt 22

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ctacttccta cgacccgtca acttc 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

agtttgtagg cgttgttgtt gttcg 25

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

aaggtggttg ggtggttgtt ttg 23

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

aataacaccc ccaccctgc 19

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ggagtggttt ttgggtttg 19

Claims

1.用于检测原发性肝癌的分子标记物甲基化水平的核酸组合在制备原发性肝癌检测产品中的应用，其特征在于，所述分子标记物为位于如下至少一种CpG岛区域内至少包含一个CpG位点的核酸分子：区域1、区域2、区域3、区域4和区域5；

其中，所述区域1选自Chr2: 38960272-38960352正链，所述区域2选自Chr2:38960318-38960424正链，所述区域3选自Chr2: 38960430-38960591正链，所述区域4选自Chr2: 38960596-38960407负链，所述区域5选自Chr2: 38960422-38960267负链；

所述核酸组合选自如下核酸组合中的至少一种：用于检测所述区域1的核酸组合1、用于检测所述区域2的核酸组合2、用于检测所述区域3的核酸组合3、用于检测所述区域4的核酸组合4和用于检测所述区域5的核酸组合5；

所述核酸组合1包括引物组合1，所述核酸组合2包括引物组合2，所述核酸组合3包括引物组合3，所述核酸组合4包括引物组合4，所述核酸组合5包括引物组合5；

所述引物组合1的碱基序列如SEQ ID NO.7-8所示，所述引物组合2的碱基序列如SEQID NO.10-11所示，所述引物组合3的碱基序列如SEQ ID NO.13-14所示，所述引物组合4的碱基序列如SEQ ID NO.16-17所示，所述引物组合5的碱基序列如SEQ ID NO.19-20所示；

所述核酸组合1还包括探针1，所述核酸组合2还包括探针2，所述核酸组合3还包括探针3，所述核酸组合4还包括探针4，所述核酸组合5还包括探针5；

所述探针1的碱基序列如SEQ ID NO.9所示，所述探针2的碱基序列如SEQ ID NO.12所示，所述探针3的碱基序列如SEQ ID NO.15所示，所述探针4的碱基序列如SEQ ID NO.18所示，所述探针5的碱基序列如SEQ ID NO.21所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述原发性肝癌检测产品选自如下产品中的至少一种：试剂、试剂盒、芯片和测序文库。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述甲基化水平通过如下至少一种的方法进行检测：甲基化特异性PCR法、测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化特异性微阵列法、甲基化敏感性限制性内切酶法和flap endonuclease 法。

4.一种试剂，其特征在于，其包括如下至少一种的核酸组合：核酸组合1、核酸组合2、核酸组合3、核酸组合4和核酸组合5；

5.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求4所述的试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、内参基因的检测引物、内参基因的检测探针、DNA聚合酶和缓冲液。