CN113604563A

CN113604563A - 一种肝癌诊断或辅助诊断的核酸组合、检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN113604563A
Application number: CN202110605465.XA
Authority: CN
Inventors: 张良禄; 张玮; 董兰兰; 李国强; 昂学; 李婷婷
Original assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Priority date: 2021-06-02
Filing date: 2021-06-02
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2041-06-02
Also published as: CN115961031A; CN113604563B

Abstract

本发明公开了一种肝癌诊断或辅助诊断的核酸组合、检测试剂盒及其应用，涉及基因检测技术领域。以人GNB4基因的CpG岛的甲基化为标志物，通过检测其甲基化的增加可以对肝癌进行诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性。采用本发明提供的检测试剂和试剂盒能有效地提高肝癌的检出率，从而满足肝细胞癌早筛早诊的临床需求。

Description

一种肝癌诊断或辅助诊断的核酸组合、检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及一种肝癌诊断或辅助诊断的核酸组合、检测试剂盒及其应用。

背景技术

原发性肝癌是我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因。原发性肝癌主要包括肝细胞癌、肝内胆管癌和肝细胞癌-肝内胆管癌混合型3种不同病理学类型，其中肝细胞癌占85％～90％，其风险因素包括乙型/丙型肝炎病毒(HBV/HCV)感染、肥胖引起的非酒精性脂肪肝疾病、慢性酒精滥用等，这些因素可能直接导致肝硬化的发展，肝硬化患者每年发生肝癌的比率约为2％-4％。

全球每年原发性肝癌新发病例85.5万，全球每年因原发性肝癌死亡81万例。肝癌患者的5年生存率在日本是30.1％，在韩国是27.2％，而在美国是17.4％。肝细胞癌的预后与疾病诊断时的严重程度相关。因为发现晚，仅有25％的初诊肝癌患者可以进行手术切除。85％的初诊肝癌患者已经处于中晚期阶段，由于肝细胞癌早期症状不明显，往往诊断时已经到达中晚期，失去手术机会。早筛早诊早治是降低肝细胞癌发病率与死亡率的有效方法，而方便、安全、快捷、高通量的筛查方法尤为重要。

目前我国肝细胞癌诊疗指南推荐的方案是：高危人群，每隔6个月进行1次肝脏超声检查和血清甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)检测，进行肝癌早期筛查。AFP是目前唯一可用的检测和监测肝癌的血液标志物，但AFP的敏感性和特异性仅为58.2％和85.3％，难以满足肝细胞癌早筛早诊的临床需求。影像学检查对早期肝细胞癌的确诊仍然相当困难，在实际应用中易受病灶大小、机器灵敏度及操作者水平等因素的影响。为了提高我国肝细胞癌高风险人群的早诊比例，急需一种灵敏性和特异性高的检测方法来普及肝癌早筛，并提高早期筛查的准确度。

目前，肝细胞癌缺乏灵敏度和准确性高的检测手段。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肝癌诊断或辅助诊断的核酸组合、检测试剂盒及其应用以解决上述技术问题。

DNA甲基化是癌症发生的早期事件，现有技术表明血液中的循环肿瘤DNA(Ct DNA)与肿瘤组织中的DNA有很强的一致性。通过检测血液Ct DNA的甲基化为肝癌的早期无创检测提供了可能。癌变过程中，DNA甲基化水平的异常多发生在CpG岛内，CpG岛主要位于基因的启动子和外显子区域，是富含CpG二核苷酸的区域，长度在200-3000bp之间，G+C的含量超过50％。

本发明是这样实现的：

本发明提供了肝癌诊断或辅助诊断的试剂在制备肝癌诊断或辅助诊断试剂盒中的应用，该试剂用于检测分子标记物，分子标记物为人GNB4基因的CpG岛的甲基化，CpG岛选自GNB4基因的如下区域中的全长区域或部分区域：

Chr3:179450970-179451662bp正链和/或

Chr3:179451803-179451038bp负链。

发明人以人GNB4基因的CpG岛的甲基化为标志物，通过检测人GNB4基因的CpG岛的甲基化水平的增加对肝癌进行诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性，为肝癌的诊断提供一种新的思路和选择。

所检测的区域可选自的Chr3:179450970-179451662bp正链和Chr3:179451803-179451038bp负链全长区域或者该区域中的部分区域，通过对靶区域的检测实现对肝癌进行诊断或辅助诊断。

需要说明的是，本发明提到的位点或区域的位置均以hg38基因组为参考基因组。

Chr3:179450970-179451662bp正链的碱基序列如下(5’-3’)：

CACGCACGGGCTCGTGCTCTGAGTTCCTGGAAGGAGGCCTCGGGGAGTGACGAGAAACCAGGGGGGTCTGCAGGACTTGGACCGCCGACCGTTCCTCGCTCCCCGGGGCGAGCGGTCTGGACCGCCCGGGAAGTGCCTGCGCCGGCGGTCGTGGGGCCAGTTCCCGCGTGGCAGCTGGGCGCGACACAGGCGCGCCCTCCTCGTCCCTCCCGGGCAGCGTCGGCCGCCCGAGCCCGGGGAGACCCGCCCCGCCCCGCGCCGTCACCCGGGCCCCGTTCCGCAGGGGTGGCTCGCGGCGCCCCACGTCCCTGCGAGAAGCCCGGGATCGCTTCGCGGGGCGCACCGACGAGCCGCCGCTCGCGAGCTCGCCGCCTACCTGGAGGGAGCTCAGGCCCGCGTCGACCGCGCGCTGCCGGTGTCCGCTGGGCGCTCAGCAGCCCCTGGAGCGCGGAGCCGGCGTGGAGAGCGCAGCTCACAGCCGAGACCAGAGCCGCCGGCCACACCCAGTCCCGCACCTCCCAGCAGCCAACTCCGCGGCGCGCCGGAGCCGGGGCGGGGACGTGGCTGGAGGCGCGAGGCGCGAGGCACGAGGCGCGCGGGCCCGGCGGGGACGTGCCGGGGACGCGCAGACCCTCGGAGCGCGCGCAGCCCGGGCGGGGGGCGAAGGGAGCGGGCGCCGCGCGCAGCTTCTGC。

Chr3:179451803-179451038bp负链上的碱基序列如下(5’-3’):

CCGGAAAGGAAACTGGCCACGCCACTTAGACGGGCGCTACTTAGCAGCGTGCCCCGGCGCCACACCAACAAGAAAACGAAACTGCCCGGGAATGAATGTTTTTCTTCTCCTTCTGGCAGGAAACGAGAGAGAAAATAGGAAGCAGAAGCTGCGCGCGGCGCCCGCTCCCTTCGCCCCCCGCCCGGGCTGCGCGCGCTCCGAGGGTCTGCGCGTCCCCGGCACGTCCCCGCCGGGCCCGCGCGCCTCGTGCCTCGCGCCTCGCGCCTCCAGCCACGTCCCCGCCCCGGCTCCGGCGCGCCGCGGAGTTGGCTGCTGGGAGGTGCGGGACTGGGTGTGGCCGGCGGCTCTGGTCTCGGCTGTGAGCTGCGCTCTCCACGCCGGCTCCGCGCTCCAGGGGCTGCTGAGCGCCCAGCGGACACCGGCAGCGCGCGGTCGACGCGGGCCTGAGCTCCCTCCAGGTAGGCGGCGAGCTCGCGAGCGGCGGCTCGTCGGTGCGCCCCGCGAAGCGATCCCGGGCTTCTCGCAGGGACGTGGGGCGCCGCGAGCCACCCCTGCGGAACGGGGCCCGGGTGACGGCGCGGGGCGGGGCGGGTCTCCCCGGGCTCGGGCGGCCGACGCTGCCCGGGAGGGACGAGGAGGGCGCGCCTGTGTCGCGCCCAGCTGCCACGCGGGAACTGGCCCCACGACCGCCGGCGCAGGCACTTCCCGGGCGGTCCAGACCGCTCGCCCCGGGGAGCGAGGAACGGTCGGCGGTCCAAGTCCTGCA。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述CpG岛选自GNB4基因的如下至少一种区域中的全长区域或部分区域：区域1、区域2、区域3、区域4、区域5、区域6、区域7、区域8和区域9。

其中，区域1选自Chr3:179450970-179451058bp正链，区域2选自Chr3:179451090-179451203bp正链，区域3选自Chr3:179451231-179451356bp正链，区域4选自Chr3:179451379-179451472bp正链，区域5选自Chr3:179451444-179451662bp正链，区域6选自Chr3:179451803-179451709bp负链，区域7选自Chr3:179451675-179451569bp负链，区域8选自Chr3:179451457-179451278bp负链，区域9选自Chr3:179451158-179451038bp负链；

优选地，CpG岛选自GNB4基因的如下至少一种区域中的全长区域或部分区域：区域2正链、区域3正链、区域8负链和区域9负链。

需要说明的是，在实际实施方式中，可以根据需要选自上述9个区域中的任一区域或任意几个区域进行甲基化检测。例如选择区域1-5进行甲基化检测。

基于本发明公开的内容，本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述区域中的一个或多个的组合的甲基化进行检测，以对肝癌进行诊断，无论采用何种技术，其都是属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种检测人GNB4基因的CpG岛甲基化水平的核酸组合，CpG岛选自GNB4基因的如下区域中的全长区域或部分区域：

Chr3:179450970-179451662bp正链和/或

Chr3:179451803-179451038bp负链；

优选地，CpG岛选自GNB4基因的如下至少一种区域中的全长区域或部分区域：区域1、区域2、区域3、区域4、区域5、区域6、区域7、区域8和区域9；

优选地，CpG岛选自GNB4基因的如下至少一种区域中的全长区域或部分区域：区域2正链、区域3正链、区域8负链和区域9负链。在血浆样本中，检测上述4个区域的甲基化对肝癌的检测灵敏度均超过85％，对肝癌的检测特异性均大于95％。在肝组织样本中，检测上述4个区域的甲基化对肝癌的检测灵敏度均超过95％，对肝癌的检测特异性均为100％。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测人GNB4基因的CpG岛甲基化水平的核酸组合选自如下核酸组合中的至少一种：用于检测区域1的核酸组合1、用于检测区域2的核酸组合2、用于检测区域3的核酸组合3、用于检测区域4的核酸组合4、用于检测区域5的核酸组合5、用于检测区域6的核酸组合6、用于检测区域7的核酸组合7、用于检测区域8的核酸组合8、用于检测区域9的核酸组合9。

核酸组合1的碱基序列如SEQ ID NO.1-3所示，核酸组合2的碱基序列如SEQ IDNO.4-6所示，核酸组合3的碱基序列如SEQ ID NO.7-9所示，核酸组合4的碱基序列如SEQ IDNO.10-12所示，核酸组合5的碱基序列如SEQ ID NO.13-15所示，核酸组合6的碱基序列如SEQ ID NO.16-18所示，核酸组合7的碱基序列如SEQ ID NO.19-21所示，核酸组合8的碱基序列如SEQ ID NO.22-24所示，核酸组合9的碱基序列如SEQ ID NO.25-27所示。

上述核酸组合仅为发明人提供的一种或几种的核酸组合，此外，在其他实施方式中，根据上述核酸组合删减或增加碱基也均在本发明的保护范围之内。例如与上述的核酸组合1-9中的任意一种核酸组合具有80％以上的序列一致性。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述核酸组合中包括探针序列，探针序列的5’端均标记有荧光报告基团，探针序列的3’端均标记有荧光淬灭基团。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY。在其他实施方式中，探针标记的荧光报告基团和猝灭基团也可以根据需要进行自适应调整，并不限于上述限定的几种类型。

本发明还提供了一种肝癌诊断或辅助诊断的检测试剂，其包括上述检测人GNB4基因的CpG岛甲基化水平的核酸组合。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测试剂为检测人GNB4基因的CpG岛的甲基化水平的试剂，甲基化水平的检测手段包括如下至少一种的方法：甲基化特异性PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和flap endonuclease法。

本发明还提供了一种肝癌诊断或辅助诊断的检测试剂盒，其包括检测人GNB4基因的CpG岛的核酸组合或肝癌诊断或辅助诊断的检测试剂。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒的检测样本为取自待测主体的血液样本或组织样本。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒还包括缓冲液、dNTPs、DNA酶和水。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的上述核酸组合物、检测试剂、试剂盒是以人GNB4基因的CpG岛的甲基化作为标志物，通过检测其甲基化水平的增加可以对肝癌进行诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性。采用本发明提供的检测试剂和试剂盒能有效地提高肝癌的检出率，从而满足肝细胞癌早筛早诊的临床需求。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种用于肝癌的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合1，核苷酸组合1包括SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合1可检测GNB4基因上Chr3:179450970-179451058区域正链(区域1)的甲基化；

区域1正链碱基序列如下(5’-3’)：

CACGCACGGGCTCGTGCTCTGAGTTCCTGGAAGGAGGCCTCGGGGAGTGACGAGAAACCAGGGGGGTCTGCAGGACTTGGACCGCCGAC。

实施例2

本实施例提供了一种用于肝癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合2，核苷酸组合2包括SEQ ID NO.3-6所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合2可检测GNB4基因上Chr3:179451090-179451203区域正链(区域2)的甲基化；

区域2正链碱基序列如下(5’-3’)：

ACCGCCCGGGAAGTGCCTGCGCCGGCGGTCGTGGGGCCAGTTCCCGCGTGGCAGCTGGGCGCGACACAGGCGCGCCCTCCTCGTCCCTCCCGGGCAGCGTCGGCCGCCCGAGCC。

实施例3

本实施例提供了一种用肝癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合3，核苷酸组合3包括SEQ ID NO.7-9所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合3可检测GNB4基因上Chr3:179451231-179451356区域正链(区域3)的甲基化；

区域3正链碱基序列如下(5’-3’)：

TCACCCGGGCCCCGTTCCGCAGGGGTGGCTCGCGGCGCCCCACGTCCCTGCGAGAAGCCCGGGATCGCTTCGCGGGGCGCACCGACGAGCCGCCGCTCGCGAGCTCGCCGCCTACCTGGAGGGAGC。

实施例4

本实施例提供了一种用于肝癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合4，核苷酸组合4包括SEQ ID NO.10-12所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合4可检测GNB4基因上Chr3:179451379-179451472区域正链(区域4)的甲基化；

区域4正链碱基序列如下(5’-3’)：

CTGCCGGTGTCCGCTGGGCGCTCAGCAGCCCCTGGAGCGCGGAGCCGGCGTGGAGAGCGCAGCTCACAGCCGAGACCAGAGCCGCCGGCCACAC。

实施例5

本实施例提供了一种用于肝癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合5，核苷酸组合5包括SEQ ID NO.13-15所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合5可检测GNB4基因上Chr3:179451444-179451662区域正链(区域5)的甲基化；

区域5正链碱基序列如下(5’-3’)：

ACAGCCGAGACCAGAGCCGCCGGCCACACCCAGTCCCGCACCTCCCAGCAGCCAACTCCGCGGCGCGCCGGAGCCGGGGCGGGGACGTGGCTGGAGGCGCGAGGCGCGAGGCACGAGGCGCGCGGGCCCGGCGGGGACGTGCCGGGGACGCGCAGACCCTCGGAGCGCGCGCAGCCCGGGCGGGGGGCGAAGGGAGCGGGCGCCGCGCGCAGCTTCTGC。

实施例6

本实施例提供了一种用于肝癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合6，核苷酸组合6包括SEQ ID NO.16-18所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合6可检测GNB4基因上Chr3:179451803-179451709区域负链(区域6)的甲基化；

区域6负链碱基序列如下(5’-3’)：

CCGGAAAGGAAACTGGCCACGCCACTTAGACGGGCGCTACTTAGCAGCGTGCCCCGGCGCCACACCAACAAGAAAACGAAACTGCCCGGGAATGA。

实施例7

本实施例提供了一种用于肝癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合7，核苷酸组合7包括SEQ ID NO.19-21所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合7可检测GNB4基因上Chr3:179451675-179451569区域负链(区域7)的甲基化；

区域7负链碱基序列如下(5’-3’)：

GAGAAAATAGGAAGCAGAAGCTGCGCGCGGCGCCCGCTCCCTTCGCCCCCCGCCCGGGCTGCGCGCGCTCCGAGGGTCTGCGCGTCCCCGGCACGTCCCCGCCGGGC。

实施例8

本实施例提供了一种用于肝癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合8，核苷酸组合8包括SEQ ID NO.22-24所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合8可检测GNB4基因上Chr3:179451457-179451278区域负链(区域8)的甲基化；

区域8负链碱基序列如下(5’-3’)：

CTGGTCTCGGCTGTGAGCTGCGCTCTCCACGCCGGCTCCGCGCTCCAGGGGCTGCTGAGCGCCCAGCGGACACCGGCAGCGCGCGGTCGACGCGGGCCTGAGCTCCCTCCAGGTAGGCGGCGAGCTCGCGAGCGGCGGCTCGTCGGTGCGCCCCGCGAAGCGATCCCGGGCTTCTCGCAG。

实施例9

本实施例提供了一种用于肝癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合9，核苷酸组合9包括SEQ ID NO.25-27所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合9可检测GNB4基因上Chr3:179451158-179451038区域负链(区域9)的甲基化；

区域9负链碱基序列如下(5’-3’)：

CTGTGTCGCGCCCAGCTGCCACGCGGGAACTGGCCCCACGACCGCCGGCGCAGGCACTTCCCGGGCGGTCCAGACCGCTCGCCCCGGGGAGCGAGGAACGGTCGGCGGTCCAAGTCCTGCA

表1 各核酸组合的序列表。

实施例10

本实施例提供了一种核酸组合，其包括实施例2中的核苷酸组合2和实施例3中的核苷酸组合3。

实施例11

本实施例提供了一种核酸组合，其包括实施例8中的核苷酸组合8和实施例9中的核苷酸组合9。

实施例12

本实施例提供了一种核酸组合，其包括实施例2中的核苷酸组合2、实施例3中的核苷酸组合3、实施例8中的核苷酸组合8和实施例9中的核苷酸组合9。

实施例13

本实施例提供了一种使用实施例1-9任意一种试剂盒进行肝癌诊断的方法，其包括如下步骤：

(1)血浆DNA提取和转化。

首先将5mL血液在1300×g转速下离心12分钟以分离血浆，血浆应放在-80℃冰箱保存备用，用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(DP709)提取血浆中DNA，用EpiTech Bisulfite Kit对提取好的DNA进行亚硫酸氢盐转化，具体操作参见试剂盒说明书。经过转化，未甲基化的胞嘧啶(C)被转化成尿嘧啶(U)，甲基化的胞嘧啶不变，尿嘧啶在后续的PCR步骤中与腺嘌呤(A)配对，胞嘧啶与鸟嘌呤(G)配对，以此实现甲基化与未甲基化序列的区分。

(2)阳性对照、阴性对照制备。

每个基因的阳性对照和阴性对照均为构建到载体上的人工合成序列，人工合成序列的碱基组成参照待扩增目的片段的序列设计而成，阴性对照中所有胞嘧啶C的位置都设计为T，阳性对照中出CG二核苷酸位置的C为C外，其他位置的C都设计为T，其他位置的核苷酸与待扩增目的片段相同。

(3)PCR反应

以β-actin作为内参基因，以PCR反应体系如表2所示。β-actin作为内参基因，其中β-actin上游引物为：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.28)；β-actin下游引物为：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.29)；β-actin探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ IDNO.30)。

本实施例中检测目标区域的探针5’端的报告基团为FAM，3’端猝灭基团为MGB，β-actin探针5’端的报告基团为VIC，3’端猝灭基团为BHQ1。

表2 PCR体系。

组分	规格	体积(μL)
			缓冲液	5×	5
dNTPs	各2.5mM	2
			检测区域上游引物	10μM	1
检测区域下游引物	10μM	1
			检测区域探针	10μM	1
β-actin上游引物	10μM	1
			β-actin下游引物	10μM	1
β-actin探针	10μM	1
			DNA酶	5U/μL	0.5
待测样本DNA	/	5
			纯化水	/	补至25

如表2所示，在检测样本中GNB4区域1-区域9任一区域的甲基化状态时，只需将某一区域对应的引物探针、β-actin引物探针、缓冲液、dNTP、DNA酶和样本DNA等按照表中的体积加入到反应体系中。

PCR反应条件如下表3所示。

表3 PCR反应条件。

Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。

质量控制：在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测，阴性对照为纯化水，阳性对照为含有β-actin基因和目标基因序列的人工合成质粒，浓度为10³拷贝/微升，阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照的Ct值应在26-30之间。阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。

结果分析和判读方法：在相同的实验条件下，对不同的样本检测同一区域的甲基化时，若样本的Ct值越小，表明该样本中该检测区域的甲基化水平越高。若某一检测区域在样本上的Ct值≤38，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阳性，若某一检测区域在样本上的Ct值>38，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阴性。将样本的甲基化检测结果同病理结果进行对比，计算甲基化检测的敏感性和特异性。敏感性为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。

实验例1

从武汉大学中南医院共搜集143例肝癌患者的肝组织样本和50例癌旁样本，按照实施例中所述方法对进行基因组提取、亚硫酸氢盐转化，并用转化后的DNA作为模板分别检测区域1-区域9的甲基化状态。如下表4所示：

表4 区域1-9在肝组织样本中的检测灵敏度和特异性。

由表4的结果可知，在组织样本中，区域1-9对肝癌样本的检测灵敏度均在85％以上，其中区域2、区域3、区域8和区域9的检测灵敏度最优，均大于95％；区域1-9对肝癌癌旁组织的检测特异性均在95％以上，其中区域2、区域3、区域8和区域9的检测特异性均为100％。

实验例2

从武汉大学中南医院共搜集到120例健康人的血液样本和95例肝癌患者的血液样本，按照实施例中所述方法进行血浆分离、基因组提取、亚硫酸氢盐转化，并用转化后的DNA作为模板分别检测区域1-区域9的甲基化状态。以Ct值＝38作为临界值，计算癌症样本和正常样本的灵敏度、特异性，如下表5所示：

表5 区域1-9在血浆样本中的检测灵敏度和特异性。

由表5的结果可知，在血浆样本中，区域1-9对肝癌样本的检测灵敏度均在80％以上，其中区域2、区域3、区域8和区域9的检测灵敏度最优，均大于85％，区域3、区域8和区域9的检测灵敏度均大于90％；区域1-9对肝癌癌旁组织的检测特异性均在95％以上，其中区域2、区域3、区域8和区域9的检测特异性均大于98％。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉艾米森生命科技有限公司

<120> 一种肝癌诊断或辅助诊断的核酸组合、检测试剂盒及其应用

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tacgtacggg ttcgtgtttt ga 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atcgacgatc caaatcctac aa 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tggaaggagg tttcggggag t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atcgttcggg aagtgtttgc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aactcgaacg accgacgcta 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcgtggggtt agttttcgcg t 21

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttattcgggt ttcgtttcg 19

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

actccctcca aataaacgac ga 22

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tttacgtttt tgcgagaagt tcgg 24

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttgtcggtgt tcgttgggc 19

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atataaccga cgactctaat ctcga 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tagtagtttt tggagcgcgg agtcg 25

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atagtcgaga ttagagtcgt cggt 24

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

acaaaaacta cgcgcgacg 19

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ttagtagtta atttcgcggc gcgtc 25

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tcggaaagga aattggttac g 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tcattcccga acaatttcgt 20

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ttagacgggc gttatttagt agcgt 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gagaaaatag gaagtagaag ttgcg 25

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

acccgacgaa aacgtaccga 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ttcgtttttc gttcgggttg cg 22

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ttggtttcgg ttgtgagttg c 21

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ctacgaaaaa cccgaaatcg 20

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tttaggggtt gttgagcgtt tagcg 25

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ttgtgtcgcg tttagttgtt acg 23

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tacaaaactt aaaccgccga 20

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

aattggtttt acgatcgtcg gcgta 25

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

aaggtggttg ggtggttgtt ttg 23

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

aataacaccc ccaccctgc 19

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ggagtggttt ttgggtttg 19

Claims

1.一种肝癌诊断或辅助诊断的试剂在制备肝癌诊断或辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂用于检测分子标记物，所述分子标记物为人GNB4基因的CpG岛的甲基化，所述CpG岛选自GNB4基因的如下区域中的全长区域或部分区域：

Chr3:179450970-179451662bp正链和/或

Chr3:179451803-179451038bp负链。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CpG岛选自GNB4基因的如下至少一种区域中的全长区域或部分区域：区域1、区域2、区域3、区域4、区域5、区域6、区域7、区域8和区域9；

其中，所述区域1选自Chr3:179450970-179451058bp正链，所述区域2选自Chr3:179451090-179451203bp正链，所述区域3选自Chr3:179451231-179451356bp正链，所述区域4选自Chr3:179451379-179451472bp正链，所述区域5选自Chr3:179451444-179451662bp正链，所述区域6选自Chr3:179451803-179451709bp负链，所述区域7选自Chr3:179451675-179451569bp负链，所述区域8选自Chr3:179451457-179451278bp负链，所述区域9选自Chr3:179451158-179451038bp负链。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述CpG岛选自GNB4基因的如下至少一种区域中的全长区域或部分区域：区域2正链、区域3正链、区域8负链和区域9负链。

4.一种检测人GNB4基因的CpG岛甲基化水平的核酸组合，其特征在于，所述CpG岛选自GNB4基因的如下区域中的全长区域或部分区域：

Chr3:179450970-179451662bp正链和/或

Chr3:179451803-179451038bp负链；

优选地，所述CpG岛选自GNB4基因的如下至少一种区域中的全长区域或部分区域：区域1、区域2、区域3、区域4、区域5、区域6、区域7、区域8和区域9；

其中，所述区域1选自Chr3:179450970-179451058bp正链，所述区域2选自Chr3:179451090-179451203bp正链，所述区域3选自Chr3:179451231-179451356bp正链，所述区域4选自Chr3:179451379-179451472bp正链，所述区域5选自Chr3:179451444-179451662bp正链，所述区域6选自Chr3:179451803-179451709bp负链，所述区域7选自Chr3:179451675-179451569bp负链，所述区域8选自Chr3:179451457-179451278bp负链，所述区域9选自Chr3:179451158-179451038bp负链；

优选地，所述CpG岛选自GNB4基因的如下至少一种区域中的全长区域或部分区域：区域2正链、区域3正链、区域8负链和区域9负链。

5.根据权利要求4所述的检测人GNB4基因的CpG岛甲基化水平的核酸组合，其特征在于，所述检测人GNB4基因的CpG岛甲基化的核酸组合选自如下核酸组合中的至少一种：用于检测所述区域1的核酸组合1、用于检测所述区域2的核酸组合2、用于检测所述区域3的核酸组合3、用于检测所述区域4的核酸组合4、用于检测所述区域5的核酸组合5、用于检测所述区域6的核酸组合6、用于检测所述区域7的核酸组合7、用于检测所述区域8的核酸组合8、用于检测所述区域9的核酸组合9；

所述核酸组合1的碱基序列如SEQ ID NO.1-3所示，所述核酸组合2的碱基序列如SEQID NO.4-6所示，所述核酸组合3的碱基序列如SEQ ID NO.7-9所示，所述核酸组合4的碱基序列如SEQ ID NO.10-12所示，所述核酸组合5的碱基序列如SEQ ID NO.13-15所示，所述核酸组合6的碱基序列如SEQ ID NO.16-18所示，所述核酸组合7的碱基序列如SEQ ID NO.19-21所示，所述核酸组合8的碱基序列如SEQ ID NO.22-24所示，所述核酸组合9的碱基序列如SEQ ID NO.25-27所示。

6.一种肝癌诊断或辅助诊断的检测试剂，其特征在于，其包括权利要求4-5任一项所述的检测人GNB4基因的CpG岛甲基化水平的核酸组合。

7.根据权利要求6所述的肝癌诊断或辅助诊断的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂为检测人GNB4基因的CpG岛的甲基化状态的试剂，所述甲基化状态的检测手段包括如下至少一种的方法：甲基化特异性PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和flap endonuclease法。

8.一种肝癌诊断或辅助诊断的检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求4-5任一项所述的检测人GNB4基因的CpG岛甲基化水平的核酸组合或权利要求6-7任一项所述的肝癌诊断或辅助诊断的检测试剂。

9.根据权利要求8所述的肝癌诊断或辅助诊断的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为取自待测主体的血液样本或组织样本。

10.根据权利要求8或9所述的肝癌诊断或辅助诊断的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲液、dNTPs、DNA酶和水。