CN117004713A - 用于诊断或辅助诊断胃癌的生物标志物和试剂盒 - Google Patents

用于诊断或辅助诊断胃癌的生物标志物和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于检测胃癌的标志物，包括DNAJC6基因的CpG岛。本发明根据DNAJC6基因的CpG岛的甲基化状态，能够区分胃癌症样本和健康样本，在实现无创检测的同时，提高胃癌早期诊断的灵敏度。

Description

用于诊断或辅助诊断胃癌的生物标志物和试剂盒
技术领域
本发明涉及癌症领域，具体而言，涉及用于诊断或辅助诊断胃癌的生物标志物和试剂盒。
背景技术
胃癌是一种由表观遗传学和多基因突变共同驱动的具有高度异质性的疾病。由于胃癌早期症状不明显，部分胃癌患者在确诊时已经失去了手术根治的最佳时期，致使很多患者的5年生存率不足30％。
如果胃癌患者在早期被确诊，经过手术切除以及辅助治疗后，其5年生存率可以达到90-95％。因此，胃癌的早期预防和诊断可以降低癌症的发生率，提高患者的治疗效果和生存时间，还可以大大减轻患者的经济压力和社会投入。
目前，临床上常用胃镜、电子计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)等诊断胃癌。胃镜是胃癌诊断的金标准，但它是有创性操作，患者接受度低。如何通过无创的或者微创的方法，快速、便捷地进行胃癌筛查是胃癌早期诊断的难点。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的第一目的在于提供一种用于诊断或辅助诊断胃癌的标志物，包括DNAJC6基因的CpG岛，以实现通过无创的或者微创的方法，快速、便捷地进行胃癌早期诊断。
本发明的一种实现方式中，DNAJC6基因的CpG岛包括DNA片段位于Chr1:65265564-65266204或其反向互补链的全长或部分区域。
本发明的一种实现方式中，DNAJC6基因的CpG岛选自以下至少一个区域的全长或部分区域：Chr1:65265544-65265710、Chr1:65265671-65265824、Chr1:65265775-65265919、Chr1:65265880-65266025、Chr1:65265988-65266140、Chr1:65266078-65266222、Chr1:65266220-65266081、Chr1:65266115-65265961、Chr1:65266023-65265880、Chr1:65265928-65265772、Chr1:65265825-65265672，以上区域均以GRCh38.p14为参考基因组。
本发明的第二目的在于检测上述生物标志物甲基化状态的试剂或试剂盒在制备胃癌诊断产品中的应用。
本发明的第三目的在于提供一种核酸产品，包括用于检测上述生物标志物甲基化状态的检测引物对。
本发明的一种实现方式中，核酸产品包括用于检测DNAJC6基因CpG岛以下核酸区域Chr1:65265544-65265710、Chr1:65265671-65265824、Chr1:65265775-65265919、Chr1:65265880-65266025、Chr1:65265988-65266140、Chr1:65266078-65266222、Chr1:65266220-65266081、Chr1:65266115-65265961、Chr1:65266023-65265880、Chr1:65265928-65265772、Chr1:65265825-65265672中至少一个区域的全长或部分区域甲基化状态的检测引物对。
本发明的一种实现方式中，检测引物对包括以下引物对中的至少一组：
用于检测核酸区域Chr1:65265544-65265710的如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示的引物对；
用于检测核酸区域Chr1:65265671-65265824的如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.6所示的引物对或者SEQ ID NO.43～SEQ ID NO.44所示的引物对；
用于检测核酸区域Chr1:65265775-65265919的如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.10所示的引物对或者SEQ ID NO.46～SEQ ID NO.47所示的引物对；
用于检测核酸区域Chr1:65265880-65266025的如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.14所示的引物对或者SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.50所示的引物对；
用于检测核酸区域Chr1:65265988-65266140的如SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.18所示的引物对或者SEQ ID NO.52～SEQ ID NO.53所示的引物对；
用于检测核酸区域Chr1:65266078-65266222的如SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.22所示的引物对或者SEQ ID NO.55～SEQ ID NO.56所示的引物对；
用于检测核酸区域Chr1:65266220-65266081的如SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.26所示的引物对或者SEQ ID NO.58～SEQ ID NO.59所示的引物对；
用于检测核酸区域Chr1:65266115-65265961的如SEQ ID NO.27～SEQ ID NO.30所示的引物对或者SEQ ID NO.61～SEQ ID NO.62所示的引物对；
用于检测核酸区域Chr1:65266023-65265880的如SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.34所示的引物对或者SEQ ID NO.64～SEQ ID NO.65所示的引物对；
用于检测核酸区域Chr1:65265928-65265772的如SEQ ID NO.35～SEQ ID NO.38所示的引物对或者SEQ ID NO.67～SEQ ID NO.68所示的引物对；
用于检测核酸区域Chr1:65265825-65265672的如SEQ ID NO.39～SEQ ID NO.42所示的引物对或者SEQ ID NO.70～SEQ ID NO.71所示的引物对。
本发明的一种实现方式中，核酸产品包括与检测引物对对应的检测探针，检测探针上连接有荧光基团和荧光淬灭基团。
本发明的一种实现方式中，荧光报告基团选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、NED和Texas Red中的一种，荧光淬灭基团可以是选自TAMRA、BHQ和MGB中的一种。
本发明的一种实现方式中，与SEQ ID NO.43～SEQ ID NO.44所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示；与SEQ ID NO.46～SEQ ID NO.47所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示；与SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.50所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示；与SEQ ID NO.52～SEQ IDNO.53所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示；与SEQ ID NO.55～SEQ ID NO.56所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.57所示；与SEQID NO.58～SEQ ID NO.59所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.60所示；与SEQ ID NO.61～SEQ ID NO.62所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.63所示；与SEQ ID NO.64～SEQ ID NO.65所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示；与SEQ ID NO.67～SEQ ID NO.68所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.69所示；与SEQ ID NO.70～SEQ ID NO.71所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.72所示。
本发明的第四目的在于提供一种胃癌诊断试剂盒，试剂盒包括上述核酸产品。
本发明的一种实现方式中，试剂盒还包括核酸提取试剂、核酸转化试剂、PCR反应试剂中的至少一种。
本发明的一种实现方式中，核酸转化试剂包括亚硫酸氢盐。
本发明的一种实现方式中，待测样本包括细胞系、活检组织、粪便、血浆、血液、全血、分离的血细胞中的至少一种样本。
本发明公开的用于诊断胃癌的标志物，包括DNAJC6基因的CpG岛，根据DNAJC6基因的CpG岛的甲基化状态，能够区分胃癌症样本和健康样本，在实现无创检测的同时，提高胃癌早期诊断的灵敏度和特异性。
具体实施方式
现详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，上述修改和变化旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
影像学筛查胃癌，比如计算机X射线断层造影(Computer tomography,CT)通常用于检查胃癌的发展及转移情况，但是胃癌患者在早期往往没有明显的临床症状，因此仅用影像学检查难以对其进行准确诊断。
电子纤维胃镜，其作为侵入性检查，严重依赖检验设备和内镜医师资源。随着胃癌早期表现的无特异性和多样化，以及各地医师经验技巧的不同，导致其漏诊率波动在8％-35％。对患者来说，胃镜检查过程痛苦，接受度低。
血清学检查，血清学检查癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA19-9、CA72-4)、胃蛋白酶原等肿瘤标志物的方法，检测灵敏度低、特异性差，因而其临床应用价值有限。
DNA甲基化是在不改变DNA碱基序列的情况下，通过改变DNA与转录因子的结合能力，从而抑制基因的转录活性，使基因的表达受到影响。DNA甲基化水平和模式的改变是肿瘤发生的一个重要原因。抑癌基因的高甲基化及癌基因的去甲基化导致的抑制和激活活性，在肿瘤的发生过程中起到重要作用。考虑到DNA的甲基化是癌症发生过程中的早期事件，因此，基因启动子区域DNA甲基化状态的检测可以作为胃癌早期诊断的生物学指标。
而传统的通过检测胃癌相关基因甲基化的方法，检测灵敏度仅60％左右，检测结果存在较多假阴性的情况。
为了提高胃癌早期诊断的效率和便捷性，本发明的第一方面提供了一种用于检测胃癌的标志物，包括DNAJC6基因的CpG岛。本发明根据DNAJC6基因的CpG岛的甲基化状态，能够区分胃癌症样本和健康样本，在实现无创检测的同时，提高胃癌早期诊断的灵敏度和特异性。
本文使用的术语“胃癌”(gastric cancer与stomach cancer具有相同的含义)是起源于胃黏膜上皮的癌症，可以发生在胃内壁，并且可以在胃的贲门、胃体、胃窦中。
本文使用的术语“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。
本文使用的术语“基因”是指编码产生氨基酸多肽链的DNA区段，它包括参与基因转录/翻译和转录/翻译调控的位于编码区和非编码区的序列，以及外显子和内含子序列。
本文使用的术语“标志物”或“生化标志物”指要用作分析患者实验样品的靶标分子的甲基化状态。这样的分子靶标的实例是核酸。
在本发明中，组织或癌症可以是来自哺乳动物并且是优选地来自人，虽然猴、猿、猫、狗、牛、马和兔也在本发明的范围内。
本发明所指“CpG岛”与一般理解相同，CpG是胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤的缩写，CpG岛是富含CpG二核苷酸的一些区域，长度为300-3000bp，GC含量大于50％，CpG岛主要位于基因的启动子和外显子区域，也可能位于其他区域如UTR和内含子区域等，在实际操作中，可采用软件、程序或手动方式，设置参数，寻找基因中的CpG岛。
一些实施方案中，DNAJC6基因的CpG岛包括DNA片段位于Chr1:65265564-65266204或其反向互补链的全长或部分区域。
一些实施方案中，DNAJC6基因的CpG岛选自以下至少一个区域的全长或部分区域：Chr1:65265544-65265710、Chr1:65265671-65265824、Chr1:65265775-65265919、Chr1:65265880-65266025、Chr1:65265988-65266140、Chr1:65266078-65266222、Chr1:65266220-65266081、Chr1:65266115-65265961、Chr1:65266023-65265880、Chr1:65265928-65265772、Chr1:65265825-65265672，以上区域均以GRCh38.p14为参考。
本发明的第二方面提供了检测上述生物标志物甲基化状态的试剂或试剂盒在制备胃癌诊断产品中的应用。
本文使用的术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
本文使用的术语“甲基化状态”指的是根据DNA片段的CpG岛中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数确定的状态，可以包括甲基化阳性和甲基化阴性的状态，代表定性的概念。举例来说，如果DNA序列CpG岛中CpG二核苷酸中的胞嘧啶发生甲基化的频率/比例/百分数超过一定阈值，则可将该DNA序列CpG岛的甲基化状态定为甲基化阳性，否则将该DNA序列CpG岛的甲基化状态定为甲基化阴性。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标DNA甲基化状态，如在一些情况下，可根据样本荧光定量PCR检测的Ct值进行比较，在一些情况下，可计算出样本中标记物的甲基化比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较，在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
本发明所指“CpG岛的甲基化状态”，指的是CpG岛内包含至少一个CpG二核苷酸位点的核酸序列的甲基化状态。对于DNAJC6基因CpG岛甲基化阳性的样本，可以诊断为胃癌患者样本，对于DNAJC6基因CpG岛甲基化阴性的样本，可以认为是健康人样本。
本发明的第三方面提供了一种核酸产品，包括用于检测上述生物标志物甲基化状态的检测引物对。
CpG岛的甲基化状态可以通过以下方法中至少一种进行检测：甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法等。检测上述标志物甲基化状态的试剂可以为通过上述至少一种检测方法检测甲基化状态所需的检测试剂，例如，引物组合物，或者引物和探针组合物等。
本文使用的术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此本发明分别设计甲基化和非甲基化序列的引物对，通过PCR的方法扩增目的片段，以保证当模板中甲基化序列的含量大于等于1％时，即可扩增得到甲基化产物，仅当模板为非甲基化序列时，扩增产物为非甲基化产物，从而将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。对于实时定量甲基化特异性PCR，加入甲基化引物，若Ct值满足要求(例如在组织样本中Ct≤38)，则表明目标序列是甲基化的。
如本文，术语“引物”指寡核苷酸，无论其是在经纯化的限制性消化物中天然存在或是合成产生的，寡核苷酸当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时(例如，存在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶和在合适的温度和pH下)，寡核苷酸能够作为合成的起始点而起作用。引物优选是单链的，以用于扩增的最大效率，但可选地也可以是双链的。如果是双链的，则在用于制备延伸产物前，首先将引物处理以分开其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物应足够长，以在诱导剂存在的情况下引发延伸产物的合成。引物的精确长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。例如，在一些实施方案中，引物范围为10-100或更多个核苷酸(例如10-300、15-250、15-200、15-150、15-100、15-90、20-80、20-70、20-60、20-50个核苷酸等)。
本发明的第三方面提供了一种用于胃癌诊断的核酸产品，包括用于检测上述生物标志物甲基化状态的检测引物对。
一些实施方案中，核酸产品包括用于检测DNAJC6基因CpG岛以下核酸区域Chr1:65265544-65265710、Chr1:65265671-65265824、Chr1:65265775-65265919、Chr1:65265880-65266025、Chr1:65265988-65266140、Chr1:65266078-65266222、Chr1:65266220-65266081、Chr1:65266115-65265961、Chr1:65266023-65265880、Chr1:65265928-65265772、Chr1:65265825-65265672中至少一个区域的全长或部分区域甲基化状态的检测引物对。
本发明的一种实现方式中，检测引物对包括以下引物对中的至少一组：
用于检测核酸区域Chr1:65265544-65265710的如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示的引物对；
用于检测核酸区域Chr1:65265671-65265824的如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.6所示的引物对或者SEQ ID NO.43～SEQ ID NO.44所示的引物对；
用于检测核酸区域Chr1:65265775-65265919的如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.10所示的引物对或者SEQ ID NO.46～SEQ ID NO.47所示的引物对；
用于检测核酸区域Chr1:65265880-65266025的如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.14所示的引物对或者SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.50所示的引物对；
用于检测核酸区域Chr1:65265988-65266140的如SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.18所示的引物对或者SEQ ID NO.52～SEQ ID NO.53所示的引物对；
用于检测核酸区域Chr1:65266078-65266222的如SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.22所示的引物对或者SEQ ID NO.55～SEQ ID NO.56所示的引物对；
用于检测核酸区域Chr1:65266220-65266081的如SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.26所示的引物对或者SEQ ID NO.58～SEQ ID NO.59所示的引物对；
用于检测核酸区域Chr1:65266115-65265961的如SEQ ID NO.27～SEQ ID NO.30所示的引物对或者SEQ ID NO.61～SEQ ID NO.62所示的引物对；
用于检测核酸区域Chr1:65266023-65265880的如SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.34所示的引物对或者SEQ ID NO.64～SEQ ID NO.65所示的引物对；
用于检测核酸区域Chr1:65265928-65265772的如SEQ ID NO.35～SEQ ID NO.38所示的引物对或者SEQ ID NO.67～SEQ ID NO.68所示的引物对；
用于检测核酸区域Chr1:65265825-65265672的如SEQ ID NO.39～SEQ ID NO.42所示的引物对或者SEQ ID NO.70～SEQ ID NO.71所示的引物对。
一些实施方案中，可以通过亚硫酸氢盐测序的方法评估DNAJC6基因CpG岛各区域的甲基化状态，具体地，通过DNAJC6基因CpG岛区域的甲基化引物对和非甲基化引物对来PCR扩增经亚硫酸氢盐处理的待测样本DNA，根据扩增产物的测序结果来评估待测样本中模板DNA的甲基化状态，然后来区分癌症样本和正常样本，进而用于胃癌的诊断。
例如，可以根据测序数据判断待测样本中DNAJC6基因CpG岛中的CpG位点是否发生甲基化，对于甲基化的CpG位点，可以根据CpG位点的甲基化程度分为完全甲基化位点和部分甲基化位点，完全甲基化位点是指测序数据中含该CpG位点的序列均发生甲基化，部分甲基化是指测序数据中含该CpG位点的序列部分发生甲基化，部分未发生甲基化。
进一步，若某一检测区域中95％以上的CpG位点均为甲基化位点，则认为该区域在此待测样本中为甲基化阳性，那么此样本为癌症阳性样本；否则认为该区域在此待测样本中为甲基化阴性，此样本为癌症阴性样本。
其中，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列的引物对用于对Chr1:65265671-65265823区域的甲基化基因片段进行特异性扩增，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8用于对Chr1:65265775-65265918区域的甲基化基因片段进行特异性扩增，SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12用于对Chr1:65265880-65266025区域的甲基化基因片段进行特异性扩增，SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16用于对Chr1:65265988-65266140区域的甲基化基因片段进行特异性扩增，SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20用于对Chr1:65266078-65266222区域的甲基化基因片段进行特异性扩增，SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24用于对Chr1:65266220-65266087区域的甲基化基因片段进行特异性扩增，SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28用于对Chr1:65266115-65265989区域的甲基化基因片段进行特异性扩增、SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32用于对Chr1:65266023-65265880区域的甲基化基因片段进行特异性扩增、SEQ ID NO.35和SEQ IDNO.36用于对Chr1:65265928-65265772区域的甲基化基因片段进行特异性扩增、SEQ IDNO.39和SEQ ID NO.40用于对Chr1:65265825-65265675区域的甲基化基因片段进行特异性扩增。
可以理解的是，各区域的甲基化基因片段是指各区域CpG位点发生甲基化后对应的DNA片段。
一些实施方案中，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6用于对Chr1:65265671-65265823区域的非甲基化基因片段进行特异性扩增、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10用于对Chr1:65265775-65265918区域的非甲基化基因片段进行特异性扩增、SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14用于对Chr1:65265880-65266025区域的非甲基化基因片段进行特异性扩增、SEQ IDNO.17和SEQ ID NO.18用于对Chr1:65265988-65266140区域的非甲基化基因片段进行特异性扩增、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22用于对Chr1:65266078-65266222区域的非甲基化基因片段进行特异性扩增、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26用于对Chr1:65266220-65266087区域的非甲基化基因片段进行特异性扩增、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30用于对Chr1:65266115-65265989区域的非甲基化基因片段进行特异性扩增、SEQ ID NO.33和SEQ IDNO.34用于对Chr1:65266023-65265880区域的非甲基化基因片段进行特异性扩增、SEQ IDNO.37和SEQ ID NO.38用于对Chr1:65265928-65265772区域的非甲基化基因片段进行特异性扩增、、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42用于对Chr1:65265825-65265675区域的非甲基化基因片段进行特异性扩增。
可以理解的是，各区域的非甲基化基因片段是指各区域CpG位点未发生甲基化对应的基因片段。
一些实施方案中，还可以通过实时荧光定量检测DNAJC6基因CpG岛的甲基化状态，因此，核酸产品还包括与检测引物对对应的检测探针，检测探针上连接有荧光基团和荧光淬灭基团，以实现通过实时荧光定量检测DNAJC6基因CpG岛的甲基化状态。
一些具体实施方案中，荧光报告基团可以是选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、NED和Texas Red中的一种，荧光淬灭基团可以是选自TAMRA、BHQ和MGB中的一种，以实现通过扩增曲线的Ct值确定DNAJC6基因CpG岛的甲基化状态。
例如，当某一检测区域在血浆样本上扩增曲线的Ct值≤某一阈值时，则认为此区域在该样本中为甲基化阳性，即为癌症阳性；若某一检测区域在样本上扩增曲线的Ct值>某一阈值时，则认为这一检测区域在该样本中为甲基化阴性，即为癌症阴性。
一些实施方案中，与SEQ ID NO.43～SEQ ID NO.44所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示；与SEQ ID NO.46～SEQ ID NO.47所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示；与SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.50所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示；与SEQ ID NO.52～SEQ ID NO.53所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示；与SEQ ID NO.55～SEQ IDNO.56所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.57所示；与SEQ ID NO.58～SEQ ID NO.59所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.60所示；与SEQID NO.61～SEQ ID NO.62所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.63所示；与SEQ ID NO.64～SEQ ID NO.65所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.66所示；与SEQ ID NO.67～SEQ ID NO.68所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.69所示；与SEQ ID NO.70～SEQ ID NO.71所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.72所示。
本发明的第四方面提供了一种胃癌诊断试剂盒，试剂盒包括上述核酸产品，以实现通过任何一种方法检测DNAJC6基因CpG岛的甲基化状态。
一些实施方案中，试剂盒还包括核酸提取试剂、核酸转化试剂、PCR反应试剂中的至少一种。核酸提取试剂用于获得样本的DNA模板。核酸转化试剂用于对提取的DNA模板进行转化，该试剂可以为亚硫酸氢盐。PCR反应试剂用于为PCR反应提供反应所需的酶、缓冲液及dNTP等。
一些具体实施方案中，核酸转化试剂包括亚硫酸氢盐，以用于将DNAJC6基因的CpG岛的未甲基化的CpG位点的CG序列转化成TG序列，而甲基化的CpG位点的CG序列则不发生改变，进一步通过检测亚硫酸氢盐转化后的待测样本DNA的甲基化状态来区分癌症样本和正常样本。
一些实施方案中，待测样本包括细胞系、活检组织、粪便、血浆、血液、全血、分离的血细胞样本中的至少一种。
需要说明的是，诊断的理想场景是这样的情形，其中单一事件或过程会造成各种疾病，例如，在感染性疾病中。在所有其它情况下，正确的诊断可能非常困难，尤其当疾病的病因学不能完全理解时，如在许多癌症类型的情况下。如熟练的技术人员将明白的，对于给定的多因子病，没有生化标志物的诊断是100％特异性且同100％灵敏度。相反地，可使用生化标志物(例如，DNAJC6基因的CpG岛的甲基化水平)来以某种可能性或预测值评估疾病的存在与否。因此，在常规的临床诊断中，通常综合考虑各种临床症状和生物学标志物来诊断、治疗和控制潜在的疾病。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1
本实施例通过分析DNAJC6 CpG岛基因区域1～11的甲基化状态验证胃癌组织样本、癌旁组织样本以及健康人白细胞样本的灵敏度和特异性。从组织样本以及白细胞样本中提取基因组DNA，经亚硫酸氢盐转化后，分别用相应的测序引物对扩增DNAJC6 CpG岛基因区域1～11，使用桑格尔测序分析DNAJC6 CpG岛基因区域1～11的甲基化状态，根据甲基化状态计算DNAJC6 CpG岛基因区域1～11检测胃癌组织样本、癌旁组织样本以及健康人白细胞样本的灵敏度和特异性。具体实验过程如下：
1.样本收集、处理
本实施例于武汉某医院收集30例胃癌患者的癌组织样本和对应的30例癌旁组织样本，30例胃癌样本的患者中有19例处于TNM分期的第Ⅲ期或第Ⅳ期，所有的样本均为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织样本。此外，还收集了30例健康人的血液样本，每人收集静脉血5～10mL。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2.DNA模板的提取
对于组织样本，使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(56404)提取DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。对于血液样本，使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作按照试剂盒说明书进行。此外，使用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)进行白细胞基因组DNA提取，具体操作见试剂盒说明书。
3.亚硫酸氢盐的转化
将提取好的样本基因组进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843)，具体实验操作参见试剂盒说明书。
4.PCR扩增及测序
对于DNAJC6 CpG岛基因区域1，Chr1:65265544-65265710，使用简并引物扩增模板DNA，简并引物序列具体见表1。按照表2配置PCR反应体系，PCR扩增程序见表3，在PCR扩增结束后，使用简并引物对扩增产物进行桑格尔测序，测序送公司进行，同时从5’端和3’端测序。
表1
表2
组分 用量(μL)
10×Taq buffer(Mg2+Free) 5
25mM Mg2+ 4
dNTP Mix(10mM each) 1
上游引物(10μM) 1
下游引物(10μM) 1
热启动Taq DNA 聚合酶 0.5
模板DNA 10
超纯水 补至50
表3
对于DNAJC6 CpG岛基因区域2～11，分别设计甲基化引物对和非甲基化引物对扩增相应的区域(引物序列见表4)，配置PCR反应体系(见表5)，PCR扩增程序同表3，在PCR扩增结束后，使用混合引物(包含甲基化引物对和非甲基化引物对)对扩增产物进行桑格尔测序(送测序公司)，同时从5’端和3’端测序。
表4
表5
组分 用量(μL)
10×Taq buffer(Mg2+Free) 5
25mM Mg2+ 4
dNTP Mix(10mM each) 1
甲基化上游引物(10μM) 1
甲基化下游引物(10μM) 1
非甲基化上游引物(10μM) 0.5
非甲基化下游引物(10μM) 0.5
热启动Taq DNA 聚合酶 0.5
模板DNA 10
超纯水 补至50
5.结果分析
根据测序峰图对每个样本各个扩增子中的CpG位点的甲基化情况进行分析。一个CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化情况分为两种，即非基化和甲基化，其中甲基化又分为完全甲基化和部分甲基化。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果为胸腺嘧啶，则其为非甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果仍然为胞嘧啶，则其为完全甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果既有胞嘧啶也有胸腺嘧啶(双峰)，则其为部分甲基化的。
如果一个扩增子中95％以上的CpG二核苷酸中胞嘧啶是甲基化的，则认为此样本在该基因区域是甲基化阳性的。计算各类样本中的甲基化阳性数目和甲基化阴性数目，并计算甲基化阳性和甲基化阴性的比例。灵敏度是指病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例。特异性是指病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。
首先，基因DNAJC6 CpG岛区域1～11在30例健康人白细胞样本中经PCR扩增及扩增产物测序分析均为甲基化阴性，即特异性达到100％。
然后，基因DNAJC6 CpG岛区域1～11在30例胃癌患者组织样本中的甲基化状态、灵敏度和特异性如表6所示。
表6
由表6可以看出，DNAJC6 CpG岛基因区域1～11检测胃癌患者癌组织样本和癌旁组织样本的效果良好。然而，DNAJC6 CpG岛基因区域1～11在组织样本中的检测效果并不相同。其中，DNAJC6 CpG岛基因区域1、3、5、6、7、9和10检测组织样本的灵敏度在60％～76％之间，其特异性均高于66％。值得注意的是，基因区域2、4、8和11检测组织样本的灵敏度都高于80％，其特异性都高于83％。以上结果表明相较于DNAJC6整个CpG岛(Chr1:65265564-65266204)来说，DNAJC6基因区域2、4、8和11检测组织样本的灵敏度和特异性都更高。
实施例2
本实施例于武汉某医院收集经组织活检确诊为胃癌患者的血浆样本及健康人血浆样本，每人收集5mL，共收集到胃癌患者血浆样本64例，健康人血浆样本53例。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
利用实施例1中提及的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取和重亚硫酸氢盐转化。随后，采用表1和表2中的引物对并按照实施例1中的方法对每个样本进行DNAJC6 CpG岛基因区域1-11的PCR扩增反应及桑格尔测序，分析测序结果，按照实施例1中的判断标准来判断每个样本在DNAJC6基因CpG岛各区域的甲基化情况，统计DNAJC6 CpG岛基因区域1～11检测胃癌患者和健康人血液样本的灵敏度和特异性，结果如表7所示。
表7
由表7可以看出，DNAJC6 CpG岛基因区域1～11检测胃癌患者和健康人血液样本的效果良好。然而，DNAJC6 CpG岛基因区域1～11在血液样本中的检测效果并不相同。其中，基因区域1、3、5、6、7、9和10检测组织样本的灵敏度在57％-73％之间，其特异性均高于73％。值得注意的是，区域2、4、8和11检测组织样本的灵敏度都高于81％，其特异性都高于84％。以上在血浆中的结果与在组织样本中的结果趋势一致，同样表明相较于DNAJC6整个CpG岛(Chr1:65265564-65266204)来说，DNAJC6 CpG岛的区域2、4、8和11检测血液样本的灵敏度和特异性都更高。
实施例3
通过测序的方法检测DNAJC6 CpG岛基因各区域的甲基化水平的方法操作繁琐、费时费力且严重依赖测序公司，为了提升该试剂盒在临床应用中的价值，本实施例还提供了基于甲基化荧光定量PCR检测受试者血液样本中DNAJC6 CpG岛基因各区域的甲基化状态的方法，可以根据Ct值来判断样本的甲基化状态，进而判断样本是否为癌症样本。
1.临床血液样本的收集、血液cfDNA的提取、转化和纯化同实施例2。
2.将各样本经亚硫酸氢盐转化后的DNA分别进行甲基化荧光定量PCR反应以检测各个样本中DNAJC6 CpG岛基因区域12～22的甲基化水平，每个基因区域单独进行检测，即一个PCR管中除加入必须的反应成分、模板以外，每次只加入一个基因区域的检测引物和探针，同时加入内参基因ACTB的检测引物和探针。检测目标区域的探针为Taqman探针，5’端的报告基团为FAM，3’端猝灭基团为MGB，ACTB探针5’端的报告基团为VIC，3’端猝灭基团为BHQ1。DNAJC6 CpG岛基因区域12～22及ACTB基因的上下游检测引物及探针序列如表8所示。采用Invitrogen Platinum II Taq热启动DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR反应液配置体系如表9所示，按照表10展示的扩增程序进行PCR扩增。利用表8中的引物对及对应的探针可以检测DNAJC6 CpG岛基因区域12～21的CpG位点如表11所示，各区域的序列如表12所示。
表8
表9
组分 规格 体积(μL)
Platinum II PCR缓冲液 5× 5
dNTPs 各2.5mM 3
DNAJC6区域上游引物 10μM 0.5
DNAJC6区域下游引物 10μM 0.5
DNAJC6区域探针 10μM 0.5
ACTB上游引物 10μM 0.5
ACTB下游引物 10μM 0.5
ACTB探针 10μM 0.5
Taq酶 / 0.5
待测样本DNA / 5
纯化水 / 补至25
表10
表11
表12
阴性对照和阳性对照：在对目的基因的不同区域分别进行检测时，阴性对照和阳性对照应进行同步检测。阴性对照为洗脱DNA所用的TE缓冲液。阳性对照的制备方法为：将ACTB的扩增区域对应的经亚硫酸氢盐完全转化后的序列进行人工合成，并克隆至载体上，形成人工合成质粒。将完全甲基化的DNAJC6基因区域12-21对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列进行人工合成，并分别克隆至载体，形成人工合成质粒。DNAJC6基因区域12-21的阳性对照为103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的区域12-21的人工合成质粒1:1混合而成，如区域12的阳性对照为103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的区域12的人工合成质粒1:1混合而成。
3.PCR结果分析：
1)Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。
2)质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照的Ct值应在26～30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
3)结果分析和判读方法：当某一检测区域在血浆样本上的Ct值≤45时，即认为在该样本在此区域被检出甲基化，即为癌症阳性；若某一检测区域在样本上的Ct值>45，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阴性，即为癌症阴性。
根据实施例2提供的方法进血浆样本DNA的提取、转化和纯化，随后按照实施例3提供的方法进行样本检测，即选用表8中针对DNAJC6 CpG岛基因区域12-21的检测引物对和探针组合进行甲基化定量PCR实验，根据得到的Ct值判断样本的阴阳性，DNAJC6 CpG岛基因区域12～21在血浆样本中的灵敏度和特异性结果如表11所示。
表11
由表11可以看出，DNAJC6 CpG岛基因区域12～21可以用来区分胃癌患者和健康人的血浆样本，且其检测血浆样本的效果各不相同。整体来看，DNAJC6 CpG岛基因区域12-21检测胃癌患者血浆样本的灵敏度都高于59％，其在健康人血浆样本中的特异性都高于77％。值得注意的是，DNAJC6 CpG岛基因区域12、14、18、21检测胃癌的灵敏度和特异性都显著高于其它区域，其检测灵敏度大于78％，其检测特异性大于86％，另外，DNAJC6 CpG岛基因区域14的检测效果最佳。
结合实施例1～3来看，DNAJC6 CpG岛基因区域12(Chr1:65265694-65265824)、14(65265898-65266024)、18(Chr1:65266094-65265961)、21(Chr1:65265807-65265672)，以及DNAJC6 CpG岛基因区域2(Chr1:65265671-65265823)、4(Chr1:65265880-65266025)、8(Chr1:65266115-65265989)、11(Chr1:65265825-65265675)均展示出最佳的诊断性能，更有利于胃癌的早期诊断。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 武汉艾米森生命科技有限公司
<120> 用于诊断或辅助诊断胃癌的生物标志物和试剂盒
<160> 96
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggatggggg aagagagaaa 20
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<212> DNA
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aaccaacaaa ccctaaaatt aaca 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
agggtttaaa aaaaccccaa ca 22
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gagtttaagg ggtaagcgtc g 21
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gaacccctac ttccgaaacg 20
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ttttgagttt aaggggtaag tgttg 25
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tcaaacccct acttccaaaa ca 22
<210> 35
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ataaaggggg gtcggcg 17
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tcttccttcc tattacgcta atcg 24
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
agaagaaagg ggggttggtg 20
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ggggtccttc ctattacact aatca 25
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
agcgtttttt ttgggtacgc 20
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ggggactcct taaatattct accg 24
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ggggtgtttt ttttgggtat gt 22
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ggggctcctt aaatattcta cca 23
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
agtagttggg ggaggagcg 19
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cgcccttcct aaacacgc 18
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tttcgatttc gtttttaggg ggagt 25
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ggtcgtgttt ttggttcgct 20
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ccgacgaatc ctaaaattaa cg 22
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tagcggagtc gcgtgttcgt tc 22
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
cgttaatttt agggttcgtc g 21
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
cgaacccaaa aaacaaccg 19
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
cgtagtagtt tgcgtttcga gtgcg 25
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gttttaagga ggtttcggcg 20
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
cctacgttat tacacgtctc accc 24
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
cgtagttcgt tgggtaggtt tcgcg 25
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ttgggtgaga cctgtaataa cg 22
<210> 56
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
caaaaacgat aactaactcc cg 22
<210> 57
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
cgcgtagcgt cgcggggt 18
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ttagagacgg tggttgattt tcc 23
<210> 59
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
aacgaccctc cccacgc 17
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
tggagaaggt taagtttcgc ggc 23
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggggagggt cgttgct 17
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
caacaatcta cgcttcgaat acc 23
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttgtttaac gggttgcgtg ttagt 25
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
gagtttaagg ggtaagcgtc g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaacccctac ttccgaaacg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaagcgtaga ttgttgcgta gcgg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgtttcggaa gtaggtgttc g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gctaatcgta ctcctaaccc gtg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggtacgcga tttcgttgcg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcgggttagg agtacgatta gc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaaactcctt aaatgttcta ccgc 24
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
tttggaaacg ggatcgggga a 21
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
aaggtggttg ggtggttgtt ttg 23
<210> 74
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
aataacaccc ccaccctgc 19
<210> 75
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
ggagtggttt ttgggtttg 19
<210> 76
<211> 167
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gggatggggg aagagagaaa cgaatttaaa taaaaactca aaaaaggaaa gggctaaccg 60
aaaaatgagc caaccaaatt ttaagttcaa caacaagcat tctggaggat tctggggttt 120
taaattcgga ggctccttaa atattctgcc gcagttgggg gaggagc 167
<210> 77
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
ggaggctcct taaatattct gccgcagttg ggggaggagc gatggacccc taggtctccg 60
gaggctacac gtgttccccg atcccgtttc cagggggagc ccttccttcc tattgcgctg 120
gtcgtgctcc tggcccgcgt gcccaggaag ggc 153
<210> 78
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
ccttcctatt gcgctggtcg tgctcctggc ccgcgtgccc aggaagggcg cagcggagtc 60
gcgtgcccgt ccgggcggag gacgccgtct ccgcgcggcg gtgccgggcc cctgcttccg 120
gaacgctaat tttagggttc gccg 144
<210> 79
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
gggcccctgc ttccggaacg ctaattttag ggttcgccgg cccccctttc ttttcacccg 60
ctttccgtgc gagccgctgc gcagcagtct gcgcttcgag tgcgctgtgt tttaaggagg 120
ccccggcgct tgccccttgg gctcgg 146
<210> 80
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
gttttaagga ggccccggcg cttgcccctt gggctcgggg gcttgggtgc gcaggtgggg 60
gctggcacgc agcccgttgg gcaggtttcg cgcagcgacc ctccccacgc cggagctaag 120
ttctttgggt gagacgtgca acaacgcagg ccc 153
<210> 81
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
cgcagcgacc ctccccacgc cggagctaag ttctttgggt gagacgtgca acaacgcagg 60
ccccaaagct ctctgcgcgc agcgccgcgg ggcttggcct tctccagtcc tcgggagtca 120
gccaccgtct ctggcttgtt atagg 145
<210> 82
<211> 134
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
tataacaagc cagagacggt ggctgactcc cgaggactgg agaaggccaa gccccgcggc 60
gctgcgcgca gagagctttg gggcctgcgt tgttgcacgt ctcacccaaa gaacttagct 120
ccggcgtggg gagg 134
<210> 83
<211> 127
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
ccaaagaact tagctccggc gtggggaggg tcgctgcgcg aaacctgccc aacgggctgc 60
gtgccagccc ccacctgcgc acccaagccc ccgagcccaa ggggcaagcg ccggggcctc 120
cttaaaa 127
<210> 84
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
gagcccaagg ggcaagcgcc ggggcctcct taaaacacag cgcactcgaa gcgcagactg 60
ctgcgcagcg gctcgcacgg aaagcgggtg aaaagaaagg ggggccggcg aaccctaaaa 120
ttagcgttcc ggaagcaggg gccc 144
<210> 85
<211> 157
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
aaaggggggc cggcgaaccc taaaattagc gttccggaag caggggcccg gcaccgccgc 60
gcggagacgg cgtcctccgc ccggacgggc acgcgactcc gctgcgccct tcctgggcac 120
gcgggccagg agcacgacca gcgcaatagg aaggaag 157
<210> 86
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
gcgcccttcc tgggcacgcg ggccaggagc acgaccagcg caataggaag gaagggctcc 60
ccctggaaac gggatcgggg aacacgtgta gcctccggag acctaggggt ccatcgctcc 120
tcccccaact gcggcagaat atttaaggag c 151
<210> 87
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
gcagttgggg gaggagcgat ggacccctag gtctccggag gctacacgtg ttccccgatc 60
ccgtttccag ggggagccct tccttcctat tgcgctggtc gtgctcctgg cccgcgtgcc 120
caggaagggc g 131
<210> 88
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
ggtcgtgctc ctggcccgcg tgcccaggaa gggcgcagcg gagtcgcgtg cccgtccggg 60
cggaggacgc cgtctccgcg cggcggtgcc gggcccctgc ttccggaacg ctaattttag 120
ggttcgccgg 130
<210> 89
<211> 127
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
cgctaatttt agggttcgcc ggcccccctt tcttttcacc cgctttccgt gcgagccgct 60
gcgcagcagt ctgcgcttcg agtgcgctgt gttttaagga ggccccggcg cttgcccctt 120
gggctcg 127
<210> 90
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
gttttaagga ggccccggcg cttgcccctt gggctcgggg gcttgggtgc gcaggtgggg 60
gctggcacgc agcccgttgg gcaggtttcg cgcagcgacc ctccccacgc cggagctaag 120
ttctttgggt gagacgtgca acaacgcagg 150
<210> 91
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
ttgggtgaga cgtgcaacaa cgcaggcccc aaagctctct gcgcgcagcg ccgcggggct 60
tggccttctc cagtcctcgg gagtcagcca ccgtctctg 99
<210> 92
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
ccagagacgg tggctgactc ccgaggactg gagaaggcca agccccgcgg cgctgcgcgc 60
agagagcttt ggggcctgcg ttgttgcacg tctcacccaa agaacttagc tccggcgtgg 120
ggagggtcgc t 131
<210> 93
<211> 134
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
tggggagggt cgctgcgcga aacctgccca acgggctgcg tgccagcccc cacctgcgca 60
cccaagcccc cgagcccaag gggcaagcgc cggggcctcc ttaaaacaca gcgcactcga 120
agcgcagact gctg 134
<210> 94
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
gagcccaagg ggcaagcgcc ggggcctcct taaaacacag cgcactcgaa gcgcagactg 60
ctgcgcagcg gctcgcacgg aaagcgggtg aaaagaaagg ggggccggcg aaccctaaaa 120
ttagcgttcc ggaagcaggg gccc 144
<210> 95
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
cgttccggaa gcaggggccc ggcaccgccg cgcggagacg gcgtcctccg cccggacggg 60
cacgcgactc cgctgcgccc ttcctgggca cgcgggccag gagcacgacc agc 113
<210> 96
<211> 136
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
cgggccagga gcacgaccag cgcaatagga aggaagggct ccccctggaa acgggatcgg 60
ggaacacgtg tagcctccgg agacctaggg gtccatcgct cctcccccaa ctgcggcaga 120
atatttaagg agcctc 136

Claims (11)

1.用于诊断或辅助诊断胃癌的生物标志物，其特征在于，包括DNAJC6基因的CpG岛。
2.根据权利要求1所述的生物标志物，所述DNAJC6基因的CpG岛包括DNA片段位于Chr1:65265564-65266204或其反向互补链的全长或部分区域。
3.根据权利要求2所述的生物标志物，所述DNAJC6基因的CpG岛选自以下至少一个区域的全长或部分区域：Chr1:65265544-65265710、Chr1:65265671-65265824、Chr1:65265775-65265919、Chr1:65265880-65266025、Chr1:65265988-65266140、Chr1:65266078-65266222、Chr1:65266220-65266081、Chr1:65266115-65265961、Chr1:65266023-65265880、Chr1:65265928-65265772、Chr1:65265825-65265672，以上区域均以GRCh38.p14为参考基因组。
4.检测如权利要求1～3任一项所述的生物标志物甲基化状态的试剂或试剂盒在制备胃癌诊断产品中的应用。
5.一种用于诊断胃癌的核酸产品，其特征在于，包括用于检测如权利要求1～3任一项所述的生物标志物甲基化状态的检测引物对。
6.根据权利要求5所述的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品包括用于检测DNAJC6基因CpG岛以下核酸区域Chr1:65265544-65265710、Chr1:65265671-65265824、Chr1:65265775-65265919、Chr1:65265880-65266025、Chr1:65265988-65266140、Chr1:65266078-65266222、Chr1:65266220-65266081、Chr1:65266115-65265961、Chr1:65266023-65265880、Chr1:65265928-65265772、Chr1:65265825-65265672中至少一个区域的全长或部分区域甲基化状态的检测引物对。
7.根据权利要求6所述的核酸产品，其特征在于，所述检测引物对包括以下引物对中的至少一组：用于检测核酸区域Chr1:65265544-65265710的如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示的引物对；用于检测核酸区域Chr1:65265671-65265824的如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.6所示的引物对或者SEQ ID NO.43～SEQ ID NO.44所示的引物对；用于检测核酸区域Chr1:65265775-65265919的如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.10所示的引物对或者SEQ ID NO.46～SEQ ID NO.47所示的引物对；用于检测核酸区域Chr1:65265880-65266025的如SEQ IDNO.11～SEQ ID NO.14所示的引物对或者SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.50所示的引物对；用于检测核酸区域Chr1:65265988-65266140的如SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.18所示的引物对或者SEQ ID NO.52～SEQ ID NO.53所示的引物对；用于检测核酸区域Chr1:65266078-65266222的如SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.22所示的引物对或者SEQ ID NO.55～SEQ IDNO.56所示的引物对；用于检测核酸区域Chr1:65266220-65266081的如SEQ ID NO.23～SEQID NO.26所示的引物对或者SEQ ID NO.58～SEQ ID NO.59所示的引物对；用于检测核酸区域Chr1:65266115-65265961的如SEQ ID NO.27～SEQ ID NO.30所示的引物对或者SEQ IDNO.61～SEQ ID NO.62所示的引物对；用于检测核酸区域Chr1:65266023-65265880的如SEQID NO.31～SEQ ID NO.34所示的引物对或者SEQ ID NO.64～SEQ ID NO.65所示的引物对；用于检测核酸区域Chr1:65265928-65265772的如SEQ ID NO.35～SEQ ID NO.38所示的引物对或者SEQ ID NO.67～SEQ ID NO.68所示的引物对；用于检测核酸区域Chr1:65265825-65265672的如SEQ ID NO.39～SEQ ID NO.42所示的引物对或者SEQ ID NO.70～SEQ IDNO.71所示的引物对。
8.根据权利要求7所述的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品包括与所述检测引物对对应的检测探针，检测探针上连接有荧光基团和荧光淬灭基团。
9.根据权利要求8所述的核酸产品，其特征在于，与SEQ ID NO.43～SEQ ID NO.44所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示；与SEQ ID NO.46～SEQ IDNO.47所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示；与SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.50所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示；与SEQID NO.52～SEQ ID NO.53所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示；与SEQ ID NO.55～SEQ ID NO.56所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.57所示；与SEQ ID NO.58～SEQ ID NO.59所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.60所示；与SEQ ID NO.61～SEQ ID NO.62所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.63所示；与SEQ ID NO.64～SEQ ID NO.65所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示；与SEQ ID NO.67～SEQ ID NO.68所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.69所示；与SEQ ID NO.70～SEQ ID NO.71所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.72所示。
10.一种胃癌诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求5～9任一项所述的核酸产品。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取试剂、核酸转化试剂、PCR反应试剂中的至少一种；
优选的，所述核酸转化试剂包括亚硫酸氢盐。
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