CN114941028B - 结直肠癌的检测和诊断的试剂及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种试剂及试剂盒，该试剂通过对MAP3K14‑AS1基因CpG岛区域的甲基化水平进行检测，实现结直肠癌的检测和诊断，具有较高的灵敏度和特异性；并且该试剂还可以用于癌前诊断，为结直肠癌的早期干预提供参考，显著降低结直肠癌的发病率；此外，该试剂在粪便和血液样本中均具有优异检测效果，适用于结直肠癌的无创辅助诊断，为结直肠癌的临床诊断治疗提供了一种新的思路。

Description

结直肠癌的检测和诊断的试剂及试剂盒
技术领域
本申请涉及生物医学技术领域，具体涉及一种结直肠癌的检测和诊断的试 剂及试剂盒。
背景技术
结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，主要包括结肠癌与直肠癌两大类。 结直肠癌通常是由良性的癌前息肉变化发展而来，这些息肉是局部生长或肠粘 膜内异常细胞的聚集突入肠腔。随着时间流逝，这些息肉中的分裂细胞可能积 累足够多的遗传变化，从而获得入侵肠壁的能力，这便是结直肠癌开始形成的 标志，最终它们可能会扩散到局部淋巴结和远处的转移部位。其中一小部分息 肉最终能演变成癌症，对于那些已经演变成癌症的，其发展过程也通常需要几 年甚至十年，因此早期检测可以早期进行干预，显著降低结直肠癌的发病率。
潜在的恶性息肉主要有两种类型：腺瘤和无柄锯齿状息肉，这两种类型发 展为结直肠癌的风险不同。其中60％–70％的结直肠癌从腺瘤发展而来。其余 的25％至35％的CRC从无蒂锯齿状息肉发育而来。因此，提高腺瘤的检出率 对于降低结直肠癌的发病率和死亡率极为重要，肠镜检测提高了高危人群中结 直肠癌的检出率，但患者接受度低、且操作不够灵活，近期分子生物学方面的 进展为开发简便、有效的早期诊断方法提供了新的方向，结直肠癌组织中存在 多基因、多位点的甲基化，并且在结直肠癌发生的早期即出现DNA甲基化的 改变。
结直肠肿瘤一般发生在结直肠上皮组织中，在其生长过程中，不断地有肿 瘤细胞脱落至肠腔内并随着粪便排出。成人每天都会有108以上的肠上皮细胞 从肠壁脱落，而肿瘤细胞由于增生异常更容易从肠道脱落，因此肠道肿瘤患者 的粪便中包含有大量的病变细胞和病变成分，检测粪便中的肿瘤细胞成分就可 以提供一种无创的辅助诊断结直肠肿瘤方法。另外，肿瘤细胞也会释放DNA 到血液中(cfDNA,circulating free DNA)，也可通过检测血液中的肿瘤DNA 对结直肠癌进行检测，但cfDNA具有含量少、半衰期短的特点，使其在提取 过程中容易丢失，因此检测难度巨大。
现有技术中公开的一些检测标记物对结直肠癌具有良好的检测效果，但对 结直肠癌前病变的检测灵敏度和特异性较差，另外，目前尚缺少在粪便和血液 中均具有优异检测效果的标记物。
发明内容
鉴于此，本申请提供一种灵敏度和特异性较高的结直肠癌的检测和诊断的 试剂及试剂盒。
第一方面，本申请提供一种用于结直肠癌的检测和诊断的试剂，所述试剂 包括：能够特异性检测DNA样本中靶核苷酸序列中的至少一个CpG二核苷酸位 点甲基化水平的检测试剂，所述靶核苷酸序列源自MAP3K14-AS1基因的CpG岛。
根据本发明所述的试剂，所述靶核苷酸序列源自MAP3K14-AS1基因CpG岛的全长或部分区域。
根据本发明所述的试剂，所述全长区域的DNA序列为SEQ ID No.43，所述 试剂包括：能特异性检测DNA样本中SEQ ID No.43所示序列中至少一个CpG二 核苷酸甲基化水平的试剂，和/或是能特异性检测DNA样本中与SEQ ID No.43 完全互补序列中至少一个CpG二核苷酸甲基化水平的试剂。
根据本发明所述的试剂，所述部分区域的DNA序列为SEQ ID No.44或与 SEQ IDNo.44完全互补的序列，所述试剂包括：能特异性检测DNA样本中SEQ ID No.44所示序列中至少一个CpG二核苷酸甲基化水平的试剂，或者是能特异 性检测DNA样本中与SEQ IDNo.44完全互补序列中至少一个CpG二核苷酸甲 基化水平的试剂。
根据本发明所述的试剂，所述部分区域的DNA序列为SEQ ID No.34以及 SEQ IDNo.42，所述试剂包括：
能特异性检测DNA样本中SEQ ID No.34所示序列中至少一个CpG二核苷 酸甲基化水平的试剂；或/和
能特异性检测DNA样本中SEQ ID No.42所示序列中至少一个CpG二核苷 酸甲基化水平的试剂。
根据本发明所述的试剂，所述部分区域的DNA序列为SEQ ID No.45或与 SEQ IDNo.45完全互补的序列，所述试剂包括：能特异性检测DNA样本中SEQ ID No.45所示序列中至少一个CpG二核苷酸甲基化水平的试剂，或者是能特异 性检测DNA样本中与SEQ IDNo.45完全互补序列中至少一个CpG二核苷酸甲 基化水平的试剂。
根据本发明所述的试剂，所述部分区域的DNA序列为SEQ ID No.35以及 SEQ IDNo.41，所述试剂包括：
能特异性检测DNA样本中SEQ ID No.35所示序列中至少一个CpG二核苷 酸甲基化水平的试剂；或/和
能特异性检测DNA样本中SEQ ID No.41所示序列中至少一个CpG二核苷 酸甲基化水平的试剂。
根据本发明所述的试剂，所述部分区域的DNA序列为SEQ ID No.36至SEQ IDNo.40，所述试剂包括：能特异性检测DNA样本中SEQ ID No.36至SEQ ID No.40中的至少一种所示序列中至少一个CpG二核苷酸甲基化水平的试剂。
根据本发明所述的试剂，所述试剂包括：
(a)反应试剂，能差异修饰所述DNA样本中的甲基化位点和非甲基化位 点；以及
(b)检测试剂，在用所述反应试剂处理DNA样本之后，所述检测试剂能 确定所述靶核苷酸中的特定CpG二核苷酸位点中的胞嘧啶的甲基化水平。
根据本发明所述的试剂，所述试剂包括：PCR试剂，所述PCR试剂包括能 特异性检测所述靶核苷酸的甲基化特异性引物对，和/或特异性探针。
根据本发明所述的试剂，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游 引物和下游引物分别包括如下引物对中的任一组：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；
SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11；
SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；
SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17；
SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；
SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23；
SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26。
根据本发明所述的试剂，所述特异性探针选自：
SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.24及SEQ ID NO.27中的 至少一种。
根据本发明所述的试剂，所述试剂还包括：重亚硫酸盐或其衍生物。
根据本发明所述的试剂，所述DNA样本来自哺乳动物的离体生物学样本， 所述哺乳动物的离体生物学样本来自血液、粪便或组织样本中的至少一种。
根据本发明所述的试剂，所述甲基化水平通过以下方法来获得：甲基化特 异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序 法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异 性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法中的至少 一种。
第二方面，本发明还涉及一种用于结直肠癌的检测和诊断的试剂盒，包括： 第一方面所述的试剂。
有益效果：
本申请提供了一种结直肠癌的检测和诊断的试剂及试剂盒，通过对 MAP3K14-AS1基因CpG岛区域的甲基化水平进行检测，实现结直肠癌的检测和 诊断，具有良好的灵敏度和特异性；并且该试剂还可以用于癌前诊断，从而可 以进行早期干预，进而降低结直肠癌的发病率；此外，该组合在粪便和血液样 本中仍具有优异检测效果，适用于结直肠癌的无创辅助诊断，为结直肠癌的临 床诊断治疗提供了一种新的思路。
具体实施方式
术语定义与说明：
术语“PCR”或“PCR扩增”是指聚合酶链反应。
术语“引物”是指够在PCR反应中充当DNA复制反应起始子的寡核苷酸 DNA。
术语“核苷酸”应当在本文中理解为除了指天然存在的核糖核苷酸或脱氧 核糖核苷酸之外，还指相对于正在使用的核苷酸的特定上下文(例如，杂交至 互补碱基)，在功能上等同的其相关的结构变体，包括衍生物和类似物。
本发明中，“DNA甲基化”是一种表观修饰，它是在不改变碱基序列的情况 下，对基因表达进行调控，所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用 下，在基因组CpG(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤)二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结 合一个甲基基团。在一个实施方案中，可以采用亚硫酸氢盐转化的方法来区分 甲基化和未甲基化的胞嘧啶(C)，亚硫酸氢盐转化过程包括变性、脱氨基和 脱磺酸基，通过变性过程，DNA双链变成两条单链，通过脱氨基和脱磺酸基 过程，未甲基化的胞嘧啶(C)被转化成尿嘧啶(U)，在后续的PCR过程中 进一步转变成胸腺嘧啶(T)，而甲基化的胞嘧啶(C)保持不变。经过以上 步骤，原本互补的两条DNA链(正义链和反义链)被转化成两条完全不互补 的两条DNA单链。
术语“甲基化水平”与一般理解相同，指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数， 既代表定性的概念，又代表定量的概念。举例来说，如果核酸序列内的胞嘧啶 (C)残基为甲基化的，则可将其称为“高甲基化的”或具有“增加的甲基化”。在实 际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平，如在 一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较，在一些情况下，可计算出样本 中标记物的甲基化比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数) ×100，然后再进行比较，在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的 分析整合，得出最终的判定指标。“CpG二核苷酸位点甲基化水平”指的是其 中胞嘧啶的甲基化水平。
术语“完全互补”是指核苷酸序列中的碱基一一对应反向互补。
术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床 状态，“辅助诊断”用于在患者临床状态确定或验证过程中提供各种信息辅助 判断，不作为唯一确定指标。
本发明人在经过大量并长期的实验后发现MAP3K14-AS1基因的CpG岛的 甲基化水平可以作为与结直肠癌检测和诊断的标志物，MAP3K14-AS1基因位 于人17号染色体的负义链上，具体位置为45247925-45268630bp(本发明中提 到的位点或区域的位置均是以GRCh38.p13为参考)，本发明发现， MAP3K14-AS1基因上CpG岛区域在结直肠癌/癌前病变中的甲基化水平显著高 于正常样本，检测其CpG岛区域甲基化的增加可以对结直肠癌或其癌前病变进 行诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性，可以有效地提高结直肠癌或其癌前病变的检出率。
因此，本发明提供了一种试剂，具体来说，所述试剂用于结直肠癌的检测 和诊断，所述试剂包括：能够特异性检测DNA样本中靶核苷酸序列中的至少 一个CpG二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂，所述靶核苷酸序列源自 MAP3K14-AS1基因的CpG岛。
在一些实施方案中，所述靶核苷酸序列源自MAP3K14-AS1基因CpG岛的全 长或部分区域。
在一些优选方案中，所述全长区域的DNA序列为SEQ ID No.43或与SEQ ID No.43完全互补的序列，所述试剂包括：能特异性检测DNA样本中SEQ ID No.43所示序列中至少一个CpG二核苷酸位点甲基化水平的试剂，和/或能特异 性检测DNA样本中与SEQ ID No.43完全互补序列中至少一个CpG二核苷酸位 点甲基化水平的试剂。
所述SEQ ID No.43为MAP3K14-AS1基因CpG岛的全长区域，具体位置为 Chr17：45261758-45262465。
在一些优选方案中，当所述部分区域的DNA序列为SEQ ID No.44或与SEQ IDNo.44完全互补的序列时，所述试剂具有更高的灵敏度和特异性，具体所述 试剂包括：能特异性检测DNA样本中SEQ ID No.44所示序列中至少一个CpG二 核苷酸位点甲基化水平的试剂，或者是能特异性检测DNA样本中与SEQ ID No.44完全互补序列中至少一个CpG二核苷酸位点甲基化水平的试剂。
所述SEQ ID No.44为MAP3K14-AS1基因CpG岛的部分区域，具体位置为 chr17:45261760-45261879。
在一些优选方案中，当所述部分区域的DNA序列为SEQ ID No.34以及SEQ IDNo.42时，所述试剂具有更高的灵敏度和特异性，具体所述试剂包括：
能特异性检测DNA样本中SEQ ID No.34所示序列中至少一个CpG二核苷 酸位点甲基化水平的试剂；或/和
能特异性检测DNA样本中SEQ ID No.42所示序列中至少一个CpG二核苷 酸位点甲基化水平的试剂。
其中，所述SEQ ID No.34为Chr17：45261773-45261870区域的正链上的核 苷酸序列，在一实施例中，所述至少一个CpG二核苷酸位点选自 Chr17:45261773-45261870区域正链上Chr17:45261795、Chr17:45261797、 Chr17:45261819、Chr17:45261851及Chr17:45261856位置上的胞嘧啶所在的CpG二核苷酸位点；
所述SEQ ID No.42为Chr17：45261760-45261879区域的负链上的核苷酸序 列，在一实施例中，所述至少一个CpG二核苷酸位点选自 Chr17:45261760-45261879区域负链上Chr17:45261876、Chr17:45261857、 Chr17:45261798、Chr17:45261796、Chr17:45261773、Chr17:45261767及 Chr17:45261761位置上的胞嘧啶所在的CpG二核苷酸位点。
在一些实施方案中，当所述部分区域的DNA序列为SEQ ID No.45或与SEQ IDNo.45完全互补的序列时，所述试剂具有更高的灵敏度和特异性，具体所述 试剂包括：能特异性检测DNA样本中SEQ ID No.45所示序列中至少一个CpG二核苷酸位点甲基化水平的试剂，或者是能特异性检测DNA样本中与SEQ ID No.45完全互补序列中至少一个CpG二核苷酸位点甲基化水平的试剂。
所述SEQ ID No.45为Chr17:45261903-45262090区域上的核苷酸序列。
在一些实施方案中，当所述部分区域的DNA序列为SEQ ID No.35以及SEQ IDNo.41时，所述试剂具有更高的灵敏度和特异性，具体所述试剂包括：
能特异性检测DNA样本中SEQ ID No.35所示序列中至少一个CpG二核苷 酸位点甲基化水平的试剂；或/和
能特异性检测DNA样本中SEQ ID No.41所示序列中至少一个CpG二核苷 酸位点甲基化水平的试剂。
其中，所述SEQ ID No.35为Chr17：45261903-45262040区域的正链上的核 苷酸序列，在一实施例中，所述至少一个CpG二核苷酸位点选自Chr17: 45261903-45262040区域正链上的Chr17:45261908、Chr17:45261920、 Chr17:45261977、Chr17:45261983、Chr17:45261987、Chr17:45261991及 Chr17:45262023位置上的胞嘧啶所在的CpG二核苷酸位点；
所述SEQ ID No.41为Chr17：45261942-45262090区域的负链上的核苷酸序 列，在一实施例中，所述至少一个CpG二核苷酸位点选自Chr17： 45261942-45262090区域负链上的Chr17:45262073、Chr17:45262024、Chr17: 45261962及Chr17:45261953位置上的胞嘧啶所在的CpG二核苷酸位点。
在一些实施方案中，当所述部分区域的DNA序列为SEQ ID No.36至SEQ ID No.40时，所述试剂具有更高的灵敏度和特异性，具体所述试剂包括：能特 异性检测DNA样本中SEQ ID No.36至SEQ ID No.40中的至少一种所示序列至 少一个CpG二核苷酸位点甲基化水平的试剂。
在一些实施方案中，所述试剂包括：
(a)反应试剂，能差异修饰所述DNA样本中的甲基化位点和非甲基化位 点；以及
(b)检测试剂，在用所述反应试剂处理DNA样本之后，所述检测试剂能 确定所述靶核苷酸的特定CpG(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤)二核苷酸位点中的胞嘧 啶的甲基化水平。
在一些实施方案中，所述试剂包括：PCR试剂，所述PCR试剂包括能特异 性扩增所述靶核苷酸中的至少一种序列的甲基化特异性PCR引物对，和/或特 异性探针。其中，本领域技术人员可以根据本领域已知的PCR引物对设计方法 /工具和探针设计方法/工具获得所述引物对和特异性探针。
在一些实施方案中，所述引物对包括如下引物对中的任一组：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；
SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11；
SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；
SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17；
SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；
SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23；和/或
SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26。
在一些实施方案中，所述特异性探针选自：
SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.24及SEQ ID NO.27中的 至少一种。
在一些实施方案中，所述试剂还包括：重亚硫酸盐或其衍生物。
在一些实施方案中，所述DNA样本来自哺乳动物的离体生物学样本，包 括人、非人类灵长动物。所述哺乳动物的离体生物学样本可以来自体液、血液、 血清、血浆、细胞、粘液、淋巴液、粪便和组织样本中的至少一种，优选的来 自血液和粪便和组织样本中的至少一种，当样本来自血液和粪便样本时，所述 试剂可适用于无创检测。
在一些实施方案中，所述甲基化水平通过以下方法来获得：甲基化特异性 PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、 焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高 分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法中的至少一 种。
本发明还涉及一种试剂盒，包括：以上实施例所述的试剂。该试剂盒用于 结直肠癌的检测和诊断，尤其适用于结直肠癌的癌前诊断或结直肠癌的辅助诊 断。
本申请还提供一种以上实施例所述试剂盒的使用方法，该方法包括：
(1)提取DNA样品；
(2)加入反应试剂，对所述DNA样品进行处理；
(3)加入检测试剂，进行PCR扩增反应，检测所述DNA样品中靶核苷酸 序列中CpG二核苷酸位点是否发生甲基化反应。所述靶核苷酸序列源自 MAP3K4-AS1 CpG岛的全长或部分区域。具体的，所述反应试剂能差异修饰 所述DNA样本中的甲基化位点和非甲基化位点，所述检测试剂能通过甲基化 检测方法确定所述靶核苷酸的特定CpG二核苷酸位点中的胞嘧啶的甲基化水 平。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整 地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实 施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下 所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。下列实施例中未注明具 体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手 册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照 制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请 的内容。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以 通过本领域已知方法制备。
实施例1
本实施例提供了一种试剂，可用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断。
该试剂包括PCR试剂1，该PCR试剂1包括：SEQ ID NO.1所示的上游引物、 SEQ IDNO.2所示的下游引物以及SEQ ID NO.3所示的探针，其中，SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.3所示的具体核苷酸序列见表1。
该PCR试剂可检测MAP3K14-AS1基因上Chr17:45261773-45261870区域 (即：区域1)正链的甲基化；具体可检测位于该区域1正链上Chr17:45261795、 Chr17:45261797、Chr17:45261819、Chr17:45261851和Chr17:45261856位置上 胞嘧啶的甲基化。
其中，区域1正链核苷酸序列为SEQ ID NO.34，具体如下(5’-3’)：
GTGAGAGCACATGGGTGTGCACCGCGCAGGGGCTGAGGCTGGGAG CCGTAGTCAGGGGCACCGGGTGGGCTTTGGCGGCGGGTCGACCTGCCTT TCAG。
实施例2
本实施例提供了一种试剂，可用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断。
该试剂包括PCR试剂2，该PCR试剂2包括：SEQ ID NO.4所示的上游引物、 SEQ IDNO.5所示的下游引物以及SEQ ID NO.6所示的探针，其中，SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.6所示的具体核苷酸序列见表1。
该PCR试剂2可检测MAP3K14-AS1基因上Chr17:45261903-45262040区域 (即：区域2)正链的甲基化；具体可检测位于该区域2正链上Chr17:45261908、 Chr17:45261920、Chr17:45261977、Chr17:45261983、Chr17:45261987、 Chr17:45261991和Chr17:45262023位置上胞嘧啶的甲基化。
其中，区域2正链核苷酸序列为SEQ ID NO.35，具体如下(5’-3’)：
CTGGGCGGATTCCTGACCGCCCCCTTCGCGCCCCTCCCCCTCTCACT TTCGCTTTCCCCGCCTGCCCCAACCCTCGCCCCCGGGCGCTCGGCCGCTC CCACCTGTCACCCCCATGCAGACCGAGGCTCTGTCCTGGAG。
实施例3
本实施例提供了一种试剂，可用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断。
该试剂包括PCR试剂3，该PCR试剂3包括：SEQ ID NO.7所示的上游引物、 SEQ IDNO.8所示的下游引物以及SEQ ID NO.9所示的探针，其中，SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.9所示的具体核苷酸序列见表1。
该PCR试剂3可检测MAP3K14-AS1基因上Chr17:45262093-45262183区域 (即：区域3)正链的甲基化；具体可检测位于该区域3正链上Chr17:45262109、 Chr17:45262127、Chr17:45262130、Chr17:45262145、Chr17:45262159、 Chr17:45262165、Chr17:45262168和Chr17:45262170位置上胞嘧啶的甲基化。
其中，区域3正链核苷酸序列SEQ ID NO.36，具体如下(5’-3’)：
CTGAGGGACTGGTGGGCGCTGGAAATATTAGAGGCGCCGGTGCCTG TGATGTCGCCGCCTCTGTGACGTCCCCGCCGCGACCCCACAGGCA。
实施例4
本实施例提供了一种试剂，可用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断。
该试剂包括PCR试剂4，该PCR试剂4包括：SEQ ID NO.10所示的上游引物、 SEQ IDNO.11所示的下游引物以及SEQ ID NO.12所示的探针，其中，SEQ ID NO.10至SEQ ID NO.12所示的具体核苷酸序列见表1。
该PCR试剂4可检测MAP3K14-AS1基因上Chr17:45262229-45262331(即： 区域4)正链的甲基化；具体可检测位于该区域4正链上Chr17:45262236、 Chr17:45262243、Chr17:45262290、Chr17:45262303、Chr17:45262311、Chr17: 45262316和Chr17:45262327位置上胞嘧啶的甲基化。
其中，区域4正链核苷酸序列为SEQ ID NO.37，具体如下(5’-3’)：
AGTGAGGCGTCCTCCGAAGGCTGCGGGCCCGAAGCCAGAACTCCT TCCTCTCCGAAGACCTCGGGGGTGGGGCTCGCGCTTCCGCAGCGGGCCT AGAGCGAGA。
实施例5
本实施例提供了一种试剂，可用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断。
该试剂包括PCR试剂5，该PCR试剂5包括：SEQ ID NO.13所示的上游引物、 SEQ IDNO.14所示的下游引物以及SEQ ID NO.15所示的探针，其中，SEQ ID NO.13至SEQ ID NO.15所示的具体核苷酸序列见表1。
该PCR试剂5可检测MAP3K14-AS1基因上Chr17:45262320-45262465(即： 区域5)正链的甲基化；具体可检测位于该区域5正链上Chr17:45262327、 Chr17:45262338、Chr17:45262377、Chr17:45262386、Chr17:45262392、 Chr17:45262441、Chr17:45262460、Chr17:45262462和Chr17:45262464位置上胞 嘧啶的甲基化。
其中，区域5正链核苷酸序列为SEQ ID NO.38，具体如下(5’-3’)：
CCTAGAGCGAGAGGCAGGCGGCAGGTAAGCCTGGCTGTGCTGGAC AGGACTTGCACCCGCTCTGCACGCCAGCGGCTCAGGGCTGCCGCCCTTT TCGTGGTCCCAGGGCCCTTCCAAGAACCGGCTAAACCAACCCAAGCCGCGCG。
实施例6
本实施例提供了一种试剂，可用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断。
该试剂包括PCR试剂6，该PCR试剂6包括：SEQ ID NO.16所示的上游引物、 SEQ IDNO.17所示的下游引物以及SEQ ID NO.18所示的探针，其中，SEQ ID NO.16至SEQ ID NO.18所示的具体核苷酸序列见表1。
该PCR试剂6可检测MAP3K14-AS1基因上Chr17:45262458-45262365(即： 区域6)负链的甲基化；具体可检测位于该区域负链上Chr17:45262442、 Chr17:45262416、Chr17:45262387和Chr17:45262378位置上胞嘧啶的甲基化。
其中，区域6负链核苷酸序列为SEQ ID NO.39，具体如下(5’-3’)：
CTTGGGTTGGTTTAGCCGGTTCTTGGAAGGGCCCTGGGACCACGAA AAGGGCGGCAGCCCTGAGCCGCTGGCGTGCAGAGCGGGTGCAAGTCCT 。
实施例7
本实施例提供了一种试剂，可用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断。
该试剂包括PCR试剂7，该PCR试剂7包括：SEQ ID NO.19所示的上游引物、 SEQ IDNO.20所示的下游引物以及SEQ ID NO.21所示的探针，其中，SEQ ID NO.19至SEQ ID NO.21所示的具体核苷酸序列见表1。
该PCR试剂7可检测MAP3K14-AS1基因上Chr17:45262332-45262229(即： 区域7)负链的甲基化；具体可检测位于该区域7负链上Chr17:45262328、 Chr17:45262317、Chr17:45262312、Chr17:45262291、Chr17:45262282、 Chr17:45262253、Chr17:45262244和Chr17:45262237位置上胞嘧啶的甲基化。
其中，区域7负链核苷酸序列为SEQ ID NO.40，具体如下(5’-3’)：
CTCTCGCTCTAGGCCCGCTGCGGAAGCGCGAGCCCCACCCCCGAGG TCTTCGGAGAGGAAGGAGTTCTGGCTTCGGGCCCGCAGCCTTCGGAGGA CGCCTCACT。
实施例8
本实施例提供了一种试剂，可用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断。
该试剂盒包括PCR试剂8，该PCR试剂8包括：SEQ ID NO.22所示的上游引 物、SEQID NO.23所示的下游引物以及SEQ ID NO.24所示的探针，其中，SEQ ID NO.22至SEQ IDNO.24所示的具体核苷酸序列见表1。
该PCR试剂8可检测MAP3K14-AS1基因上Chr17:45262090-45261942(即： 区域8)负链的甲基化；具体可检测位于该区域负链上Chr17:45262073、Chr17: 45262024、Chr17:45261962和Chr17:45261953位置上胞嘧啶的甲基化。
其中，区域8负链核苷酸序列SEQ ID NO.41，具体如下(5’-3’)：
AAAGAGCACACTGGAGGCGGAGAGGCAGCATCCACCAGCCCGCTC CCCGCCTCCAGGACAGAGCCTCGGTCTGCATGGGGGTGACAGGTGGGA GCGGCCGAGCGCCCGGGGGCGAGGGTTGGGGCAGGCGGGGAAAGCGAAAGTGAGAG。
实施例9
本实施例提供了一种试剂，可用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断。
该试剂包括PCR试剂9，该PCR试剂9包括：SEQ ID NO.25所示的上游引物、 SEQ IDNO.26所示的下游引物以及SEQ ID NO.27所示的探针，其中，SEQ ID NO.25至SEQ ID NO.27所示的具体核苷酸序列见表1。
该PCR试剂9可检测MAP3K14-AS1基因上Chr17:45261879-45261760(区域 9)负链的甲基化；具体可检测位于该区域负链上Chr17:45261876、 Chr17:45261857、Chr17:45261798、Chr17:45261796、Chr17:45261773、 Chr17:45261767和Chr17:45261761位置上胞嘧啶的甲基化。
区域9负链核苷酸序列为SEQ ID NO.42，具体如下(5’-3’)：
CCCCGGCACCTGAAAGGCAGGTCGACCCGCCGCCAAAGCCCACCC GGTGCCCCTGACTACGGCTCCCAGCCTCAGCCCCTGCGCGGTGCACACC CATGTGCTCTCACGGACACGCATGCG。
表1.实施例1至实施例9中涉及的引物和探针
Figure BDA0003166786020000141
Figure BDA0003166786020000151
/>
实施例10
使用实施例1至实施例9的试剂进行结直肠癌或腺瘤癌检测，其包括如下步 骤：
(1)DNA模板的提取
当所用样本是粪便样本时，采用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试 剂盒(鄂汉械备20200225号)提取粪便中的人源MAP3K14-AS1基因，该试剂 盒采用捕获探针对粪便中的目的片段进行捕获，捕获探针上标记有生物素，将 10μM的不同区域的探针和10mg/mL的链霉亲和素磁珠等比混合，形成捕获 剂。正链区域和负链区域分开进行捕获提取，即提取正链基因组时加入正链捕 获探针，提取负链区域时加入负链捕获探针，使用时用表2中的捕获探针与链 霉亲和素混合形成的捕获剂替代试剂盒中自带的捕获剂即可。正链和负链的捕 获探针序列参见表2，具体操作步骤参见试剂盒说明书。
表2.实施例10中涉及的正链和负链的捕获探针
Figure BDA0003166786020000161
当所用样本是血液样本，采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血 清/血浆游离DNA提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作参见 试剂盒说明书。
(2)亚硫酸盐的转化
将提取好的基因组进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米 森生命科技有限公司核酸纯化试剂(鄂汉械备20500843)，具体实验操作参见 试剂盒说明书。
(3)甲基化特异性PCR反应
将亚硫酸氢盐转化后的DNA进行甲基化特异性PCR反应以检测 MAP3K14-AS1基因区域1至区域9的甲基化状态，每个区域单独进行检测，即 一个PCR管中每次只加入一个区域的检测引物和探针，同时加入内参基因的检 测探针。以ACTB作为内参基因，PCR反应体系如表3所示。ACTB作为内参基 因，其中ACTB上游引物为：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ IDNO.46)；ACTB下游引物为：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.47)； ACTB探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ ID NO.48)。
检测目标区域的探针为Taqman探针，5’端的报告基团为FAM，3’端猝灭基 团为MGB，ACTB探针5’端的报告基团为VIC，3’端猝灭基团为BHQ1。
表3.实施例10中涉及的PCR反应体系中各组分配方成分表
Figure BDA0003166786020000171
如表3所示，在检测MAP3K14-AS1区域1至区域9任一区域在样本中的甲 基化状态时，只需将某一区域对应的引物探针、ACTB的引物探针、缓冲液、 dNTP、DNA聚合酶和样本DNA等按照表中的体积加入到反应体系中。对于粪 便样本，检测区域1至区域5时，加入的待测样本DNA是前述提取到的正链DNA 经转化而成，检测区域6至区域9时，加入的待检样本DNA是前述提取到的负 链DNA经转化而成；对于血液样本，检测区域1至区域9时，加入的待检样本 DNA是提取到的cfDNA经转化而成。
表4
Figure BDA0003166786020000172
Figure BDA0003166786020000181
质量控制：在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测。
阴性对照为纯化水。
阳性对照的制备方法为：将ACTB的扩增区域对应的经亚硫酸氢盐转化后 的序列进行人工合成，并克隆至载体上，形成人工合成质粒。将完全甲基化的 区域1-9对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列进行人工合成，并克隆至载体，形 成人工合成质粒。区域1-9的阳性对照为103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和 103拷贝/微升的区域1-9的人工合成质粒1：1混合而成，如区域1的阳性对照为 103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的区域1的人工合成质粒1： 1混合而成。
阴性对照要无扩增，阳性对照中ACTB和目标区域的Ct值均应在26-30之 间，待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满 足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当 次实验无效，须重新进行检测。
Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2 个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到 样本各个基因的Ct值。
结果分析和判读方法：若某一检测区域在样本上的Ct值≤38，则认为该样 本在这一检测区域为甲基化阳性，若某一检测区域在样本上的Ct值>38，则认 为该样本在这一检测区域为甲基化阴性。将样本的甲基化检测结果同病理结果 进行对比，计算甲基化检测的灵敏度和特异性：
灵敏度(Sensitivity)＝真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)*100％；
特异性(Specificity)＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)*100％。
在本实施例中，灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例，特 异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。
实验例1
为了验证本发明实施例提供的结直肠癌的检测和诊断的试剂检测粪便样 本的有效性，本发明还提供了实验例1：
于武汉某医院收集经肠镜和组织活检确诊为结直肠癌患者、腺瘤患者和健 康人的粪便样本，每人收集一份粪便，收集装置为武汉艾米森粪便标本采集保 存管(鄂汉械备20191654号)，共收集到结直肠癌患者粪便样本78例、结直肠 腺瘤患者粪便样本104例、健康人的粪便样本127例。按照实施例10提供的方法 进行DNA提取提取和重亚硫酸盐转化，选用实施例1至实施例9中的针对 MAP3K14-AS1基于9个区域的甲基化特异性引物和探针组合进行PCR检测， PCR检测结果如表5所示。
表5实施例1至实施例9在粪便样本中的检测灵敏度和特异性
Figure BDA0003166786020000191
由表5可以看出，在结直肠腺瘤患者的粪便样本中，实施例1至实施例9的 灵敏度均大于48％，在结直肠癌患者的粪便样本中，实施例1至实施例9的灵敏 度均大于71％，且实施例1至实施例9的特异性均大于93％，说明实施例1至实 施例9对结直肠癌、结直肠腺瘤均具有较优的检测灵敏度和特异性。
此外，实施例1、实施例2、实施例8和实施例9对结直肠腺瘤患者的粪便样 本的检测灵敏度均超过70％，对结直肠癌患者的粪便样本的检测灵敏度均超过 90％，且特异性均大于95％，说明实施例1、实施例2、实施例8和实施例9对结 直肠癌、结直肠腺瘤的检测灵敏度和特异性更加优异于其他区域。
实验例2
为了验证本发明实施例提供的结直肠癌的检测和诊断的试剂检测粪便样 本的有效性，本发明还提供了实验例2，与实验例1不同的是，实验例2采用的 是血浆样本：
于武汉某医院收集经肠镜和组织活检确诊为结直肠癌患者、腺瘤患者和健 康人的血浆样本，每人收集5mL，共收集到结直肠癌患者的血浆样本108例、 结直肠腺瘤患者的血浆样本130例、健康人的血浆样本90例。按照实施例10提 供的方法进行血浆DNA提取和重亚硫酸盐转化、选用实施例1至实施例9中的 针对MAP3K14-AS1基于9个区域的特异性引物和探针组合进行PCR检测，PCR 检测结果如表6所示。
表6实施例1至实施例9在血浆样本中的检测灵敏度和特异性
Figure BDA0003166786020000201
由表6可以看出，在结直肠腺瘤患者的血浆样本中，实施例1至实施例9的 灵敏度均大于41％，在结直肠癌患者的血浆样本中，实施例1至实施例9的灵敏 度均大于72％，且实施例1至实施例9的特异性均大于93％，说明实施例1至实 施例9对结直肠癌、结直肠腺瘤均具有较优的灵敏度和特异性。
此外，实施例1、实施例2、实施例8和实施例9对结直肠腺瘤患者的血浆样 本的检测灵敏度均超过69％，对结直肠癌患者的血浆样本的检测灵敏度均超过 85％，且特异性均大于95％，说明实施例1、实施例2、实施例8和实施例9对结 直肠癌、结直肠腺瘤的检测灵敏度和特异性更加优异于其他区域。
综上，无论是采用粪便样本还是血液样本，实施例1-实施例9的试剂在结 直肠癌、结直肠腺瘤患者检测诊断中，均有良好的灵敏度和特异性，这说明将 MAP3K14-AS1基因作为目标基因，检测MAP3K14-AS1基因CpG岛区域的甲基 化水平，用于实现结直肠癌的检测和诊断，具有较高的灵敏度和特异性；并且 该试剂还可以用于癌前诊断，为结直肠癌的早期干预提供参考；进一步的，本 发明的发明人还发现，MAP3K14-AS1基因上的特定CpG岛区域(即：SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42)上的CpG岛区域在结 直肠癌/癌前病变中的甲基化水平显著高于其他区域，并经实验验证以这些区 域上的基因作为靶核苷酸具有更优的灵敏度和特异性。这说明将这些区域上的 基因作为靶核苷酸，检测这些基因中CpG二核苷酸位点是否发生甲基化，用于 实现结直肠癌的检测和诊断，以及结直肠癌的癌前检测和诊断具有更高的灵敏 度和特异性。由于这些特定区域的干扰更少，因此本申请以这些特异性的关键 CpG岛作为靶序列进行检测，可进一步提高检测的灵敏度和特异性；此外，本 发明所提供的试剂，尤其是以MAP3K14-AS1基因上的特定区域作为靶核苷酸 检测的试剂，因为具有较优的灵敏度和特异性，因此可应用于粪便和血液样本 中，如此可简化取样环节，减小取样创伤，提高检测试剂的普及性，为结直肠 癌的无创检测以及早期筛查提供了一种新的思路。
以上对本发明所提供的一种结直肠癌的检测和诊断的试剂及试剂盒进行 了详细介绍。本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述， 以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的技术方案及其核心思想；本领域 的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行 修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使 相应技术方案的本质脱离本申请实施例的技术方案的范围。
序列表
<110> 武汉艾米森生命科技有限公司
<120> 结直肠癌的检测和诊断的试剂及试剂盒
<141> 2021-07-14
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gtgagagtat atgggtgtgt atcgc 25
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ctaaaaaaca aatcgacccg c 21
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aggggttgag gttgggagtc gtagt 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ttgggcggat ttttgatcgt 20
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ctccaaaaca aaacctcgat ctaca 25
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ttaattttcg ttttcgggcg ttcg 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ttgagggatt ggtgggcgtt 20
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
tacctataaa atcgcgacga aaacg 25
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
aggcgtcggt gtttgtgatg tcg 23
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
agtgaggcgt ttttcgaagg tt 22
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tctcgctcta aacccgctac g 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
aagatttcgg gggtggggtt c 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
tttagagcga gaggtaggcg g 21
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
cgcgcgactt aaattaattt aaccg 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
ttgtattcgt tttgtacgtt agcgg 25
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
tttgggttgg tttagtcgg 19
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
aaaacttaca cccgctctac acg 23
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
ttttggaagg gttttgggat tacg 24
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
ttttcgtttt aggttcgttg cg 22
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
aataaaacgt cctccgaaaa ctacg 25
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
tttattttcg aggttttcgg agagg 25
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
aaagagtata ttggaggcgg agag 24
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
ctctcacttt cgctttcccc g 21
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
aggatagagt ttcggtttgt atggg 25
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
tttcggtatt tgaaaggtag gtcg 24
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
cgcatacgta tccgtaaaaa cac 23
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
ttagttttag tttttgcgcg gtg 23
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
gcacacccat gtgctctcac ggacacgca 29
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
gacatcacag gcaccggcgc ctctaatatt 30
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
aagtcctgtc cagcacagcc aggcttacct 30
<210> 31
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
ccttccaaga accggctaaa ccaacccaa 29
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
tgagggactg gtgggcgctg gaaatatta 29
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
tttggcggcg ggtcgacctg cctttcaggt 30
<210> 34
<211> 98
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 34
gtgagagcac atgggtgtgc accgcgcagg ggctgaggct gggagccgta gtcaggggca 60
ccgggtgggc tttggcggcg ggtcgacctg cctttcag 98
<210> 35
<211> 138
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 35
ctgggcggat tcctgaccgc ccccttcgcg cccctccccc tctcactttc gctttccccg 60
cctgccccaa ccctcgcccc cgggcgctcg gccgctccca cctgtcaccc ccatgcagac 120
cgaggctctg tcctggag 138
<210> 36
<211> 91
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 36
ctgagggact ggtgggcgct ggaaatatta gaggcgccgg tgcctgtgat gtcgccgcct 60
ctgtgacgtc cccgccgcga ccccacaggc a 91
<210> 37
<211> 103
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 37
agtgaggcgt cctccgaagg ctgcgggccc gaagccagaa ctccttcctc tccgaagacc 60
tcgggggtgg ggctcgcgct tccgcagcgg gcctagagcg aga 103
<210> 38
<211> 146
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 38
cctagagcga gaggcaggcg gcaggtaagc ctggctgtgc tggacaggac ttgcacccgc 60
tctgcacgcc agcggctcag ggctgccgcc cttttcgtgg tcccagggcc cttccaagaa 120
ccggctaaac caacccaagc cgcgcg 146
<210> 39
<211> 94
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 39
cttgggttgg tttagccggt tcttggaagg gccctgggac cacgaaaagg gcggcagccc 60
tgagccgctg gcgtgcagag cgggtgcaag tcct 94
<210> 40
<211> 104
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 40
ctctcgctct aggcccgctg cggaagcgcg agccccaccc ccgaggtctt cggagaggaa 60
ggagttctgg cttcgggccc gcagccttcg gaggacgcct cact 104
<210> 41
<211> 149
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 41
aaagagcaca ctggaggcgg agaggcagca tccaccagcc cgctccccgc ctccaggaca 60
gagcctcggt ctgcatgggg gtgacaggtg ggagcggccg agcgcccggg ggcgagggtt 120
ggggcaggcg gggaaagcga aagtgagag 149
<210> 42
<211> 120
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 42
ccccggcacc tgaaaggcag gtcgacccgc cgccaaagcc cacccggtgc ccctgactac 60
ggctcccagc ctcagcccct gcgcggtgca cacccatgtg ctctcacgga cacgcatgcg 120
<210> 43
<211> 708
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 43
cgcgcatgcg tgtccgtgag agcacatggg tgtgcaccgc gcaggggctg aggctgggag 60
ccgtagtcag gggcaccggg tgggctttgg cggcgggtcg acctgccttt caggtgccgg 120
gggtttggga gcaggggaac gggccctggg cggattcctg accgccccct tcgcgcccct 180
ccccctctca ctttcgcttt ccccgcctgc cccaaccctc gcccccgggc gctcggccgc 240
tcccacctgt cacccccatg cagaccgagg ctctgtcctg gaggcgggga gcgggctggt 300
ggatgctgcc tctccgcctc cagtgtgctc tttggctgag ggactggtgg gcgctggaaa 360
tattagaggc gccggtgcct gtgatgtcgc cgcctctgtg acgtccccgc cgcgacccca 420
caggcaggga gccgcattta ggtttcgggc gggcggacgg gggacggccc gagtgaggcg 480
tcctccgaag gctgcgggcc cgaagccaga actccttcct ctccgaagac ctcgggggtg 540
gggctcgcgc ttccgcagcg ggcctagagc gagaggcagg cggcaggtaa gcctggctgt 600
gctggacagg acttgcaccc gctctgcacg ccagcggctc agggctgccg cccttttcgt 660
ggtcccaggg cccttccaag aaccggctaa accaacccaa gccgcgcg 708
<210> 44
<211> 120
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 44
cgcatgcgtg tccgtgagag cacatgggtg tgcaccgcgc aggggctgag gctgggagcc 60
gtagtcaggg gcaccgggtg ggctttggcg gcgggtcgac ctgcctttca ggtgccgggg 120
<210> 45
<211> 188
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 45
ctgggcggat tcctgaccgc ccccttcgcg cccctccccc tctcactttc gctttccccg 60
cctgccccaa ccctcgcccc cgggcgctcg gccgctccca cctgtcaccc ccatgcagac 120
cgaggctctg tcctggaggc ggggagcggg ctggtggatg ctgcctctcc gcctccagtg 180
tgctcttt 188
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 46
aaggtggttg ggtggttgtt ttg 23
<210> 47
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 47
aataacaccc ccaccctgc 19
<210> 48
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 48
ggagtggttt ttgggtttg 19

Claims (8)

1.一种检测MAP3K14-AS1基因甲基化水平的试剂在制备结直肠癌或结直肠腺瘤的诊断或辅助诊断产品中的应用，其特征在于，所述试剂包括能够特异性检测DNA样本中靶核苷酸序列中的至少一个CpG二核苷酸位点甲基化水平的试剂，所述靶核苷酸序列为SEQ IDNo.35所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：
（a）反应试剂，能差异修饰所述DNA样本中的甲基化位点和非甲基化位点；以及
（b）检测试剂，在用所述反应试剂处理DNA样本之后，所述检测试剂能确定所述靶核苷酸中的特定CpG二核苷酸位点中的胞嘧啶的甲基化水平。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂还包括PCR试剂，所述PCR试剂包括能特异性扩增所述靶核苷酸中的至少一种序列的引物对，和/或特异性探针。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述引物对为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述特异性探针为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂还包括：重亚硫酸盐。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述DNA样本来自哺乳动物的离体生物学样本，所述哺乳动物的离体生物学样本来自血液、粪便或组织样本中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述甲基化水平通过以下方法来获得：甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率熔解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法中的至少一种。
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