CN115433778B

CN115433778B - 一种用于检测结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的检测试剂、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN115433778B
Application number: CN202110617055.7A
Authority: CN
Inventors: 张良禄; 周谛晗; 董兰兰; 梁嘉琳; 孙帆; 李婷婷
Original assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Priority date: 2021-06-02
Filing date: 2021-06-02
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2041-06-02
Also published as: CN115433778A

Abstract

本发明公开了一种用于检测结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的检测试剂、试剂盒及其应用，涉及基因检测技术领域。检测结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因选自LRRC4基因；检测试剂包括用于检测LRRC4基因上的靶区域甲基化的试剂，通过检测LRRC4基因甲基化的增加可以对结直肠癌或结直肠腺瘤进行诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性。采用本发明提供的检测试剂和试剂盒能有效地提高结直肠癌或结直肠腺瘤的检出率，从而通过早期检测降低结直肠癌的发病率。

Description

一种用于检测结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的检测试剂、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及一种用于检测结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的检测试剂、试剂盒及其应用。

背景技术

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，主要包括结肠癌与直肠癌两大类。国家癌症中心2019年发布的全国癌症统计数据显示，我国2015年结直肠癌的新发病例数为37.63万人，因结直肠癌死亡患者19.10万人，位于恶性肿瘤发病率第三位、死亡率第五位。结直肠癌的预后与疾病诊断时的严重程度相关，美国结直肠癌患者5年生存率为67％，而我国目前仅为31％。2004年至2013年，美国结直肠癌的发病率每年下降3％，整体死亡率平均每年下降2.7％，早期筛查在其中的贡献率超过50％。目前结直肠癌的早期诊断率仅为10％左右，超过80％患者确诊时已到中晚期。

结直肠癌通常是由良性的癌前息肉变化发展而来，这些息肉是局部生长或肠粘膜内异常细胞的聚集突入肠腔。随着时间流逝，这些息肉中的分裂细胞可能积累足够多的遗传变化，从而获得入侵肠壁的能力，这便是结直肠癌开始形成的标志，最终它们可能会扩散到局部淋巴结和远处的转移部位。幸运的是，只有一小部分息肉最终能演变成癌症，对于那些已经演变成癌症的，其发展过程也通常需要几年甚至十年，因此可以早期检测降低结直肠癌的发病率。

而潜在的恶性息肉主要有两种类型：腺瘤和无柄锯齿状息肉，这两种类型与发展为结直肠癌的风险不同。通常，大多数腺瘤具有小而圆形的非典型腺体的管状组织学特征，但是随着腺瘤的生长，通常会形成长丝状结构的区域，在病理报告中被描述为绒毛状或微管性。顾名思义，腺瘤的特征在于发育异常(纤维化程度低和结构异型)。肾小管腺和绒毛腺瘤，尤其是绒毛含量为25％的腺瘤，通常尺寸较大，具有更大的隐窝性癌细胞的潜力。相反，无蒂锯齿状息肉是平坦的，像地毯一样。无蒂锯齿状息肉包括无柄锯齿腺瘤，传统的锯齿状腺瘤和混合性息肉，所有这些都与结直肠癌的发展有关。随着息肉大小的增加，腺瘤发展成结直肠癌的风险也增加了，其中60％–70％的结直肠癌从腺瘤发展而来，约25％至35％的CRC(结直肠癌)从无蒂锯齿状息肉发育而来。

因此，提高腺瘤的检出率对于降低结直肠癌的发病率和死亡率极为重要，肠镜基础提高了高危人群中结直肠癌的检出率，但患者接受度低、且操作不够灵活。近期分子生物学方面的进展为开发简便、有效的早期诊断方法提供了新的方向。结直肠癌组织中存在多基因、多位点的甲基化，并且在结直肠癌发生的早期即出现DNA甲基化的改变，因此，甲基化改变可以作为食管癌早期诊断的标志物，从DNA甲基化角度探索结直肠癌诊断策略已成为一种新的思路。

结直肠肿瘤一般发生在结直肠上皮组织中，在其生长过程中，不断地有肿瘤细胞脱落至肠腔内并随着粪便排出。成人每天都会有10⁸以上的肠上皮细胞从肠壁脱，而肿瘤细胞由于增生异常更容易从肠道脱落，因此肠道肿瘤患者的粪便中包含有大量的病变细胞和病变成分的，检测粪便中的肿瘤细胞成分就可以提供一种无创的辅助诊断结直肠肿瘤方法。另外，肿瘤细胞也会释放DNA到血液中(cfDNA,circulating free DNA)，也可通过检测血液中的肿瘤DNA对结直肠癌进行检测，但cfDNA具有含量少、半衰期短的特点，使其在提取过程中容易丢失，因此检测难度巨大。

现有技术中公开的一些检测标记物对结直肠癌具有良好的检测效果，但对结直肠癌前病变的检测灵敏性和特异性较差，另外，目前尚缺少在粪便和血液中均具有优异检测效果的标记物。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的检测试剂、试剂盒及其应用以解决上述技术问题。本发明提供的上述检测试剂、试剂盒是以LRRC4基因作为标志物，通过检测其甲基化水平可以对结直肠癌或结直肠腺瘤进行诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性。采用本发明提供的检测试剂和试剂盒能有效地提高结直肠癌或结直肠腺瘤的检出率，从而通过早期检测降低结直肠癌的发病率。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种用于检测结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的检测试剂，检测结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因选自LRRC4基因；检测试剂包括用于检测LRRC4基因上的靶区域甲基化的试剂。

靶区域选自LRRC4基因的如下至少一种区域中的全长区域或部分区域：区域1、区域2、区域3、区域4、区域5、区域6、区域7、区域8、区域9、区域10、区域11、区域12、区域13、区域14、区域15、区域16、区域17和区域18；

其中，区域1选自chr7：128030918-128031152正链，区域2选自chr7：128031134-128031215正链，区域3选自chr7：128031237-128031370正链，区域4选自chr7：128031423-128031550正链，区域5选自chr7：128031565-128031703正链，区域6选自chr7：128031769-128031873正链，区域7选自chr7：128032121-128032264正链，区域8选自chr7：128032389-128032492正链，区域9选自chr7：128032534-128032648正链，区域10选自chr7：128032789-128032660负链，区域11选自chr7：128032505-128032388负链，区域12选自chr7：128032403-128032184负链，区域13选自chr7：128032056-128031956负链，区域14选自chr7：128031943-128031837负链，区域15选自chr7：128031742-128031625负链，区域16选自chr7：128031451-128031367负链，区域17选自chr7：128031303-128031203负链，区域18选自chr7：128031184-128030976负链。

现有研究表明，LRRC4基因表达在原发性脑肿瘤中显著下调或缺失，专利CN200810031542.X提示脑组织中特异性表达基因LRRC4可用于脑胶质瘤的早期诊断、筛查和患病风险预测，而LRRC4基因编码的蛋白的具体功能尚不清楚。

发明人发现以LRRC4基因为标志物，通过检测其甲基化水平的增加可以对结直肠癌或结直肠腺瘤进行诊断或辅助诊断。而针对LRRC4基因上不同区域的甲基化改变进行诊断，具有不同的灵敏度和特异性。

需要说明的是，本发明提到的位点或区域的位置均以GRCh38.p13为参考基因组，LRRC4基因位于人7号染色体的负义链上，具体位置为128027071-128032107bp。

上述提供靶区域可以是所检测的靶区域的全长区域或者该区域中的部分区域，通过对靶区域的检测实现对结直肠癌或结直肠腺瘤进行诊断或辅助诊断。

需要说明的是，在实际实施方式中，可以根据需要选自上述18个区域中的任一区域或任意几个区域进行甲基化检测。例如选择区域1-5进行甲基化检测。

基于本发明公开的内容，本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述位点中的一个或多个的组合的甲基化进行检测，以对结直肠癌或腺瘤进行诊断，无论采用何种技术，其都是属于本发明的保护范围。

在可选的实施方案中，所述试剂通过如下方法中的一种或几种实现对目标基因甲基化的检测：

甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。

可选地，检测区域1正链上的chr7:128030940、chr7:128030964、chr7:128030980、chr7:128031140和chr7:128031142至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。

检测区域2正链上的chr7:128031140、chr7:128031142、chr7:128031194、chr7:128031205、chr7:128031208、chr7:128031162和chr7:128031165至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。

检测区域3正链上的chr7:128031249、chr7:128031254、chr7:128031275、chr7:128031283、chr7:128031293、chr7:128031347、chr7:128031352、chr7:128031358和chr7:128031367至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。

检测区域4正链上的chr7:128031433、chr7:128031437、chr7:128031476、chr7:128031478和chr7:128031529至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。

检测区域5正链上的chr7:128031572、chr7:128031575、chr7:128031582、chr7:128031587、chr7:128031602、chr7:128031606、chr7:128031613、chr7:128031623、chr7:128031684、chr7:128031686、chr7:128031690和chr7:128031695至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。

检测区域6正链上的chr7:128031773、chr7:128031777、chr7:128031780、chr7:128031783、chr7:128031787、chr7:128031812、chr7:128031815、chr7:128031821、chr7:128031831、chr7:128031854、chr7:128031861和chr7:128031864至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。

检测区域7正链上的chr7:128032142、chr7:128032194、chr7:128032196、chr7:128032205、chr7:128032249、chr7:128032251、chr7:128032257和chr7:128032261至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。

检测区域8正链上的chr7:128032391、chr7:128032396、chr7:128032405、chr7:128032420、chr7:128032422、chr7:128032424、chr7:128032431、chr7:128032437和chr7:128032482至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。

检测区域9正链上的chr7:128032536、chr7:128032543、chr7:128032548、chr7:128032554、chr7:128032592、chr7:128032595、chr7:128032600、chr7:128032632、chr7:128032636、chr7:128032641和chr7:128032643至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。

检测区域10负链上的chr7:128032785、chr7:128032771、chr7:128032756、chr7:128032741、chr7:128032679、chr7:128032677和chr7:128032672至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。

检测区域11负链上的chr7:128032504、chr7:128032502、chr7:128032499、chr7:128032483、chr7:128032442、chr7:128032438、chr7:128032432、hr7:128032406、chr7:128032397、chr7:128032392和chr7:128032388至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。

检测区域12负链上的chr7:128032397、chr7:128032392、chr7:128032388、chr7:128032384、chr7:128032369、chr7:128032364、chr7:128032360、chr7:128032197、chr7:128032195和chr7:128032186至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。

检测区域13负链上的chr7:128032169、chr7:128032164、chr7:128032160、chr7:128032156、chr7:128032141、chr7:128032136、chr7:128032132、chr7:128031969、chr7:128031967、和chr7:128031958至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。

检测区域14负链上的chr7:128031941、chr7:128031936、chr7:128031929、chr7:128031923、chr7:128031905、chr7:128031902、chr7:128031889、chr7:128031883、chr7:128031855、chr7:128031849、chr7:128031847和chr7:128031841至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。

检测区域15负链上的chr7:128031741、chr7:128031738、chr7:128031735、chr7:128031729、chr7:128031727、chr7:128031696、chr7:128031691、chr7:128031642、chr7:128031638、chr7:128031632和chr7:128031627至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。

检测区域16负链上的chr7:128031448、chr7:128031446、chr7:128031438、chr7:128031434、chr7:128031421、chr7:128031418、chr7:128031413、chr7:128031408、chr7:128031386、chr7:128031374和chr7:128031368至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。

检测区域17负链上的chr7:128031302、chr7:128031299、chr7:128031294、chr7:128031284、chr7:128031255、chr7:128031250、chr7:128031218、chr7:128031209和chr7:128031206至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。

检测区域18负链上的chr7:128031166、chr7:128031163、chr7:128031130、chr7:128031128、chr7:128031122、chr7:128031119、chr7:128030992和chr7:128030981至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述用于检测LRRC4基因上的靶区域甲基化的试剂包括如下核酸组合中的至少一种：用于检测区域1的核酸组合1、用于检测区域2的核酸组合2、用于检测区域3的核酸组合3、用于检测区域4的核酸组合4、用于检测区域5的核酸组合5、用于检测区域6的核酸组合6、用于检测区域7的核酸组合7、用于检测区域8的核酸组合8、用于检测区域9的核酸组合9、用于检测区域10的核酸组合10、用于检测区域11的核酸组合11、用于检测区域12的核酸组合12、用于检测区域13的核酸组合13、用于检测区域14的核酸组合14、用于检测区域15的核酸组合15、用于检测区域16的核酸组合16、用于检测区域17的核酸组合17和用于检测区域18的核酸组合18；

核酸组合1的碱基序列如SEQ ID NO.1-3所示，核酸组合2的碱基序列如SEQ IDNO.4-6所示，核酸组合3的碱基序列如SEQ ID NO.7-9所示，核酸组合4的碱基序列如SEQ IDNO.10-12所示，核酸组合5的碱基序列如SEQ ID NO.13-15所示，核酸组合6的碱基序列如SEQ ID NO.16-18所示，核酸组合7的碱基序列如SEQ ID NO.19-21所示，核酸组合8的碱基序列如SEQ ID NO.22-24所示，核酸组合9的碱基序列如SEQ ID NO.25-27所示，核酸组合10的碱基序列如SEQ ID NO.28-30所示，核酸组合11的碱基序列如SEQ ID NO.31-33所示，核酸组合12的碱基序列如SEQ ID NO.34-36所示，核酸组合13的碱基序列如SEQ ID NO.37-39所示，核酸组合14的碱基序列如SEQ ID NO.40-42所示，核酸组合15的碱基序列如SEQ IDNO.43-45所示，核酸组合16的碱基序列如SEQ ID NO.46-48所示，核酸组合17的碱基序列如SEQ ID NO.49-51所示，核酸组合18的碱基序列如SEQ ID NO.52-54所示。

在本发明应用较佳的实施方式中，发明人发现当上述靶区域选自LRRC4基因的如下区域中的任意一种或几种的组合时，检测的灵敏度和特异性均显著优于其他区域：区域1、区域7、区域8、区域12、区域13和区域18。在血浆样本中，检测上述六个区域的甲基化对结直肠腺瘤的检测灵敏度均超过75％，对结直肠癌的检测灵敏度均超过85％，对结直肠腺瘤和结直肠癌的检测特异性均大于95％。在粪便样本中，检测上述六个区域的甲基化对结直肠腺瘤的检测灵敏度均超过80％，对结直肠癌的检测灵敏度均超过90％，对结直肠腺瘤和结直肠癌的检测特异性均大于95％。

发明人发现，当检测样本为粪便样本时，靶区域为区域1时，对结直肠腺瘤和结直肠癌的检测特异性均达到100％，对结直肠腺瘤的检测灵敏度最高达到84.62％。当检测样本为血浆样本时，靶区域为区域18时，对结直肠腺瘤和结直肠癌的检测特异性最高达到98.89％，对结直肠腺瘤的检测灵敏度最高达到81.54％。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述用于检测LRRC4基因上的靶区域甲基化的试剂包括如下核酸组合中的至少一种：用于检测区域1的核酸组合1、用于检测区域7的核酸组合7、用于检测区域8的核酸组合8、用于检测区域12的核酸组合12、用于检测区域13的核酸组合13、用于检测区域18的核酸组合18。例如可以是核酸组合1与核酸组合7组成的组，核酸组合12与核酸组合13组成的组，核酸组合12、核酸组合13、核酸组合18组成的组。

具体地，核酸组合1的碱基序列如SEQ ID NO.1-3所示，核酸组合7的碱基序列如SEQ ID NO.19-21所示，核酸组合8的碱基序列如SEQ ID NO.22-24所示，核酸组合12的碱基序列如SEQ ID NO.34-36所示，核酸组合13的碱基序列如SEQ ID NO.37-39所示，核酸组合18的碱基序列如SEQ ID NO.52-54所示。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述核酸组合中包括探针序列，探针序列的5’端均标记有荧光报告基团，探针序列的3’端均标记有荧光淬灭基团。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY。在其他实施方式中，探针标记的荧光报告基团和猝灭基团也可以根据需要进行自适应调整，并不限于上述限定的几种类型。

本发明还提供了一种结直肠癌或结直肠腺瘤诊断或辅助诊断试剂盒，其包括上述的检测试剂；

优选地，试剂盒还包括缓冲液、dNTPs、DNA酶和水。

上述缓冲液用于调节反应体系的pH，并提供反应所需的离子，DNA酶包括不限于Taq酶、高保真酶。在其他实施方式中，上述缓冲液也可以选择包含有dNTPs、DNA酶和水的混合液。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒的检测样本包括不限于取自待测主体的血液样本、粪便样本或组织样本。

上述检测试剂在制备结直肠癌或结直肠腺瘤诊断或辅助诊断试剂盒中的应用。

本发明还提供了结直肠癌或结直肠腺瘤诊断或辅助诊断的检测核酸组合，其包括核酸组合1-18中的至少一种。

需要说明的是，上述核酸组合仅为发明人提供的一种或几种的核酸组合，此外，在其他实施方式中，根据上述核酸组合删减或增加碱基也均在本发明的保护范围之内。例如与上述的核酸组合1-18中的任意一种核酸组合具有80％以上的序列一致性。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的上述检测试剂、试剂盒是以LRRC4基因作为标志物，通过检测其甲基化水平的增加可以对结直肠癌或结直肠腺瘤进行诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性。采用本发明提供的检测试剂和试剂盒能有效地提高结直肠癌或结直肠腺瘤的检出率，从而通过早期检测降低结直肠癌的发病率。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供用于结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括检测试剂，检测试剂包括核酸组合1，核酸组合1包括SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸，具体序列参照表1所示。该核苷酸组合1可检测LRRC4基因上Chr7：128030918-128031152区域正链(区域1)的甲基化；

区域1正链碱基序列如下(5’-3’)：

AAGGAAGGCAGGAAAGCACTGGCGTGGTGTCCTTAAGCTTTCTCCACGGGAGCTGGGCACCTCGTTCCCATTCCGACTTCTTAGTTTTAATTAACAAAAGGGGGAAGTGGTGGGGGCGGGGAGGGCAGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGAAGGGGTGGGGGAGACAAAATGGCCTCTAGTAAATCCGGAGCCGGAGCCGGCGAAGCCGCGGAGTTGAGGCGCGCCTGGGAGA。

SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸可检测位于该区域正链上chr7:128030940、chr7:128030964、chr7:128030980、chr7:128031140和chr7:128031142至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。

实施例2

本实施例提供了用于结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合2，核酸组合2包括SEQ ID NO.4-6所示的核苷酸，具体序列表1。该核酸组合2可检测LRRC4基因上chr7:128031134-128031215区域正链(区域2)的甲基化；

区域2正链碱基序列如下(5’-3’)：

TTGAGGCGCGCCTGGGAGAGCCAAGGCCCGGCGGGCTATGCAGGTGCATGCCCCCCCCTCCGCCCAAGGAGCGGCGCCACCA。

SEQ ID NO.4-6所示的核苷酸可检测位于该区域正链上chr7:128031140、chr7:128031142、chr7:128031194、chr7:128031205、chr7:128031208、chr7:128031162和chr7:128031165位置上胞嘧啶的甲基化。

实施例3

本实施例提供用于结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合3，核酸组合3包括SEQ ID NO.7-9所示的核苷酸，具体序列表1。该核酸组合3可检测LRRC4基因上chr7:128031237-128031370区域正链(区域3)的甲基化；

区域3正链碱基序列如下(5’-3’)：

GGACCCTGGCACCGGCTCGCTCCAGCCGCGGGGGAAGGCGCTTCATCGCCAAAGTGCGCTCCGGCGGCCCCGGCCCGCTCTGCGGGCCGCCGCCGGAGGGAGTGCGGGGGCGCCCCGAAGCCGCCCAGGCCGCA。

SEQ ID NO.7-9所示的核苷酸可检测位于该区域正链上chr7:128031249、chr7:128031254、chr7:128031275、chr7:128031283、chr7:128031293、chr7:128031347、chr7:128031352、chr7:128031358和chr7:128031367位置上胞嘧啶的甲基化。

实施例4

本实施例提供用于结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合4，核酸组合4包括SEQ ID NO.10-12所示的核苷酸，具体序列表1。该核酸组合4可检测LRRC4基因上chr7:128031423-128031550(区域4)正链的甲基化；

区域4正链碱基序列如下(5’-3’)：

CAGCTGATTGCGGTCGTGAGCTCGCGGAGCGGCGAGAGTTAAGAGGAGGTGTTCGCGGCGCCTTCGCCCTCCCCAGACACACACCCCCTTTCTCCTCGCCTCTTCTCGGAGGGTGGAAGAGACAAAAA。

SEQ ID NO.10-12所示的核苷酸可检测位于该区域正链上chr7:128031433、chr7:128031437、chr7:128031476、chr7:128031478和chr7:128031529位置上胞嘧啶的甲基化。

实施例5

本实施例提供用于结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合5，核酸组合5包括SEQ ID NO.13-15所示的核苷酸，具体序列表1。该核酸组合5可检测LRRC4基因上chr7:128031565-128031703(区域5)正链的甲基化；

区域5正链碱基序列如下(5’-3’)：

TCCAGTCCGCCGGCTGCCGGCACGCGGGGCGGCGCTCCGTCCGGCCCCCGAGGACCAGCGGCGTGGCGGCTGCGCTCGGACCCGGTCCGCCGGCCGGAGGAGCGCGCGGCGCCCGCGGTCGCGCCCGCACCGCAGGCCC。

SEQ ID NO.13-15所示的核苷酸可检测位于该区域正链上chr7:128031572、chr7:128031575、chr7:128031582、chr7:128031587、chr7:128031602、chr7:128031606、chr7:128031613、chr7:128031623、chr7:128031684、chr7:128031686、chr7:128031690和chr7:128031695位置上胞嘧啶的甲基化。

实施例6

本实施例提供用于结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合6，核酸组合6包括SEQ ID NO.16-18所示的核苷酸，具体序列表1。该核酸组合6可检测LRRC4基因上chr7:128031769-128031873(区域6)正链的甲基化；

区域6正链碱基序列如下(5’-3’)：

CAACCGCCCGTCGCCGCCCGCCGCTGCCCGGCCCCCGGCGCGCCGCCGGCTCCGGCTTTGTGCGGAGGGAGCGAGTTCGCGGCTTCGGCTCCCGGCGCCCTCAGT。

SEQ ID NO.16-18所示的核苷酸可检测位于该区域正链上chr7:128031773、chr7:128031777、chr7:128031780、chr7:128031783、chr7:128031787、chr7:128031812、chr7:128031815、chr7:128031821、chr7:128031831、chr7:128031854、chr7:128031861和chr7:128031864位置上胞嘧啶的甲基化。

实施例7

本实施例提供用于结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合7，核酸组合6包括SEQ ID NO.19-21所示的核苷酸，具体序列表1。该核酸组合7可检测LRRC4基因上chr7:128032121-128032264(区域7)正链的甲基化；

区域7正链碱基序列如下(5’-3’)：

ACTGTTCTGGGAGAAGATTAGCGTGATGCAGTGCTCTTATGTATTAGCGCCGCTCCCCCTCCGTCGCCTGCCTCGCGGGGTTAACGCCGGCGCCTTCCAGCGCCGCGCCGGCCGGCGCCGCGCAGCCCCGCGCCTCCGGCCGCC。

SEQ ID NO.19-21所示的核苷酸可检测位于该区域正链上chr7:128032142、chr7:128032194、chr7:128032196、chr7:128032205、chr7:128032249、chr7:128032251、chr7:128032257和chr7:128032261位置上胞嘧啶的甲基化。

实施例8

本实施例提供用于结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合8，核酸组合8包括SEQ ID NO.22-24所示的核苷酸，具体序列表1。该核酸组合8可检测LRRC4基因上chr7:128032389-128032492(区域8)正链的甲基化；

区域8正链碱基序列如下(5’-3’)：

AGCGAGCCGGAGTGAGCGTCAAGTGAGGGGCCGCGCGCAAGTCGCAGGCGTTCGCAGCTATTTTGGGCCGGTCGGAGGGAGCAGTTGGGTGGCCGCTGATAGGC。

SEQ ID NO.22-24所示的核苷酸可检测位于该区域正链上chr7:128032391、chr7:128032396、chr7:128032405、chr7:128032420、chr7:128032422、chr7:128032424、chr7:128032431、chr7:128032437和chr7:128032482位置上胞嘧啶的甲基化。

实施例9

本实施例提供用于结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合9，核酸组合9包括SEQ ID NO.25-27所示的核苷酸，具体序列表1。该核酸组合9可检测LRRC4基因上chr7:128032534-128032648(区域9)正链的甲基化；

区域9正链碱基序列如下(5’-3’)：

CCCGCCCTCCGGCCCGCACCCGGGGCCCCCTGGCTCTGAAGAGCGGGGCTCAGGGGCCCGGCGGCCCGCGGCGGGGCTGCTGCATTTGGCCTGCCTCTCGCCCGGCCCGCGTCAT。

SEQ ID NO.25-27所示的核苷酸可检测位于该区域正链上chr7:128032536、chr7:128032543、chr7:128032548、chr7:128032554、chr7:128032592、chr7:128032595、chr7:128032600、chr7:128032632、chr7:128032636、chr7:128032641和chr7:128032643位置上胞嘧啶的甲基化。

实施例10

本实施例提供用于结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合10，核酸组合10包括SEQ ID NO.28-30所示的核苷酸，具体序列表1。该核酸组合10可检测LRRC4基因上chr7:128032789-128032660(区域10)负链的甲基化；

区域10负链碱基序列如下(5’-3’)：

CTGGCGGCAGTGCAGCAGCGAAGCCCGGGCTCTCGGTCCTGGGAGCCTCGTGGCCCCGGCCGCCGTCCCCCGAGTCCCCACCACGCAGTTCCGAACTCCGAACGCGAGTCCGCGCCCCGTCAGCAGTCAG。

SEQ ID NO.28-30所示的核苷酸可检测位于该区域负链上chr7:128032785、chr7:128032771、chr7:128032756、chr7:128032741、chr7:128032679、chr7:128032677和chr7:128032672位置上胞嘧啶的甲基化。

实施例11

本实施例提供用于结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合11，核酸组合11包括SEQ ID NO.31-33所示的核苷酸，具体序列表1。该核酸组合11可检测LRRC4基因上chr7:128032505-128032388(区域11)负链的甲基化；

区域11负链碱基序列如下(5’-3’)：

CCGCGCCGCTCCAGCCTATCAGCGGCCACCCAACTGCTCCCTCCGACCGGCCCAAAATAGCTGCGAACGCCTGCGACTTGCGCGCGGCCCCTCACTTGACGCTCACTCCGGCTCGCTC。

SEQ ID NO.31-33所示的核苷酸可检测位于该区域负链上chr7:128032504、chr7:128032502、chr7:128032499、chr7:128032483、chr7:128032442、chr7:128032438、chr7:128032432、hr7:128032406、chr7:128032397、chr7:128032392和chr7:128032388位置上胞嘧啶的甲基化。

实施例12

本实施例提供用于结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合12，核酸组合12包括SEQ ID NO.34-36所示的核苷酸，具体序列表1。该核酸组合12可检测LRRC4基因上chr7:128032403-128032184(区域12)负链的甲基化；

区域12负链碱基序列如下(5’-3’)：

TCACTCCGGTTCGCTCGCCCGCTCGCCCTGGCCCCGCTCCGCTCGTCTAGAGGGGGCGGGGAGGAAGCGGCCCGGGGAGGGGGGAGGGGGGAGGGGGAGAGAGGAAGAGAGGAGGAAGGAAGGAGGAAAGAGGAAGACGGGCGGCCGGAGGCGCGGGGCTGCGCGGCGCCGGCCGGCGCGGCGCTGGAAGGCGCCGGCGTTAACCCCGCGAGGCAGGCGA。

SEQ ID NO.34-36所示的核苷酸可检测位于该区域负链上chr7:128032397、chr7:128032392、chr7:128032388、chr7:128032384、chr7:128032369、chr7:128032364、chr7:128032360、chr7:128032197、chr7:128032195和chr7:128032186位置上胞嘧啶的甲基化。

实施例13

本实施例提供用于结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合13，核酸组合13包括SEQ ID NO.37-39所示的核苷酸，具体序列表1。该核酸组合13可检测LRRC4基因上chr7:128032056-128031956(区域13)负链的甲基化；

区域13负链碱基序列如下(5’-3’)：

CTGCCGCCTGCAACACCGCGAGCCCGGCGCGAGGAGGAGACGGTGGGCGCCGCGCGCAGGGGCCCCGCTGCTGCTGCTGCCGCCGCTAGCCAGCGGGGACT。

SEQ ID NO.37-39所示的核苷酸可检测位于该区域负链上chr7:128032169、chr7:128032164、chr7:128032160、chr7:128032156、chr7:128032141、chr7:128032136、chr7:128032132、chr7:128031969、chr7:128031967、和chr7:128031958位置上胞嘧啶的甲基化。

实施例14

本实施例提供用于结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合14，核酸组合14包括SEQ ID NO.40-42所示的核苷酸，具体序列表1。该核酸组合14可检测LRRC4基因上chr7:128031943-128031837(区域14)负链的甲基化；

区域14负链碱基序列如下(5’-3’)：

TCCGGAGCGTTTCCCGCAGCCGCGACCCCCGCTGCTCACGCCGCTGCAGCAGTCCGCTGGCGGCGCGGCCACTGAGGGCGCCGGGAGCCGAAGCCGCGAACTCGCTC。

SEQ ID NO.40-42所示的核苷酸可检测位于该区域负链上chr7:128031941、chr7:128031936、chr7:128031929、chr7:128031923、chr7:128031905、chr7:128031902、chr7:128031889、chr7:128031883、chr7:128031855、chr7:128031849、chr7:128031847和chr7:128031841位置上胞嘧啶的甲基化。

实施例15

本实施例提供用于结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合15，核酸组合15包括SEQ ID NO.43-45所示的核苷酸，具体序列表1。该核酸组合15可检测LRRC4基因上chr7:128031742-128031625(区域15)负链的甲基化；

区域15负链碱基序列如下(5’-3’)：

CCGCCGCCGGACCCGCGCCCGCCCCCGGACTCTCTGAAGGGGCCTGCGGTGCGGGCGCGACCGCGGGCGCCGCGCGCTCCTCCGGCCGGCGGACCGGGTCCGAGCGCAGCCGCCACGC。

SEQ ID NO.43-45所示的核苷酸可检测位于该区域负链上chr7:128031741、chr7:128031738、chr7:128031735、chr7:128031729、chr7:128031727、chr7:128031696、chr7:128031691、chr7:128031642、chr7:128031638、chr7:128031632和chr7:128031627位置上胞嘧啶的甲基化。

实施例16

本实施例提供用于结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合16，核酸组合16包括SEQ ID NO.46-48所示的核苷酸，具体序列表1。该核酸组合16可检测LRRC4基因上chr7:128031451-128031367(区域16)负链的甲基化；

区域16负链碱基序列如下(5’-3’)：

CTCCGCGAGCTCACGACCGCAATCAGCTGCCGCCGGCCCGGAGCGGCCGACGCCGGGAGAGGGAGCGCAGCATCCAGCGAGTGCG。

SEQ ID NO.46-48所示的核苷酸可检测位于该区域负链上chr7:128031448、chr7:128031446、chr7:128031438、chr7:128031434、chr7:128031421、chr7:128031418、chr7:128031413、chr7:128031408、chr7:128031386、chr7:128031374和chr7:128031368位置上胞嘧啶的甲基化。

实施例17

本实施例提供用于结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合17，核酸组合17包括SEQ ID NO.49-51所示的核苷酸，具体序列表1。该核酸组合17可检测LRRC4基因上chr7:128031303-128031203(区域17)负链的甲基化；

区域17负链碱基序列如下(5’-3’)：

CCGCCGGAGCGCACTTTGGCGATGAAGCGCCTTCCCCCGCGGCTGGAGCGAGCCGGTGCCAGGGTCCAAGGACAAAGCCGGGAAGCGCTGGTGGCGCCGCT。

SEQ ID NO.49-51所示的核苷酸可检测位于该区域负链上chr7:128031302、chr7:128031299、chr7:128031294、chr7:128031284、chr7:128031255、chr7:128031250、chr7:128031218、chr7:128031209和chr7:128031206位置上胞嘧啶的甲基化。

实施例18

本实施例提供用于结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合18，核酸组合18包括SEQ ID NO.52-54所示的核苷酸，具体序列表1。该核酸组合18可检测LRRC4基因上chr7:128031184-128030976(区域18)负链的甲基化；

区域18负链碱基序列如下(5’-3’)：

GCATGCACCTGCATAGCCCGTCGGGCCTTGGCTCTCCCAGGCGCGCCTCAACTCCGCGGCTTCGCCGGCTCCGGCTCCGGATTTACTAGAGGCCATTTTGTCTCCCCCACCCCTTCCCTCCCCTCCCCTCCCCTCCCCTCTGCCCTCCCCGCCCCCACCACTTCCCCCTTTTGTTAATTAAAACTAAGAAGTCGGAATGGGAACGAGGT。

SEQ ID NO.52-54所示的核苷酸可检测位于该区域负链上chr7:128031166、chr7:128031163、chr7:128031130、chr7:128031128、chr7:128031122、chr7:128031119、chr7:128030992和chr7:128030981位置上胞嘧啶的甲基化。

表1各核酸组合的序列表

/>

/>

实施例19

本实施例提供了使用实施例1-18任意一种试剂盒进行结直肠癌或腺瘤癌诊断的方法，其包括如下步骤：

(1)DNA模板的提取：

当待提取样本是粪便样本时，采用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20200225号)提取粪便中的人源LRRC4基因，该试剂盒采用捕获探针对粪便中的目的片段进行捕获，捕获探针上标记有生物素，正链区域和负链区域分开进行捕获提取，即提取正链基因组时加入正链捕获探针，提取负链区域时加入负链捕获探针。正链和负链的捕获探针序列参见表2，使用时用表2中的捕获探针替换试剂盒中原有的捕获探针，具体操作步骤参见试剂盒说明书。

表2正链和负链的捕获探针序列表。

/>

当待提取样本是血液样本时，采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作参见试剂盒的说明书。

(2)进行亚硫酸盐的转化。

将步骤(1)提取好的基因组进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸纯化试剂(鄂汉械备20500843)，具体实验操作参见试剂盒说明书。

(3)甲基化特异性PCR反应。

将亚硫酸氢盐转化后的DNA进行甲基化特异性PCR反应以检测LRRC4基因区域1-18的甲基化状态，每个区域单独进行检测，即一个PCR管中每次只加入一个区域的检测引物和探针，同时加入内参基因的检测探针。以β-actin作为内参基因，PCR反应体系如表3所示。β-actin作为内参基因，其中β-actin上游引物为：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ IDNO.68)；β-actin下游引物为：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.69)；β-actin探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ ID NO.70)。

本实施例中设置检测目标区域的探针5’端的报告基团为FAM，3’端猝灭基团为MGB，β-actin探针5’端的报告基团为VIC，3’端猝灭基团为BHQ1。

表3 PCR反应体系表。

组分	规格	体积(μL)
			缓冲液	5×	5
dNTPs	各2.5mM	2
			区域上游引物	10μM	1
区域下游引物	10μM	1
			区域探针	10μM	1
β-actin上游引物	10μM	1
			β-actin下游引物	10μM	1
β-actin探针	10μM	1
			DNA酶	5U/μL	0.5
待测样本DNA	/	5
			纯化水	/	补至25

如表3所示，检测样本在LRRC4基因区域1-区域18任一区域中的甲基化状态时，只需将某一区域对应的引物探针、β-actin引物探针、缓冲液、dNTP、DNA酶和样本DNA等按照表3中的体积加入到反应体系中。

对于粪便样本，检测区域1-9时，加入的待测样本DNA是前述提取到的正链DNA经转化而成，检测区域10-18时，加入的待检样本DNA是前述提取到的负链DNA经转化而成；对于血液样本，检测区域1-18时，加入的待检样本DNA是提取到的cfDNA经转化而成。

PCR反应条件如下表4所示。

表4 PCR反应条件表。

Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。

质量控制：在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测，阴性对照为纯化水，阳性对照为含有β-actin基因和目标基因序列的人工合成质粒，浓度为10³拷贝/微升，阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照的Ct值应在26-30之间。阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。

结果分析和判读方法：在相同的实验条件下，对不同的样本检测同一区域的甲基化时，若样本的Ct值越小，表明该样本中该检测区域的甲基化水平越高。若某一检测区域在样本上的Ct值≤38，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阳性，若某一检测区域在样本上的Ct值>38，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阴性。将样本的甲基化检测结果同病理结果进行对比，计算甲基化检测的敏感性和特异性。敏感性为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。

实验例1

于武汉大学中南医院收集经肠镜和组织活检确诊为结直肠癌患者、腺瘤患者和健康人的粪便样本，每人收集一份粪便，收集装置为武汉艾米森粪便标本采集保存管(鄂汉械备20191654号)，共收集到结直肠癌粪便样本78例、结直肠腺瘤样本104例、正常的粪便样本127例。按照实施例19提供的方法进行DNA提取提取和重亚硫酸盐转化、选用实施例1-18中的针对LRRC4基于18个区域的特异性引物和探针组合进行PCR检测，PCR检测结果如表5所示。

表5区域1-18在粪便样本中的检测灵敏度和特异性

由表5可以看出，区域1、区域7、区域8、区域12、区域13和区域18的检测灵敏度和特异性均显著优于其他区域，在粪便样本中，检测这几个区域的甲基化对结直肠腺瘤的检测灵敏度均超过80％，对结直肠癌的检测灵敏度均超过90％，特异性均大于95％。

实验例2

于武汉大学中南医院收集经肠镜和组织活检确诊为结直肠癌患者、腺瘤患者和健康人的血浆样本，每人收集5mL，共收集到结直肠癌血浆样本108例、结直肠腺瘤血浆样本130例、正常的血浆样本90例。按照实施例19提供的方法进行血浆DNA提取和重亚硫酸盐转化、选用实施例1-18中的针对LRRC4基于18个区域的特异性引物和探针组合进行PCR检测，PCR检测结果如表6所示。

表6区域1-18在血浆样本中的检测灵敏度和特异性

由表6可以看出，区域1、区域7、区域8、区域12、区域13和区域18的检测灵敏度和特异性均显著优于其他区域，在血浆样本中，检测这几个区域的甲基化对结直肠腺瘤的检测灵敏度均超过75％，对结直肠癌的检测灵敏度均超过85％，特异性均大于95％。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉艾米森生命科技有限公司

<120> 一种用于检测结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的检测试剂、试剂盒及

其应用

<160> 70

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaggaaggta ggaaagtatt ggcgt 25

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tctcccaaac gcgcctcaa 19

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tttttacggg agttgggtat ttcgt 25

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgaggcgcg tttgggaga 19

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

taataacgcc gctccttaaa cga 23

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttaaggttcg gcgggttatg taggt 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggattttggt atcggttcgt tttag 25

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tacgacctaa acgacttcga aacg 24

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aaggcgtttt atcgttaaag tgcgt 25

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tagttgattg cggtcgtgag tt 22

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tttttatctc ttccaccctc cga 23

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agagttaaga ggaggtgttc gcgg 24

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tttagttcgt cggttgtcgg tac 23

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aaacctacga tacgaacgcg a 21

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tcgttcggtt ttcgaggatt agcg 24

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

taatcgttcg tcgtcgttcg t 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

actaaaaacg ccgaaaaccg a 21

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tcgtcggttt cggttttgtg cg 22

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

attgttttgg gagaagatta gcgtg 25

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

aacgaccgaa aacgcgaaac ta 22

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tttgtttcgc ggggttaacg t 21

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

agcgagtcgg agtgagcgtt aa 22

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

acctatcaac gaccacccaa ctac 24

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tcgcgcgtaa gtcgtaggcg tt 22

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ttcgtttttc ggttcgtatt cg 22

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ataacgcgaa ccgaacgaaa 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tttaggggtt cggcggttcg 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ttggcggtag tgtagtagcg a 21

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ctaactacta acgaaacgcg aactc 25

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ttttcggttt tgggagtttc gtgg 24

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

tcgcgtcgtt ttagtttatt agcg 24

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gaacgaaccg aaataaacgt ca 22

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

aatagttgcg aacgtttgcg at 22

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

ttatttcggt tcgttcgttc gt 22

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

tcgcctacct cgcgaaatta ac 22

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ttggtttcgt ttcgttcgtt tagag 25

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

ttgtcgtttg taatatcgcg agttc 25

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

aatccccgct aactaacgac gac 23

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

tcgcgcgtag gggtttcgtt 20

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

ttcggagcgt ttttcgtagt c 21

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

aaacgaattc gcgacttcga c 21

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

acgtcgttgt agtagttcgt tggcg 25

<210> 43

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

tcgtcgtcgg attcgcgtt 19

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

acgtaacgac tacgctcgaa 20

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

ttttgaaggg gtttgcggtg c 21

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

tttcgcgagt ttacgatcgt aa 22

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

cgcactcgct aaatactacg ct 22

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

tagttgtcgt cggttcggag cg 22

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

tcgtcggagc gtattttggc 20

<210> 50

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

aacgacgcca ccaacgctt 19

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

ttggagcgag tcggtgttag gg 22

<210> 52

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

gtatgtattt gtatagttcg tcggg 25

<210> 53

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

acctcgttcc cattccgact tc 22

<210> 54

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

ttttaatttc gcggtttcgt cggt 24

<210> 55

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

tccaaggaca aagccgggaa gcgctggt 28

<210> 56

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

cgtttttgtc tcttccaccc tccgagaaga 30

<210> 57

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

gaagccgcga actcgctccc tccgcacaaa 30

<210> 58

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

attcacgttc tgactgaagg acaaaaggat 30

<210> 59

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

tccctccgac cggcccaaaa tagctgcgaa 30

<210> 60

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

acaccacgcc agtgctttcc tgccttcctt 30

<210> 61

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

actcgcgttc ggagttcgga actgcgtggt 30

<210> 62

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

aagtcgcagg cgttcgcagc tattttgg 28

<210> 63

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

gaaacgctcc ggagcccagg aacatagt 28

<210> 64

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

tcgcctcttc tcggagggtg gaagagacaa 30

<210> 65

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

accagcgctt cccggctttg tccttgga 28

<210> 66

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

acctcgttcc cattccgact tcttagtt 28

<210> 67

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

tgggtctgcg ctgtaagagt tggttgcc 28

<210> 68

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

aaggtggttg ggtggttgtt ttg 23

<210> 69

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

aataacaccc ccaccctgc 19

<210> 70

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

ggagtggttt ttgggtttg 19

Claims

1.一种用于检测结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因甲基化的检测试剂，其特征在于，所述检测结直肠癌或结直肠腺瘤相关基因选自LRRC4基因；所述检测试剂包括用于检测LRRC4基因上的靶区域内至少包含一个CpG位点的甲基化水平的试剂，所述靶区域选自LRRC4基因的区域1、区域7、区域8、区域12、区域13、区域18中的至少一个区域；

其中，所述区域1选自chr7：128030918-128031152正链，所述区域7选自chr7：128032121-128032264正链，所述区域8选自chr7：128032389-128032492正链，所述区域12选自chr7：128032403-128032184负链，所述区域13选自chr7：128032056-128031956负链，所述区域18选自chr7：128031184-128030976负链；

所述用于检测LRRC4基因上的靶区域内至少包含一个CpG位点的甲基化水平的试剂包括如下核酸组合中的至少一种：用于检测所述区域1的核酸组合1、用于检测所述区域7的核酸组合7、用于检测所述区域8的核酸组合8、用于检测所述区域12的核酸组合12、用于检测所述区域13的核酸组合13、用于检测所述区域18的核酸组合18；

所述核酸组合1的碱基序列如SEQ ID NO.1-3所示，所述核酸组合7的碱基序列如SEQID NO.19-21所示，所述核酸组合8的碱基序列如SEQ ID NO.22-24所示，所述核酸组合12的碱基序列如SEQ ID NO.34-36所示，所述核酸组合13的碱基序列如SEQ ID NO.37-39所示，所述核酸组合18的碱基序列如SEQ ID NO.52-54所示。

2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述核酸组合中包括探针序列，所述探针序列的5’端均标记有荧光报告基团，所述探针序列的3’端均标记有荧光淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，所述淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY。

4.一种结直肠癌或结直肠腺瘤诊断或辅助诊断试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-3任一项所述的检测试剂。

5.根据权利要求4所述的结直肠癌或结直肠腺瘤诊断或辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲液、dNTPs、DNA酶和水。

6.根据权利要求5所述的结直肠癌或结直肠腺瘤诊断或辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为取自待测主体的血液样本、粪便样本或组织样本。

7.如权利要求1-3任一项所述的检测试剂在制备结直肠癌或结直肠腺瘤诊断或辅助诊断试剂盒中的应用。

8.结直肠癌或结直肠腺瘤诊断或辅助诊断的检测核酸组合，其特征在于，其包括如下核酸组合中的至少一种；

其中，核酸组合1的碱基序列如SEQ ID NO.1-3所示，核酸组合7的碱基序列如SEQ IDNO.19-21所示，核酸组合8的碱基序列如SEQ ID NO.22-24所示，核酸组合12的碱基序列如SEQ ID NO.34-36所示，核酸组合13的碱基序列如SEQ ID NO.37-39所示，核酸组合18的碱基序列如SEQ ID NO.52-54所示。