CN117737250A - 一种膀胱癌生物标志物甲基化水平检测的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种膀胱癌生物标志物甲基化水平检测的方法及试剂盒，所述膀胱癌生物标志物包括Twist1基因和SPN基因，通过对Twist1基因和SPN基因的甲基化水平进行检测，可以准确地检测膀胱癌，具有准确性高、灵敏度高和特异性高等优点，检测方法简单快速、成本低、取样方便，可实现无创性膀胱癌早期诊断，应用前景好。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及一种膀胱癌生物标志物甲基化水平检测的方法及试剂盒。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，是男性第六大常见疾病，女性第十七大常见疾病。膀胱癌存在地域、种族及性别差异，各年龄段均可发病，高发年龄50~70岁，且男性发病率远高于女性，约为女性的3~4倍，而对于相同分期的膀胱癌，女性的复发率和死亡率均比男性高。
根据病理组织学，膀胱癌患者90%以上为尿路上皮（移行细胞）癌，5%为膀胱鳞状细胞癌，不到2%为膀胱腺癌。根据浸润膀胱壁的深度，可分为非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（MIBC），在初诊为膀胱癌的患者中，70%~85%为NMIBC，15%至30%为MIBC。NMIBC病理分期包括Ta(乳头状)、T1(固有层浸润)和原位癌。Ta患者占70%，T1患者约占20%，原位癌患者约占10%。MIBC病理分期包括T2、T3和T4。高达80%的NMIBC患者在5年内复发；30%的Ta患者进展为MIBC；而T1和原位癌更容易发展为MIBC。经尿道膀胱肿瘤切除术被认为是NMIBC的标准治疗方法，根据复发危险决定膀胱灌注治疗方案。新辅助化疗联合根治性全膀胱切除术是MIBC患者的标准治疗方案。
膀胱癌的发生发展是复杂且多因素的过程，内在遗传因素和外部环境因素均有重要影响。吸烟和长期接触工业化学产品是目前最为肯定的膀胱癌两大外在致病危险因素。约50%的膀胱癌患者有吸烟史，吸烟者膀胱癌的患病风险会增加2~3倍，风险率与吸烟强度和时间成正比。长期职业接触工业化学产品是另一类重要的危险因素，此类人群长期接触芳香胺类化合物、多环芳烃和氯代烃、β-萘胺、4-氨基联苯等。另外膀胱癌的发生还与遗传及基因异常有关，正常膀胱细胞恶变始于细胞的DNA改变，有家族史者发生膀胱癌的危险性明显增加2倍。因此，在临床工作中，对早期膀胱癌患者进行准确诊断和评估，增加手术保留膀胱的机会并提高患者总体生存率具有极其重要的意义。
目前，诊断膀胱癌主要采用膀胱镜检查和活检以及尿细胞学检查。膀胱镜检查和活检是诊断膀胱癌最可靠的方法，但它是一种侵入性检查，费用高且可引起疼痛、出血、尿路感染和其他并发症，且有时难以检测到膀胱僻静角落的肿瘤。细胞学检查是一种非侵入性检查，可以直接识别尿液中脱落的肿瘤细胞，它使用简单，价格低廉，特异性高（85%-100%），但灵敏度低（13%-75%），诊断效率低，特别是对于低级别膀胱癌（16%）。最近，几种非侵入性方法，如NMP-22、膀胱肿瘤抗原和FISH法，已被证明有助于提高尿液细胞学的敏感性。然而，由于特异性或敏感性有限，迄今为止提出的标志物尚未在日常临床实践中广泛采用。因此，需要寻找一种新型、无创、低成本、准确度高的诊断及监测方法指导临床。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种简单快速、成本低、准确性高、无创的膀胱癌检测方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明的发明人发现，SPN基因是一个与膀胱癌患病显著相关的基因，该基因甲基化位点的甲基化程度与膀胱癌的发生有较强的相关性，且目前尚未发现SPN基因在膀胱癌检测方面的相关研究。为此，本发明首次将SPN基因用作膀胱癌检测的生物标志物。进一步地，发明人发现，将SPN基因与Twist1基因联合作为判断膀胱癌发生的生物标志物，可以更好地提高检测的准确性、灵敏度和特异性，对于膀胱癌的早期诊断具有重要意义。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种生物标志物。根据本发明的实施例，所述生物标志物包括Twist1基因和SPN基因。
本发明的发明人发现，Twist1基因和SPN基因的甲基化水平与膀胱癌的发生存在显著相关性，通过对这两个基因的甲基化水平进行检测，可以准确地诊断膀胱癌，具有准确性高、灵敏度高和特异性高等优点，并且，检测方法简单快速、成本低、取样方便，可实现无创性膀胱癌早期诊断，应用前景好。
根据本发明的实施例，所述生物标志物包括Twist1基因目的区域的甲基化位点和SPN基因目的区域的甲基化位点；以GRCh38.p14为参考基因组，所述Twist1基因目的区域选自Chr7:19118311-19118422负链，所述SPN基因目的区域选自Chr16:29664517-29664618正链。
根据本发明的实施例，所述Twist1基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr7:19118316、Chr7:19118321、Chr7:19118379、Chr7:19118403、Chr7:19118408和Chr7:19118419；所述SPN基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr16:29664525、Chr16:29664538、Chr16:29664575、Chr16:29664578、Chr16:29664607和Chr16:29664614。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种引物组。根据本发明的实施例，所述引物组用于检测前面所述生物标志物，所述引物组包括：第一引物组，所述第一引物组中引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和2所示；第二引物组，所述第二引物组中引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：4和5所示。由此，利用本发明的引物组可以特异性地扩增Twist1基因和SPN基因的甲基化位点，进而诊断膀胱癌。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种探针组。根据本发明的实施例，所述探针组用于检测前面所述生物标志物，所述探针组包括第一探针，所述第一探针的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示；第二探针，所述第二探针的核苷酸序列为SEQ ID NO：6所示。由此，利用本发明的探针组可以实现Twist1基因和SPN基因的荧光定量PCR检测，进而诊断膀胱癌。
根据本发明的实施例，所述第一探针的5’端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记有MGB荧光淬灭基团；所述第二探针的5’端标记有ROX荧光报告基团，3’端标记有MGB荧光淬灭基团。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于检测前面所述生物标志物，所述试剂盒包括下列至少一种：前面所述引物组和前面所述探针组。由此，利用本发明的试剂盒可以检测Twist1基因和SPN基因甲基化水平，从而有助于诊断膀胱癌。
根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括下列至少一种：样本收集容器、DNA提取试剂、甲基化转化试剂、荧光定量PCR检测试剂、检测β-actin基因的引物和检测β- actin基因的探针。
根据本发明的实施例，样本收集容器用于收集样本，所述样本收集容器的容量为1~10 mL。
根据本发明的实施例，所述检测β-actin基因的探针的5’端标记有VIC荧光报告基团，3’端标记有MGB荧光淬灭基团。
在本发明的又一方面，本发明提出了检测前面所述生物标志物的试剂在制备检测产品中的应用。根据本发明的实施例，所述检测产品用于诊断膀胱癌。
根据本发明的实施例，所述检测生物标志物的试剂包括前面所述引物组和/或前面所述探针组。
根据本发明的实施例，所述检测产品包括试剂盒、试剂条或芯片。
根据本发明的实施例，所述试剂盒选自前面所述试剂盒。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种膀胱癌生物标志物甲基化水平检测的非诊断方法。根据本发明的实施例，所述非诊断方法包括：利用前面所述引物组和探针组对生物样本中的前面所述生物标志物进行检测。由此，利用本发明的方法可以实现准确检测膀胱癌Twist1和SPN基因的甲基化水平。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于诊断膀胱癌的装置。根据本发明的实施例，所述用于诊断膀胱癌的装置包括：检测单元，所述检测单元适于检测前面所述生物标志物中甲基化水平，得到检测结果；分析单元，所述分析单元适于基于所述检测结果诊断膀胱癌。由此，本发明的装置操作简单快速、检测准确度高、成本低、取样方便，可实现无创性膀胱癌早期诊断，应用前景好。
根据本发明的实施例，所述检测单元中含有检测装置；所述检测装置包括荧光定量PCR仪。
根据本发明的实施例，所述检测单元中进一步含有DNA提取装置。
根据本发明的实施例，所述分析单元适于基于如下判定方式诊断膀胱癌：在β- actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若Twist1基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(Twist1)- Ct(β-actin) ≤9.4，则判断为Twist1基因甲基化阳性；若Ct(Twist1)- Ct(β-actin)＞9.4或Twist1基因目的区域无扩增曲线，则判断为Twist1基因甲基化阴性；在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若SPN基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(SPN)- Ct(β-actin) ≤10.1，则判断为SPN基因甲基化阳性；若Ct(SPN)- Ct(β-actin)＞10.1或SPN基因目的区域无扩增曲线，则判断为SPN基因甲基化阴性；当Twist1基因和SPN基因中至少有一种为甲基化阳性时，判断患有膀胱癌；当Twist1基因和SPN基因均为甲基化阴性时，判断未患有膀胱癌。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于诊断膀胱癌的分析系统。根据本发明的实施例，所述用于诊断膀胱癌的分析系统包括：数据获取模块，所述数据获取模块被配置为获取生物样本中前面所述生物标志物甲基化水平的检测结果；分析模块，所述分析模块被配置为基于所述检测结果诊断膀胱癌。由此，本发明的分析系统可以准确诊断膀胱癌。
根据本发明的实施例，所述分析模块被配置基于如下判断方式诊断膀胱癌：在β- actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若Twist1基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(Twist1)- Ct(β-actin) ≤9.4，则判断为Twist1基因甲基化阳性；若Ct(Twist1)- Ct(β-actin)＞9.4或Twist1基因目的区域无扩增曲线，则判断为Twist1基因甲基化阴性；在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若SPN基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(SPN)- Ct(β-actin) ≤10.1，则判断为SPN基因甲基化阳性；若Ct(SPN)- Ct(β-actin)＞10.1或SPN基因目的区域无扩增曲线，则判断为SPN基因甲基化阴性；当Twist1基因和SPN基因中至少有一种为甲基化阳性时，判断患有膀胱癌；当Twist1基因和SPN基因均为甲基化阴性时，判断未患有膀胱癌。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种电子设备。根据本发明的实施例，所述电子设备包括存储器和处理器，所述存储器上存储有可在所述处理器上运行的程序，所述程序被所述处理器执行时实现基于生物样本中前面所述生物标志物中甲基化水平诊断膀胱癌。由此，利用本发明的电子设备可以准确诊断膀胱癌。
根据本发明的实施例，所述程序被所述处理器执行时基于如下判断方式诊断膀胱癌：在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若Twist1基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(Twist1)- Ct(β-actin) ≤9.4，则判断为Twist1基因甲基化阳性；若Ct(Twist1)- Ct(β-actin)＞9.4或Twist1基因目的区域无扩增曲线，则判断为Twist1基因甲基化阴性；在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若SPN基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(SPN)- Ct(β-actin) ≤10.1，则判断为SPN基因甲基化阳性；若Ct(SPN)- Ct(β-actin)＞10.1或SPN基因目的区域无扩增曲线，则判断为SPN基因甲基化阴性；当Twist1基因和SPN基因中至少有一种为甲基化阳性时，判断患有膀胱癌；当Twist1基因和SPN基因均为甲基化阴性时，判断未患有膀胱癌。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种计算机可读存储介质。根据本发明的实施例，所述计算机可读存储介质存储有一个或者多个程序，所述一个或者多个程序可被一个或者多个处理器执行，以实现基于生物样本中前面所述生物标志物中甲基化水平诊断膀胱癌。由此，利用本发明的计算机可读存储介质可以准确诊断膀胱癌。
根据本发明的实施例，所述一个或者多个程序被一个或者多个处理器执行时实现基于如下判断方式诊断膀胱癌：在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若Twist1基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(Twist1)- Ct(β-actin) ≤9.4，则判断为Twist1基因甲基化阳性；若Ct(Twist1)- Ct(β-actin)＞9.4或Twist1基因目的区域无扩增曲线，则判断为Twist1基因甲基化阴性；在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若SPN基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(SPN)- Ct(β-actin) ≤10.1，则判断为SPN基因甲基化阳性；若Ct(SPN)- Ct(β-actin)＞10.1或SPN基因目的区域无扩增曲线，则判断为SPN基因甲基化阴性；当Twist1基因和SPN基因中至少有一种为甲基化阳性时，判断患有膀胱癌；当Twist1基因和SPN基因均为甲基化阴性时，判断未患有膀胱癌。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
（1）甲基化异常是肿瘤发生过程中的早期事件，本发明通过检测Twist1基因和SPN基因甲基化水平可以实现早期膀胱癌的诊断，有效降低膀胱癌的发生率和病死率。操作方便，用户在获得尿液样本采集保存管后，可以居家完成尿液样本采集，然后快递寄出由专业人员进行检测。
（2）本发明检测Twist1基因和SPN基因甲基化水平的方法完全无创，以尿液作为检测样本，取样简单，易获得，不会对病人造成任何痛苦和影响，病人接受度高。
（3）本发明使用1~10 mL全尿液样本进行检测，尤其是2mL全尿液样本进行检测，依然可得到高水平的灵敏度和特异性，可适用于小体积样本检测。
（4）本发明设计了特异性的引物和探针，采用联合检测Twist1基因和SPN基因甲基化的方法，极大地提高了整体的检测准确性、灵敏度和特异性，检测灵敏度为92.1％，特异性为94.6％，避免了单基因甲基化检测所存在的灵敏度和特异性低的问题。
（5）本发明采用的膀胱癌靶基因中，Twist1基因探针采用FAM标记，SPN基因探针采用ROX标记，对照β-actin基因探针采用VIC标记，可实现多重单管检测，相比单重检测，减少试剂消耗，降低耗材成本，减少实验人员操作步骤，降低实验错误率。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了Twist1基因检测结果ROC曲线图；
图2显示了SPN基因检测结果ROC曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
本发明提出了生物标志物、引物组、探针组、试剂盒及其应用、膀胱癌生物标志物甲基化水平检测的非诊断方法、用于诊断膀胱癌的装置和分析系统、电子设备和计算机可读存储介质，下面将分别对其进行详细描述。
生物标志物
在本发明的一个方面，本发明提出了一种生物标志物。根据本发明的实施例，生物标志物包括Twist1基因和SPN基因。本发明的发明人发现，Twist1基因和SPN基因的甲基化水平与膀胱癌的发生存在显著相关性，通过对这两个基因的甲基化水平进行检测，可以准确地诊断膀胱癌，具有准确性高、灵敏度高和特异性高等优点，并且，检测方法简单快速、成本低、取样方便，可实现无创性膀胱癌早期诊断，应用前景好。
在本发明的另一方面，本发明提出了另一种生物标志物。根据本发明的实施例，生物标志物包括Twist1基因目的区域的甲基化位点和SPN基因目的区域的甲基化位点；以GRCh38.p14为参考基因组，Twist1基因目的区域选自Chr7:19118311-19118422负链，SPN基因目的区域选自Chr16:29664517-29664618正链；Twist1基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr7:19118316、Chr7:19118321、Chr7:19118379、Chr7:19118403、Chr7:19118408和Chr7:19118419；SPN基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr16:29664525、Chr16:29664538、Chr16:29664575、Chr16:29664578、Chr16:29664607和Chr16:29664614。
本发明的发明人发现，上述Twist1基因目的区域的甲基化位点和SPN基因目的区域的甲基化位点的甲基化程度与膀胱癌患病存在显著相关性，通过对上述甲基化位点的甲基化水平进行检测，可以实现准确诊断膀胱癌的目的，具有准确性高、灵敏度强和特异性强等优点。
引物组、探针组和试剂盒
在本发明的又一方面，本发明提出了一种引物组。根据本发明的实施例，引物组用于检测前面所述生物标志物，引物组包括：第一引物组，第一引物组中引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和2所示；第二引物组，第二引物组中引物的核苷酸序列分别为SEQ IDNO：4和5所示。
第一引物组可以特异性地识别和结合前述Twist1基因目的区域的甲基化位点，第二引物组可以特异性地识别和结合前述SPN基因目的区域的甲基化位点，进而，通过对甲基化位点的甲基化水平进行检测，可以实现准确诊断膀胱癌的目的。
TTTCGAGTATTTTTCGAGGC（SEQ ID NO：1）
TTTACGTCCCGACCTACTCT（SEQ ID NO：2）
TTTGTTGGCGGTTATAGTTTTC（SEQ ID NO：4）
TTACGCTTACCGCCTCTACTC（SEQ ID NO：5）
在本发明的又一方面，本发明提出了一种探针组。根据本发明的实施例，所述探针组用于检测前面所述生物标志物，探针组包括第一探针，第一探针的核苷酸序列为SEQ IDNO：3所示；第二探针，第二探针的核苷酸序列为SEQ ID NO：6所示。由此，利用本发明的探针组可以实现Twist1基因和SPN基因的荧光定量PCR检测，进而诊断膀胱癌。
TAGTTTTTTGGATGTTGGGGAGC（SEQ ID NO.3）
TAGAAGCGGCGGATTGGGGT（SEQ ID NO.6）
根据本发明的实施例，第一探针的5’端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记有MGB荧光淬灭基团；第二探针的5’端标记有ROX荧光报告基团，3’端标记有MGB荧光淬灭基团。不同探针上标记不同荧光基团，有助于实现同一反应体系中多基因检测，提高检测效率及降低检测成本。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，试剂盒用于检测前面所述生物标志物，试剂盒包括下列至少一种：前面所述引物组和前面所述探针组。由此，利用本发明的试剂盒可以检测Twist1基因和SPN基因甲基化水平，从而有助于诊断膀胱癌。
根据本发明的实施例，试剂盒进一步包括下列至少一种：样本收集容器、DNA提取试剂、甲基化转化试剂、荧光定量PCR检测试剂、检测β-actin基因的引物和检测β-actin基因的探针。
根据本发明的实施例，检测β-actin基因的探针的5’端标记有VIC荧光报告基团，3’端标记有MGB荧光淬灭基团。
样本收集容器用于收集样本，样本可以为尿液、汗液、血液、全血、血清等，优选尿液。样本收集容器的容量可以为1~10 mL或1~3 mL，利用本发明的试剂盒可以实现少量样本准确检测，从而减少了样本的收集难度，方便检测。对于样本收集容器的材质和形状不做严格限定，可以根据本领域常规操作灵活选择。
DNA提取试剂用于提取DNA，具体可以为本领域常规DNA提取试剂。
甲基化转化试剂可以使核酸片段中胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而5-甲基胞嘧啶（5mC）不发生转变。进而，通过设计针对甲基化序列的引物对甲基化位点进行PCR扩增，若是可以得到扩增片段，则表明核酸片段的位点上存在甲基化，若未得到扩增片段，则表明核酸片段的位点上不存在甲基化，从而实现诊断膀胱癌。具体地，甲基化转化试剂可以为亚硫酸盐转化试剂。
荧光定量PCR检测试剂可以包括PCR缓冲液、dNTP、DNA聚合酶等荧光定量PCR检测常用试剂。检测β-actin基因的引物和探针可以包含本领域常规序列，用于检测β-actin对照基因表达水平。检测β-actin基因的探针5’端标记有VIC荧光报告基团，可实现多重单管检测。
另外，本发明提出了前述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
（1）提取待测生物样本基因组DNA；
（2）将待测生物样本基因组DNA进行亚硫酸盐转化；
（3）采用前述试剂盒中的引物组和探针组对亚硫酸盐转化后的DNA进行甲基化定量PCR检测；
（4）对检测结果进行分析。
应用
在本发明的又一方面，本发明提出了检测前面所述生物标志物的试剂在制备检测产品中的应用。根据本发明的实施例，检测产品用于诊断膀胱癌。由此，利用生物标志物、引物组、探针组或试剂盒可以实现准确诊断膀胱癌的目的。
根据本发明的实施例，所述检测生物标志物的试剂包括前面所述引物组和/或前面所述探针组。
根据本发明的实施例，检测产品包括前面所述试剂盒、试剂条或芯片。
需要说明的是，前面针对生物标志物、引物组、探针组和试剂盒所描述的特征和优点，同样适用于该应用，在此不再赘述。
方法
在本发明的又一方面，本发明提出了一种膀胱癌生物标志物甲基化水平检测的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：利用前面所述引物组和探针组对生物样本中的前面所述生物标志物进行检测。由此，利用本发明的方法可以实现准确检测膀胱癌Twist1和SPN基因的甲基化水平，可用于膀胱癌的诊断，也可以非诊断为目的，如用于膀胱癌的生理或病理学研究、治疗膀胱癌药物的筛选等，应用价值高。
根据本发明的实施例，该方法包括：利用前面所述引物组和前面所述探针组对生物样本中的前面所述生物标志物进行检测。
需要说明的是，前面针对生物标志物、引物组和探针组所描述的特征和优点，同样适用于该方法，在此不再赘述。
装置、系统、电子设备和计算机可读存储介质
在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于诊断膀胱癌的装置。根据本发明的实施例，用于诊断膀胱癌的装置包括：检测单元，检测单元适于检测前面所述生物标志物中甲基化水平，得到检测结果；分析单元，分析单元适于基于检测结果诊断膀胱癌。由此，本发明的装置操作简单快速、检测准确度高、成本低、取样方便，可实现无创性膀胱癌早期诊断，应用前景好。
根据本发明的实施例，检测单元中含有检测装置。检测装置用于检测Twist1基因目的区域的甲基化位点和SPN基因目的区域的甲基化位点甲基化水平，包括荧光定量PCR仪等。
根据本发明的实施例，检测单元中进一步含有DNA提取装置。DNA提取装置用于提取生物样本中的DNA，包括离心机、混合器等。
根据本发明的实施例，分析单元适于基于如下判定方式诊断膀胱癌：在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若Twist1基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(Twist1)- Ct(β-actin) ≤9.4，则判断为Twist1基因甲基化阳性；若Ct(Twist1)- Ct(β-actin)＞9.4或Twist1基因目的区域无扩增曲线，则判断为Twist1基因甲基化阴性；在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若SPN基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(SPN)- Ct(β-actin) ≤10.1，则判断为SPN基因甲基化阳性；若Ct(SPN)- Ct(β-actin)＞10.1或SPN基因目的区域无扩增曲线，则判断为SPN基因甲基化阴性；当Twist1基因和SPN基因中至少有一种为甲基化阳性时，判断患有膀胱癌；当Twist1基因和SPN基因均为甲基化阴性时，判断未患有膀胱癌。具体地，Ct值可以通过荧光定量PCR仪配套软件上获取。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于诊断膀胱癌的分析系统。根据本发明的实施例，用于诊断膀胱癌的分析系统包括：数据获取模块，数据获取模块被配置为获取生物样本中前面所述生物标志物甲基化水平的检测结果；分析模块，分析模块被配置为基于检测结果诊断膀胱癌。由此，本发明的分析系统可以准确诊断膀胱癌。
根据本发明的实施例，分析模块被配置基于如下判断方式诊断膀胱癌：在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若Twist1基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(Twist1)- Ct(β-actin) ≤9.4，则判断为Twist1基因甲基化阳性；若Ct(Twist1)-Ct(β-actin)＞9.4或Twist1基因目的区域无扩增曲线，则判断为Twist1基因甲基化阴性；在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若SPN基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(SPN)- Ct(β-actin) ≤10.1，则判断为SPN基因甲基化阳性；若Ct(SPN)- Ct(β-actin)＞10.1或SPN基因目的区域无扩增曲线，则判断为SPN基因甲基化阴性；当Twist1基因和SPN基因中至少有一种为甲基化阳性时，判断患有膀胱癌；当Twist1基因和SPN基因均为甲基化阴性时，判断未患有膀胱癌。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种电子设备。根据本发明的实施例，电子设备包括存储器和处理器，存储器上存储有可在处理器上运行的程序，程序被处理器执行时实现基于生物样本中前面所述生物标志物中甲基化水平诊断膀胱癌。由此，利用本发明的电子设备可以准确诊断膀胱癌。具体地，电子设备可以为包括荧光定量PCR仪、电脑、平板电脑、计算集群等任意智能终端。
根据本发明的实施例，程序被处理器执行时基于如下判断方式诊断膀胱癌：在β- actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若Twist1基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(Twist1)- Ct(β-actin) ≤9.4，则判断为Twist1基因甲基化阳性；若Ct(Twist1)- Ct(β-actin)＞9.4或Twist1基因目的区域无扩增曲线，则判断为Twist1基因甲基化阴性；在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若SPN基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(SPN)- Ct(β-actin) ≤10.1，则判断为SPN基因甲基化阳性；若Ct(SPN)- Ct(β-actin)＞10.1或SPN基因目的区域无扩增曲线，则判断为SPN基因甲基化阴性；当Twist1基因和SPN基因中至少有一种为甲基化阳性时，判断患有膀胱癌；当Twist1基因和SPN基因均为甲基化阴性时，判断未患有膀胱癌。
在本文中，术语“存储器”指的是用于将机器指令和/或数据提供给可编程处理器的任何计算机程序产品、设备、和/或系统（例如，磁盘、光盘、存储器、可编程逻辑系统（PLD）），包括，接收作为机器可读信号的机器指令的机器可读介质。存储器可以采用只读存储器(Read Only Memory，ROM)、静态存储设备、动态存储设备或者随机存取存储器(RandomAccess Memory，RAM)等形式实现。存储器可以存储操作设备和其他应用程序，在通过软件或者固件来实现本说明书实施例所提供的技术方案时，相关的程序代码保存在存储器中，并由处理器来调用执行本申请实施例的基于生物样本中生物标志物中甲基化水平诊断膀胱癌。
在本发明中，处理器可以是通用处理器或者专用处理器等。例如可以是基带处理器或中央处理器。基带处理器可以用于对通信协议以及通信数据进行处理，中央处理器可以用于对通信设备（如，基站、基带芯片，终端设备、终端设备芯片，DU或CU等）进行控制，执行计算机程序，处理计算机程序的数据。处理器可实现在集成电路（integrated circuit，IC）、模拟IC、射频集成电路RFIC、混合信号IC、专用集成电路（application specificintegrated circuit，ASIC）、印刷电路板（printed circuit board，PCB）、电子设备等上。该处理器和收发器也可以用各种IC工艺技术来制造，例如互补金属氧化物半导体（complementary metal oxide semiconductor，CMOS）、N型金属氧化物半导体（nMetal-oxide-semiconductor，NMOS）、P 型金属氧化物半导体（positive channel metal oxidesemiconductor，PMOS）、双极结型晶体管（bipolar junction transistor，BJT）、双极 CMOS（BiCMOS）、硅锗（SiGe）、砷化镓（GaAs）等。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种计算机可读存储介质。根据本发明的实施例，计算机可读存储介质存储有一个或者多个程序，一个或者多个程序可被一个或者多个处理器执行，以实现基于生物样本中前面所述生物标志物中甲基化水平诊断膀胱癌。由此，利用本发明的计算机可读存储介质可以准确诊断膀胱癌。
根据本发明的实施例，一个或者多个程序被一个或者多个处理器执行时实现基于如下判断方式诊断膀胱癌：在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若Twist1基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(Twist1)- Ct(β-actin) ≤9.4，则判断为Twist1基因甲基化阳性；若Ct(Twist1)- Ct(β-actin)＞9.4或Twist1基因目的区域无扩增曲线，则判断为Twist1基因甲基化阴性；在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若SPN基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(SPN)- Ct(β-actin) ≤10.1，则判断为SPN基因甲基化阳性；若Ct(SPN)- Ct(β-actin)＞10.1或SPN基因目的区域无扩增曲线，则判断为SPN基因甲基化阴性；当Twist1基因和SPN基因中至少有一种为甲基化阳性时，判断患有膀胱癌；当Twist1基因和SPN基因均为甲基化阴性时，判断未患有膀胱癌。
在本文中，计算机可读存储介质可以是计算机能够存取的任何可用介质或者是包含一个或多个可用介质集成的服务器、数据中心等数据存储设备。可用介质可以是磁性介质（例如，软盘、硬盘、磁带）、光介质（例如，高密度数字视频光盘（digital video disc，DVD））、或者半导体介质（例如，固态硬盘（solid state disk，SSD））等。
需要说明的是，前面针对生物标志物、引物组和探针组所描述的特征和优点，同样适用于该装置、系统、电子设备和计算机可读存储介质，在此不再赘述。
实施例1
1、尿液样本收集
于上海某医院收集38例经病理检测确认为膀胱癌患者及37例进行常规体检的非膀胱癌的尿液样本，每份尿液样本收集体积为10mL，所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2、尿液样本DNA提取
利用上海锐翌生物科技有限公司核酸提取试剂（沪闵械备20230565）进行尿液样本DNA提取，步骤如下所示：
（1）向干净的离心管中依次加入30μL裂解缓冲液C溶液、2mL尿液、100μL裂解缓冲液B，放于60℃、1200rpm恒温混匀仪上震荡20分钟，孵育结束后将离心管冰浴5-10分钟。
（2）孵育过程中，按下表准备裂解液/磁珠混合液，并混合均匀。
表1 反应体系
（3）将步骤（2）中准备的裂解液/磁珠混合液加到步骤（1）样本管中。涡旋震荡1分钟，然后手工上下颠倒或使用混匀仪混匀5-10分钟，使磁珠一直处于悬浮状态。
（4）将离心管放于磁力架上静置，待磁珠吸附到磁力架上，管内溶液变澄清后，翻转离心管冲洗瓶盖上残留磁珠，再放置1分钟左右，之后弃去溶液。
（5）向离心管中加入1mL漂洗缓冲液A（使用前请检查是否已加入无水乙醇），震荡混匀后将混悬液转移到新的1.5mL离心管中。
（6）将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液。
（7）向离心管中加入1mL漂洗缓冲液A（使用前请检查是否已加入无水乙醇），涡旋震荡5秒后放于25℃、1500rpm的恒温混匀仪上震荡结合2分钟。
（8）将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液。
（9）向离心管中加入1mL漂洗缓冲液B（使用前请检查是否已加入无水乙醇），涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1500rpm的恒温混匀仪上震荡结合2分钟。
（10）将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液。
（11）重复步骤（9）、（10）。
（12）离心管短暂离心后，将其重新固定于磁力架上用移液器去除管底溶液，开盖室温放置5-10分钟使乙醇充分挥发（肉眼观察磁珠表面变成哑光且磁珠无干裂）。
（13）向离心管中加入50μL样本洗脱液后涡旋震荡使磁珠充分悬浮于洗脱液中，之后将离心管放于25℃、1500rpm的恒温混匀仪上震荡洗脱10分钟。
（14）将离心管固定于磁力架上静置2分钟，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中，即得DNA溶液。
3、尿液DNA亚硫酸盐转化
将上述提取获得的DNA，采用Zymo Research试剂盒（EZ-96 DNA Methylation-lightning MagPrep，货号D5047）进行亚硫酸盐转化，获得亚硫酸盐转化后的DNA，具体包括如下步骤：
（1）向上述提取好的20μL尿液DNA溶液中加入130μL CT Conversion Reagent，混匀离心。
（2）按照下表转化条件进行转化反应：
表2 反应条件
（3）先将600µL的M-Binding Buffer 和10µL的MagBinding（磁珠）加入到离心管中，上下颠倒混匀。
（4）将步骤（2）中转化完成的样本转移到含M-Binding Buffer 和磁珠离心管中，震荡混匀后室温孵育5-10min，期间每隔2-3min颠倒混匀或震荡混匀，以使磁珠处于悬浮状态。
（5）孵育完成后，低速瞬离，并将离心管置于磁力架上磁分离3min，小心移除上清。
（6）从磁力架上取下离心管，加入400µL M-Washing Buffer，震荡重悬磁珠，低速瞬离后将离心管置于磁力架上磁分离3min，小心移除上清。
（7）从磁力架上取下离心管，加入200µL L-Desulphonation Buffer，震荡重悬磁珠后室温孵育20min，期间每隔5min通过摇晃或震荡，使磁珠保持悬浮。
（8）打开恒温振荡孵育器，设置温度为55℃，不振荡。
（9）步骤（7）孵育完成后，瞬离，将离心管置于磁力架上磁分离3min，小心移除上清。
（10）取下离心管，加入400μL M-Washing Buffer，震荡重悬磁珠，低速瞬离后将离心管置于磁力架上磁分离3min，小心移除上清。
（11）重复步骤（10）一次。
（12）弃掉上清后再次瞬时离心，并将离心管置于磁力架上，尽可能多的移除残留液体，但不要吸到磁珠。
（13）将离心管开盖后置于55℃恒温振荡孵育器中烘干，烘干标准是可观察到磁珠颜色由亮黑色变为红棕色。
（14）烘干完成后加入50μL 洗脱液，重悬磁珠后置于55℃恒温振荡孵育器中，1500rpm，孵育4min。完成后置于磁力架上磁分离，并转移包含DNA的上清于新的离心管中，获得亚硫酸盐转化后的DNA，用于后续检测。
4、qPCR检测
（1）引物探针信息
Twist1基因检测引物及探针、SPN基因检测引物及探针以及对照β-actin基因检测引物及探针的序列如下表3所示。利用Twist1基因检测引物及探针可以特异性扩增Twist1基因目的区域的甲基化位点，其中目的区域是以GRCh38.p14为参考基因组，Chr7:19118311-19118422负链，甲基化位点为Chr7:19118316、Chr7:19118321、Chr7:19118379、Chr7:19118403、Chr7:19118408和Chr7:19118419。利用SPN基因检测引物及探针可以特异性扩增SPN基因目的区域的甲基化位点，其中目的区域是以GRCh38.p14为参考基因组，Chr16:29664517-29664618正链，甲基化位点为Chr16:29664525、Chr16:29664538、Chr16:29664575、Chr16:29664578、Chr16:29664607和Chr16:29664614。
表3 引物和探针序列
注：上述引物探针序列标记双下划线的CG位置即为Twist1基因和SPN基因检测的甲基化位点
（2）利用引物及探针(表3)对上述亚硫酸盐转化后的DNA进行甲基化定量PCR。
1）本实施例中，对同一样本的Twist1基因、SPN基因和β-actin基因进行同管多重检测，可先配置3种基因的PCR引物探针预混液，PCR引物探针预混液包括：0.1μMTwist1基因检测探针、0.3μMTwist1基因正向引物、0.3μMTwist1基因反向引物，0.1μMSPN基因检测探针、0.3μMSPN基因正向引物、0.3μMSPN基因反向引物，0.1μMβ-actin基因检测探针、0.3μMβ- actin基因正向引物、0.3μMβ-actin基因反向引物，去离子水补足至2.5μL。
2）PCR反应体系如表4所示。
表4 PCR反应体系
3）PCR扩增程序如表5所示。
表5 PCR扩增程序
4）配置好的反应体系采用ABI7500仪器进行扩增。
5）检测结果分析及判定标准为：
a.基线和阈值线调整：
对每个基因单独调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前 1~2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，仪器会自动得出样本各个基因的Ct值。
b.样本有效性确认：
①对照基因β-actin的VIC通道扩增曲线呈S型，且Ct值≤35，样本有效；
②对照基因β-actin的VIC通道扩增曲线呈S型，Ct值＞35或无扩增曲线，则样本无效。
c.目的基因甲基化确认：
①Twist1基因FAM通道扩增曲线呈S型，且Ct(Twist1)- Ct(β-actin) ≤9.4，判断为Twist1基因甲基化阳性；Ct(Twist1)- Ct(β-actin) ＞9.4或无扩增曲线，判断为Twist1基因甲基化阴性；
②SPN基因ROX通道扩增曲线呈S型，且Ct(SPN)- Ct(β-actin) ≤10.1，判断为SPN基因甲基化阳性；Ct(SPN)- Ct(β-actin) ＞10.1或无扩增曲线，判断为SPN基因甲基化阴性。
6）在样本有效的前提下，对其检测结果进行判读：
①当Twist1基因甲基化阳性，同时SPN基因甲基化也阳性时，样本检测结果为阳性；
②当Twist1基因甲基化阳性，SPN基因甲基化阴性或Twist1基因甲基化阴性，SPN基因甲基化阳性，样本检测结果为阳性；
③当Twist1基因甲基化阴性，同时SPN基因甲基化也阴性时，样本检测结果为阴性。
5、样本检测结果
（1）分别利用Twist1基因、SPN基因单独作为生物标志物，以及利用Twist1和SPN两种基因联合作为生物标志物，对共75例样本进行检测和分析。
（2）检测结果分别见图1、图2、表6所示，Twist1基因单独作为生物标志物时，其检测膀胱癌的灵敏度为86.8％，特异性为94.6％，受试者曲线下面积为0.940；SPN基因单独作为生物标志物时，其检测膀胱癌的灵敏度为81.6％，特异性为94.6％，受试者曲线下面积为0.889；Twist1和SPN两种基因联合作为生物标志物时，其检测膀胱癌的灵敏度为92.1％，特异性为94.6％。
注：灵敏度(真阳性率，sensitivity)＝真阳性人数/ (真阳性人数+假阴性人数)* 100％。
指正确判断病人的程度，即实际有病而被正确诊断的百分比。
特异性(真阴性率，specificity)＝真阴性人数/ (真阴性人数+假阳性人数) *100％。
指正确判断非病人的程度，即实际无病而被正确诊断为无病的百分比。
由上述结果可得：利用Twist1及SPN两种基因联合作为生物标志物进检测，可以明显提高膀胱癌的检出率，故双基因联合比单基因检测更有优势。
本发明灵敏度高、特异性强，在2mL小样本体积下进行检测，依然可得到高水平的灵敏度和特异性，且检测方法简单快捷、成本低，无创，因此在分子生物学领域中具有极大的应用价值。
表6 75例样本检测结果
注：“-”表示对照基因β-actin的VIC通道扩增曲呈S型，且Ct值≤35，样本有效，但目的基因无扩增曲线，不做Ct值计算，得到目的基因甲基化检测结果为阴性。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (27)
1.一种引物组，其特征在于，所述引物组用于检测生物标志物，所述生物标志物包括Twist1基因目的区域的甲基化位点和SPN基因目的区域的甲基化位点；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述Twist1基因目的区域选自Chr7:19118311-19118422负链，所述SPN基因目的区域选自Chr16:29664517-29664618正链；
所述引物组包括：
第一引物组，所述第一引物组中引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和2所示；
第二引物组，所述第二引物组中引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：4和5所示。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述Twist1基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr7:19118316、Chr7:19118321、Chr7:19118379、Chr7:19118403、Chr7:19118408和Chr7:19118419；
所述SPN基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr16:29664525、Chr16:29664538、Chr16:29664575、Chr16:29664578、Chr16:29664607和Chr16:29664614。
3.一种探针组，其特征在于，所述探针组用于检测生物标志物，所述生物标志物包括Twist1基因目的区域的甲基化位点和SPN基因目的区域的甲基化位点；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述Twist1基因目的区域选自Chr7:19118311-19118422负链，所述SPN基因目的区域选自Chr16:29664517-29664618正链；
所述探针组包括：
第一探针，所述第一探针的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示；
第二探针，所述第二探针的核苷酸序列为SEQ ID NO：6所示。
4.根据权利要求3所述的探针组，其特征在于，所述Twist1基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr7:19118316、Chr7:19118321、Chr7:19118379、Chr7:19118403、Chr7:19118408和Chr7:19118419；
所述SPN基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr16:29664525、Chr16:29664538、Chr16:29664575、Chr16:29664578、Chr16:29664607和Chr16:29664614。
5.根据权利要求3所述的探针组，其特征在于，所述第一探针的5’端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记有MGB荧光淬灭基团；
所述第二探针的5’端标记有ROX荧光报告基团，3’端标记有MGB荧光淬灭基团。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测生物标志物，所述生物标志物包括Twist1基因目的区域的甲基化位点和SPN基因目的区域的甲基化位点；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述Twist1基因目的区域选自Chr7:19118311-19118422负链，所述SPN基因目的区域选自Chr16:29664517-29664618正链；
所述试剂盒包括：权利要求1或2所述引物组以及权利要求3-5任一项所述探针组。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述Twist1基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr7:19118316、Chr7:19118321、Chr7:19118379、Chr7:19118403、Chr7:19118408和Chr7:19118419；
所述SPN基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr16:29664525、Chr16:29664538、Chr16:29664575、Chr16:29664578、Chr16:29664607和Chr16:29664614。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括下列至少一种：样本收集容器、DNA提取试剂、甲基化转化试剂、荧光定量PCR检测试剂、检测β-actin基因的引物和检测β-actin基因的探针。
9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述样本收集容器的容量为1~10 mL；
所述检测β-actin基因的探针的5’端标记有VIC荧光报告基团，3’端标记有MGB荧光淬灭基团。
10.检测生物标志物的试剂在制备检测产品中的应用，其特征在于，所述检测产品用于诊断膀胱癌；
所述生物标志物包括Twist1基因目的区域的甲基化位点和SPN基因目的区域的甲基化位点；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述Twist1基因目的区域选自Chr7:19118311-19118422负链，所述SPN基因目的区域选自Chr16:29664517-29664618正链。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述Twist1基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr7:19118316、Chr7:19118321、Chr7:19118379、Chr7:19118403、Chr7:19118408和Chr7:19118419；
所述SPN基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr16:29664525、Chr16:29664538、Chr16:29664575、Chr16:29664578、Chr16:29664607和Chr16:29664614。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述检测生物标志物的试剂包括权利要求1或2所述引物组和/或权利要求3-5任一项所述探针组；
所述检测产品包括试剂盒、试剂条或芯片；
所述试剂盒选自权利要求6-9任一项所述试剂盒。
13.一种膀胱癌生物标志物甲基化水平检测的非诊断方法，其特征在于，所述非诊断方法包括：
利用权利要求1或2所述引物组和权利要求3-5任一项所述探针组对生物样本中的生物标志物进行检测；
所述生物标志物包括Twist1基因目的区域的甲基化位点和SPN基因目的区域的甲基化位点；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述Twist1基因目的区域选自Chr7:19118311-19118422负链，所述SPN基因目的区域选自Chr16:29664517-29664618正链。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述Twist1基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr7:19118316、Chr7:19118321、Chr7:19118379、Chr7:19118403、Chr7:19118408和Chr7:19118419；
所述SPN基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr16:29664525、Chr16:29664538、Chr16:29664575、Chr16:29664578、Chr16:29664607和Chr16:29664614。
15.一种用于诊断膀胱癌的装置，其特征在于，所述用于诊断膀胱癌的装置包括：
检测单元，所述检测单元适于检测生物标志物中甲基化水平，得到检测结果；
分析单元，所述分析单元适于基于所述检测结果诊断膀胱癌；
所述生物标志物包括Twist1基因目的区域的甲基化位点和SPN基因目的区域的甲基化位点；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述Twist1基因目的区域选自Chr7:19118311-19118422负链，所述SPN基因目的区域选自Chr16:29664517-29664618正链。
16.根据权利要求15所述的装置，其特征在于，所述Twist1基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr7:19118316、Chr7:19118321、Chr7:19118379、Chr7:19118403、Chr7:19118408和Chr7:19118419；
所述SPN基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr16:29664525、Chr16:29664538、Chr16:29664575、Chr16:29664578、Chr16:29664607和Chr16:29664614。
17.根据权利要求15所述的装置，其特征在于，所述检测单元中含有检测装置；
所述检测装置包括荧光定量PCR仪。
18.根据权利要求15所述的装置，其特征在于，所述分析单元适于基于如下判定方式诊断膀胱癌：
在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若Twist1基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(Twist1)- Ct(β-actin) ≤9.4，则判断为Twist1基因甲基化阳性；若Ct(Twist1)- Ct(β-actin)＞9.4或Twist1基因目的区域无扩增曲线，则判断为Twist1基因甲基化阴性；
在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若SPN基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(SPN)- Ct(β-actin) ≤10.1，则判断为SPN基因甲基化阳性；若Ct(SPN)- Ct(β-actin)＞10.1或SPN基因目的区域无扩增曲线，则判断为SPN基因甲基化阴性；
当Twist1基因和SPN基因中至少有一种为甲基化阳性时，判断患有膀胱癌；
当Twist1基因和SPN基因均为甲基化阴性时，判断未患有膀胱癌；
所述检测单元中进一步含有DNA提取装置。
19.一种用于诊断膀胱癌的分析系统，其特征在于，所述用于诊断膀胱癌的分析系统包括：
数据获取模块，所述数据获取模块被配置为获取生物样本中生物标志物甲基化水平的检测结果；
分析模块，所述分析模块被配置为基于所述检测结果诊断膀胱癌；
所述生物标志物包括Twist1基因目的区域的甲基化位点和SPN基因目的区域的甲基化位点；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述Twist1基因目的区域选自Chr7:19118311-19118422负链，所述SPN基因目的区域选自Chr16:29664517-29664618正链。
20.根据权利要求19所述的分析系统，其特征在于，所述Twist1基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr7:19118316、Chr7:19118321、Chr7:19118379、Chr7:19118403、Chr7:19118408和Chr7:19118419；
所述SPN基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr16:29664525、Chr16:29664538、Chr16:29664575、Chr16:29664578、Chr16:29664607和Chr16:29664614。
21.根据权利要求19所述的分析系统，其特征在于，所述分析模块被配置基于如下判断方式诊断膀胱癌：
在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若Twist1基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(Twist1)- Ct(β-actin) ≤9.4，则判断为Twist1基因甲基化阳性；若Ct(Twist1)- Ct(β-actin)＞9.4或Twist1基因目的区域无扩增曲线，则判断为Twist1基因甲基化阴性；
在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若SPN基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(SPN)- Ct(β-actin) ≤10.1，则判断为SPN基因甲基化阳性；若Ct(SPN)- Ct(β-actin)＞10.1或SPN基因目的区域无扩增曲线，则判断为SPN基因甲基化阴性；
当Twist1基因和SPN基因中至少有一种为甲基化阳性时，判断患有膀胱癌；
当Twist1基因和SPN基因均为甲基化阴性时，判断未患有膀胱癌。
22.一种电子设备，其特征在于，所述电子设备包括存储器和处理器，所述存储器上存储有可在所述处理器上运行的程序，所述程序被所述处理器执行时实现基于生物样本中生物标志物中甲基化水平诊断膀胱癌；
所述生物标志物包括Twist1基因目的区域的甲基化位点和SPN基因目的区域的甲基化位点；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述Twist1基因目的区域选自Chr7:19118311-19118422负链，所述SPN基因目的区域选自Chr16:29664517-29664618正链。
23.根据权利要求22所述的电子设备，其特征在于，所述Twist1基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr7:19118316、Chr7:19118321、Chr7:19118379、Chr7:19118403、Chr7:19118408和Chr7:19118419；
所述SPN基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr16:29664525、Chr16:29664538、Chr16:29664575、Chr16:29664578、Chr16:29664607和Chr16:29664614。
24.根据权利要求22所述电子设备，其特征在于，所述程序被所述处理器执行时基于如下判断方式诊断膀胱癌：
在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若Twist1基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(Twist1)- Ct(β-actin) ≤9.4，则判断为Twist1基因甲基化阳性；若Ct(Twist1)- Ct(β-actin)＞9.4或Twist1基因目的区域无扩增曲线，则判断为Twist1基因甲基化阴性；
在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若SPN基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(SPN)- Ct(β-actin) ≤10.1，则判断为SPN基因甲基化阳性；若Ct(SPN)- Ct(β-actin)＞10.1或SPN基因目的区域无扩增曲线，则判断为SPN基因甲基化阴性；
当Twist1基因和SPN基因中至少有一种为甲基化阳性时，判断患有膀胱癌；
当Twist1基因和SPN基因均为甲基化阴性时，判断未患有膀胱癌。
25.一种计算机可读存储介质，其特征在于，所述计算机可读存储介质存储有一个或者多个程序，所述一个或者多个程序可被一个或者多个处理器执行，以实现基于生物样本中生物标志物中甲基化水平诊断膀胱癌；
所述生物标志物包括Twist1基因目的区域的甲基化位点和SPN基因目的区域的甲基化位点；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述Twist1基因目的区域选自Chr7:19118311-19118422负链，所述SPN基因目的区域选自Chr16:29664517-29664618正链。
26.根据权利要求25所述的计算机可读存储介质，其特征在于，所述Twist1基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr7:19118316、Chr7:19118321、Chr7:19118379、Chr7:19118403、Chr7:19118408和Chr7:19118419；
所述SPN基因目的区域的甲基化位点选自下列至少一种：Chr16:29664525、Chr16:29664538、Chr16:29664575、Chr16:29664578、Chr16:29664607和Chr16:29664614。
27.根据权利要求25所述计算机可读存储介质，其特征在于，所述一个或者多个程序被一个或者多个处理器执行时实现基于如下判断方式诊断膀胱癌：
在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若Twist1基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(Twist1)- Ct(β-actin) ≤9.4，则判断为Twist1基因甲基化阳性；若Ct(Twist1)- Ct(β-actin)＞9.4或Twist1基因目的区域无扩增曲线，则判断为Twist1基因甲基化阴性；
在β-actin基因扩增曲线呈S型且Ct(β-actin) ≤35的前提下，若SPN基因目的区域扩增曲线呈S型，且Ct(SPN)- Ct(β-actin) ≤10.1，则判断为SPN基因甲基化阳性；若Ct(SPN)- Ct(β-actin)＞10.1或SPN基因目的区域无扩增曲线，则判断为SPN基因甲基化阴性；
当Twist1基因和SPN基因中至少有一种为甲基化阳性时，判断患有膀胱癌；
当Twist1基因和SPN基因均为甲基化阴性时，判断未患有膀胱癌。
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