CN114277154A - 一种用于肺癌诊断和早期肺癌无创筛查的检测试剂盒 - Google Patents
一种用于肺癌诊断和早期肺癌无创筛查的检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114277154A CN114277154A CN202210102556.6A CN202210102556A CN114277154A CN 114277154 A CN114277154 A CN 114277154A CN 202210102556 A CN202210102556 A CN 202210102556A CN 114277154 A CN114277154 A CN 114277154A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- combination
- sequence
- seq
- lung cancer
- fluorescent probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 97
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 92
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 title claims abstract description 91
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 91
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 72
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims abstract description 60
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 60
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 46
- 101001117509 Homo sapiens Prostaglandin E2 receptor EP4 subtype Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 102100024450 Prostaglandin E2 receptor EP4 subtype Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 101000703741 Homo sapiens Short stature homeobox protein 2 Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 101000831616 Homo sapiens Protachykinin-1 Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102100024304 Protachykinin-1 Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 102100031976 Short stature homeobox protein 2 Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 14
- 101000652324 Homo sapiens Transcription factor SOX-17 Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102100030243 Transcription factor SOX-17 Human genes 0.000 claims abstract description 13
- -1 RASSF1A Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102100035342 Cysteine dioxygenase type 1 Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 101000737778 Homo sapiens Cysteine dioxygenase type 1 Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 8
- 101100178928 Mus musculus Hoxa9 gene Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 63
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 11
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 9
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 9
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 claims description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 7
- 102100021090 Homeobox protein Hox-A9 Human genes 0.000 claims description 6
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 6
- 101150109738 Ptger4 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101150108167 TAC1 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 6
- 108010027263 homeobox protein HOXA9 Proteins 0.000 claims description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 6
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 6
- 101150024390 CDO1 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101150008172 HOXA9 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101100310647 Homo sapiens SOX17 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101150007417 SOX17 gene Proteins 0.000 claims description 5
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 5
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 101150087690 ACTB gene Proteins 0.000 claims description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- AOSFMYBATFLTAQ-UHFFFAOYSA-N 1-amino-3-(benzimidazol-1-yl)propan-2-ol Chemical compound C1=CC=C2N(CC(O)CN)C=NC2=C1 AOSFMYBATFLTAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims description 3
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 3
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 claims description 3
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 claims description 3
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 101100368700 Caenorhabditis elegans tac-1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 235000005658 Spondias pinnata Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000025012 Spondias pinnata Species 0.000 claims description 2
- HJUFTIJOISQSKQ-UHFFFAOYSA-N fenoxycarb Chemical compound C1=CC(OCCNC(=O)OCC)=CC=C1OC1=CC=CC=C1 HJUFTIJOISQSKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 18
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 17
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 42
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 22
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 16
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940122426 Nuclease inhibitor Drugs 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical group [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000006148 magnetic separator Substances 0.000 description 6
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 6
- 101100477520 Homo sapiens SHOX gene Proteins 0.000 description 5
- 108700025071 Short Stature Homeobox Proteins 0.000 description 5
- 102100029992 Short stature homeobox protein Human genes 0.000 description 5
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 5
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000012487 rinsing solution Substances 0.000 description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 238000013276 bronchoscopy Methods 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 3
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010054107 Nodule Diseases 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 1,4-Benzenediol Natural products OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 5-[(1r)-1-hydroxy-2-[4-[(2r)-2-hydroxy-2-(4-methyl-1-oxo-3h-2-benzofuran-5-yl)ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]-4-methyl-3h-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C2C(=O)OCC2=C(C)C([C@@H](O)CN2CCN(CC2)C[C@H](O)C2=CC=C3C(=O)OCC3=C2C)=C1 OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 0.000 description 1
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 102000012406 Carcinoembryonic Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 description 1
- 108010066302 Keratin-19 Proteins 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 206010073310 Occupational exposures Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- GLEVLJDDWXEYCO-UHFFFAOYSA-N Trolox Chemical compound O1C(C)(C(O)=O)CCC2=C1C(C)=C(C)C(O)=C2C GLEVLJDDWXEYCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000006477 desulfuration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000023556 desulfurization Effects 0.000 description 1
- 230000003009 desulfurizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 230000006650 fundamental cellular process Effects 0.000 description 1
- 108010083422 gastrin-releasing peptide precursor Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical group O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000687 hydroquinonyl group Chemical group C1(O)=C(C=C(O)C=C1)* 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000003849 large cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 231100000675 occupational exposure Toxicity 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 239000000107 tumor biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于分子诊断技术领域，公开了一种用于肺癌诊断和早期肺癌无创筛查的检测试剂盒，包括用于检测人源生物样品中肺癌相关基因的靶区域的甲基化水平的引物对和荧光探针组合，所述肺癌相关基因为SHOX2、RASSF1A、PTGER4、TAC1、SOX17、CDO1、HOXA9中的一种或多种；而且，采用多个肺癌相关基因、不同靶序列组合检测能够有效提升检测的灵敏度、特异性和准确性。该试剂盒采用甲基化特异性荧光定量PCR的方法，操作简单，易于推广，对于提升肺癌患者生存率具有重要意义，具备良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断领域，具体地涉及一种用于肺癌诊断和早期肺癌无创筛查的检测试剂盒，所述试剂盒可以检测SHOX2、RASSF1A、PTGER4、TAC1、SOX17、CDO1、HOXA9中一个或多个基因的靶区域的甲基化水平。
背景技术
2018年全球癌症统计数据显示，全球范围内肺癌仍然是癌症发病率和死亡率的主要因素，当年估计新增210万肺癌病例和180万死亡病例，占癌症死亡人数的18.4％。尽管目前诊断和治疗的手段不断提升，但大部分肺癌病例都是在晚期确诊的，其五年生存率仅有16％，而吸烟、环境污染、职业暴露、呼吸性系统疾病和遗传因素等是肺癌发生的原因。
根据肺癌细胞在显微镜下的形态特点，可以初步分为两种类型：小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。绝大多数肺癌是非小细胞肺癌，约占85％。它又能进一步被分为三类，分别是：腺癌，鳞癌和大细胞癌。其中腺癌是最主要的类型，约占非小细胞肺癌中的50％。根据癌细胞的扩散程度，肺癌分为0期、I期、II期、III期或者IV期，其中0期和I期预后良好，IV期即为癌症晚期。早期诊断癌症是提高患者生存的主要因素，在I期确诊的非小细胞肺癌患者5年总生存率接近50％，而IV期确诊的肺癌患者五年生存率只有1％。要想解决肺癌防治的诸多问题，关键需要进一步推广和完善肺癌筛查及早诊早治策略。
2019年肺癌筛查与管理中国专家共识中推荐的肺癌筛查手段有：LDCT检查、肿瘤标志物检测、支气管镜检查和痰液细胞学检查。痰液细胞学检查是一种特异性很高而灵敏度较弱的手段，不能作为常规肺癌筛查手段。支气管镜检查作为一种侵入性、创伤性检查手段，对临床医师技术操作技术要求高且不容易为患者接受，也不能作为常规肺癌筛查手段。常用的肿瘤标记物胃泌素释放肽前体、神经元特异性烯醇化酶、癌胚抗原、细胞角蛋白19片段等对肺癌诊断有参考价值，但这些蛋白标记物与肿瘤基因异常变化并无直接关联，且需要定量cutoff值来保证特异性而限制了灵敏度。LDCT检查对肺癌灵敏度高，是目前高危人群肺癌筛查的可靠手段，但LDCT误诊率高，较高的假阳性率会导致不必要的焦虑、不必要的辐射暴露和进一步的侵入性检查，如支气管镜检查，以明确排除肺癌。肺癌的早期发现、早期诊断、早期治疗是降低肺癌死亡人数的重要措施，然而当前肺癌的早期诊断技术存在诸多弊端。为了有效的提高肺癌高风险人群的早诊比例，急需一种灵敏性和特性高的且无创的方法来提高早期筛查的依从性，实现肺癌的早诊早治，提高患者生存率。
CpG二核苷酸内胞嘧啶残基的甲基化在基本的细胞过程、人类疾病甚至癌症中起着重要作用。在癌症发生的早期即发生了DNA甲基化，同时DNA甲基化是一种非常稳定的标记，故DNA甲基化检测可以作为一种有效的癌症筛查手段，而且表观遗传癌症生物标志物独立于经典形态学，因此具有克服细胞学局限性的广泛潜力。大量研究表明，基因甲基化检测是一种理想的肺癌早期诊断方法。随着检测技术的不断进步，可以实现多种基因的甲基化检测。游离循环肿瘤DNA(ctDNA)是由肿瘤细胞坏死或者凋亡后释放到体液中的单链或者双链DNA，对ctDNA进行检测，可以对肿瘤进行实时监控、早期诊断与预后判断等。目前相关研究报道中通过单一甲基化ctDNA在检出灵敏度上都不高，因此难以作为肺癌早期筛查的有效方法。而研究发现多基因甲基化联合检测在病变组织、支气管肺泡灌洗液、痰液、外周血等样本中均具有较高的检出率，并且较单一基因甲基化检测灵敏度及特异性更高，是一种理想的肺癌早期诊断方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于肺癌辅助诊断和早期肺癌无创筛查的检测试剂盒，以不同肺癌相关基因的不同检测区域作为甲基化检测的靶区域，显著提高了检测的灵敏度和特异性，实现了早期肺癌的快速、准确检测。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
一种用于肺癌诊断和早期肺癌无创筛查的检测试剂盒，包括用于检测人源生物样品中肺癌相关基因靶区域的甲基化水平的引物对和荧光探针组合；所述引物对和荧光探针组合用于对亚硫酸盐处理后的肺癌相关基因的靶区域进行荧光定量PCR扩增；所述肺癌相关基因为SHOX2、RASSF1A、PTGER4、TAC1、SOX17、CDO1、HOXA9中的一种或多种。
作为本发明的一种优选实施方式，所述肺癌相关基因为SHOX2、RASSF1A、PTGER4、TAC1、SOX17、CDO1、HOXA9中的至少两种。
更加优选地，所述肺癌相关基因为SHOX2、RASSF1A、PTGER4、TAC1、SOX17、CDO1、HOXA9中的至少三种。
最优选地，所述肺癌相关基因至少包括PTGER4和TAC1。
具体的，在上述技术方案中，所述肺癌相关基因的靶区域位置如下所示：
所述SHOX2基因检测靶区域选自GRCh38:3:158095904～158099559的全长区域或部分区域；
所述RASSF1A基因检测靶区域选自GRCh38:3:50329537～50333792的全长区域或部分区域；
所述PTGER4基因检测靶区域选自GRCh38:5:40679345～40681915的全长区域或部分区域；
所述TAC1基因检测靶区域选自GRCh38:7:97731968～97733724的全长区域或部分区域；
所述SOX17基因检测靶区域选自GRCh38:8:54457647～54460002的全长区域或部分区域；
所述CDO1基因检测靶区域选自GRCh38:5:115804332～115805732的全长区域或部分区域；
所述HOXA9基因检测靶区域选自GRCh38:7:27163082～27164508的全长区域或部分区域。
优选地，本发明为各上述肺癌相关基因分别提供两个靶区域，具体如下所示：
所述SHOX2基因的靶区域为GRCh38:3:158096232～158097040的全长区域或部分区域，以及GRCh38:3:158098541～158099300的全长区域或部分区域；
所述RASSF1A基因的靶区域为GRCh38:3:50329626～50330340的全长区域或部分区域，以及GRCh38:3:50332982～5033697的全长区域或部分区域；
所述PTGER4基因的靶区域为GRCh38:5:40679563～40680228的全长区域或部分区域，以及GRCh38:5:40680965～40681833的全长区域或部分区域；
所述TAC1基因的靶区域为GRCh38:7:97731978～97732326的全长区域或部分区域，以及GRCh38:7:97732777-97733338的全长区域或部分区域；
所述SOX17基因的靶区域为GRCh38:8:54457679～54458470的全长区域或部分区域，以及GRCh38:8:54459030～54459859的全长区域或部分区域；
所述CDO1基因的靶区域为GRCh38:5:115804358～115804732的全长区域或部分区域，以及GRCh38:5:115804748～115805462的全长区域或部分区域；
所述HOXA9基因的靶区域为GRCh38:7:27163398～27163804的全长区域或部分区域，以及GRCh38:7:27163836～27164255的全长区域或部分区域。
更加优选地，所述肺癌相关基因的两个靶区域位置具体如下所示：
SHOX2基因的两个靶区域的序列分别为GRCh38:3:158096298-158096648和GRCh38:3:158098932-158099255；
RASSF1A基因的两个靶区域的序列分别为GRCh38:3:50329826-50330145和GRCh38:3:50333182-5033501；
PTGER4基因的两个靶区域的序列分别为GRCh38:5:40679693-40679952和GRCh38:5:40681355-40681679；
TAC1基因的两个靶区域的序列分别为GRCh38:7:97732108-97732308和GRCh38:7:97732777-97732976；
SOX17基因的两个靶区域的序列分别为GRCh38:8:54458199-54458429和GRCh38:8:54459095-54459355；
CDO1基因的两个靶区域的序列分别为GRCh38:5:115804423-115804162和GRCh38:5:115805064-115805397；
HOXA9基因的两个靶区域的序列分别为GRCh38:7:27163478-27163677和GRCh38:7:27163961-27164160。
针对不同肺癌相关基因的不同靶区域，采用不同的引物对和荧光探针组合进行检测。可以理解的是，所述引物对和荧光探针组合与对应的肺癌相关甲基化基因的经亚硫酸盐处理后的检测靶区域的序列互补。
优选地，对于所述的7种肺癌相关基因的靶区域，本发明提供了14种引物对和荧光探针组合，具体情况如表1所示。可以理解的是，所述检测试剂盒中至少包括表1中的一种组合，更加优选地，所述检测试剂盒中至少包括表1中的二种组合。
表1
进一步地，在上述技术方案中，所述荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，所述荧光探针的3’端标记有荧光淬灭基团。
优选地，所述荧光报告基团为FAM、ROX、VIC、JOE、CY3、CY5、NED、TAMRA和TEXAS RED中的任意一种，所述荧光淬灭基团为AMRA、DABCYL、ECLIPSE、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3和结合分子沟的非荧光淬灭剂(MGB)中的任意一种。
更加优选地，所述荧光报告基团为FAM、ROX、VIC、CY5中的至少两种，所述荧光淬灭基团为BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、MGB中的至少一种。
进一步地，在上述技术方案中，所述检测试剂盒还包括ACTB引物对和荧光探针组合，所述ACTB为内参基因，该组合用于扩增所述人源生物样品中经亚硫酸盐处理后的ACTB基因保守序列。
优选地，所述ACTB基因的保守序列具体选自GRCh38:7:5561241～5561495区域。
优选地，所述ACTB引物对和荧光探针组合的具体情况如表2所示：
表2
进一步地，在上述技术方案中，所述检测试剂盒的PCR反应体系可以为：共20μL，1.2×Taqman qPCR缓冲液、6mM的MgCl2溶液、250nM的脱氧核糖核苷三磷酸混合液、1.5个活性单位的DNA聚合酶、引物探针组合、纯化水。具体地，所述引物探针组合包括组合1～14中的至少一个以及组合15。
进一步地，在上述技术方案中，所述人源生物样品包括但不限于组织、血液、血浆、血清、痰液、尿液、胸水和肺泡灌洗液等。
优选地，所述人源生物样品为血液、血浆、血清或痰液。
更加优选地，所述人源生物样品为血浆或血清。
进一步地，在上述技术方案中，所述检测试剂盒中还包括有对人源生物样品进行DNA提取和纯化试剂。
其中，所述提取和纯化试剂包含亚硫酸盐转化剂，所述亚硫酸盐转化剂可以将所述人源生物样品DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶残基保持不变。经亚硫酸盐转化剂转化后的模板序列在随后的PCR扩增反应中与试剂盒中的相对应的引物对和荧光探针组合互补结合，模板上甲基化的胞嘧啶残基位点作为胞嘧啶残基与引物的鸟嘌呤残基配对，而未甲基化的胞嘧啶残基位点作为尿嘧啶残基不能与试剂盒中引物配对结合。
优选地，所述亚硫酸盐转化剂为亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵、偏重亚硫酸钠中的一种或两种。
进一步地，在上述技术方案中，所述检测试剂盒中包含有阴性质控品和阳性质控品。
优选地，所述阴性质控品为纯化水、检测靶区域甲基化阴性的细胞DNA经亚硫酸盐转化后的bisDNA或人工合成的检测靶区域甲基化阴性的质粒中的任意一种。
优选地，所述阳性质控品为检测靶区域序列甲基化阳性的细胞DNA经亚硫酸盐转化后的bisDNA或人工合成的检测靶甲基化阳性的质粒中的任意一种。
进一步地，在上述技术方案中，所述检测试剂盒中还可以包括说明书，所述说明书用于阐述所述检测试剂盒的使用方法，以及对检测结果进行判断说明的方法。
优选地，所述说明书的内容包括：采用逻辑回归的统计方法，针对不同甲基化基因靶序列或组合构建诊断模型，设定不同的cutoff值；根据检测结果，对受试者罹患肺癌的风险进行预测和评估。
优选地，所述检测试剂盒的使用方法可以参照以下步骤：
对待测样品进行处理得到bisDNA溶液，取其中5～10μL用试剂盒中的引物对和荧光探针组合进行甲基化检测，同时检测阳性质控品至阴性质控品；所述引物对和荧光探针组合包括组合1～14中的至少一个以及组合15；
使用检测试剂盒中的说明书分析检测样品肺癌相关基因靶序列的甲基化情况。
更加优选地，所述待测样品的处理过程可参考以下步骤：
(1)样品收集：获取人源血浆或血清；
(2)裂解：取2.0mL血浆或血清，向其中加入2.0mL裂解液、200μL蛋白酶K，室温孵育15min；所述裂解液包括蛋白变性剂、表面活性剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂；
(3)转化：向步骤(2)中的混合液中加入1.0mL转化液，分别于98℃孵育10min，64℃孵育60min；所述转化混合液包括亚硫酸盐转化剂、保护剂和pH调节剂；
(4)离心：向步骤(3)中加入2.0mL异丙醇，涡旋混匀后16000g离心1min，用移液器小心吸取下层澄清液体于新的离心管中；
(5)结合：向步骤(4)中的混合液加入2.0mL结合液和100μL磁珠，室温孵育2min后进行磁分离；所述结合液包括离液盐和NaCl；
(6)漂洗：将步骤(5)中获得的磁珠用800μL漂洗液漂洗后进行磁分离；重复该步骤一次；
(7)脱硫：向步骤(6)中漂洗后的磁珠中加入800μL脱硫剂，室温孵育15min后进行磁分离；
(8)漂洗：将步骤(7)中获得的磁珠用800μL漂洗液漂洗两次后进行磁分离；
(9)洗脱：向步骤(8)中获得的磁珠中加入40～100μL洗脱液，56℃孵育5min后磁分离，获取bisDNA溶液。
本发明的有益效果：本发明采用对肺癌相关基因SHOX2、RASSF1A、PTGER4、TAC1、SOX17、CDO1、HOXA9中的一种或多种基因的甲基化水平进行检测的方法，实现了对肺癌的辅助诊断和早期肺癌无创筛查；通过定位肺癌相关甲基化基因的靶区域，以及采用不同肺癌相关甲基化基因的组合，有效避免了肺癌相关甲基化标志物的不确定性和ctDNA片段缺失所造成的局限性，并提高了检测的准确性和特异性。而且，本发明试剂盒可以检测通过无创手段获取的生物样品，提升了受试者的依从性。故，本发明提供的试剂盒可以实现肺癌的早诊早治，提高患者生存率，具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1为实施例1中血浆样本提取纯化后bisACTB检测结果示意图；
图2为实施例2中的检测试剂盒检测1×104copies/μL DNA溶液中浓度梯度基因甲基化扩增结果示意图；
图3为实施例3中的检测试剂盒检测结果与临床结果比对所得ROC曲线图；
图4为实施例4中7个甲基化基因检测结果与临床结果比对所得ROC曲线图；
图5为实施例4中较优选组合标志物检测结果与临床结果比对所得ROC曲线；
图6为实施例4中对比组合标志物检测结果与临床结果比对所得ROC曲线图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明为达到预期目的所采取的技术方案和实施效果，以下通过具体的实施例对本发明的具体实施方式、特点和效果进行详细说明。需要理解的是，以下实施例只是作为示例用来更加清楚地阐述本发明的技术方案，并非用来限制本发明。
本发明选取了7种肺癌相关甲基化基因标志物，具体为SHOX2、RASSF1A、PTGER4、TAC1、SOX17、CDO1和HOXA9，并为每个标志物都提供了两个靶区域。进一步地，针对不同标志物的不同靶序列，分别设计了14个引物对和荧光探针组合。本发明提供的检测试剂盒包括14个组合中的至少一个组合；优选地，检测试剂盒包括14个组合中的至少两个组合，且两个组合最好来自不同的标志物。
针对上述检测试剂盒，本发明在某一具体的实施方式中采用逻辑回归分析方式构建多标志物联合诊断模型来检测肺癌。通过将样本分成病例组和对照组，用SPSS或Medcalc软件对检测数据和临床结果进行逻辑分析，得出每个标志物的回归系数和一个偏差常数，即得到相应的逻辑回归方程。再将每个标志物的检测Ct值代入逻辑回归方程中，根据逻辑分数公式计算相应的逻辑分数，用Medcalc软件对逻辑分数和临床结果进行ROC曲线分析，选择95％置信区间内最佳的cutoff值。
下述实施例中，未注明仪器、耗材和试剂，均为可通过市售购买的常规产品。
实施例1DNA提取纯化
DNA提取和纯化试剂由裂解液、蛋白酶K、转化液、结合液、漂洗液A、脱硫剂、漂洗液B和洗脱液组成。
裂解液由蛋白变性剂、表面活性剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂组成。
转化液由亚硫酸盐转化剂、保护剂和pH调节剂组成，其中，亚硫酸盐转化剂为亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵、偏重亚硫酸钠中的一种或两种，保护剂为氢醌或Trolox，pH调节剂为NaOH。
结合液由高浓度离液盐和NaCl组成。
漂洗液A由高浓度离液盐、核酸酶抑制剂、pH缓冲剂和无水乙醇组成。
脱硫剂由NaOH和无水乙醇组成。
漂洗液B由核酸酶抑制剂、pH缓冲剂和无水乙醇组成。
洗脱液由核酸酶抑制剂和pH缓冲剂组成。
在本实施例中，所述蛋白变性剂为硫氰酸胍，所述表面活性剂为NP-40，所述pH缓冲剂为Tris-HCl，所述核酸酶抑制剂为EDTA，所述离液盐为盐酸胍。
本实施例以肺癌患者血浆样本为例，经过提取纯化，获得血浆bisDNA。提取纯化方法包括如下步骤：
(1)将新鲜采集的EDTA抗凝血样4℃、1600g离心10min，小心地吸出血浆上清液，并转移到新的离心管中；
(2)继续4℃、16000g离心10min，进一步去除附着在细胞碎片上的细胞源核酸，小心地将上清液吸出并转移到新的离心管中；
(3)取2.0mL血浆，向其中加入2.0mL裂解液、200μL蛋白酶K，涡旋振荡混匀，室温孵育15min，期间每3～5min上下颠倒混匀10sec；
(4)继续加入1.0mL转化混合液，振荡混匀后简短离心，以去除管盖内壁的液滴，分别于98℃孵育10min，64℃孵育60min；
(5)孵育完成后加入2.0mL异丙醇，涡旋混匀后16000g离心1min，用移液器小心吸取下层澄清液体与新的离心管中；
(6)向以上混合液中加入2.0mL结合液和100μL磁珠，室温孵育10min，期间每3min上下颠倒混匀10sec，孵育结束后用磁分离器吸附磁珠2min，然后弃去上清溶液；
(7)加入800μL漂洗液A重悬磁珠，振荡清洗1min，用磁分离器吸附磁珠1min，然后弃去上清溶液；重复该步骤一次；
(8)加入800μL脱硫剂重悬磁珠，室温孵育15min，期间每3～5min上下颠倒混匀10sec；用磁分离器吸附磁珠1min，然后弃去上清溶液。
(9)加入800μL漂洗液B重悬磁珠，振荡清洗1min，用磁分离器吸附磁珠1min，然后弃去上清溶液；
(10)重复步骤(9)一次，6000g快速离心30sec，用磁分离器吸附磁珠，去除残余上清溶液，室温静置5min，以去除残余乙醇；
(11)加入100μL洗脱缓冲液重悬磁珠，振荡洗脱2min，用磁分离器吸附磁珠，吸取上清于新的离心管中，做好标记；
(12)将标记好的DNA存放于4℃冰箱待用，或者保存于-20℃冰箱长期保存。
使用本实施例提供的DNA提取和纯化试剂以及制备方法，能够实现DNA提取转化一步完成。
用以上方法提取6例肺癌患者血浆样本，通过荧光定量PCR检测内参基因bisACTB的Ct值见图1，其中用于扩增内参基因bisACTB的引物探针组合为组合15(bisACTB的制备检测具体过程可参考实施例2)。
实施例2一种检测试剂盒
本实施例提供的检测试剂盒选择TAC1、PTGER4和SHOX2三个基因标志物中各一个靶区域作为检测区域，具体为：
TAC1基因的靶区域为GRCh38:7:97732108～97732308；
PTGER4基因的靶区域为GRCh38:5:40681355～40681679；
SHOX2靶区域为GRCh38:3:158098932-158099255。
针对以上检测区域的核酸序列，分别构建甲基化状态下和非甲基化状态下经亚硫酸盐转化之后的人工合成质粒作为阳性质控品和阴性质控品，分别命名为TAC1-M1、TAC1-UM1、PTGER4-M1、PTGER4-UM1、SHOX2-M1和SHOX2-UM1。
为了监控模板DNA质量和PCR检测结果是否有效，以ACTB作为内参，ACTB基因的检测区域为GRCh38:7:5561241～5561495。根据ACTB检测区域经亚硫酸盐转化后的序列，构建对应的人工合成质粒bisACTB。
用以上质粒分别配制不同浓度梯度的甲基化基因溶液，包括单个基因甲基化、两个基因甲基化和三个基因甲基化，每种甲基化组合均配制出1x104copies/μLDNA模板中含有100％基因甲基化，10％基因甲基化，1％基因甲基化，0.1％基因甲基化和0％基因甲基化的模板DNA溶液。以SHOX2为例，列出每种浓度甲基化DNA模板的配制方法如下：
(1)SHOX2 100％甲基化溶液配制：10％体积的1×105copies/μL的SHOX2-M1和10％体积的1×105copies/μL bisACTB以及80％体积的TE缓冲液充分混匀所得溶液；
(2)SHOX2 10％甲基化溶液配制：10％体积的1×104copies/μL的SHOX2-M1、9％体积的1×105copies/μL的SHOX2-UM1和10％体积的1×105copies/μL bisACTB以及71％体积的TE缓冲液充分混匀所得溶液；
(3)SHOX2 1％甲基化溶液配制：10％体积的1×103copies/μL的SHOX2-M1、9.9％体积的1×105copies/μL的SHOX2-UM1和10％体积的1×105copies/μLbisACTB以及70.1％体积的TE缓冲液充分混匀所得溶液；
(4)SHOX2 0.1％甲基化溶液配制：10％体积的1×102copies/μL的SHOX2-M1、9.99％体积的1×105copies/μL的SHOX2-UM1和10％体积的1×105copies/μLbisACTB以及70.01％体积的TE缓冲液充分混匀所得溶液；
(5)SHOX2 0％甲基化溶液配制：10％体积的1×105copies/μL的SHOX2-UM1和10％体积的1×105copies/μL bisACTB以及80％体积的TE缓冲液充分混匀所得溶液。
本实施例中检测以上甲基化基因组合的引物对和荧光探针组合包括检测SHOX2基因甲基化的组合2，检测TAC1甲基化的组合7，检测PTGER4甲基化的组合6，检测内参基因ACTB的组合15。
其中，组合2中荧光探针5’端荧光报告基团为FAM，3’端荧光淬灭基团为MGB；组合7中荧光探针5’端荧光报告基团为ROX，3’端荧光淬灭基团为BHQ-2；组合6中荧光探针5’端荧光报告基团为Cy5，3’端荧光淬灭基团为BHQ-3；组合15中荧光探针5’端荧光报告基团为VIC，3’端荧光淬灭基团为MGB。
本实施例中PCR反应体系除包括以上4个组合外，还包括1.2×Taqman qPCR缓冲液、6mM的MgCl2溶液、250nM的脱氧核糖核苷三磷酸混合液、1.5个活性单位的DNA聚合酶以及纯化水，共20μL。
向以上20μL混合反应液中分别加入5μL不同浓度梯度的甲基化基因溶液，每种溶液重复检测3次，进行荧光定量PCR反应。
荧光定量PCR反应程序包括三个阶段：95℃5min；95℃15s，62℃30s，10个循环；95℃15s，60℃30s，35个循环；在第三阶段收集FAM/ROX/Cy5/VIC荧光信号。以FAM/ROX/Cy5/VIC荧光信号达到设定的阈值所需的循环数Ct值为标准，出现扩增曲线的基因则为甲基化阳性，否则为阴性。
检测结果显示，不论是单个基因甲基化、两个基因甲基化，还是三个基因甲基化的不同浓度梯度甲基化溶液，每个甲基化基因均能稳定检出，且甲基化阴性模板无扩增。其中1×104copies/μL DNA溶液中三个基因浓度梯度甲基化检测结果如图2所示。
由本实施例可知，本发明提供的肺癌辅助诊断和/或早期肺癌无创筛查的多基因甲基化检测试剂盒，能够检出1×104copies/μL DNA溶液中0.1％的基因甲基化。
实施例3逻辑回归分析和cutoff值设置
本实施例采用实施例2中提供的试剂盒和检测方法，说明对样本进行逻辑回归分析和cutoff值设置的方法。
本实施例通过检测20例正常人血浆样本、25例肺部良性疾病病人血浆样本、51例肺癌病人血浆样本中SHOX2、TAC1和PTGER4的甲基化情况，用SPSS或Medcalc软件对检测数据和临床结果进行逻辑分析，得到相应的逻辑回归方程：y＝k1×x1+k2×x2+k3×x3+b。其中x1/x2/x3分别为SHOX2、TAC1、PTGER4基因扩增Ct值，k1/k2/k3分别为SHOX2、TAC1、PTGER4基因的临床系数，b为常数，具体数值见表3：
表3
| 基因 | SHOX2 | TAC1 | PTGER4 | 常数 |
| 数值 | -0.2749(k<sub>1</sub>) | -0.42624(k<sub>2</sub>) | -0.70429(k<sub>3</sub>) | 44.96082(b) |
根据公式S＝EXP(y)/[EXP(y)+1]×100计算得出相应的逻辑分数。用Medcalc软件对逻辑分数和临床结果进行ROC曲线分析，选择最佳cutoff值。
本实施例中ROC曲线如图3所示，获得的cutoff值见表4：
表4
根据以上表格，在检测临床样本时，当逻辑分数≥46.26时，即为罹患肺癌高风险，建议受试者接受进一步临床检查；当逻辑分数＜46.26时，即为罹患肺癌低风险，建议受试者每年一次甲基化检测。
实施例4标志物的ROC曲线分析
本实施例提供了本发明中提供的7种甲基化基因标志物及多标志物联合检测模型ROC曲线分析结果。
收集237例临床血浆样本，其中包括83例正常病人样本，74例肺部结节病人样本(其中良性结节45例，炎性结节29例)，80例非小细胞肺癌病人样本(其中0期2例，I期9例，II期18例，III期26例，IV期25例)。
按照实施例1中的方法，获得237例对应的bis-cfDNA模板。然后使用本发明提供的各个标志物的引物对和荧光探针组合进行荧光定量PCR检测，获得每个标志物的甲基化水平检测数据。使用MedCalc软件，选择95％置信区间，产生ROC曲线及其曲线下面积(AUC)值。表5展示了本发明7个甲基化基因两个靶序列ROC曲线的曲线下面积(AUC)，各个基因的ROC曲线见图4。
表5
根据ROC曲线分析可知：7个甲基化基因的两个靶区域的曲线下面积结果较为一致，但也存在一定差异，可同时选择一个基因的两个靶区域或者任意一个进行检测；7个基因的曲线下面积中TAC1和PTGER4的面积最大且差异面积最大，优先选择二者组合。
同时检测标志物的两个靶区域或同时检测更多的标志物，可以获得更好的灵敏度和特异性，但会增加使用成本。采用荧光定量PCR的方法，同时检测3个标志物，无疑是兼顾灵敏度和特异性的较优方案。
本实施例采用至少包括TAC1和PTGER4的3个标志物的组合，用实施例2中的逻辑回归方法，不同组合的ROC曲线下面积(AUC)、cutoff值及对应的灵敏度和特异性，具体结果见表6，ROC曲线见图5。
表6
| 标志物组合 | 灵敏度％ | 特异性％ | Cutoff | AUC | 95％CI |
| PTGER4/TAC1/SHOX2 | 86.25 | 89.81 | >27.25 | 0.926 | 0.885to 0.956 |
| PTGER4/TAC1/RASSF1A | 86.25 | 88.54 | >30.02 | 0.937 | 0.898to 0.964 |
| PTGER4/TAC1/SOX17 | 81.25 | 89.81 | >33.33 | 0.946 | 0.909to 0.971 |
| PTGER4/TAC1/CDO1 | 80 | 89.81 | >37.88 | 0.941 | 0.903to 0.967 |
| PTGER4/TAC1/HOXA9 | 83.75 | 89.17 | >31.85 | 0.936 | 0.897to 0.964 |
为了更好地说明表6中组合标志物的有益效果，本实施例中同时分析了一些不同时包括TAC1和PTGER4的标志物组合的ROC曲线下面积(AUC)、cutoff值及对应的灵敏度和特异性，具体结果见表7，ROC曲线见图6。
表7
| 标志物组合 | 灵敏度％ | 特异性％ | Cutoff | AUC | 95％CI |
| SHOX2/RASSF1A/PTGER4 | 75 | 91.12 | >32.6 | 0.842 | 0.789to 0.886 |
| SHOX2/RASSF1A/TAC1 | 80 | 89.17 | >32.78 | 0.873 | 0.823to 0.912 |
| SHOX2/RASSF1A/SOX17 | 68.75 | 89.17 | >38.22 | 0.895 | 0.849to 0.931 |
| SHOX2/PTGER4/SOX17 | 72.5 | 89.81 | >38.53 | 0.910 | 0.867to 0.944 |
| SHOX2/PTGER4/HOXA9 | 70 | 89.17 | >35.73 | 0.874 | 0.825to 0.913 |
| SHOX2/SOX17/HOXA9 | 70 | 89.17 | >42.61 | 0.886 | 0.838to 0.923 |
对比表6和表7结果，可以看出至少包括TAC1和PTGER4的三标志物联合检测模型与不同时包括TAC1和PTGER4的三标志物联合检测模型相比，ROC曲线下面积(AUC)明显更大，且在保持90％附近的特异性时，具有更好的灵敏度。说明至少包括TAC1和PTGER4的三标志物联合检测模型可以作为较优的组合标志物应用于肺癌临床检测。
需要说明的是，本实施例从使用成本上考虑只对包括TAC1和PTGER4在内的三个标志物单个检测区域联合检测模型进行展开分析，且只展开部分组合模型，不代表本发明的所有实施例。使用者可根据实际需要，如需要更好的有益效果，可以选择三个以及三个以上的标志物单个检测区域或两个检测区域进行联合检测。
同时，本实施例中不同组合模型cutoff值设定是在保持90％附近的特异性所设定的cutoff值，不代表本发明仅能使用该cutoff值，根据不同的使用目的，可在本发明提供的ROC曲线中选择合适的cutoff值。
实施例5多标志物联合检测模型在肺癌检测临床应用的效果
本实施例提供了实施例4中多标志物联合检测模型在肺癌检测临床应用的实际效果。
选择PTGER4/TAC1/SHOX2组合的临床检测结果进行分析，检测实际效果与临床诊断结果比对结果见表8所示。
表8
上表检测结果显示本发明提供PTGER4/TAC1/SHOX2标志物组合检测该批237例临床样本的检测肺癌的总体灵敏度为86.25％，特异度为90.45％，准确度为89.03％，其中，肺癌0期-II期的灵敏度为82.76％。故本申请提供的试剂盒可以用于肺癌的辅助诊断或者用于一般风险人群的肺癌早期筛查。
本实施例只是用PTGER4/TAC1/SHOX2组合展现多标志物联合检测肺癌的临床使用效果，使用者可根据实际使用预期用途选择合适的组合模型进行临床应用。
以上所述实施例为本发明的部分实施例，并非全部实施例。本领域技术人员可以对上述各实施例的技术方案进行修改或对部分技术特征进行等同替换，这些修改和替换均在本发明保护范围之内。
序列表
<110> 武汉康录生物技术股份有限公司
<120> 一种用于肺癌诊断和早期肺癌无创筛查的检测试剂盒
<160> 45
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tatcgggagg tgttggagag c 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcccgaacta ccgaactact acg 23
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgcctcgat acaaccg 17
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttcgtttcg tttgttcgat c 21
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctaccttcta acccgactta aacg 24
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcgtacgagt ataggcgtt 19
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tggtttcgtt cggttcgc 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atacgcaacg cgttaacacg 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgggagttgg tattcgttgg gcg 23
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgaagcgtgc gtgttttc 18
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgatcgcgta cgtacgtata cg 22
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaaaccgcgc cgcaaccg 18
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttttatttcg cgcgtttagt ttc 23
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaacgcccat taaccgaatt aa 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aacgcgtcct ccctaaacgc cg 22
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agcgattggc gggttttac 19
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tactacaacc gcgaactacc g 21
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttgtagttta tgcgtttaac gt 22
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gagcgattag cgtgcgttc 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cgaaataacc cgaacaaccg 20
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cgcgaacact tactacg 17
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acgtggtacg tatcgttatt acgg 24
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
caaaatcccg taaaaaaccc g 21
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
acccctttcc atcctctcgc acg 23
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gtttggattt tgttgcgtta gtc 23
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aaacaccgac cgaaaccg 18
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aaagcgttta tcggtcgtc 19
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tttgtacggt ttggttgagt cg 22
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccgacgaaaa aaccctactc g 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ataaccacgc gaccgccctc g 21
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tacgcgattt ttgggacgtc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ctacgaacac gactcacgcg 20
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ccccgacttc cccgaactcc g 21
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cgagtgggta atgtacgtta agttc 25
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cattcctcct caaacgaaac g 21
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cgccgcctaa cattaaaact acaacgcg 28
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ggtttatttg tcgttcgtcg tc 22
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ccaccgctac ccgacgac 18
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ctacctcatt acgcttaccg cccaacg 27
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cgtagtaatt cggggttggt tc 22
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cttccgaacc gcatcgac 18
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cgcggtttcg atttttcgtt cgc 23
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ggtgtttgtt tttttgatta ggtgt 25
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
acctcataac cttatcacac aaacc 25
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tacctacacc cacaacac 18
Claims (10)
1.一种用于肺癌诊断和早期肺癌无创筛查的检测试剂盒，其特征在于，包括用于检测人源生物样品中肺癌相关基因的靶区域的甲基化水平的引物对和荧光探针组合；
所述引物对和荧光探针组合用于对亚硫酸盐处理后的肺癌相关基因的靶区域进行荧光定量PCR扩增；
所述肺癌相关基因为SHOX2、RASSF1A、PTGER4、TAC1、SOX17、CDO1、HOXA9中的一种或多种；
所述SHOX2基因的靶区域为GRCh38:3:158096232～158097040和/或GRCh38:3:158098541～158099300的全长区域或部分区域；
所述RASSF1A基因的靶区域为GRCh38:3:50329626～50330340和/或GRCh38:3:50332982～5033697的全长区域或部分区域；
所述PTGER4基因的靶区域为GRCh38:5:40679563～40680228和/或GRCh38:5:40680965～40681833的全长区域或部分区域；
所述TAC1基因的靶区域为GRCh38:7:97731978-97732326和/或GRCh38:7:97732777-97733338的全长区域或部分区域；
所述SOX17基因的靶区域为GRCh38:8:54457679～54458470和/或GRCh38:8:54459030～54459859的全长区域或部分区域；
所述CDO1基因的靶区域为GRCh38:5:115804358～115804732和/或GRCh38:5:115804748～115805462的全长区域或部分区域；
所述HOXA9基因的靶区域为GRCh38:7:27163398～27163804和/或GRCh38:7:27163836～27164255的全长区域或部分区域。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述肺癌相关基因为SHOX2、RASSF1A、PTGER4、TAC1、SOX17、CDO1、HOXA9中的至少两种，所述肺癌相关基因至少包括PTGER4和TAC1。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，
用于扩增所述SHOX2基因的靶区域的引物对和荧光探针组合为组合1和/或组合2，所述组合1的引物对序列如SEQ ID No.1～2所示，所述组合1的荧光探针序列如SEQ ID No.3所示，所述组合2的引物对序列如SEQ ID No.4～5所示，所述组合2的荧光探针序列如SEQ IDNo.6所示；
用于扩增所述RASSF1A基因的靶区域的引物对和荧光探针组合为组合3和/或组合4，所述组合3的引物对序列如SEQ ID No.7～8所示，所述组合3的荧光探针序列如SEQ ID No.9所示，所述组合4的引物对序列如SEQ ID No.10～11所示，所述组合4的荧光探针序列如SEQID No.12所示；
用于扩增所述PTGER4基因的靶区域的引物对和荧光探针组合为组合5和/或组合6，所述组合5的引物对序列如SEQ ID No.13～14所示，所述组合5的荧光探针序列如SEQ IDNo.15所示，所述组合6的引物对序列如SEQ ID No.16～17所示，所述组合6的荧光探针序列如SEQ ID No.18所示；
用于扩增所述TAC1基因的靶区域的引物对和荧光探针组合为组合7和/或组合8，所述组合7的引物对序列如SEQ ID No.19～20所示，所述组合7的荧光探针序列如SEQ ID No.21所示，所述组合8的引物对序列如SEQ ID No.22～23所示，所述组合8的荧光探针序列如SEQID No.24所示；
用于扩增所述SOX17基因的靶区域的引物对和荧光探针组合为组合9和/或组合10，所述组合9的引物对序列如SEQ ID No.25～26所示，所述组合9的荧光探针序列如SEQ IDNo.27所示，所述组合10的引物对序列如SEQ ID No.28～29所示，所述组合10的荧光探针序列如SEQ ID No.30所示；
用于扩增所述CDO1基因的靶区域的引物对和荧光探针组合为组合11和/或组合12，所述组合11的引物对序列如SEQ ID No.31～32所示，所述组合11的荧光探针序列如SEQ IDNo.33所示，所述组合12的引物对序列如SEQ ID No.34～35所示，所述组合12的荧光探针序列如SEQ ID No.36所示；
用于扩增所述HOXA9基因的靶区域的引物对和荧光探针组合为组合13和/或组合14，所述组合13的引物对序列如SEQ ID No.37～38所示，所述组合13的荧光探针序列如SEQ IDNo.39所示，所述组合14的引物对序列如SEQ ID No.40～41所示，所述组合14的荧光探针序列如SEQ ID No.42所示。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，所述荧光探针的3’端标记有荧光淬灭基团；
所述荧光报告基团为FAM、ROX、VIC、JOE、CY3、CY5、NED、TAMRA和TEXAS RED中的任意一种；
所述荧光淬灭基团为AMRA、DABCYL、ECLIPSE、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3和MGB中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括用于扩增所述人源生物样品中经亚硫酸盐处理后的ACTB基因保守序列的ACTB引物对和荧光探针组合。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述ACTB引物对和荧光探针组合中的引物对序列如SEQ ID No.43～44所示，且其荧光探针序列如SEQ ID No.45所示。
7.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述人源生物样品包括组织、血液、血浆、血清、痰液、尿液、胸水或肺泡灌洗液。
8.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括对人源生物样品进行DNA提取和纯化试剂；所述提取和纯化试剂包含将所述人源生物样品DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的亚硫酸盐转化剂。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述亚硫酸盐转化剂为亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵、偏重亚硫酸钠中的一种或两种以上。
10.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：
阴性质控品，为纯化水、检测靶区域甲基化阴性的细胞DNA经亚硫酸盐转化后的bisDNA或人工合成的检测靶区域甲基化阴性的质粒中的任意一种；
阳性质控品，为检测靶区域序列甲基化阳性的细胞DNA经亚硫酸盐转化后的bisDNA或人工合成的检测靶甲基化阳性的质粒中的任意一种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210102556.6A CN114277154B (zh) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | 一种用于肺癌诊断和早期肺癌无创筛查的检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210102556.6A CN114277154B (zh) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | 一种用于肺癌诊断和早期肺癌无创筛查的检测试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114277154A true CN114277154A (zh) | 2022-04-05 |
| CN114277154B CN114277154B (zh) | 2022-11-29 |
Family
ID=80881796
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210102556.6A Active CN114277154B (zh) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | 一种用于肺癌诊断和早期肺癌无创筛查的检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114277154B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115976205A (zh) * | 2022-09-28 | 2023-04-18 | 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 | 一种适于数字pcr定量检测肺癌相关基因甲基化的引物探针组合、试剂盒及检测方法 |
| CN116987788A (zh) * | 2023-06-19 | 2023-11-03 | 嘉兴允英医学检验有限公司 | 一种利用冲洗液检测早期肺癌的方法与试剂盒 |
| WO2023236201A1 (en) * | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Suzhou Huhu Health Technology Co., Ltd | Methods, compositions, and kits for detecting malignant lung nodules and lung cancer |
| CN117737250A (zh) * | 2024-02-21 | 2024-03-22 | 上海金翌生物科技有限公司 | 一种膀胱癌生物标志物甲基化水平检测的方法及试剂盒 |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130022974A1 (en) * | 2011-06-17 | 2013-01-24 | The Regents Of The University Of Michigan | Dna methylation profiles in cancer |
| CN107034296A (zh) * | 2017-06-05 | 2017-08-11 | 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 | 一种用于早期肺癌无创筛查的组合物及其应用 |
| CN109825586A (zh) * | 2019-03-11 | 2019-05-31 | 深圳市新合生物医疗科技有限公司 | 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法 |
| CN110229908A (zh) * | 2019-07-03 | 2019-09-13 | 四川沃文特生物技术有限公司 | 用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针及试剂盒 |
| CN110387421A (zh) * | 2019-08-28 | 2019-10-29 | 深圳市新合生物医疗科技有限公司 | 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法 |
| CN110964809A (zh) * | 2018-09-29 | 2020-04-07 | 广州市康立明生物科技有限责任公司 | Hoxa7甲基化检测试剂 |
| CN111254199A (zh) * | 2020-03-23 | 2020-06-09 | 郑州大学第一附属医院 | 与肺癌相关的keap1基因甲基化检测试剂盒 |
| CN112094912A (zh) * | 2020-10-16 | 2020-12-18 | 中国药科大学 | 一种用于鉴别肺结节良恶性的血浆游离dna甲基化基因组合及其应用 |
| CN112195245A (zh) * | 2020-10-16 | 2021-01-08 | 中国药科大学 | 血浆中肺癌相关甲基化基因组合及其应用 |
| EP3789505A1 (de) * | 2019-09-05 | 2021-03-10 | Forschungszentrum Borstel | Verfahren und mittel zur diagnose von lungenkrebs |
-
2022
- 2022-01-27 CN CN202210102556.6A patent/CN114277154B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130022974A1 (en) * | 2011-06-17 | 2013-01-24 | The Regents Of The University Of Michigan | Dna methylation profiles in cancer |
| CN107034296A (zh) * | 2017-06-05 | 2017-08-11 | 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 | 一种用于早期肺癌无创筛查的组合物及其应用 |
| CN110964809A (zh) * | 2018-09-29 | 2020-04-07 | 广州市康立明生物科技有限责任公司 | Hoxa7甲基化检测试剂 |
| CN109825586A (zh) * | 2019-03-11 | 2019-05-31 | 深圳市新合生物医疗科技有限公司 | 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法 |
| CN110229908A (zh) * | 2019-07-03 | 2019-09-13 | 四川沃文特生物技术有限公司 | 用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针及试剂盒 |
| CN110387421A (zh) * | 2019-08-28 | 2019-10-29 | 深圳市新合生物医疗科技有限公司 | 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法 |
| EP3789505A1 (de) * | 2019-09-05 | 2021-03-10 | Forschungszentrum Borstel | Verfahren und mittel zur diagnose von lungenkrebs |
| CN111254199A (zh) * | 2020-03-23 | 2020-06-09 | 郑州大学第一附属医院 | 与肺癌相关的keap1基因甲基化检测试剂盒 |
| CN112094912A (zh) * | 2020-10-16 | 2020-12-18 | 中国药科大学 | 一种用于鉴别肺结节良恶性的血浆游离dna甲基化基因组合及其应用 |
| CN112195245A (zh) * | 2020-10-16 | 2021-01-08 | 中国药科大学 | 血浆中肺癌相关甲基化基因组合及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ALICIA HULBERT等: ""Early Detection of Lung Cancer Using DNA Promoter Hypermethylation in Plasma and Sputum"", 《CLIN CANCER RES》 * |
| BING WEI等: ""A panel of DNA methylation biomarkers for detection and improving diagnostic efficiency of lung cancer"", 《SCIENTIFIC REPORTS》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023236201A1 (en) * | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Suzhou Huhu Health Technology Co., Ltd | Methods, compositions, and kits for detecting malignant lung nodules and lung cancer |
| CN115976205A (zh) * | 2022-09-28 | 2023-04-18 | 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 | 一种适于数字pcr定量检测肺癌相关基因甲基化的引物探针组合、试剂盒及检测方法 |
| CN116987788A (zh) * | 2023-06-19 | 2023-11-03 | 嘉兴允英医学检验有限公司 | 一种利用冲洗液检测早期肺癌的方法与试剂盒 |
| CN116987788B (zh) * | 2023-06-19 | 2024-03-01 | 嘉兴允英医学检验有限公司 | 一种利用冲洗液检测早期肺癌的方法与试剂盒 |
| CN117737250A (zh) * | 2024-02-21 | 2024-03-22 | 上海金翌生物科技有限公司 | 一种膀胱癌生物标志物甲基化水平检测的方法及试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114277154B (zh) | 2022-11-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114277154B (zh) | 一种用于肺癌诊断和早期肺癌无创筛查的检测试剂盒 | |
| WO2021128519A1 (zh) | Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒 | |
| EP3828291A1 (en) | Methylation modification-based tumor marker stamp-ep1 | |
| WO2023071889A1 (zh) | 用于检测胃癌淋巴结节转移相关的甲基化生物标记物或其组合及应用 | |
| EP3904515A1 (en) | Tumor marker stamp-ep3 based on methylation modification | |
| CN112195245A (zh) | 血浆中肺癌相关甲基化基因组合及其应用 | |
| EP3828273A1 (en) | Methylation modification-based tumor marker stamp-ep2 | |
| EP3916092A1 (en) | Tumor marker stamp-ep5 based on methylated modification | |
| CN111549135A (zh) | 一种用于宫颈癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法、应用 | |
| CN114672568B (zh) | 一种用于检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒 | |
| CN115516110A (zh) | 结直肠癌dna甲基化的检测方法及试剂 | |
| TW202012640A (zh) | Hoxa7甲基化檢測試劑 | |
| EP3904516A1 (en) | Methylation modification-based tumor marker stamp-ep6 | |
| CN116970705B (zh) | 用于尿路上皮癌基因甲基化检测的核酸产品、试剂盒及应用 | |
| EP3964578A1 (en) | Methylation-based modified tumor marker stamp-ep8 and application thereof | |
| WO2023226939A1 (zh) | 用于检测结直肠癌淋巴结转移的甲基化生物标记物及其应用 | |
| CN113943799A (zh) | 用于检测膀胱癌的组合物及其试剂盒和应用 | |
| WO2020063898A1 (zh) | Hoxa7甲基化检测试剂在制备肺癌诊断试剂中的用途 | |
| CN115820850A (zh) | 一种子宫内膜癌的生物标志物、探针引物组合和试剂盒 | |
| EP3964581A1 (en) | Tumor marker stamp-ep7 based on methylated modification and use thereof | |
| CN116814781A (zh) | 用于检测尿路上皮癌的标志物、试剂盒和装置 | |
| EP3964580A1 (en) | Tumor marker stamp-ep9 based on methylation modification and application thereof | |
| CN115772566B (zh) | 用于辅助检测肺癌体细胞erbb2基因突变的甲基化生物标记物及其应用 | |
| CN115772567B (zh) | 用于辅助检测肺癌体细胞tp53基因突变的甲基化位点及其应用 | |
| CN115772564B (zh) | 用于辅助检测肺癌体细胞atm基因融合突变的甲基化生物标记物及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 430075 Workshop No. 1-4 (1), No. 8, Wuhan Optics Valley Precision Medical Industry Base Phase I (all for own use), No. 9, Gaokeyuan 3rd Road, Wuhan East Lake New Technology Development Zone, Wuhan, Hubei Province Applicant after: WUHAN HEALTHCARE BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Address before: 430075 No. 666 High-tech Avenue, Donghu Development Zone, Wuhan City, Hubei Province, 4th Floor, B6 Building, Wuhan National Biological Industrial Base Applicant before: WUHAN HEALTHCARE BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. |
|
| CB02 | Change of applicant information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |