CN111254199A - 与肺癌相关的keap1基因甲基化检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种与肺癌相关的KEAP1基因甲基化检测试剂盒。所述试剂盒中包含扩增目的基因KEAP1的引物对(SEQ ID NO:1‑2)和扩增内参基因ACTB的引物对(SEQ ID NO:4‑5)，以及检测目的基因和内参基因的Taqman探针(SEQ ID NO:3和6)。本发明还提供一种检测方便、针对性强、无创性、检测准确率高的可用于检测与肺癌相关的KEAP1基因启动子区甲基化程度的方法，其中KEAP1基因CpG位点甲基化水平与肺癌的早期发病呈正相关，可通过对样品DNA甲基化水平测定来辅助早期诊断肺癌。本发明的试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对肺癌的筛查，无创性、检测率高且针对性强，有利于肺癌的早期发现和及时治疗。

Description

与肺癌相关的KEAP1基因甲基化检测试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物检测技术，具体地说，涉及一种与肺癌相关的KEAP1基因甲基化检测试剂盒。
背景技术
肺癌，又称原发性支气管癌，是对人类健康危害最大的恶性肿瘤之一，其死亡率居各类恶性肿瘤之首。在临床实践中，肺癌早期诊断一直是难点，但早期发现对癌症患者的有效治疗至关重要。目前，临床症状出现以后进行组织学和细胞学检查是肺癌诊断的金标准，但早期肺癌由于常无特殊症状而几乎不被医生和患者察觉，用常规的诊断方法也难以早期发现和早期定性诊断，并且活体取样检测也困难，严重影响了癌症的早期诊断和病人的预后。由于临床表现具有个体差异，多数患者就诊时已发展至晚期，因此早发现、早诊断、早治疗对延长肺癌恶性肿瘤患者生存期和降低死亡率有着重大意义。
与肺癌诊治有关的技术手段在不断改善，包括检测异常的基因突变，表观遗传修饰和利用免疫系统的潜力来控制肿瘤的生长等。而肿瘤标志物发展成为继影像诊断、病理诊断之后的肿瘤诊断治疗的新领域，对肿瘤的诊断、监测和治疗产生了重大影响；其中一个领域就是甲基化DNA检测。近年来研究表明，肺癌的发生发展与抑癌基因启动子区CpG岛甲基化导致的抑癌基因表达失活有关，且其可能发生在肺癌的早期，并且在肺癌确诊前就能被检测出来。DNA甲基化检测是肺癌早期诊断、患病风险预测、临床病程监控和疗效评估的潜在指标，且可以在体液或组织中检测到，能够反映肿瘤的存在、分化程度、预后估计和判断治疗效果等。
KEAP1是细胞防御氧化和亲电性应激损伤的重要蛋白，其与核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)组成重要的细胞防御体系。生理状况下，KEAP1结合Nrf2，并与E3泛素化连接酶结合，通过泛素化介导Nrf2蛋白降解，维持细胞浆内Nrf2处于较低水平。一旦细胞受到外源性或内源性的氧化应激或亲电性应激刺激，KEAP1便成为敏感的传感器，其通过对自身半胱氨酸残基的修饰，阻止Nrf2降解并促进Nrf2释放，而累积的Nrf2进入细胞核内，激活抗氧化反应元件(antioxidant responseelement,ARE)，进而激活ARE下游的细胞保护基因，从而保护细胞免受氧化应激或亲电性应激所致损伤。最新研究表明，KEAP1基因甲基化与肺癌密切相关，高甲基化的KEAP1以较高的敏感性和特异性将肺部良恶性病变区分来。
组织活检需要从病人取出标本，标本比较难以获得，而且也做到随时检测病情的发展，对受检者具有一定的创伤。此外，在外周循环血中，同一基因异常甲基化的DNA只占全部DNA的极小部分约0.1-1％，这些非甲基化DNA与甲基化DNA只存在微小的差异，需要从高度复杂的“背景”中检测出异常的甲基化DNA。另外循环血中的DNA(cfDNA/ctDNA)通常是已经降解(通常为几十到一百多碱基对)的片段，所以需要特别的抽提和检测技术才能获得较高的灵敏度。而在DNA甲基化检测方法上，亚硫酸氢盐处理+测序(BSP)方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准；其过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，用PCR扩增目的片段，并对PCR产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。因此，亟待开发一种能够检测样品DNA中基因1％低频甲基化水平，甲基化覆盖不限于1个CpG位点，检测结果可快速、直观、方便进行判别，成本较低的基因甲基化检测方法和试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种与肺癌相关的KEAP1基因甲基化检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种检测方便、针对性强、无创性、检测准确率高的可用于检测与肺癌相关的KEAP1基因启动子区甲基化程度/水平的方法，其中KEAP1基因CpG位点甲基化水平与肺癌的早期发病呈正相关，可通过对样品DNA甲基化水平测定来辅助早期诊断肺癌。
本发明构思如下：基因甲基化位点的选择直接与临床检测灵敏度相关。为了检测到较多的与功能关系密切的CpG位点，本发明人选取了人KEAP1基因启动子特定的甲基化区域(具体位置为转录起始位点上游-248bp～-174bp)，在此基础上，本发明人设计了高度特异的引物来扩增出不同的目的片段，并用高度特异的探针来识别。经过大量的实验和比较，最终确定了一对特性性和敏感性相对较高的引物和探针用于后续研究。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种与肺癌相关的KEAP1基因甲基化检测引物，包括序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物。
第二方面，本发明提供与SEQ ID NO:1-2所示引物配套使用的探针(Taqman探针)，探针序列如SEQ ID NO:3所示，探针序列的5′端具有荧光基团，3′端具有淬灭基团。
第三方面，本发明提供含有SEQ ID NO:1-2所示引物和/或SEQ ID NO:3所示探针的检测试剂或试剂盒。
第四方面，本发明提供与肺癌相关的KEAP1基因甲基化检测试剂盒，包括SEQ IDNO:1-2所示引物和SEQ ID NO:3所示探针。
所述试剂盒还包括用于检测内参基因ACTB的引物和探针(Taqman探针)，其中，ACTB检测引物包括序列如SEQ ID NO:4所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:5所示的反向引物；ACTB检测探针的序列如SEQ ID NO:6所示，探针的5′端具有荧光基团，3′端具有淬灭基团，且SEQ ID NO:6所示探针的荧光基团不同于SEQ ID NO:3所示探针的荧光基团。
优选地，SEQ ID NO:3所示探针的5′端荧光基团为FAM，SEQ ID NO:3所示探针的3′端淬灭基团为BBQ-650。SEQ ID NO:6所示探针的5′端荧光基团为VIC，SEQ ID NO:6所示探针的3′端淬灭基团为BHQI。
本发明中涉及的目的基因(KEAP1)、内参基因(ACTB)的引物及探针如下：
目的基因正向引物：
SEQ ID NO:1:5'-CGGTCGTCGGATTACGAGGT-3'
目的基因反向引物：
SEQ ID NO:2:5'-CGAAACTACGCGCCACCATC-3'
内参基因正向引物：
SEQ ID NO:4:5'-GGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAG-3'
内参基因反向引物：
SEQ ID NO:5:5'-CCACCACCCAACACACAATA-3'
目的基因Taqman探针：
SEQ ID NO:3:5'-6-FAM-GCGTTGTGCGTTGTTAAAAG-BBQ-650-3'
内参基因Taqman探针：
SEQ ID NO:6:5'-6-VIC-TTTGGATTGTGAATTTGTGTTTG-BHQ1-3'
进一步地，所述试剂盒还包括dNTPs、DNA聚合酶、可溶性镁盐、PCR反应缓冲液、血浆游离DNA提取试剂和DNA甲基化转化试剂等中的至少一种。
所述DNA甲基化转化试剂可以选自亚硫酸氢盐、重亚硫酸氢盐、亚硫酸盐和重亚硫酸盐等中的至少一种。
第五方面，本发明提供一种基于甲基化特异性PCR法检测血浆游离DNA中KEAP1基因甲基化的qPCR反应体系，所述反应体系按10μL计包含：10×PCR反应缓冲液0.5-1.5μL，200-500μM dNTPs，3-6mM MgCl2，1-4U热启动Taq DNA聚合酶，SEQ ID NO:1所示的正向引物、SEQ ID NO:2所示的反向引物各300-500nM，SEQ ID NO:3所示的探针200-400nM，SEQ IDNO:4所示的正向引物、SEQ ID NO:5所示的反向引物各200-300nM，SEQ ID NO:6所示的探针50-150nM；30-60nM ROX染料；其中，SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物按等摩尔比混合，SEQ ID NO:4所示的正向引物和SEQ ID NO:5所示的反向引物按等摩尔比混合。
其中，PCR反应缓冲液包含50-150mM的Tris-HCl和400-600mM的KCl。
优选地，所述反应体系按10μL计包含：10×PCR反应缓冲液1μL，300μM dNTPs，4mMMgCl2，2U热启动Taq DNA聚合酶，SEQ ID NO:1所示的正向引物、SEQ ID NO:2所示的反向引物各400nM，SEQ ID NO:3所示的探针250nM，SEQ ID NO:4所示的正向引物、SEQ ID NO:5所示的反向引物各250nM，SEQ ID NO:6所示的探针100nM，50nM ROX染料。
其中，PCR反应缓冲液包含100mM的Tris-HCl和500mM的KCl。
第六方面，本发明提供一种非诊断目的与肺癌相关的KEAP1基因甲基化检测方法，包括如下步骤：
(1)血浆游离DNA提取：利用血浆游离DNA提取试剂从待测样本中提取血浆游离DNA；
(2)DNA甲基化转化：利用DNA甲基化转化试剂对提取的血浆游离DNA进行处理并随后进行纯化；
(3)荧光定量PCR扩增：以纯化后DNA为模板，利用SEQ ID NO:1-3所示的引物和探针以及SEQ ID NO:4-6所示的引物和探针进行PCR扩增；
(4)分析PCR扩增产物。
前述的方法，步骤(3)包括：以纯化后DNA作为模板，每个模板的PCR扩增做三个重复；每个反应体系(10μL)包含：10×PCR反应缓冲液0.5-1.5μL，200-500μM dNTPs，3-6mMMgCl2，1-4U热启动Taq DNA聚合酶，SEQ ID NO:1所示的正向引物、SEQ ID NO:2所示的反向引物各300-500nM，SEQ ID NO:3所示的探针200-400nM，SEQ ID NO:4所示的正向引物、SEQID NO:5所示的反向引物各200-300nM，SEQ ID NO:6所示的探针50-150nM；30-60nM ROX染料。
其中，PCR反应缓冲液包含50-150mM的Tris-HCl和400-600mM的KCl。
优选地，所述反应体系按10μL计包含：10×PCR反应缓冲液1μL，300μM dNTPs，4mMMgCl2，2U热启动Taq DNA聚合酶，SEQ ID NO:1所示的正向引物、SEQ ID NO:2所示的反向引物各400nM，SEQ ID NO:3所示的探针250nM，SEQ ID NO:4所示的正向引物、SEQ ID NO:5所示的反向引物各250nM，SEQ ID NO:6所示的探针100nM，50nM ROX染料。
其中，PCR反应缓冲液包含100mM的Tris-HCl和500mM的KCl。
扩增条件为：90-100℃预变性8-12min；90-100℃变性20-40s，60-70℃退火30-60s，65-75℃延伸30-60s，40-50个循环。
优选地，扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸45s，45个循环。
PCR反应结束后，将Ct阈值设定在线性扩增区间，Ct值小于40的扩增判定为阳性；
结果判定的标准如下：KEAP1靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性，则判定该靶点结果阳性。对于样本是否阳性的判定标准为，内参基因(ACTB)检测结果阳性，且KEAP1靶点检测为阳性，则判定该样本为阳性。
第七方面，本发明提供上述检测方法在肺癌早期诊断及预后评估中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供一种与肺癌相关的KEAP1基因甲基化检测试剂盒，还优化了PCR扩增反应程序，进一步提高了扩增效率。KEAP1基因启动子区域的甲基化水平可用于肺癌的早期诊断，可以方便快捷地在分子水平上实现对肺癌的筛查，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优势，有利于肺癌的早期发现和及时治疗。本发明的检测试剂盒采用Taqman探针荧光定量法，全程利用简单PCR反应而非传统复杂的亚硫酸氢盐处理+测序(BSP)方法，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，并且对仪器要求不高，过程不繁琐，减少了污染和操作误差，能够准确快速地检测KEAP1基因的甲基化程度。
附图说明
图1为本发明实施例1中对从10例健康对照人的血浆样本进行检测的部分结果。
图2为本发明实施例1中对20例肺癌病人的血浆样本进行检测的部分结果。
图3为本发明实施例1中利用试剂盒对早期肺癌的诊断价值分析(ROC曲线)结果。
图4为本发明实施例2中引物和探针的测试结果。
图5为本发明实施例2中引物和探针的测试结果。
图6为本发明实施例2中引物和探针的测试结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 利用本发明试剂盒对健康人和肺癌病人的血浆cfDNA/ctDNA样本进行KEAP1基因甲基化检测
一、实验材料
1.10例健康人的血浆样本和20例肺癌病人的血浆样本(样本来自郑州某三甲医院)；
2.游离DNA(cfDNA)提取试剂盒购自广州吉赛生物科技股份有限公司；
3.重亚硫酸盐修饰试剂盒购自Zymo Research公司；
4.本发明试剂盒，其中包含检测靶点KEAP1的引物及探针(SEQ ID NO:1-3)、检测内参基因ACTB的引物及探针(SEQ ID NO:4-6)；
5.DNA聚合酶及缓冲试剂购自天根生化科技(北京)有限公司。
二、实验方法
1.血浆游离DNA提取
使用游离DNA(cfDNA)提取试剂盒，从10例健康人血浆样本和20例肺癌病人的血浆样本中提取cfDNA，操作步骤按照试剂盒说明书进行。
2.游离DNA甲基化转化
使用Zymo Research公司的重亚硫酸盐修饰试剂盒对提取的30例血浆cfDNA/ctDNA进行亚硫酸氢盐处理并随后进行纯化。
3.qPCR扩增
对亚硫酸氢盐处理过的血浆ctDNA/cfDNA使用Thermo Fisher公司PCR仪器进行qPCR扩增，每个模板的PCR扩增做三个重复。该PCR扩增反应体系如下：
每个反应体系10μL，其中包含：10×PCR反应缓冲液1μL，300μM dNTPs，4mM MgCl2，2U热启动Taq聚合酶，50nM ROX染料，用于检测KEAP1基因的正、反向引物各400nM，KEAP1检测探针250nM，用于检测ACTB基因的正、反向引物各250nM，ACTB检测探针100nM；所述PCR缓冲液包括100mM的Tris-HCl和500mM的KCl；所述dNTPs包括dNTP、dGTP、dCTP和dTTP。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸45s，45个循环。
所用引物及探针序列分别如表1和表2所示。
表1检测相关基因的引物序列
Figure BDA0002421119420000061
表2检测相关基因的Taqman探针序列
基因 Taqman探针序列 序列编号
KEAP1 5'-GCGTTGTGCGTTGTTAAAAG-3' SEQ ID NO:3
ACTB 5'-TTTGGATTGTGAATTTGTGTTTG-3' SEQ ID NO:6
其中，目的基因KEAP1的Taqman探针序列5′端被FAM修饰，3′端被BBQ-650修饰；内参基因ACTB的Taqman探针序列5′端被VIC修饰，3′端被BHQI修饰。
三、实验结果
PCR反应结束后，将Ct阈值设定在线性扩增区间，Ct值小于40的扩增判定为阳性；
结果判定的标准如下：KEAP1靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性，则判定该靶点结果阳性。对于样本是否阳性的判定标准为，内参基因(ACTB)检测结果阳性，且KEAP1靶点检测为阳性，则判定该样本为阳性。
表3显示的是使用本发明试剂盒对20例肺癌病人血浆样本进行临床检测的信息。
表3 20例肺癌病人血液样本的临床信息
肺癌病人编号 年龄 临床分期 病理类型
1 71 Ia1期 非小细胞肺癌|腺癌
2 54 Ia2期 非小细胞肺癌|腺癌
3 77 IIb期 非小细胞肺癌|腺癌
4 64 Ia3期 非小细胞肺癌|鳞癌
5 61 IIa期 非小细胞肺癌|腺癌
6 54 Ia1期 非小细胞肺癌|腺癌
7 70 Ia2期 非小细胞肺癌|腺癌
8 58 IIb期 非小细胞肺癌|腺癌
9 51 Ia1期 非小细胞肺癌|腺癌
10 76 IIa期 非小细胞肺癌|腺癌
11 80 Ia1期 非小细胞肺癌|腺癌
12 65 Iab期 非小细胞肺癌|鳞癌
13 70 IIb期 非小细胞肺癌|腺癌
14 49 Ia3期 非小细胞肺癌|腺癌
15 51 IIa期 非小细胞肺癌|腺癌
16 55 Ia1期 非小细胞肺癌|鳞癌
17 77 Ia2期 非小细胞肺癌|鳞癌
18 81 IIa期 非小细胞肺癌|腺癌
19 72 Ia1期 非小细胞肺癌|腺癌
20 63 IIb期 非小细胞肺癌|鳞癌
测试结果显示，1例健康对照人KEAP1基因甲基化检测阳性和17例肺癌病人KEAP1基因甲基化检测阳性；经过综合分析，本发明试剂盒的灵敏度和特异性分别为85％和90％。该试剂盒的检测下限为25皮克。
图1所示为本发明对从10例健康对照人的血浆样本进行检测的部分结果。图2所示为本发明对20例肺癌病人的血浆样本进行检测的部分结果。图3为使用本发明试剂盒对早期肺癌的诊断价值分析(ROC曲线)，AUC值为0.88，p值为0.001。
实施例2 KEAP1引物及探针的优化
一、实验材料
1.甲基化阳性参照购自Zymo Research公司；
2.重亚硫酸盐修饰试剂盒购自Zymo Research公司；
3.检测试剂盒：包含检测靶点KEAP1的引物及探针、检测内参基因ACTB的引物及探针；
4.DNA聚合酶及缓冲试剂购自天根生化科技(北京)有限公司。
二、实验方法
1、甲基化阳性参照的甲基化转化
使用Zymo Research公司的重亚硫酸盐修饰试剂盒对10ng甲基化阳性参照进行亚硫酸氢盐处理并随后进行纯化。
2、qPCR扩增
对亚硫酸氢盐处理过的血浆ctDNA/cfDNA使用Thermo Fisher公司PCR仪器进行qPCR扩增，每个模板的PCR扩增做三个重复。该PCR扩增反应体系如下：
每个反应体系10μL，其中包含：10×PCR反应缓冲液1μL，300μM dNTPs，4mM MgCl2，2U热启动Taq聚合酶，50nM ROX染料，用于检测KEAP1基因的正、反向引物各400nM，KEAP1检测探针250nM，用于检测ACTB基因的正、反向引物各250nM，ACTB检测探针100nM；所述PCR缓冲液包括100mM的Tris-HCl和500mM的KCl；所述dNTPs包括dNTP、dGTP、dCTP和dTTP。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸45s，45个循环。
所用引物及探针序列分别如表1-表2以及表4-表5所示。
表4用于检测KEAP1基因效果差的引物序列
Figure BDA0002421119420000081
表5用于检测KEAP1基因效果差的Taqman探针序列
Figure BDA0002421119420000091
其中，目的基因KEAP1的Taqman探针序列5′端被FAM修饰，3′端被BBQ-650修饰；内参基因ACTB的Taqman探针序列5′端被VIC修饰，3′端被BHQI修饰。
三、实验结果
PCR反应结果显示，利用SEQ ID NO:7-9所示引物和探针(图4)以及SEQ ID NO:10-12所示的引物和探针均未扩增出来PCR曲线(图5)，但利用SEQ ID NO:1-3所示引物和探针扩增出来的曲线均一、光滑(图6)。以上结果表明SEQ ID NO:1-3所示的引物和探针为最佳检测引物和探针。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 郑州大学第一附属医院
<120> 与肺癌相关的KEAP1基因甲基化检测试剂盒
<130> P200102
<141> 2020-03-23
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggtcgtcgg attacgaggt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgaaactacg cgccaccatc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgttgtgcg ttgttaaaag 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtgatggag gaggtttagt aag 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccaccaccca acacacaata 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttggattgt gaatttgtgt ttg 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gattttgcgg tcgtcggatt 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttgtgcgttg ttaaaaggag a 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
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<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgaaactacg cgccaccatc ta 22
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgttaaaagg agaatagt 18

Claims (10)

1.与肺癌相关的KEAP1基因甲基化检测引物，其特征在于，包括序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物。
2.与权利要求1所述引物配套使用的探针，其特征在于，探针序列如SEQ ID NO:3所示，探针序列的5′端具有荧光基团，3′端具有淬灭基团。
3.含有权利要求1所述引物和/或权利要求2所述探针的检测试剂或试剂盒。
4.与肺癌相关的KEAP1基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物和权利要求2所述探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测内参基因ACTB的引物和探针，其中，ACTB检测引物包括序列如SEQ ID NO:4所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:5所示的反向引物；ACTB检测探针的序列如SEQ ID NO:6所示，探针的5′端具有荧光基团，3′端具有淬灭基团，且SEQ ID NO:6所示探针的荧光基团不同于SEQ ID NO:3所示探针的荧光基团。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO:3所示探针的5′端荧光基团为FAM，SEQ ID NO:3所示探针的3′端淬灭基团为BBQ-650；和/或
SEQ ID NO:6所示探针的5′端荧光基团为VIC，SEQ ID NO:6所示探针的3′端淬灭基团为BHQI。
7.根据权利要求4-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、DNA聚合酶、可溶性镁盐、PCR反应缓冲液、血浆游离DNA提取试剂和DNA甲基化转化试剂中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA甲基化转化试剂选自亚硫酸氢盐、重亚硫酸氢盐、亚硫酸盐和重亚硫酸盐中的至少一种。
9.一种基于甲基化特异性PCR法检测血浆游离DNA中KEAP1基因甲基化的qPCR反应体系，其特征在于，所述反应体系按10μL计包含：10×PCR反应缓冲液0.5-1.5μL，200-500μMdNTPs，3-6mM MgCl2，1-4U热启动Taq DNA聚合酶，SEQ ID NO:1所示的正向引物、SEQ IDNO:2所示的反向引物各300-500nM，SEQ ID NO:3所示的探针200-400nM，SEQ ID NO:4所示的正向引物、SEQ ID NO:5所示的反向引物各200-300nM，SEQ ID NO:6所示的探针50-150nM；30-60nM ROX染料；其中，SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物按等摩尔比混合，SEQ ID NO:4所示的正向引物和SEQ ID NO:5所示的反向引物按等摩尔比混合；
其中，PCR反应缓冲液包含50-150mM的Tris-HCl和400-600mM的KCl。
10.非诊断目的与肺癌相关的KEAP1基因甲基化检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)血浆游离DNA提取：利用血浆游离DNA提取试剂从待测样本中提取血浆游离DNA；
(2)DNA甲基化转化：利用DNA甲基化转化试剂对提取的血浆游离DNA进行处理并随后进行纯化；
(3)荧光定量PCR扩增：以纯化后DNA为模板，利用SEQ ID NO:1-3所示的引物和探针以及SEQ ID NO:4-6所示的引物和探针进行PCR扩增；
(4)分析PCR扩增产物；
优选地，步骤(3)的扩增条件为：90-100℃预变性8-12min；90-100℃变性20-40s，60-70℃退火30-60s，65-75℃延伸30-60s，40-50个循环。
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