CN111560435A

CN111560435A - 一种用于结直肠癌检测的dna甲基化试剂盒及使用方法、应用

Info

Publication number: CN111560435A
Application number: CN202010428888.4A
Authority: CN
Inventors: 王志强; 万季; 蔡雪儿; 罗海燕; 王一杏; 夏迪; 汪健; 金泰庆; 余涛; 关建洪; 王奕; 宋麒
Original assignee: Shenzhen Neocura Biotechnology Corp
Current assignee: Shenzhen Neocura Biotechnology Corp
Priority date: 2020-05-20
Filing date: 2020-05-20
Publication date: 2020-08-21

Abstract

本发明公开了一种用于结直肠癌检测的DNA甲基化试剂盒及其使用方法、应用。该试剂盒包括检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平的特异性引物和探针，所述特定基因为SEPT9、NDRG4和ACTB。本发明试剂盒能够显著提高早期结直肠癌的阳性检出率和特异性(真实阴性率)，可将生物标记物的检测灵敏度提高到皮克/纳克级DNA分子。

Description

一种用于结直肠癌检测的DNA甲基化试剂盒及使用方法、应用

技术领域

本发明属于生物技术和DNA检测技术领域，尤其涉及一种用于结直肠癌检测的DNA甲基化试剂盒及其使用方法、应用，具体而言，涉及一种利用血浆游离DNA进行甲基化qPCR以确定一个目标基因靶点的甲基化状态来用于结直肠癌检测或筛查的试剂盒及其使用方法。

背景技术

结直肠癌(CRC)是全世界第三大常见癌症，每年有600,000人死亡。对于CRC，早期识别和早期干预是降低死亡率的最佳方法。目前的筛查方法是结肠镜检查和大便隐血和免疫组织化学检测(gFOBT/FIT)。由于结肠镜检查的不适以及对肠道制品的厌恶，这些筛查方法并未充分使用。因此，使用可靠的非侵入性血液基础检测来评估CRC风险对于早期发现CRC可能是有价值的。

液体活检是用检测分子生物标志物来替代传统组织活检的非侵入性方法，其用于分析的生物样品(如DNA)可以从血液、尿液、唾液、痰液或组织样本中获得。与传统的癌症诊断方法相比，液体活检具有以下优势：

1.易取得，液体活检样本可从尿液、唾液和胸腔积液中获得；

2.比传统的肿瘤活组织检查更少侵入性；

3.能取样所有可能的癌细胞，而非仅局限于肿瘤活检的某部分；

4.便于早期发现癌症；

5.能用于监测肿瘤动态(治疗前、治疗间和治疗后)；

6.具有能作为理想识别标靶治疗因子的潜力。

坏死或凋亡的细胞释放到血液中的DNA，被称为循环游离DNA(circulating freeDNA，cfDNA)，然而在肿瘤患者的血液中，一部分cfDNA来自死亡的肿瘤细胞，这部分DNA就被定义为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)，其主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在，这些ctDNA多为大约134-144bp的DNA片段，并携带一定的肿瘤特征(包括异常甲基化、突变、缺少、插入、拷贝数等)。较早期的癌症(意味着肿瘤尺寸较小且癌细胞较少)，释放较少的游离循环肿瘤ctDNA，而其浓度更小于游离cfDNA；当肿瘤负荷增加时，患者的ctDNA水平会升高。迄今为止，ctDNA是获得癌症患者血液中分子肿瘤相关改变的诊断、预后、以及预测信息的最佳材料。

DNA甲基化改变是癌症进程中最早发生的分子变化之一，且具有组织特异性，肿瘤抑制基因的高甲基化水平已被确定为抑制基因表达和促进癌细胞生长和扩增的重要机制。在结直肠癌中，SEPT9、NDRG4、MLH1和其它基因中的CpG(胞嘧啶(C)后接续鸟苷(G))的高甲基化已被认为是癌症的生物标记之一。因此，对这些基因中的一种或多种的甲基化状态进行分析可用于诊断结直肠癌的状态。

ctDNA的甲基化分析可以为癌症诊断提供了一个可行的选择，但临床上使用ctDNA辅助癌症诊断和疗法选择的主要挑战，仍在于如何开发高灵敏度的检测方法以便在高cfDNA背景水平中区分微弱的ctDNA信号，特别是对于ctDNA浓度可能至pg/mL程度的早期诊断，对检测方法的灵敏度和选择性要求更高。然而，目前的检测试剂盒由于受到DNA提取方法不佳、亚硫酸氢盐处理量差、用于检测甲基化DNA的引物或者探针设计不佳等定量PCR方法的限制，并不能很好地利用ctDNA甲基化基因进行结直肠癌的早期筛查和辅助诊断。

Epigenomics公司生产的Epi proLung试剂盒，其检测针对结直肠癌的SEPT9和PTGER4的甲基化状态。Epigenomics AG(德国柏林，以下称为“Epigenomics”)已经发布了由FDA、cFDA和European Medicines Agency(EMA)批准的检测细胞游离DNA中的Septin 9(SEPT9)甲基化的试剂盒。该试剂盒用于从患者血浆中提取游离DNA、处理游离DNA以及使用定量PCR(qPCR)检测测定特定SEPT9区域的甲基化水平。Epigenomics描述的方法可以从3.5mL样本中分离出其中含量大约为9ng/mL的cfDNA，其测定可以检测到其中大约14pg/mL的甲基化SEPT9 DNA。对于每名患者该检测需要超过30ng的cfDNA。然而考虑到每次从癌症患者血样中分离出来的总cfDNA约为40ng，这是一个很大的数量。此外，Epigenomics的方法是一个二重qPCR检测，它只测量一个SEPT9甲基化区域和一个内部参照基因ACTB的甲基化状态。该试剂盒所使用的引物可以结合SEPT9的非甲基化区域，并分别利用探针识别甲基化DNA和阻断剂识别未甲基化DNA。该检测方法需要较大量的cfDNA进行SEPT9甲基化状态检测，同时不够严谨的qPCR检测会产生较大量假阳性结果，这些因素可能会导致误诊。

因此，迫切需要更敏感和准确地检测DNA甲基化水平或状态的方法，以帮助CRC诊断测定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于结直肠癌早期诊断、检测或者筛查的血液多基因联合检测引物探针组合试剂盒，以解决现有技术中存在的检测方法特异性和敏感性过低的缺陷。

本发明的第一方面在于提供一种用于结直肠癌检测的DNA甲基化试剂盒，其特征在于，包括检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平的特异性引物和探针，所述特定基因为SEPT9、NDRG4和ACTB。

在一些实施方式中，用于检测SEPT9基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQ ID NO:1-2和探针SEQ ID NO:3、特异性引物SEQ ID NO:4-5和探针SEQ ID NO:6、特异性引物SEQ ID NO:7-8和探针SEQID NO:9。

在一些实施方式中，用于检测NDRG4基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQ ID NO:10-11和探针SEQ IDNO:12、特异性引物SEQ ID NO:13-14和探针SEQ ID NO:15、特异性引物SEQ ID NO:16-17和探针SEQ ID NO:18。

在一些实施方式中，用于检测ACTB基因甲基化状态的特异性引物SEQ ID NO:19-20和探针SEQ ID NO:21。

在一些实施方式中，所述特异性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20均经过硫代磷酸酯修饰，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。

在一些实施方式中，所述探针SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21是基于TaqManTM设计的，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。

在一些实施方式中，所述SEPT9基因探针SEQ ID NO:3、6、9核苷酸序列5’端标记ABY，3’端标记QSY。

在一些实施方式中，所述NDRG4基因探针SEQ ID NO:12、15、18核苷酸序列5’端标记JUN，3’端标记QSY。

在一些实施方式中，所述ACTB基因探针SEQ ID NO:21核苷酸序列5’端标记VIC，3’端标记MGBNFQ。

在一些实施方式中，所述特异性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20和所述探针SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21的长度为10-50nt。

在一些实施方式中，所述试剂盒中还包含下述组成部分：dNTP混合溶液、MgCl₂溶液、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、PCR去离子水。

在一些实施方式中，所述试剂盒中还包含下述组成部分：血浆游离DNA提取试剂和血浆游离DNA甲基化转化试剂。

在一些实施方式中，所述血浆游离DNA甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐。

在一些实施方式中，所述受试样品DNA为完整基因组、无细胞DNA或循环肿瘤DNA。

在一些实施方式中，具体的特异性引物和探针序列如下表1所示：

表1本发明试剂盒中包含的特异性引物和探针

本发明的第二方面在于提供一种根据第一方面所述的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)提取血浆游离DNA；

(2)将提取的血浆游离DNA进行甲基化转化并纯化，优选采用亚硫酸氢盐为血浆游离DNA甲基化转化试剂；

(3)将进行甲基化转化并纯化的血浆游离DNA进行荧光定量PCR扩增，PCR反应结束后，将Ct阈值设定在线性扩增区间，Ct值小于40的扩增认定为阳性；

(4)结果判定：每个靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性则确定为该靶点结果阳性，当内部参照位点ACTB检测结果阳性，且SEPT9和NDRG4中至少1个靶点检测结果阳性则判定该样本为阳性。

在本发明的一些实施方式中，所述第(3)步骤中，每个模板的PCR扩增做三个重复。

在本发明的一些实施方式中，所述第(3)步骤中，每个反应体系10μL，其中含(0.5-1.5μL)1xPCR反应缓冲液、200-400μm dNTPs、3-6mM MgCl₂、1-3U AmpliTaq Gold DNA聚合酶、30-60nM ROX染料。

在本发明的一些实施方式中，所述第(3)步骤中，SEPT9和NDRG4基因区域靶点的引物各300-500nM。

在本发明的一些实施方式中，所述第(3)步骤中，SEPT9和NDRG4基因区域靶点的探针各200-300nM。

在本发明的一些实施方式中，所述第(3)步骤中，ACTB基因区域靶点的引物150-250nM，ACTB基因区域靶点的探针50-150nM。

在本发明的一些实施方式中，所述第(3)步骤中，PCR扩增条件为：90-100℃预变性8-12min；90-100℃变性10-20s，60-70℃退火和延伸60-70s，40-50个循环。

在本发明的一些实施方式中，所述第(3)步骤选用下述方法中的任一种：甲基化特异性定量PCR、实时甲基化特异性PCR、使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR。

本发明的第三方面在于提供根据第一方面所述的试剂盒在在制备结直肠癌检测的试剂或医疗器械中的医用。

本发明的有益效果在于：

本发明试剂盒能够显著提高早期结直肠癌的阳性检出率和特异性(真实阴性率)，可将生物标记物的检测灵敏度提高到皮克/纳克级DNA分子。

附图说明

图1为本发明一种实施方式的试剂盒的健康人血液样本的结直肠癌甲基化qPCR扩增曲线图；

图2为本发明一种实施方式的试剂盒的结直肠癌患者血液样本的结直肠癌甲基化qPCR扩增曲线图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

下述实施例中所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

定义

术语“患者”、“个体”或“受试者”可以在本文中互换使用，可以指哺乳动物，特别是人类。所述受试者可能有轻度、中度或重度疾病。所述患者可能是未治、易治或难治。所述患者可能是基于特定症状或家族病史需要治疗或需要诊断的个体。

术语“样本”、“患者样本”、“生物样本”等包括从患者、个体或受试者获得的各种样本类型，并且可用于诊断或监测检测。所述患者样本可以从健康受试者、患病患者或患有结直肠癌相关症状的患者获得。而且，从患者获得的样本可以被分割，并且只有一部分可以用于诊断。此外，所述样本或其一部分可以在保持样本用于以后分析的条件下储存。该定义具体包括血液和其他生物来源的液体样本(包括但不限于外周血、血清、血浆、尿、唾液、痰、粪便和滑液)，固体组织样本(如活检标本或组织培养物或由其衍生的细胞及其后代)。该定义还包括在获取后以任何方式操作的样本，如通过离心、过滤、沉淀、透析、色谱法、试剂处理、洗涤或富集某些细胞群。这些术语还包括临床样本、培养细胞、细胞上清液、组织样本、器官等。所述样本还可以包含新鲜冷冻和/或福尔马林固定的石蜡包埋组织块，例如由临床或病理活组织检查制备的块，其被制备用于病理分析或通过免疫组织化学研究。

术语“测量”、“确定”、“检测”或“检查”在全文中可互换使用，并且可以指包括获得患者样本和/或检测患者样本中的生物标志物甲基化状态或水平的方法。在一个实施方式中，这些术语是指获得患者样本并检测样本中一种或多种生物标志物的甲基化状态或水平。在另一个实施方式中，术语“测量”、“确定”或“检测”是指检测患者样本中一种或多种生物标志物的甲基化状态或水平。测量可以通过本领域已知的方法和本文进一步描述的方法完成，包括但不限于甲基化特异性定量聚合酶链式反应(qPCR)。

术语“甲基化”是指在胞嘧啶的C5或N4位置、腺嘌呤的N6位置的胞嘧啶甲基化或其他类型的核酸甲基化。体外扩增的DNA是未甲基化的，因为体外DNA扩增方法不保留扩增模板的甲基化模式。然而，“未甲基化的DNA”或“甲基化的DNA”也可以分别指其原始模板是未甲基化或甲基化的扩增DNA。

术语“CpG岛”是指具有高密度CpG的基因组DNA的连续区域。

术语“甲基化状态”或“甲基化水平”是指特定核苷酸或部分DNA中的核苷酸处的甲基化的存在、不存在和/或量。

应该理解的是，无论在何处使用语言“包括”描述实施例，还提供了以“由…组成”和/或“基本上由…组成”描述的其他类似实施例。

实施例1：利用本发明试剂盒对健康人cfDNA样本进行结直肠癌甲基化多重qPCR检测

(一)实验材料

1.5份健康人血浆和5份结直肠癌患者血浆(购自Bloodworks NW公司)；

2.QIAamp循环系统核酸提取试剂盒(购自Qiagen公司)；

3.EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒(购自Zymo Research公司)；

4.本发明试剂盒(其中包含检测靶点SEPT9的其中一套引物及探针组合1和NDRG4的其中一套引物及探针组合1、ACTB扩增引物及探针)；

5.AmpliTaq Gold^TMDNA聚合酶及缓冲试剂(购自Thermo Fisher公司)。

(二)实验方法

1.血浆游离DNA提取

使用QIAamp循环系统核酸提取试剂盒从人血浆样本中提取cfDNA，步骤按照试剂盒说明书进行。

2.游离DNA甲基化转化

使用Zymo Research公司的EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒对提取的10份血浆cfDNA进行亚硫酸氢盐处理并随后进行纯化。

3.qPCR扩增

对亚硫酸氢盐处理过的血浆cfDNA使用Thermo Fisher公司Quant Studio 5仪器进行qPCR扩增，每个模板的PCR扩增做三个重复。每个反应体系10μL，其中含1xPCR反应缓冲液、300μm dNTPs、4mM MgCl₂、2U AmpliTaq Gold DNA聚合酶、50nM ROX染料；SEPT9和NDRG4基因区域靶点的引物各400nM，SEPT9和NDRG4基因区域靶点的探针各250nM；ACTB基因区域靶点的引物200nM，ACTB基因区域靶点的探针100nM；

PCR扩增条件为：95℃预变性10min；

95℃变性15s，65℃退火和延伸60s，45个循环；

PCR反应结束后，将Ct阈值设定在线性扩增区间，Ct值小于40的扩增认定为阳性。

(三)实验结果

对于结果的判定标准是，首先每个检测位/靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性则确定为该靶点结果阳性，其次，对于样本是否阳性的判定标准为，内部参照位点(ACTB)检测结果阳性，且两个靶点(SEPT9和NDRG4)中至少1个靶点检测阳性则判定该样本为阳性。

下表2显示的是使用本发明的多重测定(SEPT9和NDRG4)对10个血浆样品进行检测的结果。测试结果显示，利用本发明试剂盒进行早期结直肠癌筛查，其阳性检出率为100％，特异性(真实阴性率)为100％。

图1：健康人血液样本的结直肠癌甲基化qPCR扩增曲线图；

图2：结直肠癌患者血液样本的结直肠癌甲基化qPCR扩增曲线图。

表2利用本发明试剂盒对人血液样本的检测结果

编号	分期	结果
			健康人血浆1	-	阴性
健康人血浆2	-	阴性
			健康人血浆3	-	阴性
健康人血浆4	-	阴性
			健康人血浆5	-	阴性
结直肠癌患者血浆1	I期	阳性
			结直肠癌患者血浆2	I期	阳性
结直肠癌患者血浆3	I期	阳性
			结直肠癌患者血浆4	I期	阳性
结直肠癌患者血浆5	IIa期	阳性

与实施例1不同的，采用包含检测靶SEPT9和NDRG4的组合2引物及探针组合、采用包含检测靶SEPT9和NDRG4的组合3引物及探针组合的试剂盒，对健康人血液样本和结直肠癌患者血液样本检测取得了与实施例1类似的结果。

以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。

序列表

<110> 深圳市新合生物医疗科技有限公司

<120> 一种用于结直肠癌检测的DNA甲基化试剂盒及使用方法、应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ttcgcgcgat tcgttgttta tta 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

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<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

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<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

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<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

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<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

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<212> DNA

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<210> 8

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<210> 9

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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<212> DNA

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<212> DNA

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<213> 人工序列()

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<212> DNA

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<212> DNA

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<211> 24

<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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tagggagtat ataggttggg gaagtt 26

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<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

aacacacaat aacaaacaca aattcac 27

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

tggtgatgga ggaggtttag gcagt 25

Claims

1.一种用于结直肠癌检测的DNA甲基化试剂盒，其特征在于，包括检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平的特异性引物和探针，所述特定基因为SEPT9、NDRG4和ACTB。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，用于检测SEPT9基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQ ID NO:1-2和探针SEQ ID NO:3、特异性引物SEQ ID NO:4-5和探针SEQ ID NO:6、特异性引物SEQ IDNO:7-8和探针SEQ ID NO:9。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，用于检测NDRG4基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQ ID NO:10-11和探针SEQ ID NO:12、特异性引物SEQ ID NO:13-14和探针SEQ ID NO:15、特异性引物SEQ ID NO:16-17和探针SEQ ID NO:18。

4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，用于检测ACTB基因甲基化状态的特异性引物SEQ ID NO:19-20和探针SEQ ID NO:21。

5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20均经过硫代磷酸酯修饰，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交；

和/或，所述探针SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21是基于TaqManTM设计的，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。

6.根据权利要求1-5任一所述的试剂盒，其特征在于，所述SEPT9基因探针SEQ ID NO:3、6、9核苷酸序列5’端标记ABY，3’端标记QSY；

和/或，所述NDRG4基因探针SEQ ID NO:12、15、18核苷酸序列5’端标记JUN，3’端标记QSY；

和/或，所述ACTB基因探针SEQ ID NO:21核苷酸序列5’端标记VIC，3’端标记MGBNFQ。

7.根据权利要求1-6任一所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20和所述探针SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21的长度为10-50nt。

8.根据权利要求1-7任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含下述组成部分：dNTP混合溶液、MgCl₂溶液、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、PCR去离子水；

和/或，所述试剂盒中还包含下述组成部分：血浆游离DNA提取试剂和血浆游离DNA甲基化转化试剂；

和/或，所述血浆游离DNA甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐；

和/或，所述受试样品DNA为完整基因组、无细胞DNA或循环肿瘤DNA。

9.一种根据权利要求1-8任一所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取血浆游离DNA；

(4)结果判定：每个靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性则确定为该靶点结果阳性，当内部参照位点ACTB检测结果阳性，且SEPT9和NDRG4中至少1个靶点检测结果阳性则判定该样本为阳性；

优选地，所述第(3)步骤中，每个模板的PCR扩增做三个重复；

和/或，每个反应体系10μL，其中含(0.5-1.5μL)1xPCR反应缓冲液、200-400μm dNTPs、3-6mM MgCl₂、1-3U AmpliTaq Gold DNA聚合酶、30-60nM ROX染料；

和/或，SEPT9和NDRG4基因区域靶点的引物各300-500nM；

和/或，SEPT9和NDRG4基因区域靶点的探针各200-300nM；

和/或，ACTB基因区域靶点的引物150-250nM，ACTB基因区域靶点的探针50-150nM；

和/或，PCR扩增条件为：90-100℃预变性8-12min；90-100℃变性10-20s，60-70℃退火和延伸60-70s，40-50个循环；

和/或，所述第(3)步骤选用下述方法中的任一种：甲基化特异性定量PCR、实时甲基化特异性PCR、使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR。

10.根据权利要求1-8任一所述的试剂盒在制备结直肠癌检测的试剂或医疗器械中的医用。