CN104975110A - 用于检测生物样本中bmp3和ndrg4甲基化水平的引物和探针 - Google Patents
用于检测生物样本中bmp3和ndrg4甲基化水平的引物和探针 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供用于检测生物样本中BMP3和NDRG4甲基化水平的引物和探针。本发明还提供一种使用本发明的引物和探针检测生物样本中BMP3和NDRG4甲基化水平的方法及试剂盒。本发明提供的引物和探针具有高灵敏度和特异性，该检测方法可提供用于结直肠肿瘤早期诊断的信息，为结直肠肿瘤早发现提供了一个简便易行的解决方案。
Description
技术领域
本发明属于生物技术及诊断研究领域，涉及一种用于检测生物样本中BMP3和NDRG4甲基化水平的引物和探针，及利用该引物和探针检测样品中BMP3和NDRG4甲基化水平，以提供用于结直肠肿瘤早期诊断的信息。
背景技术
结直肠癌也被称为大肠癌，发生在结肠(大肠)或直肠中，通常发展缓慢，是中国城镇第二高发癌症，40岁以上无症状人群中6％患有早期肠癌。随着食品结构和生活习惯的改变，以及环境问题的日益突出，导致大肠癌发生率快速增长，据《中国肿瘤登记年报》报道显示，肠癌是目前中国城市发病率仅次于肺癌的第二大癌症，主要包括结肠癌与直肠癌两大类。目前我国每年新增结直肠癌确诊病例44万例，每年死亡患者多达23万人。国家癌症早诊早治项目专家委员会2013年研究报告指出，中国40岁以上高危人群患进展期腺瘤和早期肠癌比率为6％。这些癌变病灶不及时切除，90％的情况下将会转化为恶性肠癌。由于大部分患者在早期并未发现重视并得到及时治疗，肠癌死亡率居高不下。如果将肠癌早期筛查技术在中国进行普及推广，预计结直肠癌死亡率可从现有水平降低50％以上。
筛查是在未出现疾病症状的人群中寻找并确诊患者。目前筛查主要有以下几类：(1)常规血检类，特异性敏感性不强，对身体有创伤性；(2)影像学类，如肠镜检查，软式乙状结肠镜，CT结肠成像(虚拟肠镜检查)，双对比钡灌肠(DCBE)等，此类方法需要检查前药物清肠、麻醉等处理，对身体创伤性比较严重；(3)粪便潜血检测类，如粪便隐血试验(FOBT)，粪便免疫化学试验(FIT)等，方便无创但特异性敏感性不强。同时，以上方法均需要到医院实施，处理周期长，或者费用较高。
发明内容
本发明针对上述缺点，提供了一种用于检测生物样本中BMP3和NDRG4甲基化水平的引物和探针，通过取病人的生物样本，采用荧光实时PCR反应技术，达到快速敏捷地检测出BMP3和NDRG4甲基化水平，以达到高灵敏和特异性提供用于结直肠肿瘤早期诊断的信息，为结直肠肿瘤早发现提供一个简便易行的解决方案的目的。
为实现上述目的，本发明采取下述技术方案来实现：
本发明人体生物样本包括组织、细胞、血液、分泌物和排泄物；其中排泄物为粪便。采用本发明的引物和探针可检测上述各种生物样本，基于无侵入性和低廉方便考虑，优选粪便样本。
用于检测生物样本中BMP3和NDRG4甲基化水平的引物，包括正向引物，一条选自(A)组的正向引物和一条选自(B)组的正向引物；
(A)BMP3正向引物
GTTTAATTTTCGGTTTCGTCGTC(SEQ ID NO：1)
AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：2)
AATATTCGGGTTATATACGTCGCGA(SEQ ID NO：3)
AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：4)
TTGAAAATATTTGGGTTATATATGTTGT(SEQ ID NO：5)
GAGTGGAGACGGCGTTCGTA(SEQ ID NO：6)
TGGAGTGGAGATGGTGTTTGT(SEQ ID NO：7)
TTAGGTTGCGTTGGGTTAGCG(SEQ ID NO：8)
TTGTTAGGTTGTGTTGGGTTAGTG(SEQ ID NO：9)
GGTGAGGTTCGCGTAGTTGTTG(SEQ ID NO：10)
GTGAGGTTTGTGTAGTTGTTGGG(SEQ ID NO：11)
AATATTCGGGTTTATACGTCGC(SEQ ID NO：12)
AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：13)
GAGTGGAGACGGCGTTCGTA(SEQ ID NO：14)
AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：15)
AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：16)
AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：17)
AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：18)
TATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：19)
TTTGAAAATATTCGGGTTATATACGTYGY(SEQ ID NO：20)
TTTGAAAATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：21)
TTTGAAAATATTTGGGTTATATACGTTGC(SEQ ID NO：22)
TTTGAAAATATTCGGGTTATATACGTTGC(SEQ ID NO：23)
TTTGAAAATATTTGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：24)
TTTGAAAATATTYGGGTTATATACGTYGC(SEQ ID NO：25)
AATATTCGGGTTATATACGTCGCGATT(SEQ ID NO：26)
AGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAA(SEQ ID NO：27)
GAGTGGAGACGGCGTTCGTA(SEQ ID NO：28)
GGAGTGGAGACGGCGTTC(SEQ ID NO：29)
GAGTGGAGACGGCGTTC(SEQ ID NO：30)
GGCGTTCGTAGCGTTTTGC(SEQ ID NO：31)
GCGTTCGTAGCGTTTTGC(SEQ ID NO：32)
TTTGGAGTTTAATTTTCGGTTTC(SEQ ID NO：33)
AGTGGGGTTGGTCGTTATTTC(SEQ ID NO：34)
TTGAAAATATTTGGGTTATATATGTTGT(SEQ ID NO：35)
TGGAGTGGAGATGGTGTTTGT(SEQ ID NO：36)
TTGTTAGGTTGTGTTGGGTTAGTG(SEQ ID NO：37)
GTGAGGTTTGTGTAGTTGTTGGG(SEQ ID NO：38)
(B)NDRG4正向引物
CGGTTTTCGTTCGTTTTTTCG(SEQ ID NO：39)
CGAAACTTCAACGCCGCCGAC(SEQ ID NO：40)
GTACGTGGAGGGGTTTTTGGTTG(SEQ ID NO：41)
CGCGCAAACAAAAAACGAAACTTCGA(SEQ ID NO：42)
GAGTGGGTGAGAAGTCGGTGGGG(SEQ ID NO：43)
GGCGGAGTGGGTGAGAAGTCG(SEQ ID NO：44)
GGGTTTTTGGTTGTTCGTATTTGTATT(SEQ ID NO：45)
CGGTTTTCGTTTTTGTAGTCGCGGGT(SEQ ID NO：46)
GCGGAGGGGTTTTTGGTTGTTCG(SEQ ID NO：47)
GCGGGTGAGAAGTCGGC(SEQ ID NO：48)
CGGAGCGGGTGAGAAGTC(SEQ ID NO：49)
CGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGT(SEQ ID NO：50)
CGGTTTTCGTTCGTTTTTTCG(SEQ ID NO：51)
ATYGATYGGGGTGTTTTTTAGGTTTY(SEQ ID NO：52)
ATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTC(SEQ ID NO：53)
ATCGATTGGGGTGTTTTTTAGGTTTT(SEQ ID NO：54)
ATCGATTGGGGTGTTTTTTAGGTTTC(SEQ ID NO：55)
ATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTT(SEQ ID NO：56)
GGGTGTTTTTTAGGTTTCGCGTC(SEQ ID NO：57)；
和反向引物，一条选自(C)组的反向引物和一条选自(D)组的反向引物；
(C)BMP3反向引物
CTCCCGACGTCGCTACG(SEQ ID NO：58)
CCTCACCCGCGCAAAACG(SEQ ID NO：59)
CGCGAACCTCACCCGCGCAA(SEQ ID NO：60)
CCTCACCCGCGCAAAACG(SEQ ID NO：61)
ACCTCACCCACACAAAACACT(SEQ ID NO：62)
CCACTTACTACGCTAACCCAACG(SEQ ID NO：63)
CCACTTACTACACTAACCCAACAC(SEQ ID NO：64)
ACTCCGAAAACGCAAAAAACCG(SEQ ID NO：65)
AACACTCCAAAAACACAAAAAACC(SEQ ID NO：66)
CACTCCGAAAACGCAAAAAACCG(SEQ ID NO：67)
ACACTCCAAAAACACAAAAAACCAAC(SEQ ID NO：68)
CCACTTACTACGCTAACCCAACG(SEQ ID NO：69)
CCACTTACTACGCTAACCCAACG(SEQ ID NO：70)
CCACTTACTACGCTAACCCAACG(SEQ ID NO：71)
CACTCCGAAAACGCAAAAAACCG(SEQ ID NO：72)
CACTCCGAAAACGCAAAAAACCG(SEQ ID NO：73)
CACTCCGAAAACGCAAAAAACCG(SEQ ID NO：74)
CCTCACCCGCGCAAAACG(SEQ ID NO：75)
ACCTCACCCGCGCAAAACG(SEQ ID NO：76)
ATAAACTCTTCCCCAACAACTACRCRAA(SEQ ID NO：77)
ATAAACTCTTCCCCAACAACTACGCGAA(SEQ ID NO：78)
ATAAACTCTTCCCCAACAACTACACAAA(SEQ ID NO：79)
ATAAACTCTTCCCCAACAACTACACGAA(SEQ ID NO：80)
ATAAACTCTTCCCCAACAACTACGCAAA(SEQ ID NO：81)
GCAACCTAACAAATAAACTCTTCCCCAA(SEQ ID NO：82)
AACAAATAAACTCTTCCCCAACAACTAC(SEQ ID NO：83)
CCACTTACTACGCTAACCCAACG(SEQ ID NO：84)
ACTTACTACGCTAACCCAACG(SEQ ID NO：85)
CTTACTACGCTAACCCAACG(SEQ ID NO：86)
ACTCCCGACGTCGCTACG(SEQ ID NO：87)
TCCAAACCAACTAAAACGAAAAC(SEQ ID NO：88)
ACCTCACCCACACAAAACACT(SEQ ID NO：89)
CCACTTACTACACTAACCCAACAC(SEQ ID NO：90)
AACACTCCAAAAACACAAAAAACC(SEQ ID NO：91)
ACACTCCAAAAACACAAAAAACCAAC(SEQ ID NO：92)
(D)NDRG4反向引物
TCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCGTAG(SEQ ID NO：93)
GTAACTTCCGCCTTCTACGC(SEQ ID NO：94)
AAACCGCGACGCGAAACC(SEQ ID NO：95)
GACCCGCGAAACGATACCG(SEQ ID NO：96)
AAGCAAAAAGCAAACGCGC(SEQ ID NO：97)
CACCGCGAAAATACGAACGAAAC(SEQ ID NO：98)
GAACGAAACAAACGCGCAAACG(SEQ ID NO：99)
TAAAATACCCGATAAACGAACG(SEQ ID NO：100)
GTAACTTCCGCCTTCTACGC(SEQ ID NO：101)
CGTAACTTCCGCCTTCTACGC(SEQ ID NO：102)
TCGCGCGTAACTTCCGCCTT(SEQ ID NO：103)
CGATCCCTCGCGCGTAACTT(SEQ ID NO：104)
TCGCGCGTAACTTCCGCCTT(SEQ ID NO：105)
GTAACTTCCGCCTTCTACGC(SEQ ID NO：106)
CCTTCTACRCRACTAAAATACCCRAT(SEQ ID NO：107)
CCTTCTACGCGACTAAAATACCCGAT(SEQ ID NO：108)
CCTTCTACACAACTAAAATACCCGAT(SEQ ID NO：109)
CCTTCTACACGACTAAAATACCCGAT(SEQ ID NO：110)
CCTTCTACGCAACTAAAATACCCGAT(SEQ ID NO：111)
AACCTAAAACTAATCCCGAACGAACC(SEQ ID NO：112)
GCGCGTAACTTCCGCCTTCTA(SEQ ID NO：113)。
本发明还提供一种用于检测生物样本中BMP3和NDRG4甲基化水平的探针，所述探针包括一条选自(E)组的探针和一条选自(F)组的探针，
(E)BMP3探针
CGCCGAGGCGGTTTTTTGCG(SEQ ID NO：114)
TAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCG(SEQ ID NO：115)
TGGAGTGGAGACGGCGTTCGTAGCGT(SEQ ID NO：116)
TAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCG(SEQ ID NO：117)
TTTAGTGTTGGAGTGGAGATGGTGTTTGT(SEQ ID NO：118)
CCCAACAACTACGCGAACCTCACCCG(SEQ ID NO：119)
CCCAACAACTACACAAACCTCACCCAC(SEQ ID NO：120)
AAACCGACGACGAAACCGAAAATTAAACTCCAAA(SEQ ID NO：121)
AAACCAACAACAAAACCAAAAATTAAACTCCAAACC(SEQ ID NO：122)
TTATTTGTTAGGTTGCGTTGGGTTAGCGTAGTAAGTG(SEQ ID NO：123)
TATTTGTTAGGTTGTGTTGGGTTAGTGTAGTAAGTGGG(SEQ ID NO：124)
TAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCG(SEQ ID NO：125)
CCCAACAACTACGCGAACCTCACCCG(SEQ ID NO：126)
CCCAACAACTACGCGAACCTCACCCG(SEQ ID NO：127)
TAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCG(SEQ ID NO：128)
CCCAACAACTACGCGAACCTCACCCG(SEQ ID NO：129)
CCCAACAACTACGCGAACCTCACCCG(SEQ ID NO：130)
TAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCG(SEQ ID NO：131)
AGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCG(SEQ ID NO：132)
TAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCGTA(SEQ ID NO：133)
CGCTACGAACGCCGTCTCCACTCCAACGCTA(SEQ ID NO：134)
CCCAACAACTACGCGAACCTCACCCG(SEQ ID NO：135)
CGGGTGAGGTTCGCGTAGTTGTTGGG(SEQ ID NO：136)
TTCCCCAACAACTACGCGAACCTCACC(SEQ ID NO：137)
ACACTCCGAAAACGCAAAAAACCGACGA(SEQ ID NO：138)
ATTCGGTCGCGTTTCGGGTTTCGTGC(SEQ ID NO：139)
TTTAGTGTTGGAGTGGAGATGGTGTTTGT(SEQ ID NO：140)
CCCAACAACTACACAAACCTCACCCAC(SEQ ID NO：141)
AAACCAACAACAAAACCAAAAATTAAACTCCAAACC(SEQ ID NO：142)
TATTTGTTAGGTTGTGTTGGGTTAGTGTAGTAAGTGGG(SEQ ID NO：143)；
(F)NDRG4探针
TTCGTTTATCGGGTATTT(SEQ ID NO：144)；
TAGGTTTCGCGTCGCGGTTTTCGTT(SEQ ID NO：145)；
TTGTATTCGCGCGTCGGCGGCGTCGAAG(SEQ ID NO：146)；
TTGTATTCGCGCGTCGGCGGCGTTGAAGT(SEQ ID NO：147)；
TCGCGCGTCGGCGGCGTCGAAG(SEQ ID NO：148)；
TCGCGCGTCGGCGGCGTTGAAG(SEQ ID NO：149)；
TCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCGTAG(SEQ ID NO：150)；
CGTCGCGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGTTCGT(SEQ ID NO：151)；
ACGCGACTAAAATACCCGATAAACGAACGAAAAAACGAAC(SEQ ID NO：152)。
本发明结合上述引物和探针，还提供一种生物样本中BMP3和NDRG4甲基化水平的检测方法，包括以下步骤：
步骤a，样品的制备
从收集到的生物样本中提取DNA，然后对DNA进行修饰，修饰后的DNA纯化回收，溶于水后备用；
步骤b，PCR检测
加入前述的引物和探针，将步骤a中修饰后的DNA进行荧光定量PCR检测；
步骤c，甲基化水平分析
计算目标基因BMP3和NDRG4与内参基因B2M的扩增Ct比差值，得到样本相对甲基化水平，根据已知病理信息的大量临床样本分析设定的判定阈值，判定样本基因甲基化程度是否正常。
进一步，其中步骤a中DNA的修饰方法为取一定体积的DNA，加入1/10体积NaOH，37-42℃金属浴孵育20min；加入5-10倍DNA溶液体积的配亚硫酸盐转化液，混匀后，50-55℃金属浴避光孵育16h。
进一步，其中步骤a中修饰后的DNA使用DNA纯化柱纯化回收，回收过程中使用0.2-0.3M NaOH的90％乙醇溶液脱硫。
进一步，其中步骤c中B2M所用引物为：
一个正向引物，选自
GAGATAAAGTTATTAAATTGTTATATTTGTG(SEQ ID NO：153)
GTAGGTTTGGGTAATTTTAAATAGTGGA(SEQ ID NO：154)，
一个反向引物，选自
AAAATCTTACTATATTACCCAAACTAA(SEQ ID NO：155)
TTCTTTCAAAATATCATCCCCCAAT(SEQ ID NO：156)。
进一步，其中步骤c中B2M所用探针为：
CTCAAACTCCTAATCTCAAATAATCCTCCTTCCC(SEQ ID NO：157)
TTCCTACAAATCTTCCCCCAAACACCCTT(SEQ ID NO：158)。
本发明还提供一种检测生物样本中BMP3和NDRG4甲基化水平的试剂盒，包括：
任选一个BMP3正向引物和一个NDRG4正向引物；
任选一个BMP3反向引物和一个NDRG4反向引物；
任选一个BMP3探针和一个NDRG4探针。
本发明还提供前述引物在检测生物样本中BMP3和NDRG4甲基化水平的试剂盒中的应用。
本发明还提供前述探针在检测生物样本中BMP3和NDRG4甲基化水平的试剂盒中的应用。
进一步，前述各种探针的5′端设有FAM，HEX，Alexa Fluor647，JOE，TAMRA，CY3，CY5中的一种荧光物质。
进一步，前述各种探针的3′端设有BHQ1，BHQ2，BQ3，DABCYL中的一种。
本发明的有益效果：
BMP3(Bone Morphogenetic Protein 3)和NDRG4(N-Myc Downstream-Regulated Gene 4)在结直肠癌细胞中都有高度的甲基化表现，本发明利用大量临床样本验证，设计和筛选引物探针，使用本发明引物和探针进行检测具有高灵敏度和高特异性。
本发明的检测方法基于定量PCR的甲基化DNA检测技术，利用探针和PCR引物来区分甲基化和未甲基化的DNA。首先用亚硫酸氢盐处理DNA片段，并设计能与待测位点互补的探针引物，通过实时定量PCR测定，测定该基因中和结直肠肿瘤最具有关联性的CpG位点，并同时测定样本中的内参基因B2M(Beta 2Microglobulin)，判定目标基因的甲基化水平。这种方法优势在于其高通量和高敏感性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。可以为医生提供用于结直肠肿瘤早期诊断的信息，为结直肠肿瘤早发现提供了一个简便易行的解决方案。
普通人每天数以百万计的细胞从结肠壁脱落进入到排泄系统，包括肠道肿瘤形成过程中的细胞，进入排泄系统后的细胞中含有相应的DNA，其中含有和肿瘤密切相关的遗传信息，反映结直肠癌或肿瘤的形成过程。早期肠癌细胞中有些基因发生甲基化转变，是肠癌的预兆，这些细胞会自然脱落到肠道中，与粪便一起排出。通过检测这些DNA标记物，就可以发现结直肠癌或肿瘤等在肠壁上的存在。
因此本发明优选的检测方法采用粪便DNA，从普通粪便中取得，非侵入性，无创无痛，方便家中采样，无需前往医院，无需饮食或用药限制，无时间限制，而本发明的粪便DNA检测方法，比粪便潜血查出更多的癌症和癌前病变，假阳性更低。
附图说明
图1是实施例1中待测目标基因荧光定量PCR扩增曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1
使用以下各项进行PCR反应。
(1)样品制备
收集到的粪便样本在实验室提取DNA，取20-50ul(2-10μg)DNA，加入1/10体积3M NaOH(0.3M终浓度，新鲜配制)，37-42℃金属浴孵育20min；加入5-10倍DNA溶液体积的配亚硫酸盐转化液，混匀，50-55℃金属浴避光孵育16hr；修饰后的DNA使用DNA纯化柱纯化回收，中间使用0.2-0.3M NaOH的90％乙醇溶液脱硫；溶于20-40ulH2O，备用。
(2)PCR反应
按照表1的PCR反应体系，使用下述引物和探针，将修饰后的样本DNA进行荧光定量PCR检测。
引物及探针：
任意一个BMP3的正向引物、反向引物和探针的组合，本实施例中选择
GTTTAATTTTCGGTTTCGTCGTC(SEQ ID NO：1)，
CTCCCGACGTCGCTACG(SEQ ID NO：58)和
CGCCGAGGCGGTTTTTTGCG(SEQ ID NO：114)。
任意一个NDRG4的正向引物、反向引物和探针的组合，本实施例中选择
CGGTTTTCGTTCGTTTTTTCG(SEQ ID NO：39)，
CGGTTTTCGTTCGTTTTTTCG(SEQ ID NO：39)和
TTCGTTTATCGGGTATTT(SEQ ID NO：144)，
任意一个B2M的正向引物、反向引物和探针的组合，本实施例中选择
GTAGGTTTGGGTAATTTTAAATAGTGGA(SEQ ID NO：154)，
TTCTTTCAAAATATCATCCCCCAAT(SEQ ID NO：156)和
TTCCTACAAATCTTCCCCCAAACACCCTT(SEQ ID NO：158)。
其中3条探针5′端、3′端荧光物质组合分别为：FAM和BQ1，HEX和BQ1，JOE和BQ2。
表1的PCR反应体系
| 组分(50μL) | 终浓度 |
| PCR Buffer，-Mg | 1X |
| MgCl2 | 1.5-2.5mM |
| dNTP mix | 0.2-0.3mM |
| Taq Polymerase | 1-2.5U/rxn |
| ROX | 1/50-1/500 |
| Primer | 0.2-0.3μM |
| Probe | 0.05-0.1μM |
| Distilled water | up to 50 |
PCR反应程序：95℃2min；95℃20sec，60℃1min，50个循环。
(3)甲基化水平分析。计算目标基因BMP3及NDRG4与内参基因B2M的扩增Ct差值，得出样本相对甲基化水平。本实施例中采用ABI7500实时荧光定量PCR仪，图1是待测样品荧光定量PCR扩增曲线。从图1中可以看出，B2M(c)的Ct值：31.95，BMP3(a)的Ct值：34.77，相对表达水平2.82，NDRG4(b)的Ct值：34.99，相对表达水平3.04
上述具体实施例中，对于未详细描述的方法、设备、试剂等，均使用本技术领域中已有的相应常规实施方式实现.
实施例3
一种用于检测生物样本中的BMP3和NDRG4甲基化水平的试剂盒
本实施例中的试剂盒包括：DNA变性液，亚硫酸盐转化液，硅基膜柱结合液，DNA脱硫液，PCR反应液。其中PCR反应液包括PCR缓冲液，dNTPs，PCR引物，探针和DNA聚合酶。
本实施例中BMP3，NDRG4和B2M的PCR中正向引物分别为GTTTAATTTTCGGTTTCGTCGTC(SEQ ID NO：1)和CGGTTTTCGTTCGTTTTTTCG(SEQID NO：39)，GTAGGTTTGGGTAATTTTAAATAGTGGA(SEQ ID NO：154)，反向引物分别为CTCCCGACGTCGCTACG(SEQ ID NO：58)和TCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCGTAG(SEQ ID NO：93)，TTCTTTCAAAATATCATCCCCCAAT(SEQ ID NO：156)，探针分别为CGCCGAGGCGGTTTTTTGCG(SEQ ID NO：114)和TTCGTTTATCGGGTATTT(SEQ IDNO：144)，TTCCTACAAATCTTCCCCCAAACACCCTT(SEQ ID NO：158)，所述探针5′端、3′端荧光物质组合分别为：FAM和BQ1，HEX和BQ1，JOE和BQ2。
本实施例中其他成分没有特殊要求，选择一般通用即可实现反应目的。
使用该试剂盒对目标基因进行检测时，包括以下步骤：
(1)DNA修饰。将粪便DNA使用DNA变性液预变性，接着经过亚硫酸盐转化液进行DNA转化，转化后的DNA用硅基膜结合柱纯化回收，纯化回收过程使用DNA脱硫液做脱硫处理，修饰后的DNA溶于超纯水备用。
(2)目标基因荧光定量PCR扩增。使用试剂盒中的PCR反应液对修饰后的待测样本DNA进行PCR扩增反应，得出扩增结果。
(3)甲基化水平分析。根据扩增结果计算BMP3及NDRG4与内参基因B2M的扩增Ct差值，得出样本目标基因相对甲基化表达水平，根据阈值设定条件判断样本正常与否。
本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.用于检测生物样本中BMP3和NDRG4甲基化水平的引物，其特征在于，
包括正向引物，一条选自(A)组的正向引物和一条选自(B)组的正向引物；
(A)BMP3正向引物
GTTTAATTTTCGGTTTCGTCGTC(SEQ ID NO：1)
AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：2)
AATATTCGGGTTATATACGTCGCGA(SEQ ID NO：3)
AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：4)
TTGAAAATATTTGGGTTATATATGTTGT(SEQ ID NO：5)
GAGTGGAGACGGCGTTCGTA(SEQ ID NO：6)
TGGAGTGGAGATGGTGTTTGT(SEQ ID NO：7)
TTAGGTTGCGTTGGGTTAGCG(SEQ ID NO：8)
TTGTTAGGTTGTGTTGGGTTAGTG(SEQ ID NO：9)
GGTGAGGTTCGCGTAGTTGTTG(SEQ ID NO：10)
GTGAGGTTTGTGTAGTTGTTGGG(SEQ ID NO：11)
AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：12)
AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：13)
GAGTGGAGACGGCGTTCGTA(SEQ ID NO：14)
AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：15)
AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：16)
AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：17)
AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：18)
TATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：19)
TTTGAAAATATTCGGGTTATATACGTYGY(SEQ ID NO：20)
TTTGAAAATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：21)
TTTGAAAATATTTGGGTTATATACGTTGC(SEQ ID NO：22)
TTTGAAAATATTCGGGTTATATACGTTGC(SEQ ID NO：23)
TTTGAAAATATTTGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO：24)
TTTGAAAATATTYGGGTTATATACGTYGC(SEQ ID NO：25)
AATATTCGGGTTATATACGTCGCGATT(SEQ ID NO：26)
AGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAA(SEQ ID NO：27)
GAGTGGAGACGGCGTTCGTA(SEQ ID NO：28)
GGAGTGGAGACGGCGTTC(SEQ ID NO：29)
GAGTGGAGACGGCGTTC(SEQ ID NO：30)
GGCGTTCGTAGCGTTTTGC(SEQ ID NO：31)
GCGTTCGTAGCGTTTTGC(SEQ ID NO：32)
TTTGGAGTTTAATTTTCGGTTTC(SEQ ID NO：33)
AGTGGGGTTGGTCGTTATTTC(SEQ ID NO：34)
TTGAAAATATTTGGGTTATATATGTTGT(SEQ ID NO：35)
TGGAGTGGAGATGGTGTTTGT(SEQ ID NO：36)
TTGTTAGGTTGTGTTGGGTTAGTG(SEQ ID NO：37)
GTGAGGTTTGTGTAGTTGTTGGG(SEQ ID NO：38)
(B)NDRG4正向引物
CGGTTTTCGTTCGTTTTTTCG(SEQ ID NO：39)
CGAAACTTCAACGCCGCCGAC(SEQ ID NO：40)
GTACGTGGAGGGGTTTTTGGTTG(SEQ ID NO：41)
CGCGCAAACAAAAAACGAAACTTCGA(SEQ ID NO：42)
GAGTGGGTGAGAAGTCGGTGGGG(SEQ ID NO：43)
GGCGGAGTGGGTGAGAAGTCG(SEQ ID NO：44)
GGGTTTTTGGTTGTTCGTATTTGTATT(SEQ ID NO：45)
CGGTTTTCGTTTTTGTAGTCGCGGGT(SEQ ID NO：46)
GCGGAGGGGTTTTTGGTTGTTCG(SEQ ID NO：47)
GCGGGTGAGAAGTCGGC(SEQ ID NO：48)
CGGAGCGGGTGAGAAGTC(SEQ ID NO：49)
CGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGT(SEQ ID NO：50)
CGGTTTTCGTTCGTTTTTTCG(SEQ ID NO：51)
ATYGATYGGGGTGTTTTTTAGGTTTY(SEQ ID NO：52)
ATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTC(SEQ ID NO：53)
ATCGATTGGGGTGTTTTTTAGGTTTT(SEQ ID NO：54)
ATCGATTGGGGTGTTTTTTAGGTTTC(SEQ ID NO：55)
ATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTT(SEQ ID NO：56)
GGGTGTTTTTTAGGTTTCGCGTC(SEQ ID NO：57)；
和反向引物，一条选自(C)组的反向引物和一条选自(D)组的反向引物；
(C)BMP3反向引物
CTCCCGACGTCGCTACG(SEQ ID NO：58)
CCTCACCCGCGCAAAACG(SEQ ID NO：59)
CGCGAACCTCACCCGCGCAA(SEQ ID NO：60)
CCTCACCCGCGCAAAACG(SEQ ID NO：61)
ACCTCACCCACACAAAACACT(SEQ ID NO：62)
CCACTTACTACGCTAACCCAACG(SEQ ID NO：63)
CCACTTACTACACTAACCCAACAC(SEQ ID NO：64)
ACTCCGAAAACGCAAAAAACCG(SEQ ID NO：65)
AACACTCCAAAAACACAAAAAACC(SEQ ID NO：66)
CACTCCGAAAACGCAAAAAACCG(SEQ ID NO：67)
ACACTCCAAAAACACAAAAAACCAAC(SEQ ID NO：68)
CCACTTACTACGCTAACCCAACG(SEQ ID NO：69)
CCACTTACTACGCTAACCCAACG(SEQ ID NO：70)
CCACTTACTACGCTAACCCAACG(SEQ ID NO：71)
CACTCCGAAAACGCAAAAAACCG(SEQ ID NO：72)
CACTCCGAAAACGCAAAAAACCG(SEQ ID NO：73)
CACTCCGAAAACGCAAAAAACCG(SEQ ID NO：74)
CCTCACCCGCGCAAAACG(SEQ ID NO：75)
ACCTCACCCGCGCAAAACG(SEQ ID NO：76)
ATAAACTCTTCCCCAACAACTACRCRAA(SEQ ID NO：77)
ATAAACTCTTCCCCAACAACTACGCGAA(SEQ ID NO：78)
ATAAACTCTTCCCCAACAACTACACAAA(SEQ ID NO：79)
ATAAACTCTTCCCCAACAACTACACGAA(SEQ ID NO：80)
ATAAACTCTTCCCCAACAACTACGCAAA(SEQ ID NO：81)
GCAACCTAACAAATAAACTCTTCCCCAA(SEQ ID NO：82)
AACAAATAAACTCTTCCCCAACAACTAC(SEQ ID NO：83)
CCACTTACTACGCTAACCCAACG(SEQ ID NO：84)
ACTTACTACGCTAACCCAACG(SEQ ID NO：85)
CTTACTACGCTAACCCAACG(SEQ ID NO：86)
ACTCCCGACGTCGCTACG(SEQ ID NO：87)
TCCAAACCAACTAAAACGAAAAC(SEQ ID NO：88)
ACCTCACCCACACAAAACACT(SEQ ID NO：89)
CCACTTACTACACTAACCCAACAC(SEQ ID NO：90)
AACACTCCAAAAACACAAAAAACC(SEQ ID NO：91)
ACACTCCAAAAACACAAAAAACCAAC(SEQ ID NO：92)
(D)NDRG4反向引物
TCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCGTAG(SEQ ID NO：93)
GTAACTTCCGCCTTCTACGC(SEQ ID NO：94)
AAACCGCGACGCGAAACC(SEQ ID NO：95)
GACCCGCGAAACGATACCG(SEQ ID NO：96)
AAGCAAAAAGCAAACGCGC(SEQ ID NO：97)
CACCGCGAAAATACGAACGAAAC(SEQ ID NO：98)
GAACGAAACAAACGCGCAAACG(SEQ ID NO：99)
TAAAATACCCGATAAACGAACG(SEQ ID NO：100)
GTAACTTCCGCCTTCTACGC(SEQ ID NO：101)
CGTAACTTCCGCCTTCTACGC(SEQ ID NO：102)
TCGCGCGTAACTTCCGCCTT(SEQ ID NO：103)
CGATCCCTCGCGCGTAACTT(SEQ ID NO：104)
TCGCGCGTAACTTCCGCCTT(SEQ ID NO：105)
GTAACTTCCGCCTTCTACGC(SEQ ID NO：106)
CCTTCTACRCRACTAAAATACCCRAT(SEQ ID NO：107)
CCTTCTACGCGACTAAAATACCCGAT(SEQ ID NO：108)
CCTTCTACACAACTAAAATACCCGAT(SEQ ID NO：109)
CCTTCTACACGACTAAAATACCCGAT(SEQ ID NO：110)
CCTTCTACGCAACTAAAATACCCGAT(SEQ ID NO：111)
AACCTAAAACTAATCCCGAACGAACC(SEQ ID NO：112)
GCGCGTAACTTCCGCCTTCTA(SEQ ID NO：113)。
2.用于检测生物样本中BMP3和NDRG4甲基化水平的探针，其特征在于，
所述探针包括一条选自(E)组的探针和一条选自(F)组的探针，
(E)BMP3探针
CGCCGAGGCGGTTTTTTGCG(SEQ ID NO：114)
TAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCG(SEQ ID NO：115)
TGGAGTGGAGACGGCGTTCGTAGCGT(SEQ ID NO：116)
TAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCG(SEQ ID NO：117)
TTTAGTGTTGGAGTGGAGATGGTGTTTGT(SEQ ID NO：118)
CCCAACAACTACGCGAACCTCACCCG(SEQ ID NO：119)
CCCAACAACTACACAAACCTCACCCAC(SEQ ID NO：120)
AAACCGACGACGAAACCGAAAATTAAACTCCAAA(SEQ ID NO：121)
AAACCAACAACAAAACCAAAAATTAAACTCCAAACC(SEQ ID NO：122)
TTATTTGTTAGGTTGCGTTGGGTTAGCGTAGTAAGTG(SEQ ID NO：123)
TATTTGTTAGGTTGTGTTGGGTTAGTGTAGTAAGTGGG(SEQ ID NO：124)
TAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCG(SEQ ID NO：125)
CCCAACAACTACGCGAACCTCACCCG(SEQ ID NO：126)
CCCAACAACTACGCGAACCTCACCCG(SEQ ID NO：127)
TAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCG(SEQ ID NO：128)
CCCAACAACTACGCGAACCTCACCCG(SEQ ID NO：129)
CCCAACAACTACGCGAACCTCACCCG(SEQ ID NO：130)
TAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCG(SEQ ID NO：131)
AGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCG(SEQ ID NO：132)
TAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCGTA(SEQ ID NO：133)
CGCTACGAACGCCGTCTCCACTCCAACGCTA(SEQ ID NO：134)
CCCAACAACTACGCGAACCTCACCCG(SEQ ID NO：135)
CGGGTGAGGTTCGCGTAGTTGTTGGG(SEQ ID NO：136)
TTCCCCAACAACTACGCGAACCTCACC(SEQ ID NO：137)
ACACTCCGAAAACGCAAAAAACCGACGA(SEQ ID NO：138)
ATTCGGTCGCGTTTCGGGTTTCGTGC(SEQ ID NO：139)
TTTAGTGTTGGAGTGGAGATGGTGTTTGT(SEQ ID NO：140)
CCCAACAACTACACAAACCTCACCCAC(SEQ ID NO：141)
AAACCAACAACAAAACCAAAAATTAAACTCCAAACC(SEQ ID NO：142)
TATTTGTTAGGTTGTGTTGGGTTAGTGTAGTAAGTGGG(SEQ ID NO：143)；
(F)NDRG4探针
TTCGTTTATCGGGTATTT(SEQ ID NO：144)；
TAGGTTTCGCGTCGCGGTTTTCGTT(SEQ ID NO：145)；
TTGTATTCGCGCGTCGGCGGCGTCGAAG(SEQ ID NO：146)；
TTGTATTCGCGCGTCGGCGGCGTTGAAGT(SEQ ID NO：147)；
TCGCGCGTCGGCGGCGTCGAAG(SEQ ID NO：148)；
TCGCGCGTCGGCGGCGTTGAAG(SEQ ID NO：149)；
TCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCGTAG(SEQ ID NO：150)；
CGTCGCGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGTTCGT(SEQ ID NO：151)；
ACGCGACTAAAATACCCGATAAACGAACGAAAAAACGAAC(SEQ IDNO：152)。
3.一种生物样本中BMP3和NDRG4甲基化水平的检测方法，其特征在于，
包括以下步骤：
步骤a，样品的制备
从收集到的生物样本中提取DNA，然后对DNA进行修饰，修饰后的DNA纯化回收，溶于水后备用；
步骤b，PCR检测
加入权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针，将步骤a中修饰后的DNA进行荧光定量PCR检测；
步骤c，甲基化水平分析
计算目标基因BMP3和NDRG4与内参基因B2M的扩增Ct比差值，得到样本相对甲基化水平。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
其中步骤a中DNA的修饰方法为，取一定体积的DNA，加入1/10体积NaOH，37-42℃金属浴孵育20min；加入5-10倍DNA溶液体积的配亚硫酸盐转化液，混匀后，50-55℃金属浴避光孵育16h。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
其中步骤a中修饰后的DNA使用DNA纯化柱纯化回收，回收过程中使用0.2-0.3M NaOH的90％乙醇溶液脱硫。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
其中步骤c中B2M所用引物为：
一个正向引物，选自
GAGATAAAGTTATTAAATTGTTATATTTGTG(SEQ ID NO：153)
GTAGGTTTGGGTAATTTTAAATAGTGGA(SEQ ID NO：154)，
一个反向引物，选自
AAAATCTTACTATATTACCCAAACTAA(SEQ ID NO：155)
TTCTTTCAAAATATCATCCCCCAAT(SEQ ID NO：156)。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
其中步骤c中B2M所用探针为：
CTCAAACTCCTAATCTCAAATAATCCTCCTTCCC(SEQ ID NO：157)
TTCCTACAAATCTTCCCCCAAACACCCTT(SEQ ID NO：158)。
8.一种检测生物样本中BMP3和NDRG4甲基化水平的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
如权利要求1所述的正向引物；
如权利要求1所述反向引物；
如权利要求2所述的探针。
9.如权利要求1所述的引物在检测生物样本中BMP3和NDRG4甲基化水平的试剂盒中的应用。
10.如权利要求2所述的探针在检测生物样本中BMP3和NDRG4甲基化水平的试剂盒中的应用。
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| CN (1) | CN104975110A (zh) |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106011263A (zh) * | 2016-06-28 | 2016-10-12 | 宁波大学 | 用于检测与胃癌相关的ndrg4基因甲基化程度的试剂盒及其应用 |
| CN106399570A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-02-15 | 杭州诺辉健康科技有限公司 | 用于早期结直肠癌辅助诊断的试剂盒及其使用方法和检测系统 |
| CN106521006A (zh) * | 2016-12-27 | 2017-03-22 | 刘鹏飞 | Ndrg4基因甲基化检测用试剂体系和试剂盒及其应用 |
| CN106521007A (zh) * | 2016-12-27 | 2017-03-22 | 刘鹏飞 | Bmp3基因甲基化检测用试剂体系和试剂盒及其应用 |
| CN106893777A (zh) * | 2017-03-02 | 2017-06-27 | 武汉艾米森生命科技有限公司 | 用于检测结直肠癌相关基因多位点甲基化试剂盒及应用 |
| CN108660209A (zh) * | 2018-05-23 | 2018-10-16 | 杭州诺辉健康科技有限公司 | 基于bmp3基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法 |
| CN108676878A (zh) * | 2018-05-23 | 2018-10-19 | 杭州诺辉健康科技有限公司 | 基于ndrg4基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法 |
| CN109943638A (zh) * | 2019-05-08 | 2019-06-28 | 湖南百伯基因技术有限公司 | 一种检测ndrg4、sdc2和bmp3基因甲基化的引物探针组合及其应用和试剂盒 |
| CN111560435A (zh) * | 2020-05-20 | 2020-08-21 | 深圳市新合生物医疗科技有限公司 | 一种用于结直肠癌检测的dna甲基化试剂盒及使用方法、应用 |
| CN112752763A (zh) * | 2018-05-23 | 2021-05-04 | 杭州诺辉健康科技有限公司 | 筛查结直肠癌和晚期腺瘤的试剂盒及其应用 |
| CN114045343A (zh) * | 2021-12-01 | 2022-02-15 | 大连晶泰生物技术有限公司 | 一种多基因甲基化突变的检测方法和试剂盒及其应用 |
| CN114085904A (zh) * | 2020-08-24 | 2022-02-25 | 广州达健生物科技有限公司 | 结直肠癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用 |
| CN115287352A (zh) * | 2022-06-01 | 2022-11-04 | 上海市第一人民医院 | 用于数字pcr检测结直肠癌基因甲基化的引物探针组合及其试剂盒和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140057262A1 (en) * | 2011-03-14 | 2014-02-27 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Methods and materials for using the contents of phagocytes to detect neoplasms |
-
2015
- 2015-08-10 CN CN201510486088.7A patent/CN104975110A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140057262A1 (en) * | 2011-03-14 | 2014-02-27 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Methods and materials for using the contents of phagocytes to detect neoplasms |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HONGZHI ZOU ET AL.: "Quantification of Methylated Markers with a Multiplex Methylation-Specific Technology", 《CLINICAL CHEMISTRY》 * |
| JOHN B. KISIEL ET AL.: "Stool Methylated DNA Markers Decrease Following Colorectal Cancer Resection—Implications for Surveillance", 《DIG DIS SCI》 * |
| 陆宏娜 等: "粪便中基因甲基化检测筛查结直肠肿瘤的荟萃分析", 《世界华人消化杂志》 * |
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106011263A (zh) * | 2016-06-28 | 2016-10-12 | 宁波大学 | 用于检测与胃癌相关的ndrg4基因甲基化程度的试剂盒及其应用 |
| CN106399570A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-02-15 | 杭州诺辉健康科技有限公司 | 用于早期结直肠癌辅助诊断的试剂盒及其使用方法和检测系统 |
| CN106521006A (zh) * | 2016-12-27 | 2017-03-22 | 刘鹏飞 | Ndrg4基因甲基化检测用试剂体系和试剂盒及其应用 |
| CN106521007A (zh) * | 2016-12-27 | 2017-03-22 | 刘鹏飞 | Bmp3基因甲基化检测用试剂体系和试剂盒及其应用 |
| CN106893777A (zh) * | 2017-03-02 | 2017-06-27 | 武汉艾米森生命科技有限公司 | 用于检测结直肠癌相关基因多位点甲基化试剂盒及应用 |
| EP3797112A4 (en) * | 2018-05-23 | 2022-03-23 | Hangzhou New Horizon Health Technology Co., Ltd. | KIT FOR SCREENING COLORECTAL CANCER AND ADVANCED ADENOMA AND ITS APPLICATION |
| CN108660209A (zh) * | 2018-05-23 | 2018-10-16 | 杭州诺辉健康科技有限公司 | 基于bmp3基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法 |
| CN108676878A (zh) * | 2018-05-23 | 2018-10-19 | 杭州诺辉健康科技有限公司 | 基于ndrg4基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法 |
| CN112752763A (zh) * | 2018-05-23 | 2021-05-04 | 杭州诺辉健康科技有限公司 | 筛查结直肠癌和晚期腺瘤的试剂盒及其应用 |
| JP2021526370A (ja) * | 2018-05-23 | 2021-10-07 | 杭州諾輝健康科技有限公司Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｎｅｗ Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． | 大腸がんおよび進行腺腫をスクリーニングするためのキットおよびその応用 |
| CN109943638A (zh) * | 2019-05-08 | 2019-06-28 | 湖南百伯基因技术有限公司 | 一种检测ndrg4、sdc2和bmp3基因甲基化的引物探针组合及其应用和试剂盒 |
| CN111560435A (zh) * | 2020-05-20 | 2020-08-21 | 深圳市新合生物医疗科技有限公司 | 一种用于结直肠癌检测的dna甲基化试剂盒及使用方法、应用 |
| CN114085904A (zh) * | 2020-08-24 | 2022-02-25 | 广州达健生物科技有限公司 | 结直肠癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用 |
| CN114085904B (zh) * | 2020-08-24 | 2024-02-23 | 广州达健生物科技有限公司 | 结直肠癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用 |
| CN114045343A (zh) * | 2021-12-01 | 2022-02-15 | 大连晶泰生物技术有限公司 | 一种多基因甲基化突变的检测方法和试剂盒及其应用 |
| CN115287352A (zh) * | 2022-06-01 | 2022-11-04 | 上海市第一人民医院 | 用于数字pcr检测结直肠癌基因甲基化的引物探针组合及其试剂盒和应用 |
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