ES2510842T3

ES2510842T3 - Gen asociado con cáncer de hígado, y método para la determinación del riesgo de adquirir cáncer de hígado

Info

Publication number: ES2510842T3
Application number: ES08845421.0T
Authority: ES
Inventors: Takeaki Ishizawa; Norihiro Kokudo; Hirohide Yoshikawa; Yuko Shikauchi; Yacko Murase
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2007-10-30
Filing date: 2008-10-29
Publication date: 2014-10-21
Anticipated expiration: 2028-10-29
Also published as: EP2210942A1; WO2009057294A1; US20110218121A1; JP2009106191A; JP5209272B2; EP2210942A4; EP2210942B1; CN101855348A

Abstract

Un método para detectar cáncer de hígado detectando en una muestra la presencia de metilación de uno cualquiera o más de los genes o de las regiones génicas del grupo que consiste en el gen humano SALL3c, gen humano ECEL1, gen humano FOXC1, gen humano NRG3 y gen humano KCNIP2, una región génica representada por SEC ID Nº: 6 (NT_037622.5, 1393861 a 1395960) y una región génica representada por SEC ID Nº: 7 (NT_022135.15, 7774305 a 7776805) que es detectable usando un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 9 para el gen humano SALL3c, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:12 y SEC ID Nº:13 para el gen humano ECEL1, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:16 y SEC ID Nº:17 para el gen humano FOXC1, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 20 y SEC ID Nº: 21 para el gen humano NRG3, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 24 y SEC ID Nº: 25 para el gen humano KCNIP2, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 28 y SEC ID Nº: 29 para la región génica representada por SEC ID Nº: 6, y un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 32 y SEC ID Nº: 33 para la región génica representada por SEC ID Nº: 7, donde la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre y tejido hepático de un sujeto.

Description

Gen asociado con cáncer de hígado, y método para la determinación del riesgo de adquirir cáncer de hígado

5 Campo técnico:

La presente invención se refiere a un método para medir un riesgo de adquirir cáncer de hígado causado por un virus de la hepatitis u otra causa. Más específicamente, la invención se refiere a un método, a un gen marcador, y a un kit diagnóstico para determinar la presencia o ausencia de un factor genético de cáncer de hígado detectando la presencia o ausencia de metilación de un gen que afecta a un riesgo de cáncer de hígado en una muestra que contiene ADN genómico humano, tal como un componente de la célula sanguínea o un componente del plasma extraído de un sujeto. La invención también se refiere a un método para seleccionar un agente terapéutico candidato para el cáncer de hígado.

15 Antecedentes de la técnica:

El cáncer de hígado es un nombre que hace referencia a un tumor maligno que ocurre en el hígado y puede clasificarse de manera aproximada a partir de sus metástasis en un carcinoma hepatocelular, que ocurre principalmente en las células hepáticas, y al cáncer de hígado metastásico, que se origina a partir de un órgano distinto al hígado y después de transfiere al hígado. Un informe de la mortalidad del cáncer realizado por el Departamento de Estadística en el año 1996 revela que aproximadamente 10.000 pacientes mueren por cáncer cada año en Japón y que la mortalidad del cáncer de hígado es del 21,4 % (1996), que es una enfermedad causante importante después del cáncer de estómago, y, en los 40 y 50, la mortalidad del cáncer de hígado es más elevada que la del cáncer de estómago.

25 También, se ha informado recientemente que el número de muertes por cáncer de hígado es de 34.000, que es aproximadamente el 11 % del número total de muertes por cáncer. El noventa por ciento o más de los pacientes con cáncer de hígado están infectados con el virus de la hepatitis, y también se dice que el número de pacientes con hepatitis viral que tienen un riesgo de desarrollar cáncer de hígado en Japón es de tres millones. El carcinoma hepatocelular constituye el 95 % del cáncer de hígado primario, y el número de muertes del mismo alcanza aproximadamente el 70 % de todas las muertes por enfermedades hepáticas. Las causas del carcinoma hepatocelular son la hepatitis crónica y la cirrosis hepática debidas a hepatitis B y C, y el número de casos de carcinoma hepatocelular celular se incrementa cada año. En aproximadamente el 70 % de las hepatitis C, la misma enfermedad progresa gradualmente y produce cirrosis hepática y después cáncer de hígado. Se sabe que

35 aproximadamente el 80 % de los casos de cáncer de hígado están causados por hepatitis C.

El cáncer de hígado se trata mediante resección del hígado, tratamiento local, embolización terapéutica de la arteria hepática, o radioterapia. La resección del hígado es efectiva, ya que la función hepática puede soportar la operación, y se emplea más frecuentemente. En el tratamiento local, el tamaño de un tumor disminuye mediante la colocación, por ejemplo, de una aguja dentro del tumor a través de la piel e inyectando, por ejemplo, alcohol o se quema localmente con microondas o una onda de radio. La embolización terapéutica de la arteria hepática elimina a las células cancerosas mediante la oclusión de la arteria hepática para desconectar a las células cancerosas de su fuente de nutrientes. Además, la radioterapia elimina las células cancerosas irradiando el foco como una diana con un haz de radiación. Sin embargo, actualmente, la operación quirúrgica es el medio más efectivo.

45 Es muy posible incrementar la tasa de supervivencia de los pacientes con cáncer de hígado mediante el tratamiento en un estadio muy temprano. En el caso del carcinoma hepatocelular, se ha notificado que la tasa de supervivencia de los pacientes de carcinoma hepatocelular en estadio temprano a los cinco años es del 45 %, mientras que la tasa de supervivencia de los pacientes con carcinoma hepatocelular en estadio no temprano a los cinco años es del 11 %. Además, la supervivencia a los cinco años de los pacientes en el estadio clínico I de la enfermedad es del 91 %, y de aquellos en los estadios II y III es del 12 % y del 0 %, respectivamente. Por lo tanto, la detección temprana del cáncer de hígado es importante, y también se desea para desarrollar, por ejemplo, un agente diagnóstico que pueda diagnosticar convenientemente y con alta precisión el cáncer de hígado. Además, el riesgo de recurrencia después de la operación de cáncer de hígado es alto, y el diagnóstico de la recurrencia también es necesario.

55 Actualmente, como indicadores de disfunción hepática se usan ampliamente AST (GOT), ALT (GPT), y γ-GTP (γglutamil transpeptidasa). Las pruebas se usan para diagnosticar la disfunción hepática, pero el diagnóstico de la inflamación, fibrilación, y progreso a cáncer requieren pruebas víricas. Además, el cáncer de hígado se diagnostica, por ejemplo, mediante diagnóstico por imagen o usando un marcador tumoral. Dado que el diagnóstico por imagen puede diagnosticar la zona que progresa a cirrosis hepática o a cáncer hepático, se emplea una prueba de ultrasonidos abdominal, TC, o RMI. La prueba TC y la prueba de ultrasonidos pueden detectar cáncer temprano incluso si su tamaño es de 10 mm o inferior y exhiben alta precisión. Sin embargo, las pruebas requieren la aprobación del seguro, un nivel técnico experto, e instalaciones altamente equipadas, lo que supone una desventaja para las pruebas frecuentes y para permitir a cualquier institución médica realizar las pruebas. También, como

65 marcadores de carcinoma hepatocelular se conocen, por ejemplo, la α-fetoproteína (AFP) y la proteína inducida por la ausencia de antagonista de la vitamina K (PIVKA-2; des-gamma-carboxiprotrombina).

Sin embargo, la AFP y la PIVKA-2 tienen el inconveniente de que tienen una tasa de positivos baja, de aproximadamente el 30 al 40 %. Se determina que un sujeto con un nivel de AFP de 20 ng/ml o más tiene carcinoma hepatocelular. Sin embargo, dado que la AFP también se incrementa en pacientes sin cáncer de hígado, tales como los de hepatitis crónica y cirrosis de hígado activa, la discriminación entre los casos leves y moderados es difícil. Por 5 lo tanto, en algunos casos, se usa una fracción de AFP-L3, que es un marcador tumoral que exhibe mayor especificidad para el carcinoma hepatocelular. Por otro lado, la PIVKA-2 es un marcador tumoral que tiene alta especificidad para el carcinoma hepatocelular y raramente se incrementa en otras enfermedades. Sin embargo, se observa un nivel incrementado de este, por ejemplo, en daño hepático por consumo de alcohol, durante la administración de fármacos (por ejemplo, warfarina o un fármaco antituberculoso), y durante carencias vitamínicas,

10 aunque no se tenga carcinoma hepatocelular.

En el diagnóstico presente actualmente, el cáncer de hígado se diagnostica usando una combinación de AFP, fracción AFP-L3, y PIVKA-2. Se requiere el diagnóstico del cáncer de hígado usando un marcador sanguíneo para tener una mejora del rendimiento diagnóstico para el cáncer de hígado. Es decir, se necesita un marcador

15 diagnóstico eficaz que tenga capacidad y sensibilidad incrementada.

Por lo tanto, se desea desarrollar un nuevo método, y, por ejemplo, un candidato de este es el uso de la metilación aberrante del gen P16, que es un gen relacionado con cáncer, como un indicador (Bibliografía 1 que no es de Patente). Además, se propone un método diagnóstico para determinar si un sujeto tiene hepatitis C severa en

20 progresión a cáncer de hígado midiendo el nivel de GPC3 en una muestra de un paciente con hepatitis C (Bibliografía 1 de Patente).

Bibliografía 1 que no es de Patente 1: Wong IHN, et al., Detection of aberrant p16 methylation in the plasma and serum of liver cancer patients, Cancer Res., 59, 71-73, 1999.

25 Bibliografía 1 de Patente: JP-A-2007-192557, Method for monitoring hepatitis C patient for progression to severe liver disease and liver cancer diagnostic method.

Sumario de la invención:

30 Problema técnico:

Sin embargo, los marcadores convencionales de cáncer de hígado o AFP y PIVKA-2 tienen inconvenientes tales como que tienen una reactividad baja en cáncer en estadio temprano, que PIVKA-2 requiere un equipo de diagnóstico que cuesta varios millones de yenes y que requiere tiempo y esfuerzo debido a la combinación con dos o 35 tres tipos de otros marcadores tumorales, y que el tipo de tumor no se puede determinar. Por consiguiente, un objetivo a resolver por la presente invención es proporcionar un gen marcador conveniente que tiene alta reactividad también a cáncer en estadio temprano y alta sensibilidad para cáncer de hígado y proporcionar un método para determinar un riesgo de recurrencia después de la resección del cáncer de hígado. Además, es un objetivo de la presente invención proporcionar un método para buscar un fármaco candidato que se dirija a un gen marcador

40 metilado de cáncer de hígado.

Solución al problema:

Los autores de la presente invención han realizado intensos estudios para resolver los problemas anteriormente

45 mencionados. Como un resultado, los investigadores han descubierto el hecho de que el gen SALL3c humano, el gen ECEL1 humano, el gen FOXC1 humano, el gen NGR3 humano, y el gen KCNIP2 humano metilados, y las regiones génicas metiladas representadas por SEC ID Nº: 6 (NT_037622.5, 1393863 to 1395B63) y SEC ID Nº: 7 (NT_022135.15, 7774305 a 7776805) son genes o regiones génicas susceptibles a cáncer de hígado. Es decir, se ha descubierto que el cáncer de hígado puede detectarse por la presencia o ausencia de metilación en esos genes o

50 regiones génicas o la frecuencia de metilación. La presente invención demuestra que el cáncer de hígado puede detectarse usando, como indicadores, la metilación de estos genes o regiones génicas o la alta frecuencia de metilación, y por lo tanto se ha llevado a cabo. Además, dado que un fármaco candidato que suprime o previene la metilación de cualquiera de estos genes tiene una elevada posibilidad de convertirse en un fármaco terapéutico para el cáncer de hígado, la presente invención también es eficaz como un método para buscar un fármaco candidato.

55 Es decir, la presente invención proporcionó lo siguiente:

Un método para detectar cáncer de hígado tal como se especifica en las reivindicaciones, en particular en las reivindicaciones 1 y 2.

60 El uso de un polinucleótido para el diagnóstico in vitro del cáncer de hígado, tal como se especifica en las reivindicaciones, en particular en las reivindicaciones 3, 6 y 7.

El uso de un kit para el diagnóstico in vitro del cáncer de hígado tal como se especifica en las reivindicaciones, en 65 particular en las reivindicaciones 4 y de 6 a 8.

El uso de una micromatriz para el diagnóstico in vitro del cáncer de hígado tal como se especifica en las reivindicaciones, en particular en las reivindicaciones 5 y de 6 a 8.

Un conjunto de cebadores tal como se especifica en las reivindicaciones, en particular en la reivindicación 9, donde 5 el gen SALL3c es una forma de corte y empalme alternativa del gen SALL3 y se ha descubierto recientemente por los autores de la presente invención, quienes pertenecen a la Japanese Foundation For Cancer Research.

Un método para detectar un riesgo de recurrencia después de la operación de cáncer de hígado tal como se especifica en las reivindicaciones, en particular en las reivindicaciones 10 y 11.

El uso de un polinucleótido para detectar el diagnóstico in vitro del riesgo de recurrencia después de la operación de cáncer de hígado tal como se especifica en las reivindicaciones, en particular en las reivindicaciones de 12 a 16.

El uso de un kit para el diagnóstico in vitro del riesgo de recurrencia después de la operación de cáncer de hígado tal 15 como se especifica en las reivindicaciones, en particular en las reivindicaciones 13 y 15.

El uso de una micromatriz para el diagnóstico in vitro del riesgo de recurrencia después de la operación de cáncer de hígado tal como se especifica en las reivindicaciones, en particular en las reivindicaciones 14 y 15.

Efectos ventajosos de la invención:

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un nuevo método de detección que puede detectar directamente el cáncer de hígado a bajo coste, en particular, por ejemplo, cáncer de hígado en estadio temprano y un riesgo de recurrencia después de la operación de cáncer de hígado y que es muy conveniente y muy fiable. La

25 detección temprana del cáncer de hígado es un método más eficaz para disminuir la tasa de mortalidad del cáncer, y se desean un marcador diagnóstico y un método para la detección en un estadio temprano. Además, también puede proporcionarse un oligonucleótido, una micromatriz, y un kit que se usan para el método de detección. Además, es posible buscar un fármaco candidato que suprima o inhiba la metilación usando, como indicador, la metilación de los genes.

Descripción de las realizaciones:

La presente invención se describirá en detalle a continuación. Obsérvese que las realizaciones no se limitan a las que se indican a continuación.

35 La presente invención proporciona un método para detectar cáncer de hígado, en particular, cáncer de hígado en estadio temprano y recurrencia del cáncer después de la operación de cáncer. El método se basa en el hallazgo de que la metilación del gen SALL3c humano, el gen ECEL1 humano, el gen FOXC1 humano, el gen NGR3 humano, el gen KCNIP2 humano, o un gen representado por SEC ID Nº: 6 (NT_037622.5, 1393863 to 1395863) o SEC ID Nº: 7 (NT_022135.15, 7774305 a 7776805) y una alta frecuencia de metilación son indicadores altamente específicos para el cáncer de hígado, y se centra en la metilación de estos genes y de las regiones génicas o genes metilados.

El método para detectar cáncer de hígado midiendo la metilación de un gen específico de acuerdo con la presente invención puede realizarse del siguiente modo: Primero, en el método de detección de cáncer de hígado de la 45 presente invención, se extrae un componente del suero, plasma, o célula sanguínea del sujeto. Los ejemplos de la muestra a ensayar incluyen líquido intersticial, líquido extravascular, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, saliva, y tejido hepático. La muestra se extrae después de la operación, preferentemente del tercer al séptimo día. La muestra de tejido es, por ejemplo, tejido extraído por operación o con un endoscopio o parte del tejido, una muestra de biopsia, o líquido de lavado orgánico. Además, el método para extraer ADN de estas muestras se conoce bien en el campo de la técnica, y, por ejemplo, se puede emplear la extracción con fenol/cloroformo. Como alternativa, se puede usar un reactivo comercialmente disponible para la extracción de ADN. En tal caso, se pueden usar un kit de extracción de ADN genómico comercialmente disponible y un aparato, tal como el kit de purificación de ADN genómico en sangre GFX. Además, se puede detectar directamente un gen específico, por ejemplo, mediante PCR sin un tratamiento para extraer ADN de la muestra. Además, en el método de detección de la presente invención,

55 solamente varios mililitros de sangre, o aproximadamente, 10 mg de tejido de cáncer resecado son suficientes como muestra. Por lo tanto, el método es significativamente menos invasivo y por lo tanto sobrecarga menos a los pacientes o sujetos.

La expresión "metilación del ADN" se refiere a que una citosina (C), una base del ADN, está metilada (adición de CH3). La metilación se observa, en muchos casos, en un sitio CpG donde C se sitúa próxima a G, y aproximadamente el 80 % de los sitios CpG están metilados. Una región de un genoma donde la densidad de sitios CpG es alta se denomina isla CpG y se piensa que está involucrada, por ejemplo, en la regulación de la expresión génica, cáncer, e impronta. En general, las citosinas de las islas CpG raramente están metiladas, y los sitios CpG fuera de las islas CpG están metilados. Además, una región de ADN en la que se genera un sitio CpG metilado 65 solamente en una cadena de ADN durante la replicación del ADN retorna a un estado en el que ambas cadenas de ADN están metiladas mediante una función de la metiltransferasa. Por lo tanto, los sitios CpG metilados y no

metilados se conservan incluso después de la replicación del ADN, y se sabe que funcionan como un marcador en un genoma. Como significado biológico de la metilación, en particular, cuando una isla CpG está presente en la región 5’ de un gen, la metilación funciona como un interruptor de la expresión del gen. Normalmente, la isla CpG en la región 5’ de un gen no está metilada de modo que el gen puede expresarse. Por ejemplo, en cáncer, la isla CpG

5 de la región 5’ de un gen supresor de tumores, que normalmente no está metilada, está aberrantemente metilada para suprimir la expresión, lo que se ha reconocido recientemente como un mecanismo oncogénico importante.

El término "nucleótido" se refiere a un ácido nucleico. Un polinucleótido consiste en nucleótidos unidos entre sí, incluyendo ADN y ARN, y significa lo mismo que un denominado cebador, sonda o fragmento oligomérico.

10 A fin de medir un grado o frecuencia de la metilación del ADN, por ejemplo, se puede usar COBRA (análisis de restricción de bisulfito combinado) o secuenciación con bisulfito. Estos métodos se basan en un principio de que la citosina no metilada se convierte en uracilo, mientras que la citosina metilada no se convierte en uracilo, tratando el ADN con un reactivo modificador de la citosina no metilada tal como bisulfito. Como técnica para analizar

15 semicuantitativamente y con alta sensibilidad la metilación del ADN, se conoce la Methylight. En la Methylight, la metilación se detecta por PCR en tiempo real usando una combinación de un cebador que reconoce una secuencia de metilación específica y una sonda TaqMan. Además, otro ejemplo es un método que usa una enzima de restricción (tal como Dnp1) que escinde específicamente una secuencia génica metilada.

20 Información de las secuencias génicas:

La información acerca de los genes que pueden usarse en el método de la presente invención se cita en la siguiente tabla 1 (SEC ID Nº: 1 a 7).

25 La tabla 1 muestra los Nº de SEC ID, los nombres de los genes, y los Nos de referencia de los genes que se pueden usar en la presente invención.

La información de cualquiera de las secuencias génicas se puede obtener usando los Nos de referencia que se pueden confirmar en la página web (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) del National Biotechnology Information Center 30 (NCBI). SALL3C, que no tiene Nº de referencia, se ha identificado por los autores de la presente invención que pertenecen a la Japanese Foundation For Cancer Research, como una nueva forma de corte y empalme alternativa de SALL3 (NM_171999) y tiene intención de registrarlo en un banco de genes (NCBI). La secuencia génica de SALL3C se muestra como SEC ID Nº: 1. En los genes no nombrados, las funciones de estos no están claras aunque se conoce la información de la secuencia génica. Estos genes sin nombre se muestran por las posiciones de las

35 regiones génicas que se usan en la presente invención.

[Tabla 1].

SEC ID Nº:: Nombre del gen (posición de la región génica) Nº de referencia

SEC ID Nº: 1: 3C similar a sal (SALL3C)
SEC ID Nº: 1

SEC ID Nº: 2: gen I similar a la enzima convertidora de endotelina (ECEL1) NM_004826

SEC ID Nº: 3: caja Forkhead (FOXC1) NM_001453

SEC ID Nº: 4: neurregulina 3 (NRG3) NM_001010848

SEC ID Nº: 5: proteína 2 que interacciona con el canal Kv (KCNIP2) NM_014591

SEC ID Nº: 6: De 1393863 a 1395863 NT_037622.5

SEC ID Nº: 7: De 7774305 a 7776805 NT_022135.15

Método de detección de la metilación en genes de acuerdo con la presente invención:

40 Un método de detección de metilación en un gen específico que se usa en el método de detección de la presente invención se mostrará a modo de ejemplo más adelante.

Como técnica para analizar semicuantitativamente y con alta sensibilidad la metilación del ADN, se conocen la

Methylight y la secuenciación con bisulfito. En la secuenciación con bisulfito, un ADN monocatenario se trata con 45 bisulfito (sulfito de hidrógeno de sodio) para causar sulfonilación e hidroaminación. Posteriormente, se realiza la

desulfonilación para convertir la citosina en uracilo. Por otro lado, dado que la tasa de sulfonilación de la citosina

metilada es muy baja, la citosina metilada no se convierte en uracilo, pero la citosina no metilada se sustituye por

timina (Frommer M, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. E.E.U.U. 891827-1831, (1992) Clark S J, et al., Nucleic Acids Res.,

22, 2990 (1994)). El estado de metilación se puede analizar utilizando la diferencia (C y T) en las secuencias. Existe 50 una serie de métodos que utilizan el tratamiento con bisulfito para experimentos más específicos, tales como la

secuenciación con bisulfito y el análisis de restricción de sulfito combinado (COBRA), y se puede seleccionar un

método de esos métodos de modo que sea adecuado para el fin analítico.

El ADN que se usa para la detección de la metilación se trata del siguiente modo: Primero, se extrae el ADN de las células sanguíneas o del suero usando los kits DNeasy para sangre y tejidos (Qiagen). Posteriormente, la muestra 5 de ADN extraída de las células sanguíneas o el suero se trata con bisulfito. Se desnaturaliza una pequeña cantidad del ADN del suero o 500 ng del ADN extraído de las células sanguíneas mediante tratamiento con NaCl 0,2 M a 37 °C durante 10 minutos. Después, se añaden a la misma, sulfito de hidrógeno de sodio a una concentración final de 3 M e hidroquinona a una concentración final de 0,5 M, seguido de una reacción durante 16 horas. La solución de reacción se desaliniza usando el kit de purificación de ADN Wizard. El tratamiento con bisulfito se realiza en NaOH

10 0,3 M durante 15 minutos y después se termina. El ADN modificado se precipita con etanol y después se lava con etanol al 70 %. El ADN modificado se disuelve en 20 µL de agua destilada. Como alternativa, se usa el kit Epi TectBisulfite (Qiagen).

Después, se preparan los cebadores para detectar específicamente cada uno de los genes metilados para detectar

15 la presencia o ausencia de metilación en los genes o regiones génicas que se muestran en la tabla 1 o una frecuencia de metilación de acuerdo con la presente invención. La tabla 2 muestra las secuencias (de 5’ a 3’) de los conjuntos de cebadores que pueden detectar los respectivos genes que se usan en los ejemplos de la presente invención. Después, se realiza la PCR anidada usando cebadores F1 y R1 en la primera PCR y cebadores F2 y R2 en la segunda PCR. La PCR anidada es un método para realizar una PCR en dos etapas que usa cebadores

20 externos y cebadores internos. Los primeros productos de PCR de una región deseada se usan como moldes, y ambos cebadores se diseñan de modo que reconozcan las caras internas de las posiciones que usaron los primeros cebadores. Las secuencias de los cebadores se muestran en la tabla 2, pero no se limitan a las mismas en tanto que pueden detectar específicamente o identificar la metilación de los genes. En la presente invención, los marcadores para el diagnóstico de la adquisición de cáncer de hígado pueden ser cebadores que pueden amplificar estos genes

25 específicos. A fin de amplificar una muestra de gen por PCR, es preferente la ADN polimerasa con alta fidelidad. Los cebadores se diseñan y se sintetizan usando parte de la información de la secuencia génica que se muestra en la tabla 2 de tal modo que se pueda amplificar el gen metilado específico como una diana. Después de la compleción de la reacción de amplificación, los productos amplificados se detectan por la presencia o ausencia de metilación o una frecuencia de la metilación. En la presente invención, la longitud completa de cada uno de los genes

30 anteriormente mencionados no se mide o se detecta necesariamente, y una parte del gen se puede medir o detectar dado que cada gen se puede especificar.

[Tabla 2].

SEC ID Nº: nombre del gen, etc.: Secuencia del cebador

SEC ID Nº: 1 SALL3C: F1: gttcgggttggtcgtttatcgttc (SEC ID Nº: 8) R1: cccacacactcgacccctaacg (SEC ID Nº: 9) F2: agacgtattggggcgaggggc (SEC ID Nº: 10) R2: ctccccgcgatcacacgcacg (SEC ID Nº:11)

SEC ID Nº: 2 ECEL1: F1: tttcgcggagacgttaatttagttc (SEC ID Nº: 12) R1: aaacgcaaaacgtatacaacgccg (SEC ID Nº: 13) F2: gagggttgggaaattgcggttttc (SEC ID Nº: 14) R2: ctcctcgcgctacgtcatccg (SEC ID Nº: 15)

SEC ID Nº: 3 FOXC1: F1: gcgggtcggtattagttcggtc (SEC ID Nº: 16) R1: ctacgacgtataaaacccgtaaacg (SEC ID Nº: 17)

F2: ggggttatgtaggcgcgttatttc (SEC ID Nº: 18) R2: tacgaatacacgctcataaaaaccg (SEC ID Nº: 19)

SEC ID Nº: 4, NRG3: F1: gggattcggcgcgtaggaggc (SEC ID Nº: 20) R1: caacgtaactcccgaaaaaactcg (SEC ID Nº: 21) F2: gtcgttttttgatcgatcggaggc (SEC ID Nº: 22) R2: aaaccgcgacaaaaacataaaaccg (SEC ID Nº: 23)

SEC ID Nº: 5 KCNIP2: F1: ttcgtttttcggttttattcgatgtc (SEC ID Nº: 24) R1: actaaacgaatctaaattaatccccg (SEC ID Nº: 25) F2: gatggttattttcgaggtttattagc (SEC ID Nº: 26) R2: cctccctttctaaaacgaaaatacg (SEC ID Nº: 27)

SEC ID Nº: 6 NT_037622.5 1393863 a 1395863: F1: agtataatatatcgcgtttataaattatc (SEC ID Nº: 28) R1: aacgacgcgacttatcgaacacg (SEC ID Nº: 29) F2: gcgttttttatttaatgtaaatggagc (SEC ID Nº: 30) R2: taatcgcgacatcaaccatcgacg (SEC ID Nº: 31)

SEC ID Nº: 7 NT_022135.15 7774305 a 7776805: F1: gagagtacgttagttttggagattc (SEC ID Nº: 32) R1: cacgtactttccctccttaactcg (SEC ID Nº: 33) F2: ttagtattgcgaatagcgttagtatc (SEC ID Nº: 34) E2: aataaatactaacttaatcgaaataaacg (SEC ID Nº: 35)

La amplificación génica (PCR) en los ejemplos de la presente invención se realiza del siguiente modo: Dado que una muestra del gen a ensayar incluye un gran número de moldes que no se pueden amplificar, se usa la Tth polimerasa, que es una herramienta potente, y como molde se usan 2 µl de ADN tratado con bisulfito. La solución de reacción de PCR en la primera PCR se preparara tal como se muestra en la tabla 3 usando el kit de GeneAmp XL para PCR disponible en Applied Biosystems.

[Tabla 3]

ADN molde: 2 µl

tampón XL II 3,3X: 15 µl

Mg(OAc)2 25 mM: 2,2 µl

mezcla dNTP 10 mM: 1 µl

cebador A: 1 µl

cebador B: 1 µl

rTh polimerasa: 0,5 µl

Ad: 27,3 µl

En el primer paso de la PCR, se repite un ciclo de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación de 53 a 54 °C durante 30 segundos, y extensión a 68 °C durante 3 minutos 40 veces. Después, se prepara la solución de 10 reacción de PCR para la segunda etapa de la PCR tal como se muestra en la tabla 4 usando el kit de PCR GeneAmp XL disponible a partir de Applied Biosystems. El producto de PCR de la primera etapa se diluye en agua destilada a 1/500 (en el caso del ADN de suero) o 1/1000 (en el caso del ADN de células sanguíneas), y se usa 1 µL del producto de PCR tratado diluido como ADN molde. En el segundo paso de la PCR, se repite un ciclo de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación de 53 a 54 °C durante 30 segundos, y extensión a 68 °C

15 durante 3 minutos 40 veces.

[Tabla 4]

ADN molde: 1 µl

tampón XL II 3,3X: 15 µl

Mg(OAc)2 25 mM: 2,2 µl

mezcla dNTP 10 mM: 1 µl

cebador A: 1 µl

cebador B: 1 µl

rTh polimerasa: 0,5 µl

Ad: 28,3 µl

Kit para el diagnóstico de la adquisición de cáncer de hígado:

20 En la presente invención, el kit para el diagnóstico de la adquisición de cáncer de hígado incluye, además de los cebadores que pueden amplificar cada uno de los genes mostrados anteriormente, uno o más de los componentes que son necesarios para realizar la presente invención. Por ejemplo, El kit de la presente invención puede incluir un componente para preservar o suplir una enzima y un componente de reacción necesario para realizar la PCR. Los ejemplos de dichos componentes incluyen, pero no se limitan a los mismos, oligonucleótidos de la presente

invención, tampón de la enzima, dNTP, reactivos control (tales como oligonucleótidos diana para muestras de tejido y controles positivos y negativos), reactivos para marcaje o detección, un soporte en fase sólida, y un manual.

Método para seleccionar al agente terapéutico candidato:

5 El método para seleccionar un agente terapéutico candidato incluye las etapas de cultivar células de mamífero en presencia y ausencia de un compuesto de ensayo, midiendo una frecuencia de metilación del gen humano SALL3c, el gen humano ECEL1, el gen humano FOXC1, el gen humano NGR3, el gen humano KCNIP2, SEC ID Nº: 6 (NT_037622.5, 1393863 a 1395863), o SEC ID Nº: 7 (NT_022135.15, 7774305 a 7776805) en cada célula, y

10 seleccionar un compuesto de ensayo que tenga un efecto supresor de la metilación como un agente terapéutico candidato para el cáncer de hígado. La presente invención se basa en el hallazgo de que dado que la metilación de los genes y las regiones génicas se asocia con cáncer de hígado, se identifica a un compuesto que suprime o inhibe la metilación como un agente terapéutico candidato para el cáncer de hígado. En el presente documento, se usan células de mamífero dado que la metilación no se produce en células de levaduras ni en Escherichia coli, o dado que

15 el significado fisiológico de la metilación difiere del de la presente invención incluso si se produce.

La presente invención se describirá más específicamente con referencia a los siguientes ejemplos, pero no se limita a los mismos.

20 Ejemplo 1:

Tasa de detección en cada estadio del cáncer de hígado de cada gen marcador:

La tabla 5 muestra los resultados de un ensayo de cada gen marcador para las características que pueden detectar

25 cáncer en estadio temprano en pacientes que tengan cáncer de hígado que se clasifica en cáncer bien diferenciado (estadio temprano) y cáncer poco o moderadamente diferenciado (avanzado). Todos los pacientes tienen una operación programada para resecar el cáncer de hígado independientemente de su sexo. Además, la clasificación de la buena diferenciación o de la diferenciación moderada o pobre estaba de acuerdo con los hallazgos de los médicos a cargo de la operación del cáncer de hígado. A fin de evaluar las tasas de detección del cáncer de hígado

30 de acuerdo con la presente invención, se investigaron de modo similar las tasas de detección de AFP y PIVKA-2, que son marcadores de cáncer que se usan convencionalmente.

Tal como se muestra en la tabla 5, a través del marcador AFP, que se usa convencionalmente, se mostraron bajas tasas de detección en todos los estadios de cáncer de hígado, el marcador PIVKA-2 mostró una tasa de detección 35 alta, del 70 % en cáncer bien diferenciado y una tasa detección menor que el anterior, 44 % en cáncer moderadamente y poco diferenciado. Los SALL3C, ECEL1, y NT_037622.5 (1393863 a 1395863) metilados de la presente invención mostraron tasas de detección altas del 80 %, 70 %, y 80 %, respectivamente. En cáncer bien diferenciado, que son más altos que la tasa de detección del marcador PIVKA-2 y muestran su eficacia. Aquí, la tasa de detección calculada es una proporción del número de pacientes que reaccionaron para un gen marcador (un

40 grupo en el que se detecta el gen marcador) respecto al número de pacientes que tienen cáncer bien diferenciado o cáncer poco o moderadamente diferenciado. Además, también es posible detectar cáncer moderadamente o poco diferenciado en consideración a la investigación clínica que muestra que "uno cualquiera de los marcadores es positivo antes de la operación y cambia a negativo después de la operación" y que los individuos sanos muestran negativos en cualquiera de los genes del ejemplo 3.

45 [Tabla 5]

SEC ID Nº:, Nº de referencia, Nombre del gen (posición de la región génica): Cáncer bien diferenciado Cáncer poco o moderadamente diferenciado

SEC ID Nº: 1 SALL3C: 8 sujetos (80 %) 24 sujetos (53 %)

SEC ID Nº: 2, NM_004826 ECEL1: 7 sujetos (70 %) 17 sujetos (38 %)

SEC ID Nº: 3, NM_001453 FOXC1: 5 sujetos (50 %) 10 sujetos (22 %)

SEC ID Nº: 4, NM_001010848 NRG3: 4 sujetos (40 %) 8 sujetos (18 %)

SEC ID Nº: 5, NM_014591 KCNIP2: 2 sujetos (20 %) 5 sujetos (11 %)

SEC ID Nº: 6, NT_037622.5 1393863 a1395863: 8 sujetos (80 %) 28 sujetos (62 %)

SEC ID Nº: 7, NT_022135.15 7774305 a 7776805: 4 sujetos (40 %) 2 sujetos (4 %)

AFP: 2 sujetos (20 %) 11 sujetos (24 %)

PIVKA II: 7 sujetos (70 %) 20 sujetos (44 %)

Ejemplo 2

Tasa de detección en invasión vascular del cáncer de hígado de cada gen marcador

La invasión vascular del cáncer de hígado significa que las células cancerosas invaden la circunferencia de la vena

5 porta, la vena hepática, la arteria hepática, y el conducto biliar o entra en estos sistemas vasculares, e incluye la invasión vascular macroscópica que se puede diagnosticar por inspección por imagen visual de un espécimen resecado y la invasión vascular microscópica que puede diagnosticarse primero al microscopio. La invasión microscópica vascular se conoce como uno de los factores pronósticos más poderosos frente la recurrencia después del tratamiento, pero es difícil de diagnosticar antes de la operación por la tecnología actual si la invasión vascular

10 microscópica está presente o no. Los resultados que se muestran en la tabla 6 muestran que el marcador AFP y el marcador PIVKA-2, que se usan convencionalmente, no pueden determinar la presencia o ausencia de invasión vascular en cáncer de hígado. Por otro lado, los ECEL1 y NT_037622.5 (1393863 a 1395863) metilados de la presente invención exhibían tasas de detección del 55 % y del 85 %, respectivamente, frente a cáncer de hígado que tiene invasión vascular y, al mismo tiempo, exhibían tasas detección del 37 % y del 54 %, respectivamente, frente al

15 cáncer de hígado que no tiene invasión vascular. Esto significa que el uso de estos dos genes marcadores hace posible anticipar si el cáncer de hígado tiene o no invasión vascular. Aquí, la tasa de detección calculada es una proporción del número de pacientes que reaccionaron para el gen marcador (un grupo en el que se detecta el gen marcador) respecto al número de pacientes de cáncer que tienen cáncer invasión vascular o no tienen invasión vascular. Por otro lado, dado que las tasas de detección del SALL3c metilado fueron del 45 % en cáncer de hígado

20 que tenía invasión vascular y del 66 % en cáncer que no tenía invasión vascular, se puede detectar el cáncer de hígado que no tiene invasión vascular.

[Tabla 6]

SEC ID Nº:, Nº de referencia, Nombre del gen (posición de la región génica): Con invasión vascular Sin invasión vascular

SEC ID Nº: 1 SALL3C: 9 sujetos (45 %) 23 sujetos (66 %)

SEC ID Nº: 2, NM_004826 ECEL1: 11 sujetos (55 %) 13 sujetos (37 %)

SEC ID Nº: 3, NM_001453 FOXC1: 7 sujetos (35 %) 8 sujetos (23 %)

SEC ID Nº: 4, NM_001010848 NRG3: 4 sujetos (20 %) 8 sujetos (23 %)

SEC ID Nº: 5, NM_014591 KCNIP2: 2 sujetos (10 %) 5 sujetos (14 %)

SEC ID Nº: 6, NT_037622.5 1393863 a 1395863: 17 sujetos (85 %) 19 sujetos (54 %)

SEC ID Nº: 7, NT_022135.15 7774305 a 7776805: 4 sujetos (20 %) 8 sujetos (23 %)

AFP: 6 sujetos (30 %) 7 sujetos (20 %)

PIVKA II: 8 sujetos (40 %) 19 sujetos (54 %)

25 Ejemplo 3

Reacción de cada gen marcador antes y después de la operación de resección de cáncer de hígado

En la presente invención, en particular, los SALL3C, ECEL1, y NT_037622.5 (1393863 a 1395863) metilados, que

30 exhiben tasas de detección de cáncer de hígado altas, se inspeccionaron antes y después de la operación de resección por si el gen marcador se detectaba o no. Además, se evaluaron las muestras de pacientes (especímenes) para el plasma y las células sanguíneas. Los resultados se muestran por (-/-) lo que significa que el marcador no se detectó antes ni después de la operación, (+/+) que significa que el marcador se detectaba antes y después de la operación, (+/-) lo que significa que el marcador se detectaba antes de la operación pero no se

35 detectaba después de la operación, y (-/+) lo que significa que el marcador no se detectaba antes de la operación pero se detectaba después de la operación. En la hipótesis de trabajo, se asume que un marcador de la enfermedad que se detecta antes de la operación y no se detecta después de la operación, (+/-), es efectivo. Por otro lado, se asume que la tasa de detección de un marcador que muestra (-/+) es baja, y se asume que un marcador que muestra (+/+), que se detecta antes y después de la operación a pesar de la enucleación del cáncer de hígado, tiene

40 la tasa de detección baja. Sin embargo, dado que esos marcadores de la enfermedad no son efectivos dependiendo de, por ejemplo, la constitución de un paciente en algunos casos, se asume que se puede obtener una tasa alta de detección en comparación con (-/+) y (+/+).

Después, se calcularon las tasas de detección y las tasas de no detección de cada gen marcador antes y después

45 de la operación a partir de los resultados de los ensayos presentes (tabla 7). En la tabla 7, (-) significa que no se detectó un gen metilado (negativo), y (+) significa que se detectó un gen metilado (positivo). Los resultados muestran que los SALL3C, ECEL1, y NT_037622.5 (1393863 a 1395863) metilados extraídos de las células sanguíneas

exhibían tasas de detección altas del 56 %, 42 %, y 64 %, respectivamente, como en aquellos que se detectan antes de la operación y no se detectan después de la operación (+/-). Por otro lado, estos genes marcadores exhibieron tasas de detección bajas, del 20 %, 36 %, y 18 %, respectivamente, así como aquellos que también que se detectan después de la operación (+/+), respondiendo a la operación de enucleación del cáncer. Además, todos esos genes 5 marcadores exhibieron tasas de detección bajas, del 2 % como aquellos que no se detectaban antes de la operación y se detectaban después de la operación, pero estos genes marcadores como aquellos que no se detectaban ni antes ni después de la operación (-/-), exhibieron tasas de detección bajas, del 22 %, 20 %, y 16 %, respectivamente. Esto muestra que en los pacientes de cáncer de hígado, las tasas de detección genes marcadores SALL3C, ECEL1, y NT_037622.5 (1393863 a 1395863) metilados antes y después de la operación son lógicas en 10 grupos de pacientes en los que se detectan esos genes marcadores, y que la fiabilidad de estos es alta, aunque es un grupo, con una cierta probabilidad, de que los genes marcadores no se detecten debido a, por ejemplo, la constitución genética. Además, la media (media de tres genes marcadores) del grupo de pacientes en el que no se detectan los genes marcadores es del 19 %, pero la media del grupo de pacientes en el que se detectan los genes marcadores es alta, del 54 %, mostrando que los genes marcadores son altamente efectivos. Además, El ADN

15 extraído de las células sanguíneas exhibía mayor especificidad y sensibilidad como muestra de ensayo de un paciente.

En cada ejemplo, los sueros y células sanguíneas de cinco individuos sanos (mujer de 34 años, mujer de 34 años, hombre de 50 años, hombre de 63 años y mujer de 64 años) de los que se sabía que eran Ag-HB (antígeno de la

20 hepatitis B) negativos y Ac-VHC (anticuerpo de la hepatitis C) negativos se sometieron de forma similar a PCR y de ese modo se confirmó que la metilación de siete genes y regiones génicas de acuerdo con la presente invención era negativa.

[Tabla 7]

Gen marcador,: Muestra -/ +/ +/+ -/+

SALL3C: plasma 50 sujetos (91 %) 4 sujetos (7 %) 0 sujetos (0 %) 1 sujeto (2 %)

SEC ID Nº:1: célula 12 sujetos (22 %) 31 sujetos (56 %) 11 sujetos (20 %) 1 sujeto (2 %)

sanguínea

ECEL1: plasma 46 sujetos (84 %) 9 sujetos (16 %) 0 sujetos (0 %) 0 sujetos (0 %)

SEC ID Nº: 2: célula 11 sujetos (20 %) 23 sujetos (42 %) 20 sujetos (36 %) 1 sujeto (2 %)

sanguínea

NT_037622.5: plasma 50 sujetos (91 %) 3 sujetos (5 %) 0 sujetos (0 %) 2 sujetos (4 %)

1393863 a: célula 9 sujetos (16 %) 35 sujetos (64 %) 10 sujetos (18 %) 1 sujeto (2 %)

1395863: sanguínea

SEC ID Nº: 6

25 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> The university of Tokyo Japanese Foundation For Cancer Research

30 <120> Gen asociado con cáncer de hígado, y método para la determinación del riesgo de adquirir cáncer de hígado

<130> 128078001 35 <140> PCT/JP20008/003082

<141>

<150> JP20070281552

<151> 40

<160> 35

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1 45 <211> 3713

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1 50

<210> 2

<211> 2872

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 3452

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 2091

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 2608

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 2100

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 2501

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7

5: <210> 8 <211> 24 <212> ADN <213>Secuencia artificial

10: <220> <223> cebador diseñado basado en un gen humano <400> 8 gttcgggttg gtcgtttatc gttc 24

15: <210> 9 <211> 22 <212> ADN <213>Secuencia artificial

20: <220> <223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 9 cccacacact cgacccctaa cg: 22

25: <210> 10 <211> 21 <212> ADN <213>Secuencia artificial

30: <220> <223> cebador diseñado basado en un gen humano

35: <400> 10 agacgtattg gggcgagggg c <210> 11 <211> 21 <212> ADN 21

<213> Secuencia artificial

5: <220> <223> cebador diseñado basado en un gen humano <400> 11 ctccccgcga tcacacgcac g 21

<210> 12 <211> 25 <212> ADN <213>Secuencia artificial

15: <220> <223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 12 tttcgcggag acgttaattt agttc: 25

<210> 13 <211> 24 <212> ADN <213>Secuencia artificial

25: <220> <223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 13 aaacgcaaaa cgtatacaac gccg: 24

35: <210> 14 <211> 24 <212> ADN <213>Secuencia artificial <220> <223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 14 gagggttggg aaattgcggt tttc: 24

45: <210> 15 <211> 21 <212> ADN <213>Secuencia artificial

<220> <223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 15 ctcctcgcgc tacgtcatcc g 21

55: <210> 16 <211> 22 <212> ADN <213>Secuencia artificial

<220> <223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 16 gcgggtcggt attagttcgg tc: 22

65: <210> 17 <211> 25 <212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<223> cebador diseñado basado en un gen humano 5

<400> 17 ctacgacgta taaaacccgt aaacg 25

<210> 18

<211> 24

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220> 15 <223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 18 ggggttatgt aggcgcgtta tttc 24

<210> 19

<211> 25

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

25 <220>

<223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 19 tacgaataca cgctcataaa aaccg 25

<210> 20

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 35

<220>

<223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 20 gggattcggc gcgtaggagg c 21

<210> 21

<211> 24

<212> ADN 45 <213>Secuencia artificial

<220>

<223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 21 caacgtaact cccgaaaaaa ctcg 24

<210> 22

<211> 24 55 <212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 22 gtcgtttttt gatcgatcgg aggc 24

<210> 23 65 <211> 25

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<223> cebador diseñado basado en un gen humano 5

<400> 23 aaaccgcgac aaaaacataa aaccg 25

<210> 24

<211> 26

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220> 15 <223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 24 ttcgtttttc ggttttattc gatgtc 26

<210> 25

<211> 26

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

25 <220>

<223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 25 actaaacgaa tctaaattaa tccccg 26

<210> 26

<211> 26

<212> ADN

<213>Secuencia artificial 35

<220>

<223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 26 gatggttatt ttcgaggttt attagc 26

<210> 27

<211> 25

<212> ADN 45 <213>Secuencia artificial

<220>

<223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 27 cctccctttc taaaacgaaa atacg 25

<210> 28

<211> 29 55 <212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 28 agtataatat atcgcgttta taaattatc 29

<210> 29 65 <211> 23

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

5: <220> <223> cebador diseñado basado en un gen humano <400> 29 aacgacgcga cttatcgaac acg 23

<210> 30 <211> 27 <212> ADN <213>Secuencia artificial

15: <220> <223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 30 gcgtttttta tttaatgtaa atggagc: 27

<210> 31 <211> 24 <212> ADN <213>Secuencia artificial

25: <220> <223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 31 taatcgcgac atcaaccatc gacg: 24

35: <210> 32 <211> 25 <212> ADN <213>Secuencia artificial <220> <223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 32 gagagtacgt tagttttgga gattc: 25

45: <210> 33 <211> 24 <212> ADN <213>Secuencia artificial

<220> <223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 33 cacgtacttt ccctccttaa ctcg: 24

55: <210> 34 <211> 26 <212> ADN <213>Secuencia artificial

<220> <223> cebador diseñado basado en un gen humano

<400> 34 ttagtattgc gaatagcgtt agtatc: 26

65: <210> 35 <211> 29 <212> ADN

<213>Secuencia artificial

5: <220> <223> cebador diseñado basado en un gen humano <400> 35 aataaatact aacttaatcg aaataaacg 29

10

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar cáncer de hígado detectando en una muestra la presencia de metilación de uno cualquiera o más de los genes o de las regiones génicas del grupo que consiste en el gen humano SALL3c, gen 5 humano ECEL1, gen humano FOXC1, gen humano NRG3 y gen humano KCNIP2, una región génica representada por SEC ID Nº: 6 (NT_037622.5, 1393861 a 1395960) y una región génica representada por SEC ID Nº: 7 (NT_022135.15, 7774305 a 7776805) que es detectable usando un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 9 para el gen humano SALL3c, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:12 y SEC ID Nº:13 para el gen humano ECEL1, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:16 y SEC ID Nº:17 para el gen humano FOXC1, un

10 conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 20 y SEC ID Nº: 21 para el gen humano NRG3, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 24 y SEC ID Nº: 25 para el gen humano KCNIP2, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 28 y SEC ID Nº: 29 para la región génica representada por SEC ID Nº: 6, y un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 32 y SEC ID Nº: 33 para la región génica representada por SEC ID Nº: 7, donde la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre y tejido hepático de un sujeto.
2. El método de acuerdo a la reivindicación 1, donde la metilación se detecta o identifica mediante un conjunto de cebadores seleccionados del grupo que consiste en: un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 9, y/o un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:10 y SEC ID Nº:11 para el gen humano SALL3c; un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:12 y SEC ID Nº:13, y/o un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:14 y SEC ID Nº:15 para el gen 20 humano ECEL1; un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:16 y SEC ID Nº:17, y/o un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:18 y SEC ID Nº:19 para el gen humano FOXC1; un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 20 y SEC ID Nº: 21, y/o un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 22 y SEC ID Nº: 23 para el gen humano NRG3, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 24 y SEC ID Nº: 25, y/o un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 26 y SEC ID Nº: 27 para el gen humano KCNIP2, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 28 y SEC ID Nº: 29, y/o un conjunto de cebadores

25 de SEC ID Nº: 30 y SEC ID Nº: 31 para la región génica representada por SEC ID Nº: 6; un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 32 y SEC ID Nº: 33, y/o un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 34 y SEC ID Nº: 35 para la región génica representada por SEC ID Nº: 7.
3. Uso de un polinucleótido para el diagnóstico in vitro del cáncer de hígado, caracterizado por que el polinucleótido

30 puede detectar la metilación de al menos uno de los genes o de las regiones génicas seleccionados del grupo que consiste en:

(1) gen humano SALL3c,

(2) gen humano ECEL1, 35 (3) gen humano FOXC1,

(4)

gen humano NGR3,

(5)

gen humano KCNIP2,

(6)

SEC ID Nº: 6 (NT_037622.5, 1393861 a 1395960) y

(7)

SEC ID Nº: 7 (NT_022135.15, 7774305 a 7776805

40 que es detectable usando un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 9 para el gen humano SALL3c, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:12 y SEC ID Nº: 13 para el gen humano ECEL1, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:16 y SEC ID Nº:17 para el gen humano FOXC1, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 20 y SEC ID Nº: 21 para el gen humano NRG3, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 24 y SEC ID Nº: 25 para el gen humano

45 KCNIP2, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 28 y SEC ID Nº: 29 y SEC ID Nº: 6, y un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 32 y SEC ID Nº: 33 para SEC ID Nº: 7.
4. Uso de un kit para el diagnóstico in vitro de cáncer de hígado, caracterizado por que el kit comprende uno o más

polinucleótidos que pueden detectar la metilación de al menos uno de los genes o de lasregiones génicas 50 seleccionadas del grupo que consiste en:

(1)

gen humano SALL3c,

(2)

gen humano ECEL1,

(3) gen humano FOXC1, 55 (4) gen humano NGR3,

(5)

gen humano KCNIP2,

(6)

SEC ID Nº: 6 (NT_037622.5, 1393861 a 1395960) y

(7)

SEC ID Nº: 7 (NT_022135.15, 7774305 a 7776805

60 que es detectable usando un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 9 para el gen humano SALL3c, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:12 y SEC ID Nº:13 para el gen humano ECEL1, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:16 y SEC ID Nº: 17 para el gen FOXC1 humano, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 20 y SEC ID Nº: 21 para el gen humano NRG3, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 24 y SEC ID Nº: 25 para el gen humano KCNIP2, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 28 y SEC ID Nº: 29 para SEC ID Nº: 6, y un conjunto de

65 cebadores de SEC ID Nº: 32 y SEC ID Nº: 33 para SEC ID Nº: 7.
5. Uso de una micromatriz para el diagnóstico in vitro del cáncer de hígado, caracterizado por que la micromatriz comprende uno o más polinucleótidos que pueden detectar la metilación de al menos uno de los genes o regiones génicas seleccionadas del grupo que consiste en:

5 (1) gen humano SALL3c,

(2)

gen humano ECEL1,

(3)

gen humano FOXC1,

(4)

gen humano NGR3,

(5)

gen humano KCNIP2,

(6)

SEC ID Nº: 6 (NT_037622.5, 1393861 a 1395960) y

(7)

SEC ID Nº: 7 (NT_022135.15, 7774305 a 7776805

que es detectable usando un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 9 para el gen humano SALL3c, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:12 y SEC ID Nº:13 para el gen humano ECEL1, un conjunto de cebadores

15 de SEC ID Nº: 16 y SEC ID Nº:17 para el gen humano FOXC1, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 20 y SEC ID Nº: 21 para el gen humano NRG3, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 24 y SEC ID Nº: 25 para el gen humano KCNIP2, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:28 y SEC ID Nº: 29 para SEC ID Nº: 6, y un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 32 y SEC ID Nº: 33 para SEC ID Nº: 7.
6. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 3-5, donde el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en: un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 9, y/o un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:10 y SEC ID Nº:11 para el gen humano SALL3c; un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:12 y SEC ID Nº:13, y/o un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:14 y SEC ID Nº:15 para el gen humano ECEL1; un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:16 y SEC ID Nº:17, y/o un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:18 y SEC ID Nº:19 para el

25 gen humano FOXC1; un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 20 y SEC ID Nº: 21, y/o un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 22 y SEC ID Nº: 23 para el gen humano NRG3, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 24 y SEC ID Nº: 25, y/o un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 26 y SEC ID Nº: 27 para el gen humano KCNIP2, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 28 y SEC ID Nº: 29, y/o un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 30 y SEC ID Nº: 31 para la región génica representada por SEC ID Nº: 6; un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 32 y SEC ID Nº: 33, y/o un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 34 y SEC ID Nº: 35 para la región génica representada por SEC ID Nº:
7.
7. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-6, donde el gen o la región génica se seleccionan

del grupo que consiste en: 35

(1)

gen humano SALL3c,

(2)

gen humano ECEL1, y

(3)

SEC ID Nº: 6 (NT_037622.5, 1393861 a 1395960).
8. Uso de un polinucleótido de acuerdo con las reivindicaciones 4 o 5 para fabricar un kit de detección o una micromatriz para detectar cáncer de hígado.
9. Un conjunto de cebadores seleccionado del grupo que consiste en: un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 9 para el gen humano SALL3c, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:10 y SEC ID Nº:11 para el gen 45 humano SALL3c, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:12 y SEC ID Nº: 13 para el gen humano ECEL1, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:14 y SEC ID Nº: 15 para el gen humano ECEL1, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:16 y SEC ID Nº:17 para el gen humano FOXC1, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:18 y SEC ID Nº: 19 para el gen humano FOXC1, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 20 y SEC ID Nº: 21 para el gen humano NRG3, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 22 y SEC ID Nº: 23 para el gen humano NRG3, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 24 y SEC ID Nº: 25 para el gen humano KCNIP2, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 26 y SEC ID Nº: 27 para el gen humano KCNIP2, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 28 y SEC ID Nº: 29 para la región génica representada por SEC ID Nº: 6, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 30 y SEC ID Nº: 31 para la región génica representada por SEC ID Nº: 6, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 32 y SEC ID Nº: 33 para la región génica representada por SEC ID Nº: 7, y un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 34 y SEC ID Nº: 35 para la

55 región génica representada por SEC ID Nº: 7.
10. Un método para detectar un riesgo de recurrencia después de la operación de cáncer de hígado detectando en una muestra la presencia de metilación de uno cualquiera o más de los genes o de las regiones génicas del grupo que consiste en el gen humano SALL3c y el gen humano ECEL1, y una región génica representada por SEC ID Nº: 6 (NT_037622.5, 1393861 a 1395960) que es detectable usando un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 9 para el gen humano SALL3c, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 12 y SEC ID Nº:13 para el gen humano ECEL1, y un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 28 y SEC ID Nº: 29, donde la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre y tejido hepático de un sujeto.

65 11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, donde la metilación se detecta o identifica de un conjunto de cebadores seleccionados del grupo que consiste en: un conjunto de cebadores de SEC ID Nº 8 y SEC ID Nº: 9, y/o

un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:10 y SEC ID Nº:11 para el gen humano SALL3c; un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:12 y SEC ID Nº:13, y/o un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 14 y SEC ID Nº 15 para el gen humano ECEL1; y un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 28 y SEC ID Nº: 29, y/o un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 30 y SEC ID Nº: 31 para la región génica representada por SEC ID Nº: 6.
12. Uso de un polinucleótido para el diagnóstico in vitro del riesgo de recurrencia después de la operación de cáncer de hígado, caracterizado por que el polinucleótido puede detectar la metilación de al menos uno de los genes o de las regiones génicas seleccionados del grupo que consiste el gen humano SALL3c, el gen ECEL1 humano, y/o la metilación de las regiones génicas SEC ID Nº: 6 (NT_037622.5,1393861 a 1395960), que es detectable usando un

10 conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 9 para el gen humano SALL3c, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:12 y SEC ID Nº:13 para el gen humano ECEL1, y un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 28 y SEC ID Nº: 29 para la región génica representada por SEC ID Nº: 6.
13. Uso de un kit para el diagnóstico in vitro del riesgo de recurrencia después de la operación de cáncer de hígado,

15 caracterizado por que el kit comprende uno o más polinucleótidos que pueden detectar la metilación de al menos uno de los genes o de las regiones génicas seleccionados del grupo que consisten en el gen humano SALL3c, el gen ECEL1 humano, y/o la metilación de las regiones génicas SEC ID Nº: 6 (NT_037622.5, 1393861 a 1395960), que es detectable usando un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 9 para el gen humano SALL3c, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:12 y SEC ID Nº:13 para el gen humano ECEL1, y un conjunto de cebadores

20 de SEC ID Nº: 28 y SEC ID Nº: 29 para la región génica representada por SEC ID Nº: 6.
14. Uso de una micromatriz para el diagnóstico in vitro del riesgo de recurrencia después de la operación de cáncer de hígado, caracterizado porque la micromatriz comprende uno o más polinucleótidos que pueden detectar la metilación de al menos uno de los genes o de las regiones génicas seleccionados del grupo que consisten en el gen

25 humano SALL3c, el gen ECEL1 humano, y/o la metilación de las regiones génicas SEC ID Nº: 6 (NT_037622.5, 1393861 a 1395960), que es detectable usando un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 9 para el gen humano SALL3c, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:12 y SEC ID Nº:13 para el gen humano ECEL1, y un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 28 y SEC ID Nº: 29 para la región génica representada por SEC ID Nº: 6.

30 15. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en: un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 9, y/o un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:10 y SEC ID Nº: 11 para el gen humano SALL3c, un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:12 y SEC ID Nº:13, y/o un conjunto de cebadores de SEC ID Nº:14 y SEC ID Nº:15 para el gen humano ECEL1; y un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 28 y SEC ID Nº: 29, y/o un conjunto de cebadores de SEC ID Nº: 30 y SEC ID Nº: 31 para

35 la región génica representada por SEC ID Nº: 6.
16. Uso de un polinucleótido acuerdo a las reivindicaciones 13 o 14 para fabricar un kit de detección o una micromatriz para detectar el riesgo de recurrencia después de la operación de cáncer de hígado.