CN109072310A - 在尿液中检测癌症 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了确定个体是否具有癌前病变或癌症的体外方法，其包括确定甲基化标志物组的一种或多种甲基化标志物在所述个体的尿液样品中的存在或不存在；以及基于尿液样品中所述一种或多种甲基化标志物的存在或不存在的检测来确定所述个体是否具有癌前病变或癌症，其中所述一种或多种甲基化标志物的存在指示所述个体具有癌前病变或癌症。本发明还提供了基于甲基化标志物组的一种或多种甲基化标志物在尿液样品中的存在或不存在对癌前病变或癌症进行分型的方法。

Description

在尿液中检测癌症
本发明涉及尿液样品分析领域。具体来说，本发明涉及鉴定个体尿液中的癌性核酸，特别是甲基化核酸。
癌症几乎总是由专家在显微镜下观察细胞或组织样品来诊断。在一些情况下，对细胞的蛋白质、DNA和RNA进行的测试可以帮助告诉医生是否存在癌症。这些测试结果在选择最佳治疗选项时是重要的。
这些测试通常在个体有疾患自己挂号时进行。在这些情况下，如果是癌症，则很可能癌症已经进展到简单手术不能治愈或转移可能性显著的程度，导致需要使用化学疗法和/或放射进行侵入性治疗以及总体预后不良。
另一方面，当疾患不是由癌症引起时，患者在等待活组织检查结果的相当长时间内处于不确定状态。
因此，需要一种简单、快速且非侵入性的方法来确定个体是否具有癌症，并且如果是癌症，则确定它是什么类型的癌症。
本发明提供了用于尿液样品中癌症和癌前病变的检测和分型的工具和方法。所述工具和方法检测尿液中的核酸，特别是DNA，并通过分析所检测核酸的甲基化状态来进行癌症或癌前病变的检测和分型。
本领域中已知某些类型的癌症和癌前病变与某些基因的甲基化相关。DNA的甲基化是一种自然过程，并且通常当细胞在体内分化为特化细胞时发生。DNA甲基化是将甲基基团添加到DNA中的过程。甲基化已被证明可以改变某些DNA的行为和功能。当位于基因启动子中时，DNA甲基化通常起到抑制基因转录的作用。DNA甲基化对于正常发育至关重要，并且与许多关键过程(包括基因组印记、X染色体失活、重复元件抑制和衰老)相关。在疾病中，它与癌症相关。
在真核生物中，甲基化限于DNA的四种核苷酸之一。胞嘧啶DNA甲基化的发生率在各物种之间是不同的。DNA甲基化通常发生在CpG二核苷酸情形中。已经检测到其它形式的甲基化，主要是在胚胎干细胞或神经发育中。
在哺乳动物中，所有CpG的60％至90％被甲基化。随着时间的推移，甲基化的C残基自发地脱氨基形成T残基，这被认为是人类基因组中CpG二核苷酸相对表现不足(under-representation)的原因。
未甲基化的CpG通常聚集成被称为CpG岛的簇，其存在于许多基因的5'调节区中。在癌症和癌前病变中，基因启动子CpG岛获得异常的高甲基化，这导致转录沉默，其可以在细胞分裂后由子细胞遗传。DNA甲基化的改变已被认为是癌症发展的重要组成部分。低甲基化通常较早出现并且与染色体不稳定性和印迹丧失有关，而高甲基化与启动子相关。
肾小球滤过屏障使得具有低分子量(<5500Da)和小有效分子半径的物质(例如水、尿素和葡萄糖)以与血浆中相同的浓度出现在滤液中。越来越大的大分子越来越被限制通过，因此肾小球滤液中通常只存在痕量的血浆白蛋白(69kDa)。其它因素如半径和电荷也会影响物质在滤液中的出现。测量结果表明，肾小球滤过限制了阴离子的通过，但增强了阳离子的通过。该结论是部分基于以下观察结果：较长和/或带更多负电荷的糖链(葡聚糖)似乎以较低效率通过。
肾小管的功能是回收在肾小球处滤过的大部分流体和溶质。如果流体没有被回收，则肾脏将在不到半小时内排出整个血浆体积。在小管中，NaCl、NaHCO3、滤过的营养物(例如葡萄糖和氨基酸)、二价离子(例如Ca2+、HPO4 2-和SO4 2-)和水被重吸收。最后，近端小管将NH4+以及各种内源性和外源性溶质分泌到管腔中，制成含废物的浓缩物，以组成最终的尿液(Boulpaep等,Medical Physiology,2012,Philadelphia:Saunders)。
在尿液的不同组分中，发现也存在一些DNA。尿液中的大多数DNA存在于细胞中。根据专用于尿液的DNA分离试剂盒制造商(Zymoresearch)，可回收DNA的总量为约5-25μg/L尿液。
发明内容
本发明提供了一种确定检测个体是否具有癌前病变或癌症的体外方法，其包括
-确定甲基化标志物组的一种或多种甲基化标志物在所述个体的尿液样品中的存在或不存在；和
-基于所述尿液样品中所述一种或多种甲基化标志物的存在的检测来确定所述个体是否具有癌前病变或癌症，其中所述一种或多种甲基化标志物的存在或不存在指示所述个体具有癌前病变或癌症并且所述甲基化标志物的不存在指示所述个体不具有癌前病变或癌症。
本发明还提供了一种确定具有癌症的个体中癌前病变或癌症的类型的体外方法，其包括
-确定甲基化标志物组的一种或多种甲基化标志物在所述个体的尿液样品中的存在或不存在；和
-基于所述尿液样品中所述一种或多种甲基化标志物的存在或不存在的检测来确定癌前病变或癌症的类型，其中所述一种或多种甲基化标志物的存在或不存在指示所述个体的癌前病变或癌症的一种或多种类型。
本发明还提供了一种试剂盒，其包括用于检测甲基化标志物组中的一种或多种甲基化标志物的工具，其中所述甲基化标志物组包含选自表9中鉴定的甲基化标志物的至少一种甲基化标志物，并且其中所述甲基化标志物组还包含用于从尿液中提取核酸的核酸提取缓冲剂。
还提供了一种核酸扩增装置，其包括用于扩增来自甲基化标志物组的一种或多种甲基化标志物的核酸的至少两种核酸扩增引物。
本发明还提供了根据本发明的试剂盒或根据本发明的装置的用途，其用于从具有癌症的个体的尿液样品确定所述个体的癌前病变或癌症的类型。
本发明还提供了根据本发明的试剂盒或根据本发明的装置的用途，其用于从个体的尿液样品检测所述个体中的癌前病变或癌症。
具体实施方式
本发明提供了在个体中确定个体是否具有癌前病变或癌症的体外方法。本发明还提供了确定具有癌前病变或癌症的个体中癌前病变或癌症的类型的体外方法。所述方法包括确定甲基化标志物组的一种或多种甲基化标志物在所述个体的尿液样品中的存在或不存在。癌前病变和癌症的类型可以从个体的尿液中一种或多种特定甲基化标志物的存在或不存在的检测来确定。某些或某个甲基化标志物的存在和/或不存在指示个体可能具有的癌前病变或癌症的类型。一种或多种甲基化标志物的存在或不存在指示个体具有癌前病变或癌症，并且所述甲基化标志物的不存在指示所述个体不具有癌前病变或癌症。
利用本发明可以检测各种癌前病变和癌症。虽然一些甲基化标志物在无论存在或不存在癌前病变或癌症的情况下总是被检测到，但一些甲基化标志物只有当个体具有癌前病变或癌症时才在尿液中检测到。一些癌症甲基化标志物在各种类型的癌前病变或癌症下被检测到，因此同样适用于确定个体是否具有癌前病变或癌症，并且(当与其它甲基化标志物组合时)也适用于癌症分型。
癌前病状或恶变前病状有时称为潜在癌前病状或潜在恶变前病状，是与癌症风险增加相关的细胞形态紊乱的状态。如果不加以治疗，则这些病状可能会导致癌症。这些病状通常是不典型增生(dysplasia)或良性肿瘤。有时术语“癌前病变”用于描述原位癌，这是一种尚未进展到侵袭性侵入阶段的非侵入性癌症。并非所有原位癌都会进展到侵入性疾病。
癌前(也称为恶变前)病变是在显微镜检查下看起来异常的在形态上非典型的组织，在所述组织中相比于看起来正常的对应物更有可能发生癌症。癌前病变的实例是光化性角化病；巴雷特食管(Barrett's esophagus)；萎缩性胃炎；先天性角化不良；缺铁性吞咽困难(sideropenic dysphagia)；扁平苔藓(lichen planus)；口腔粘膜下纤维化；日光弹性纤维变性(solar elastosis)；宫颈不典型增生(cervical dysplasia)；粘膜白斑病(leukoplakia)；结肠息肉病(polyposis coli)和红斑(erythroplakia)。在一个优选的实施方式中，所述癌前病变是结肠息肉病。可检测和/或分型的癌症包括并优选由以下组成：肺癌，优选非小细胞肺癌，宫颈癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，包括原位导管癌，头颈癌，尿路上皮细胞癌例如膀胱癌，血液系统恶性肿瘤例如但不限于骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和骨髓增生异常综合征，胃肠道(GI道)和辅助消化器官(包括但不限于食管、胃、胆道系统、胰腺、小肠、大肠和直肠)的癌症。在一个优选的实施方式中，待检测的癌症包括肺癌，优选非小细胞肺癌，乳腺癌，头颈癌，血液系统恶性肿瘤例如但不限于骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和骨髓增生异常综合征，胃肠道或辅助消化器官(包括但不限于食管、胃、胆道系统、胰腺、小肠、大肠、直肠、胆囊、肝脏和肛门)的癌症。本发明中的癌症表示原发性癌症和转移的癌症。
优选的是，癌前病变或癌症是其核酸必须通过肾脏到达尿液的癌前病变或癌症。即使在精心收集的尿液样品中，癌症诸如尿路上皮细胞癌如膀胱癌或其癌前前体阶段也可以将核酸直接脱落到尿液中而不必通过肾脏。癌前病变或癌症可通过检测至少一些与癌前状态已进展到癌症的个体的尿液相关的甲基化标志物来检测。在一个优选的实施方式中，所述癌症不是尿路上皮细胞癌、宫颈癌或前列腺癌，或其癌前阶段。在一个优选的实施方式中，所述癌症不是膀胱癌或其癌前阶段。
癌前病变或癌症的分型通常涉及确定癌症的起源组织。例如，已经转移到肺的膀胱癌通常被分型为膀胱癌。分型可以包括确定癌症是否可能已经转移，这是任选的。分型还可以导致确定个体具有几种类型的癌前病变或癌症中的一种或多种。
所述个体优选是哺乳动物，优选是人。
尿液是一种溶液，其中组分的浓度可根据饮食和消耗液体量而变化。在各种公知的尿液组分中，也存在核酸。发现尿液中的大部分DNA都与细胞相关。商业来源提到可以从尿液中回收的DNA量平均为约5-100μg/L。在本发明中，优选样品是无细胞尿液样品。DNA可以以聚合物状态穿过肾脏屏障，其中片段大(平均150bp)得足以用PCR扩增。尿液中的无细胞DNA平均为约2-100μg/L。并非所有尿液样品都含有足够的DNA用于分析。通常通过进行对照来鉴定这样的样品。合适的对照是PCR以确定标准DNA如肌动蛋白的存在。在DNA不足的情况下，收集个体的另一样品通常是足够的。可选地，DNA可以从较大体积的尿液中浓缩。还可以通过例如冷冻干燥来浓缩尿液。
在输血后的女性尿液中或在怀有男胎的妇女中显示男性基因片段。在注射有人类DNA的啮齿动物中，序列也可以在尿液中扩增。另一项研究能够每1mL样品捕获47-65pg/μL(无细胞)DNA(等于47-65μg/L)。此外，在源自尿液的游离DNA中已证实结肠直肠肿瘤相关突变(Su等,2008；Ann N Y Acad Sci.2008年8月；1137:197-206)。尿液的长期储存可以影响DNA的质量。因此，在本发明中通常使用新鲜的尿液样品，样品通常在取样的一天内使用，但是在适当处理尿液样品后更长的等待时间也是可能的(参见例如Hilhorst等,2013；BMCNephrol,2013.14:第238页)。其它DNA保存手段和方法也是可能的，例如由Zymo research商业提供的(尿液调节缓冲剂)，其在室温下保存DNA数天。
在CpG二核苷酸处异常甲基化的胞嘧啶是癌症中的普遍现象。(Jones,PA和Laird,PW,"癌症表观遗传学得到广泛认可(Cancer epigenetics comes of age)",Nat.Genet.21:163-167(1999))。由于CpG岛高甲基化，启动子中的染色质结构可改变，从而阻止与转录机制的正常相互作用。(Baylin,SB等,"DNA甲基化的改变：瘤形成的一个基本方面(Alterations in DΝA methylation:A fundamental aspect of neoplasia)",Advances in Cancer research(G.F.Nande Woude和G.Klein编),第72卷:141-196(1998),Academic Press,San Diego,CA)。当这种情况发生在与生长抑制相关的基因中时，所产生的转录沉默可以促进肿瘤进展。此外，已证实启动子CpG岛高甲基化是经典肿瘤抑制基因以及对细胞周期调节和DNA错配修复重要的基因的转录失活的常见机制。因此，胞嘧啶的甲基化在控制基因表达中起重要作用，并且甲基化模式或状况的改变可能引起疾病。在细胞的正常状态、癌前状态和癌症状态之间CpG二核苷酸处的甲基化差异在本文中被称为甲基化标志物。在尿液中检测到这种甲基化标志物可以指示该个体具有癌前病变或癌症。具有增加的CpG二核苷酸甲基化的染色体DNA也称为高甲基化DNA。高甲基化通常与细胞的癌性或癌前状态相关。可以以各种方式检测甲基化标志物。可通过使用能够确定患病细胞或组织与正常细胞或组织之间CpG位点内的差异性甲基化水平的甲基化测定法来进行检测。可用于此目的的甲基化特异性测定法包括例如甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐基因组测序方法、甲基化特异性引物延伸方法、以及本领域已知的其它方法，以及利用高通量或微阵列。适用于检测甲基化标志物的方法描述于Shanmuganathan等,(2013)Journal of MolecularDiagnostics,第15卷:第17-26页中。该参考文献和其中提及的论文，只要它们描述用于检测甲基化标志物的方法，就通过引用并入本文。适用于下一代亚硫酸氢盐扩增子测序的方法描述于Margolin等,(2016)第18卷:第283-298页，其也通过引用并入本文。WO2009104967中公开了一种合适的装置，该文献也通过引用并入本文。
本发明的甲基化标志物通常在不具有癌前病变或癌症的个体的尿液中未检测到。只有当个体具有癌前病变或癌症时才检测到本发明的甲基化标志物。不同的癌前病变或癌症可能与尿液中不同的甲基化标志物相关。在本发明中利用这种差异来进行癌前病变或癌症的分型。各种癌症类型或癌前病变类型可能与在呈现癌前病变或癌症的个体的尿液中相同甲基化标志物的存在相关。检测到这些标志物指示个体中存在与所检测标志物相关的癌前病变或癌症中的一种或多种。这些甲基化标志物有时也称为共有标志物。共有标志物特别适用于检测个体本身是否具有癌症或癌前病变。
在个体的尿液中检测到一种甲基化标志物指示在所述个体中存在癌症或癌前病变。在尿液中测试多于一种甲基化标志物通常允许更准确地确定个体是否具有癌前病变或癌症。在尿液中测试多于一种甲基化标志物通常允许更准确地对个体具有的癌前病变或癌症进行分型。在本发明的用于确定个体是否具有癌症的方法中通常使用许多不同类型的癌症或癌前病变所共有的标志物。许多癌前病变或癌症不共有的标志物以及优选肿瘤特异性标志物通常用于对个体具有的癌前病变或癌症进行分型。
本发明的方法可同时检测测试尿液的个体具有癌症或癌前病变并对所述癌症或癌前病变进行分型。
在本文中使用时，术语“多核苷酸引物/探针”是指通过一种或多种类型的化学键，通常通过互补碱基配对，通常通过氢键形成，能够结合于互补序列的靶核酸的核酸。在本文中使用时，探针可包括天然(即A、G、C或T)或修饰的碱基(7-脱氮鸟苷、肌苷等)或糖部分，此外，引物/探针中的碱基可通过除磷酸二酯键以外的键连接，只要它不干扰杂交即可。因此，例如，引物/探针可以是肽核酸，其中组成碱基通过肽键而不是磷酸二酯键连接。本领域技术人员应理解，探针可以结合与引物/探针序列不具有完全互补性的靶序列，这取决于杂交条件的严格度。引物/探针优选用同位素、发色团、发光体、色原体直接标记，或者例如用可稍后结合链亲和素复合物的生物素间接标记。通过测定引物/探针的存在或不存在，可以检测所选序列或子序列的存在或不存在。
在本文中使用时，术语“甲基化”是指甲基基团在基因调节区的CpG二核苷酸内的核苷酸碱基胞嘧啶的C5位上的共价连接。术语“高甲基化”是指对应于以下的甲基化状态：相对于与测试样品相同类型的正常个体或细胞样品的DNA序列内的相应CpG二核苷酸处存在的5-甲基-胞嘧啶(“5-mCyt”)的量，测试样品的DNA序列内的一个或多个CpG二核苷酸处的5-mCyt的存在增加。术语“甲基化状态”或“甲基化状况”或“甲基化水平”或“甲基化程度”是指DNA序列内的一个或多个CpG二核苷酸处的5-mCyt的存在或不存在。在本文中使用时，术语“甲基化状况”或“甲基化状态”或“甲基化水平”或“甲基化程度”可互换使用。
在本文中使用时，术语“CpG岛”是富含CpG二核苷酸且被定义为长度大于200bp的序列的短DNA序列，其GC含量大于0.5并且基于GC含量的观测值/预期值比率大于0.6。参见Gardiner-Garden和Frommer,"脊椎动物基因组中的CpG岛(CpG islands in vertebrategenomes)",J Mol Biol 196(2):261-282(1987)。CpG岛与所有管家基因和许多组织特异性基因的5'末端以及一些组织特异性基因的3'末端相关。一些基因含有5'和3'CpG岛两者，所述5'和3'CpG岛由数千碱基对的CpG贫化DNA隔开。5'CpG岛延伸通过5'侧接DNA、外显子和内含子，而大部分3'CpG岛似乎与外显子相关。CpG岛通常存在于相对于不同物种中的等同基因的转录单元的相同位置，但有一些值得注意的例外。据估计CpG岛占哺乳动物基因组的1％-2％，并且存在于所有管家基因的启动子中，以及40％的显示出组织特异性表达的基因中较不保守的位置中。CpG岛中CpG二核苷酸的持久性很大程度上归因于CpG岛普遍缺乏甲基化，而与表达状况无关。术语“CpG位点”是指CpG岛内的CpG二核苷酸。CpG岛的长度通常但不总是在约0.2至约1kb之间。
在本文中使用时，“检测”是指在尿液样品中鉴定包含甲基化标志物的靶核酸分子的存在或不存在。在本文中使用时，“检测”还指在测量或观察由直接或间接标记的探针核酸分子(能够与靶杂交)产生的信号的过程中检测靶核酸分子的存在。因此，检测到探针核酸直接指示存在并因此指示检测到靶核酸，例如编码标志物基因的序列。例如，如果可检测标记是荧光标记，则当通过适当波长激发时，通过观察或测量探针核酸上的荧光标记所发射的光来“检测”靶核酸，或者如果可检测标记是荧光/猝灭剂对，则通过观察或测量在探针核酸上存在的荧光/猝灭剂对的结合或解离后所发射的光来“检测”靶核酸，其中检测到探针核酸指示检测到靶核酸。如果可检测标记是放射性标记，则通过例如放射自显影术来“检测”与放射性标记的探针杂交后的靶核酸。用于“检测”荧光、放射性和其它化学标记的方法和技术可见于Ausubel等,(1995,精编分子生物学实验指南(Short Protocols inMolecular Biology),第3版,John Wiley and Sons,Inc.)。可选地，可以“间接检测”核酸，其中将一个部分连接到将与靶杂交的探针核酸，例如酶活性，从而允许在适当的底物或特异性抗原或其它允许通过添加抗体或其它特异性指示剂来检测的标志物的存在下进行检测。可选地，可以通过使用被具体设计成与靶核酸序列的一部分杂交的寡核苷酸引物扩增从患者临床样品制备的核酸样品来检测靶核酸分子。根据本发明，定量扩增方法，例如但不限于TaqMan，也可用于“检测”靶核酸。在本文中使用时，在所测量的核酸水平(例如通过定量PCR)或可检测标记提供的可检测信号水平都高于背景水平的情况下，“检测”到核酸分子。
在本文中使用时，“检测”还指检测靶核酸分子的特定CpG位点上的甲基化状态或状况，其指示个体的癌前病变或癌症状况和/或癌前病变或癌症的类型。靶核酸分子的特定CpG位点上的甲基化状态或状况可以为诊断、疾病监测和治疗方法提供有用的信息。本领域已知的各种方法可用于确定特定CpG二核苷酸的甲基化状况。这些方法包括但不限于甲基化CpG岛扩增，参见Toyota等,"通过甲基化CpG岛扩增来鉴定结直肠癌中的差异甲基化序列(Identification of differentially methylated sequences in colorectal cancerby methylated CpG island amplification)",Cancer Res.,59:2307-2312(1999)，也参见WO00/26401A1；差异甲基化杂交，参见Huang等,"人乳腺癌细胞中CpG岛的甲基化分析(Methylation profiling of CpG islands in human breast cancer cells)",Hum.Mol.Genet,8:459-470(1999)；甲基化特异性PCR(MSP)，参见Herman等,"甲基化特异性PCR：用于CpG岛甲基化状况的新型PCR测定法(Methylation-specific PCR:a novel PCRassay for methylation status of CpG islands)",PNAS USA 93:9821-9826(1992)，也参见美国专利No.5,786,146；甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)，参见美国专利No.6,251,594；联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)，参见Xiong和Laird,"COBRA：灵敏和定量的DNA甲基化测定法(COBRA:a sensitive and quantitative DNA methylationassay)",Nucleic acids Research,25(12):2532-2534(1997)；以及甲基化特异性引物延伸(MSPE)等。
当标志物CpG二核苷酸被甲基化时，检测到(存在)所述甲基化标志物。当包含标志物的标志物CpG二核苷酸未被甲基化时，未检测到(不存在)所述甲基化标志物。
本发明的方法包括确定甲基化标志物组的一种或多种甲基化标志物在尿液中的存在或不存在。当标志物CpG二核苷酸被甲基化时，检测到(存在)所述甲基化标志物。当包含标志物的标志物CpG二核苷酸未被甲基化时，未检测到(不存在)所述甲基化标志物。在一个优选的实施方式中，确定甲基化标志物组的两种或更多种甲基化标志物的存在或不存在。在一个优选的实施方式中，检测甲基化标志物组的三种或更多种，优选四种或更多种甲基化标志物的存在或不存在。所述甲基化标志物组优选包含选自表9中鉴定的甲基化标志物的至少一种甲基化标志物。所述甲基化标志物组优选包含表9的甲基化标志物组，并且更优选由表9的甲基化标志物组组成。在一种甲基化标志物的存在与多于一种类型的癌症或癌前病变相关的情况下，确定多于一种甲基化标志物的存在或不存在是有帮助的。在这些情况下，优选更多种甲基化标志物。在这些情况下，优选确定区分癌症所需要的数量的甲基化标志物。
检测到表9的基因RASSF1A、ZNF154、TMEFF2、GDF15、CDKN2A、SHOX2、SOX17、GATA2、3OST2、CYGB、FAM19A4、PHACTR3和APC中至少一种的启动子区域中至少一种甲基化标志物的存在指示个体具有肺癌，优选非小细胞肺癌。在一个优选的实施方式中，检测到表9的基因RASSF1A、ZNF154、TMEFF2、CDKN2A、SHOX2、SOX17、GATA2、3OST2、CYGB、FAM19A4、PHACTR3和APC中至少两种的启动子区域中的至少一种甲基化标志物以指示个体具有肺癌，优选非小细胞肺癌。在一个优选的实施方式中，检测到表9的基因RASSF1A、ZNF154、TMEFF2、CDKN2A、SHOX2、SOX17、GATA2、3OST2、CYGB、FAM19A4、PHACTR3和APC中至少三种并且优选至少四种的启动子区域中的甲基化标志物以指示个体具有肺癌，优选非小细胞肺癌。在确定个体是否具有肺癌的情况下，优选确定基因RASSF1A的启动子区域中甲基化标志物的存在或不存在。在一个优选的实施方式中，确定基因GATA2、3OST2、GDF15、TMEFF2中至少一种以及基因RASSF1A的启动子区域中的甲基化标志物。在一个优选的实施方式中，确定基因GATA2、3OST2、GDF15、TMEFF2中至少一种并且优选至少两种、优选至少三种并且更优选四种以及基因RASSF1A的启动子区域中甲基化标志物的存在或不存在。在确定个体是否具有肺癌的另一个实施方式中，优选确定基因CYGB、FAM19A4或PHACTR3的启动子区域中甲基化标志物的存在或不存在。在确定个体是否具有肺癌的另一个实施方式中，优选确定基因CYGB的启动子区域中甲基化标志物的存在或不存在。在确定个体是否具有肺癌的另一个实施方式中，优选确定FAM19A4或PHACTR3中至少一种以及基因CYGB的启动子区域中甲基化标志物的存在或不存在。在一个优选的实施方式中，确定基因GATA2、3OST2、GDF15、TMEFF2中至少一种以及基因CYGB的启动子区域中的甲基化标志物。在一个优选的实施方式中，确定基因GATA2、3OST2、GDF15、TMEFF2、FAM19A4或PHACTR3中至少一种并且优选至少两种、优选至少三种并且更优选四种以及基因CYGB的启动子区域中甲基化标志物的存在或不存在。甲基化标志物群组的扩展增加了方法的准确性。
检测到表9的基因GDF15、TMEFF2、VIM、TWIST1、NID2、ZNF154和RASSF1A中至少一种的启动子区域中至少一种甲基化标志物的存在指示个体具有尿路上皮细胞癌，例如膀胱癌。在一个优选的实施方式中，检测到表9的基因GDF15、TMEFF2、VIM、TWIST1、NID2、ZNF154和RASSF1A中至少两种的启动子区域中的至少一种甲基化标志物以指示个体具有尿路上皮细胞癌，例如膀胱癌。在一个优选的实施方式中，检测到表9的基因GDF15、TMEFF2、VIM、TWIST1、NID2、ZNF154和RASSF1A中至少三种并且优选至少四种的启动子区域中的甲基化标志物以指示个体具有尿路上皮细胞癌，例如膀胱癌。在确定个体是否具有尿路上皮细胞癌如膀胱癌的情况下，优选确定基因GDF15的启动子区域中甲基化标志物的存在或不存在。在一个优选的实施方式中，确定基因TMEFF2、VIM和RASSF1A中至少一种并且优选至少两种并且更优选三种以及基因GDF15的启动子区域中的甲基化标志物。
检测到表9的基因CYGB、SFRP2A和MGMT中至少一种的启动子区域中至少一种甲基化标志物的存在指示个体具有结肠癌。在一个优选的实施方式中，检测到表9的基因CYGB、SFRP2A和MGMT中至少两种的启动子区域中的至少一种甲基化标志物以指示个体具有结肠癌。在一个优选的实施方式中，检测到表9的基因CYGB、SFRP2A和MGMT中至少三种的启动子区域中的甲基化标志物以指示个体具有结肠癌。在确定个体是否具有结肠癌的情况下，优选确定基因CYGB的启动子区域中甲基化标志物的存在或不存在。在一个优选的实施方式中，确定表9的基因CYGB和MGMT中至少两种的启动子区域中的甲基化标志物以指示个体具有结肠癌。
甲基化标志物群组的扩展增加了方法的准确性。
检测到表9的基因FAM19A4、PHACTR3、PRDM14、CAD M1、MAL和miR124-2中至少一种的启动子区域中至少一种甲基化标志物的存在指示个体具有宫颈癌。在一个优选的实施方式中，检测到表9的基因FAM19A4、PHACTR3、PRDM14、CAD M1、MAL和miR124-2中至少两种的启动子区域中的至少一种甲基化标志物以指示个体具有宫颈癌。在一个优选的实施方式中，检测到表9的基因FAM19A4、PHACTR3、PRDM14、CAD M1、MAL和miR124-2中至少三种并且优选至少四种、优选至少五种基因、更优选至少六种的启动子区域中的甲基化标志物以指示个体具有宫颈癌。在确定个体是否具有宫颈癌的情况下，优选确定基因FAM19A4、基因PRDM14或优选其组合的启动子区域中甲基化标志物的存在或不存在。优选确定基因FAM19A4、基因PRDM14或优选其组合的启动子区域中甲基化标志物的存在或不存在以及基因MAL、miR124-2、PHACTR3和CADM1中的一种、两种、三种或优选四种的启动子中甲基化标志物的存在或不存在。甲基化标志物群组的扩展增加了方法的准确性。
检测到表9的基因GSTP1的启动子区域中至少一种甲基化标志物的存在指示个体具有前列腺癌。
一些标志物在多于一种的肿瘤中被检测到。在这些情况下，所述标志物特别适合于指示个体具有癌症或癌前病变。(癌前病变)癌症的类型可以通过其它诊断手段和/或通过在测试中包括更多种甲基化标志物来确定。
本发明的方法可指示个体具有(癌前病变)癌症。在这种情况下，本发明通常也可以指示癌症的起源组织(原发肿瘤部位)是什么。指示个体具有结肠癌并不意味着癌症必须位于结肠中。肿瘤可能已转移并存在于不同位置。
本发明的方法可指示个体具有癌症。但所述方法更通常指示被测试的个体具有癌症或癌前病变的可能性显著。建议个体进行进一步测试来做出癌症诊断。在一个方面，本发明的方法是具有癌前病变或癌症的可能性比正常更高的个体的选择方法。
优选通过确定表9的基因FAM19A4；RASSF1A或ZNF154的启动子区域中甲基化标志物的存在或不存在来确定个体中癌前病变或癌症的存在或不存在的检测。在一个优选的实施方式中，通过确定表9的基因FAM19A4；RASSF1A的启动子区域中的甲基化标志物和表9的ZNF154的启动子区域中的甲基化标志物以及优选其组合的存在或不存在来确定个体中癌前病变或癌症的存在或不存在的检测。确定表9的基因FAM19A4；或RASSF1A和/或表9的ZNF154的启动子区域中的甲基化标志物不存在，指示收集尿液的个体不具有或不再具有癌前病变或癌症。
如本发明所公开的甲基化标志物的存在或不存在的检测优选包括尿液样品中核酸的扩增。优选地，至少一种甲基化标志物的存在的检测包括对个体的尿液样品中的核酸的至少15个，优选至少30个，优选至少50个，优选至少100个并且更优选150个连续核苷酸进行核酸扩增。优选地，至少一种甲基化标志物是表9中鉴定的基因的启动子区域中的CpG岛。
甲基化标志物优选包含表9中所列基因的启动子区域中的CpG岛中的一个或多个CpG的甲基化。因此，表9的甲基化标志物是表9中所列基因的启动子区域的CpG岛中的一个或多个CpG的甲基化。在Davidovic等和Snellenberg等[1,2]中讨论了用于甲基化特异性PCR(优选定量PCR)以检测该甲基化的引物的一种设计方法。
确定癌前病变或癌症的类型优选包括检测个体的尿液样品中表9的至少一种甲基化标志物的存在。表9的甲基化标志物的存在指示个体具有癌症或癌前病变。随后，特定甲基化标志物的存在通常包括分型中的某些癌前病变或癌症。某种其它甲基化标志物的不存在可以从癌前病变或癌症的类型列表中排除某种类型。因此，存在和不存在都可以指示某些类型的癌前病变或癌症。确定个体不具有癌症或癌前病变优选包括确定表9中所述基因中的两种或更多种的启动子中，优选地表9中所述基因中的至少三种、四种、五种、六种、七种或更多种的启动子中甲基化标志物的不存在。
本发明还提供了一种对癌症或癌前病变发生率进行个体群体筛查的方法，其包括收集所述个体群体的尿液样品，并确定甲基化标志物组的一种或多种甲基化标志物在所述尿液样品中的存在或不存在；和
-基于尿液样品中所述一种或多种甲基化标志物的存在或不存在的检测来确定是否存在具有癌症或癌前病变的个体，其中所述一种或多种甲基化标志物的存在指示所述群体的个体具有癌前病变或癌症，并且所述甲基化标志物的不存在指示所述群体的个体不具有癌前病变或癌症。所述一种或多种甲基化标志物优选是本发明的甲基化标志物，例如表9中所述的甲基化标志物。
群体筛查或测试尿液样品以确定个体是否具有癌症或癌前病变优选是在癌症或癌前病变状况未知的个体的尿液样品或多个尿液样品(在筛查的情况下)上进行的。
本发明的样品是尿液样品。在一个优选的实施方式中，样品是无细胞尿液样品。可以通过过滤尿液或通过离心并收集上清液来收集无细胞样品。从所收集的尿液样品中基本上除去完整细胞的其它方法是本领域已知的，并且也可用于本发明。通常，在执行本发明的方法之前还从尿液中除去较大的细胞碎片，尽管不一定总是如此。如本发明中所定义的细胞是含有细胞核的细胞。红细胞可以存在于尿液中并且优选也被除去。通过在3000×g下离心后收获上清液来适当地收集无细胞样品。
本发明还提供了一种核酸扩增装置，其中优选地甲基化标志物组包含至少一种用于检测选自表9中所鉴定的甲基化标志物的甲基化标志物的工具。在一个优选的实施方式中，所述装置包括用于扩增包含来自表1的甲基化标志物组的甲基化标志物的核酸的核酸扩增引物。
附图说明
图1：癌症患者尿液(红色)和健康对照尿液(绿色)中的2种甲基化标志物的qPCR结果的实例。显示箱形图，其以对数标度分别示出MGMT和FAM19A4相对于管家基因B-肌动蛋白的甲基化水平。MGMT是在癌症患者与健康对照之间未检测到区分能力的标志物的实例。FAM19A4是具有良好区分能力的标志物的实例。
图2：甲基化特异性qPCR结果的实例。示出了多个基因的扩增曲线图(上图)和产物熔融曲线。可清楚地看到不同扩增子的不同熔融温度(下图)。
实施例
材料和方法
所有尿液样品均由志愿者在完全同意的情况下提供。由于尿液是非侵入性获得的‘废物’，因此无需医学和伦理审查委员会(medical and ethical overview board)批准。然而，征得所有受试者的同意使用其尿液。
我们收集了20名具有膀胱癌样症状的患者、20名具有确诊宫颈癌的患者的尿液。在第一个实验中，我们测试了20名肺癌患者和10名健康个体的尿液样品。在第二个实验中，我们测试了肺癌患者的14个独立尿液样品和19个对照。我们还测试了11名结肠癌患者的尿液样品和22个对照。对于宫颈癌患者，将基于宫颈拭子的常规甲基化测试与我们的结果进行比较。
我们对于膀胱癌研究了基因RASSF1A、VIM、GDF15和TMEFF2的启动子区域甲基化，对于肺癌研究了基因APC、GATA2、3OST2、RASSF1A、GDF15、TMEFF2VIM、GYGB、FAM19A4和PHACTR3的启动子区域甲基化，对于宫颈癌研究了基因FAM19A4、PHACTR3、PRDM14、CAD M1、MAL和miR124-2的启动子区域甲基化，并且对于结肠癌研究了基因CYGB、SFRP2A和MGMT的启动子区域甲基化。
表1：qPCR中使用的每个基因的引物序列。
根据方案，使用Zymo research‘Quick-DNATM尿液’试剂盒从尿液样品中提取DNA(每次提取5-40mL尿液，取决于可获量)。随后用亚硫酸氢盐(Zymo research‘EZ DNA甲基化TM’试剂盒，根据方案)处理DNA。在BIORAD实时CFX 384中使用iQ SYBR Green supermix或在ABI-7500实时PCR系统(Applied Biosystems)上，将所得亚硫酸氢盐处理的DNA用于甲基化特异性qPCR(MSP)。使用机器专用软件分析结果(数据实例见图2)。
结果
相对于血液，由于有用化合物的初始滤过和连续活性重吸收，尿液已含有身体‘废物’的浓缩物。此外，尿液相比于血液可以以更大的量获得，从而允许我们用多达40mL尿液开始。通过将来自该尿液的DNA洗脱在10μL H2O中，除由肾脏进行的浓缩之外还实现了4000x的浓缩步骤，然后进行定量PCR(qPCR)。
对所有qPCR样品同时测试基因β-肌动蛋白的存在，β-肌动蛋白在此用作甲基化独立标志物。这用于评估尿液样品中是否存在足够的DNA用于qPCR。一些样品不含(足够的)DNA。
膀胱癌样品的qPCR结果显示20个中有12个在样品中含足够的DNA，并且在这12个中，有11个对于我们的甲基化标志物中的一种或多种呈阳性。
样品# 所检测的基因甲基化
2 GDF15 TMEFF2 RASSF1A
3 GDF15 TMEFF2 VIM
7 GDF15 TMEFF2 RASSF1A
8 GDF15 TMEFF2
11 GDF15 TMEFF2
12 -
14 GDF15 TMEFF2
15 GDF15 TMEFF2
17 GDF15 TMEFF2 VIM
18 GDF15 TMEFF2 VIM
19 GDF15 TMEFF2 VIM
20 GDF15 TMEFF2
表2：在具有足以用于MSP分析的DNA浓度的膀胱癌患者的尿液中检测到的基因。测试这些尿液样品中的GDF15、TMEFF2、VIM和RASSF1A。
将宫颈癌患者的尿液用于比较拭子与自发尿液和导管尿液的甲基化模式。在尿液和拭子样品中观察到类似的甲基化模式。导管尿液(其与肿瘤细胞或肿瘤细胞碎片无接触)显示出我们的标志物基因的明显甲基化，如下表3所示。5名健康女性对照受试者在尿液中对于所有6种标志物均呈阴性。
表3：相比于宫颈拭子，在宫颈癌患者的尿液中检测到的基因。对于每个患者，并非所有样品都可用。对FAM的指称是指基因FAM19A4。
甲基化DNA序列在宫颈癌患者的导管尿液中的存在指示甲基化标志物在尿液不与肿瘤直接接触的情况下到达尿液的能力，因为导管尿液不通过外阴，这排除了宫颈、阴道和外阴污染。为了证实肿瘤来源的甲基化DNA序列在没有直接接触的情况下到达尿液，研究了非泌尿生殖系统癌症——肺癌，这排除了离体污染的可能性。用2种不同的甲基化标志物群组来分析2组患者样品。
表4中仅列出了对β-肌动蛋白对照基因具有阳性信号的患者。在第一样品组中，我们在27个样品中的19个中发现了足够的DNA(β-肌动蛋白甲基化独立对照)。测试样品中的RASSF1A、GATA2、3OST2、APC、GDF15、TMEFF2和VIM。在这19个样品中，有11个显示出下述基因的启动子区域的高甲基化。
患者 阳性基因
1 -
2 RASSF1A APC GATA2 3OST2 TMEFF2
3 RASSF1A GATA2 GDF15
4 RASSF1A
5 RASSF1A
6 RASSF1A TMEFF2
10 -
11 -
12 GDF15
14 RASSF1A
15 -
16 -
18 RASSF1A
20 RASSF1A
21 3OST2
22 -
23 -
24 3OST2 VIM GDF15
26 -
表4：在来自肺癌患者的尿液中发现的甲基化标志物。
在该样品组中的10个健康对照中，有8个具有阳性β-肌动蛋白信号。在这8个样品中，有2个对一种或两种标志物显示出甲基化阳性(表5)，表明该测试的截止值的必要性。
对照
2 -
3 -
4 -
5 -
6 RASSF1AGDF15
7 -
9 RASSF1A
10 -
表5：与肺癌样品组合测试的对照样品。
在第二样品组中，14个患者样品具有阳性b-肌动蛋白信号。在这14个样品中，有11个显示出被称为CYGB、FAM19A4和PHACTR3的3种基因的启动子区域具有高于特定阈值的高甲基化(表6)。在具有阳性b-肌动蛋白信号的19个健康对照样品中的0个中，检测到这3种标志物高于同一阈值。研究了第四种甲基化标志物：在14个患者样品中的12个中鉴定到PRDM14，但在19个对照样品中的8个中也鉴定到PRDM14(表7)。这表明并非所有先前在肿瘤中鉴定到的高甲基化DNA序列在尿液样品中都具有强大的诊断能力。
患者 阳性基因
1 FAM19A4 PRDM14
3 FAM19A4 PHACTR3 PRDM14
4 - PRDM14
5 CYGB FAM19A4 PRDM14
6 CYGB FAM19A4 PRDM14
8 -
9 FAM19A4
10 PHACTR3 PRDM14
11 - PRDM14
13 CYGB PRDM14
15 PHACTR3 PRDM14
16 CYGB PRDM14
17 FAM19A4 PRDM14
18 FAM19A4 PRDM14
表6：在来自肺癌患者的尿液中发现的甲基化标志物。
对照
1 - PRDM14
2 - PRDM14
3 -
4 -
5 -
6 - PRDM14
8 - PRDM14
9 - PRDM14
10 -
11 -
12 PRDM14
13 -
14 -
16 -
17 -
19 -
20 -
21 - PRDM14
22 - PRDM14
表7：在来自健康对照的尿液中发现的甲基化标志物。
为了进一步确定至少一些未与尿液接触的来自肿瘤的高甲基化DNA序列确实到达尿液并且可以在患者的尿液样品中被检测到这一结论，我们测试了来自具有非泌尿生殖系统癌症——结肠癌的另一组尿液样品。
11个尿液样品具有阳性b-肌动蛋白信号。测试这些样品中的3种甲基化标志物：CYGB、SFRP2和MGMT。所有这些标志物都可在癌症患者的尿液中检测到。在这3种标志物中，与健康对照相比，仅CYGB更常在患者的尿液中被检测到(参见表7)。图1示出MGMT不存在区分能力。这再次强调，并非所有在肿瘤中鉴定到的甲基化DNA序列都可用作尿液样品中的癌症选择性标志物。
表8：在来自结肠癌患者和健康对照的尿液中发现的甲基化标志物。
图1示出癌症患者尿液(红色)和健康对照尿液(绿色)中的2种甲基化标志物的qPCR结果的实例。显示箱形图，其以对数标度分别示出MGMT和FAM19A4相对于管家基因B-肌动蛋白的甲基化水平。MGMT是在癌症患者与健康对照之间未检测到区分能力的标志物的实例。FAM19A4是具有良好区分能力的标志物的实例。
结论
结果表明，尿液含有足够的肿瘤DNA，即使尿液与肿瘤(细胞)没有直接接触，所述DNA也能保持足够的甲基化状况以供检测。此外，所检测到的甲基化DNA片段可以与指示肿瘤检测和预测的基因特异性序列连接。因此，我们得出结论，尿液中无细胞的甲基化DNA片段的检测是用于癌症检测和分型的可行方法。
表9.本发明的甲基化标志物存在于该表中所示基因的启动子区域的CpG岛中。用于甲基化特异性PCR(MSP)的引物可根据Davidovic等和Snellenberg等[1.2]中的指导原则进行设计。
引用文献
1.Snellenberg,S.等,开发多重甲基化特异性PCR作为HPV阳性宫颈刮片女性的候选分类测试(Development of a multiplex methylation-specific PCR as candidatetriage test for women with an HPV-positive cervical scrape).BMC Cancer,2012.12:p.551.
2.Davidovic,R.S.等,甲基化特异性PCR：引物设计中的四个步骤(Methylation-specific PCR:four steps in primer design).Central European Journal ofBiology,2014.9(12):p.1127-1139.

Claims (15)

1.一种确定个体是否具有癌前病变或癌症的体外方法，其包括
-确定甲基化标志物组的一种或多种甲基化标志物在所述个体的尿液样品中的存在或不存在；和
-基于所述尿液样品中所述一种或多种甲基化标志物的存在或不存在的检测来确定所述个体是否具有癌前病变或癌症，其中所述一种或多种甲基化标志物的存在指示所述个体具有癌前病变或癌症并且所述甲基化标志物的不存在指示所述个体不具有癌前病变或癌症。
2.一种确定具有癌症的个体中癌前病变或癌症的类型的体外方法，其包括
-确定甲基化标志物组的一种或多种甲基化标志物在所述个体的尿液样品中的存在或不存在；和
-基于所述尿液样品中所述一种或多种甲基化标志物的存在或不存在的检测来确定癌前病变或癌症的类型，其中所述一种或多种甲基化标志物的存在或不存在指示所述个体的癌前病变或癌症的一种或多种类型。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，所述甲基化标志物组包含选自表9中鉴定的甲基化标志物的至少一种甲基化标志物。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中
-检测到表9的RASSF1A、ZNF154、TMEFF2、GDF15、CDKN2A、SHOX2、SOX17、GATA2、3OST2；GYGB；FAM19A4；PHACTR3和APC的启动子区域中至少一种甲基化标志物的存在指示所述个体具有肺癌，优选非小细胞肺癌；
-检测到表9的基因GDF15；TMEFF2、VIM、TWIST1、NID2、ZNF154和RASSF1A中至少一种的启动子区域中至少一种甲基化标志物的存在指示所述个体具有尿路上皮细胞癌，例如膀胱癌；
-检测到表9的GSTP1中至少一种甲基化标志物的存在指示所述个体具有前列腺癌；
-检测到表9的基因FAM19A4、PHACTR3、PRDM14、CADM1、MAL和miR124-2中至少一种的启动子区域中至少一种甲基化标志物的存在指示所述个体具有宫颈癌；以及
-检测到表9的基因CYGB、SFRP2A和MGMT中至少一种的启动子区域中至少一种甲基化标志物的存在指示所述个体具有结肠癌。
5.根据权利要求1至4所述的方法，其中甲基化标志物的存在或不存在的检测包括所述尿液样品中核酸的扩增。
6.根据权利要求1至5所述的方法，其中至少一种甲基化标志物是表9中鉴定的基因的启动子区域中的CpG岛。
7.根据权利要求1至6所述的方法，其中所述癌前病变选自光化性角化病；巴雷特食管；萎缩性胃炎；先天性角化不良；缺铁性吞咽困难；扁平苔藓；口腔粘膜下纤维化；日光弹性纤维变性；宫颈不典型增生；粘膜白斑病；结肠息肉病和红斑，和/或所述癌症选自肺癌，优选非小细胞肺癌，宫颈癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，包括原位导管癌，头颈癌，尿路上皮细胞癌例如膀胱癌，血液系统恶性肿瘤例如但不限于骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和骨髓增生异常综合征，胃肠道(GI道)和辅助消化器官的癌症，包括但不限于食管、胃、胆道系统、胰腺、小肠、大肠的癌症，胆囊癌，肝癌，肛门癌和直肠癌。
8.根据权利要求1至7所述的方法，其中确定癌前病变或癌症的类型包括在所述个体的尿液样品中检测表9的至少一种甲基化标志物的不存在。
9.根据权利要求1至8所述的方法，其中所述尿液样品是无细胞尿液样品。
10.一种试剂盒，其包括用于检测甲基化标志物组中的一种或多种甲基化标志物的工具，其中所述甲基化标志物组包含选自表9中鉴定的甲基化标志物的至少一种甲基化标志物，并且其中所述甲基化标志物组还包含用于从尿液中提取核酸的核酸提取缓冲剂。
11.一种核酸扩增装置，其包括用于扩增来自甲基化标志物组的一种或多种甲基化标志物的核酸的至少两种核酸扩增引物。
12.根据权利要求11所述的核酸扩增装置，其中所述甲基化标志物组包含选自表9中鉴定的甲基化标志物的至少一种甲基化标志物。
13.根据权利要求11或12所述的核酸扩增装置，其包括用于扩增包含来自表9的所述甲基化标志物组的所述甲基化标志物的核酸的核酸扩增引物。
14.一种根据权利要求10所述的试剂盒或根据权利要求11至13任一项所述的装置的用途，其用于从具有癌症的个体的无细胞尿液样品确定所述个体的癌前病变或癌症的类型。
15.一种根据权利要求10所述的试剂盒或根据权利要求11至13任一项所述的装置的用途，其用于从个体的无细胞尿液样品检测所述个体中的癌前病变或癌症。
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