JP2023527868A - 遺伝子マーカー組成物及びその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、腫瘍遺伝子マーカー組成物、メチル化検出試薬、キット及びその使用を開示する。ＨＯＸＢ４、ＳＲＣＩＮ１遺伝子組み合わせのメチル化レベルを検出することにより、肺がんサンプルを区別することができる。本発明の試薬は、試験により、肺がんを検出及び診断できることが実証されており、臨床的応用価値を有する。【選択図】図２

Description

本発明は、生物医学分野に属し、特に遺伝子マーカー組成物及びその使用に関する。
肺がんは、気管支粘膜、腺、又は肺胞上皮に由来する肺の悪性腫瘍である。病理学的タイプによると、次のように分類することができる。１）小細胞肺がん（ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ，ＳＣＬＣ）：特殊な病理学的タイプの肺がんであり、明らかに遠隔転移の傾向があり、予後が悪く、ほとんどの患者は放射線療法や化学療法に敏感である。２）非小細胞肺がん（ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ，ＮＳＣＬＣ）：小細胞肺がん以外の他の病理学的タイプの肺がんであり、扁平上皮がん、腺がん、大細胞がんなどを含む。生物学的挙動と臨床経過にはある程度の違いがある。発生場所に応じて、次のように分類することができる。１）中枢型肺がん（ｃｅｎｔｒａｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）：分節気管支開口内及びその上で増殖する肺がんである。２）末梢型肺がん（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）：分節気管支開口から遠い位置で増殖する肺がんである。
近年、人口の高齢化、大気汚染、喫煙などの要因の影響を受けて、中国の肺がんの発生率と死亡率は年々増加している。国立がんセンターが発表した「２０１７年中国がん登録年次報告書」によると、中国では毎分約７人ががんと診断されており、肺がんの発生率と死亡率は第１位となっている。中国は世界で最も多くの肺がん患者がいる国となっており、専門家は中国の肺がん患者の数が２０２５年まで１００万人に達すると予測している。疫学的研究によると、喫煙は肺がんを引き起こす重要な要因である。世界では、肺がんの約８０％～９０％は、喫煙が原因である。非喫煙者と比較して、４５～６４歳で毎日１～１９本と２０本以上のタバコを吸う人の肺がんの罹患相対リスクは、それぞれ４．２７と８．６１であり、非喫煙者と比較して、毎日１～１９本のタバコと２０本以上のタバコの長期喫煙者の肺がんによる死亡の相対リスクは、それぞれ６．１４と１０．７３であった。肺がんの治療技術は日々進歩してきたが、５年生存率は４％からわずか１２％程度まで向上した。既存の抗悪性腫瘍薬は病気を軽減することしかできず、患者の無増悪生存期間の平均は３～５か月のみ延長されるが、ステージＩの肺がん患者の場合、手術後の５年生存率は６０％から７０％と高い。したがって、肺がんの早期診断と早期手術は、肺がんの５年生存率を改善し、死亡率を下げる最も効果的な方法の１つである。
現在の肺がんの臨床補助診断には、主に次の種類があるが、いずれも早期発見と早期診断を完全に達成することはできない。
（１）血液生化学検査
原発性肺がんについては、現在、特異的な血液生化学検査はない。肺がん患者の血中アルカリホスファターゼ又は血中カルシウムの上昇は、骨転移の可能性を考慮し、血中アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、乳酸脱水素酵素又はビリルビンの上昇は、肝転移の可能性を考慮する。
（２）腫瘍マーカー検査
１）ＣＥＡ：肺がん患者の３０％～７０％は、血清中のＣＥＡレベルが異常に高いが、主に進行した肺がん患者に見られる。現在、血清中のＣＥＡの検査は、主に肺がんの予後を推定し、治療経過を監視するために使用されている。２）ＮＳＥ：小細胞肺がんの第一選択マーカーであり、小細胞肺がんの診断及び治療反応の監視に使用され、検出方法や使用する試薬によって基準値は異なる。３）ＣＹＦＲＡ２１－１：非小細胞肺がんの第一選択マーカーであり、肺の扁平上皮がんに対する診断感度は６０％にも達することができ、検出方法や使用する試薬によって基準値は異なる。
（３）画像検査
１）胸部Ｘ線検査：胸部正面及び側面Ｘの線写真を含む必要がある。一次病院では、胸部正面及び側面のＸ線写真が依然として、肺がんの最初の診断のための最も基本的で好ましい画像診断方法である。肺がんが診断されるか又は疑われると、胸部ＣＴ検査を行う。２）ＣＴ検査：胸部ＣＴは、肺がんの診断と鑑別診断、病期分類、治療後のフォローアップに使用される最も一般的で重要な肺がんの検査方法である。ＣＴガイド下肺生検は、肺がんの重要な診断技術であり、対応可能な病院は、それを定性が困難な肺内病変の診断、肺がんの臨床診断に細胞診や組織診で検証する必要がありかつ他の方法では素材が入手困難である症例に適用することができる。近年、マルチスライスヘリカルＣＴと低線量ＣＴ（ＬＤＣＴ）は、肺がんの早期発見と死亡率の低下に効果的なスクリーニングツールである。国家肺がん検診研究（ＮＬＳＴ）により、ＬＤＣＴは胸部Ｘ線スクリーニングと比較して肺がん死亡率を２０％減少できることが示されている。低線量ヘリカルＣＴは、肺がんの早期スクリーニングの重要な方法として推奨されているが、人的要因が多く、偽陽性率が非常に高い。３）超音波検査：主に腹部の重要臓器や腹腔、後腹膜リンパ節の転移の有無を調べるのに使用され、頸部リンパ節の検査にも使用されている。胸壁に隣接する肺内病変又は胸壁病変については、嚢胞性を識別し、超音波ガイド下生検を行うことができる。超音波は、胸水抜きの位置確定にもよく使用されている。４）骨スキャン：肺がんの骨転移の検出感度は高いが、ある程度の偽陽性率がある。肺がんの術前検査、局所症状を伴う患者に適用できる。
（４）他の検査
１）喀痰細胞診検査：現在、簡便な肺がんの非侵襲的診断法であり、連続塗抹検査で陽性率は約６０％にも達することができ、肺がん疑い症例の一般的な診断法となっている。２）ファイバー気管支鏡検査：肺がん診断において最も重要な方法の一つであり、肺がんの質的・位置確定診断及び手術スキームの選択に対して重要な役割を果たし、手術治療を受ける患者とって必要な一般的な検査項目である。気管支鏡穿刺生検（ＴＢＮＡ）は治療前の病期分類に有利であるが、技術的に困難でリスクが高いため、この検査を必要とする患者は、上級病院に転送してさらなる検査を受けるべきである。３）その他：経皮的肺生検、胸腔鏡下生検、縦隔鏡生検、胸水細胞診検査などは、適応がある場合、既存の条件に応じてそれぞれを使用して診断を支援することができる。
画像検査におけるマルチスライスヘリカルＣＴと低線量ＣＴ（ＬＤＣＴ）は、肺がんの早期発見と死亡率の低下に効果的なスクリーニングツールである。国家肺がん検診研究（ＮＬＳＴ）により、ＬＤＣＴは胸部Ｘ線スクリーニングと比較して肺がん死亡率を２０％減少できることが示されている。肺がんスクリーニング項目の成功又は失敗は、ハイリスク群の識別に依存することが臨床現場で証明されている。複数のハイリスク因子を統合したリスク予測モデルは、肺がんのハイリスク群を識別する方法の一つとして世界的に認知されている。リスクモデルは、臨床医に介入や治療の改善を支援することで、肺がん患者に対する治療効果をさらに改善することができる。ハイリスク群のスクリーニングが現在の高い肺がん死亡率を低下できることは世界的に認識されているが、ハイリスク群の同定は依然として解決が難しい問題である。肺がんスクリーニングのベネフィット・リスク比を最大化するために重要な問題は、第一にハイリスク群をどのように同定するかある。第二にどのような方法で集団をスクリーニングするかである。その方法は、ハイリスク因子の同定、総合リスクの定量化要約、及びスクリーニングベネフィット閾値の選択を含む。
技術の急速な発展に伴い、腫瘍マーカー検出は、画像診断と病理診断に続く腫瘍診断と治療の新しい分野になり、腫瘍の診断、検出、治療に大きな影響を与えることができる。腫瘍マーカーは、体液又は組織で検出でき、腫瘍の存在、分化度、予後推定、個別化医療及び治療効果などを反映することができる。早期肺がんの患者は明らかな症状がなく、医師や患者が気づきにくいに加え、血液や生化学項目には明らかな特異的マーカーが存在しないため、従来の診断法では早期発見と早期診断が困難である。したがって、肺がんの早期診断、特に大規模な集団スクリーニングへの適用は比較的困難である。
ますます多くの研究により、腫瘍形成のプロセスに２種類のメカニズムが関与することが明らかである。一つは、ＤＮＡヌクレオチド配列の変化による変異、即ち、遺伝的メカニズムである。腫瘍は、遺伝子疾患として分子生物学の分野で実証されている。もう一つは、エピジェネティクス（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）メカニズムであり、即ち、ＤＮＡ配列の変化に依存しない遺伝子発現レベルの変化であり、腫瘍形成のプロセスにおけるその役割はますます注目されている。遺伝学とエピジェネティクスの２つのメカニズムは交互に存在して共同で腫瘍の形成を促進する。遺伝子の異常なメチル化は、腫瘍形成の初期段階で現れ、遺伝子の異常なメチル化の程度は、腫瘍の進行中に増加する。よく見られる９８種類の原発性ヒト腫瘍のゲノムを分析した結果、各腫瘍に少なくとも６００個の異常にメチル化されたＣｐＧアイランドがあることを見出した。
多くの研究により、プロモーターの異常なメチル化は多くの腫瘍の発生において頻発する初期イベントであることが示されているため、腫瘍関連遺伝子のメチル化状態は腫瘍形成の早期高感度指標であり、有望な腫瘍分子バイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）と考えられている。さらに重要なことに、がん細胞はＤＮＡを末梢血に放出することができる。正常人の末梢血には、ナノグラムレベルの遊離ＤＮＡが存在する。研究により、腫瘍組織における腫瘍関連遺伝子のプロモーターの異常なメチル化は、末梢血血漿／血清、及び腫瘍関連臓器に関連する体液（唾液、喀痰など）でも検出できることを見出した。これらの生物学的サンプルは、比較的入手が容易であり、それらのサンプルにあるＤＮＡをＰＣＲ技術により大量に増幅した後、高感度で検出することができる。したがって、特定の腫瘍関連遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態を検出することにより、腫瘍の早期診断に非常に価値のある情報を提供することができる。他のタイプの腫瘍分子マーカーと比較して、プロモーターの異常なメチル化の検出にはより多くの利点がある。特定の遺伝子は、そのプロモーターの異常メチル化領域が異なるタイプの腫瘍において同じであるため、検出は比較的便利である。また、対立遺伝子欠失のようなマーカーと比較して、異常なメチル化は、陽性シグナルであり、正常組織の陰性バックグラウンドと容易に区別することができる。Ｅｓｔｅｌｌｅｒらは、２２例の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の腫瘍組織及び血清中のｐ１６、ＤＡＰＫ、ＧＳＴＰ１及びＭＧＭ Ｔなどの遺伝子のプロモーター領域での異常なメチル化状態を検出した結果、６８％（１５／２２）の腫瘍組織に少なくとも１種の遺伝子のプロモーターメチル化が存在することを見出し、１５例の組織陽性症例のうちの１１例では、血清にもプロモーターの異常メチル化が検出された。また、多くの研究者は、肝臓がん、頭頸部がん、食道がん、及び結腸がん患者の腫瘍組織及び血清から特定の腫瘍関連遺伝子のプロモーターのメチル化を検出した。
従来の肺がん検出技術は、主に感度が低く、偽陽性が多く、侵襲性が高いという問題がある。また、現在の一般的な検出技術では、早期肺がんを検出することは困難である。
肺がんの非侵襲的検出、例えば喀痰検出はより困難である。肺がん患者の喀痰中の腫瘍マーカーについても研究されたが、他の腫瘍患者の血液サンプル中の腫瘍マーカーの検出及び評価と比較して、喀痰サンプルの成功率は非常に低い。これは主に次の理由によるものである。（１）喀痰の組成は比較的複雑であり、異なる集団は、異なる疾患や環境下での喀痰の組成及び粘度に違いが大きい。（２）喀痰には、気管上皮細胞、細菌、口腔粘膜細胞などの非肺がん細胞成分が多く含まれており、一般的なサンプル処理方法では、十分な数の肺がん由来ＤＮＡを効果的にエンリッチメントすることはできない。（３）多くの喫煙者は喀痰がでない。Ａ Ｊ Ｈｕｂｅｒｓらは「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｐｕｔｕｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ」において過去１０件の文献を研究した結果、肺がん組織中のマーカーのメチル化程度の中央値は４８％であるのに対し、喀痰でのメチル化程度の中央値は３８％であり、メチル化マーカーは組織内での検出率が喀痰よりも明らかに高いことを示している。また、Ｒｏｓａｌｉａ Ｃｉｒｉｎｃｉｏｎｅの「Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ａｎｄ ｓｐｕｔｕｍ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓｐｉｒａｌ ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ： Ａ ｎｅｓｔｅｄ ｃａｓｅ－ｃｏｎｔｒｏ」には、肺がんがん組織におけるＲＡＲｂｅｔａ２、Ｐ１６、ＲＡＳＳＦ１Ａの検出率はそれぞれ６５．５％、４１．４％、５１．７％に達するのに対し、喀痰における検出率は、わずか４４．４％、５％、５％であることが開示されている。
本発明の目的の一つは、遺伝子マーカー組成物、及びこの遺伝子マーカー組成物を検出する検出／診断試薬、並びにその使用を提供することにある。
一方、本発明では、遺伝子マーカー組成物が提供される。前記遺伝子マーカーは、ＨＯＸＢ４及びＳＣＲＩＮ１を含む。
本発明の遺伝子マーカー組成物は、各遺伝子マーカーにおける任意の長さの断片も含み、つまり、ＨＯＸＢ４、ＳＣＲＩＮ１のそれぞれに由来する任意の断片（この断片の長さは任意である）の組み合わせは、いずれも本発明の保護範囲に含まれる。
ＨＯＸＢ４遺伝子は、Ａｎｔｐホメオボックス遺伝子ファミリーのメンバーであり、１７番染色体上のホメオボックスＢクラスター遺伝子に属する。ＨＯＸＢ４遺伝子は、ホメオボックスＤＮＡ結合ドメインを持つ核タンパク質をコードし、コードされたタンパク質は発育に関与する配列特異的な転写因子として機能する。このタンパク質の細胞内又は異所性発現は、造血幹細胞及び前駆細胞をインビボ及びインビトロで増幅するため、治療性幹細胞増幅の潜在的な候補になる。
ＳＲＣＩＮ１（ＳＲＣ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １）ＳＲＣキナーゼシグナル伝達阻害遺伝子１と呼ばれる。ＳＲＣＩＮ１遺伝子とタンパク質は、ＳＲＣの負の調節因子として機能し、ＣＳＫを活性化することでＳＲＣ活性と下流のシグナル伝達を阻害し、細胞の拡散と移動を害するとともに、樹状突起スパインの形態を調節し、カルシウム依存性エキソサイトーシスに関与する。
本発明は、肺がん検出試薬又はキットの製造における多遺伝子のメチル化組合せ検出試薬の使用をさらに提供する。前記遺伝子は、ＨＯＸＢ４及びＳＣＲＩＮ１を含む。
現在、肺がんの見逃し率は比較的高い。特に、腺がんの場合では、喀痰の非侵襲的検出はさらに困難であり、検出率は非常に低い。これは、ほとんどの腺がんが小さい気管支から発生する末梢型肺がんであり、肺の深部にある脱落した細胞が喀痰により出るのがより困難であるためである。したがって、現在、腺がんの喀痰痰検出手段はほぼゼロである。
早期腫瘍のスクリーニングでは、見逃し率の低減は非常に重要である。早期腫瘍スクリーニング製品がすべて又はほとんどの患者をスクリーニングできないと、見逃された患者は十分なリスク警告を得ることができない。そうすると、治療のタイミングが遅れてしまい、患者にとって大きな損失である。
先行技術において肺がんに関連するいくつかの腫瘍マーカーが発見されたが、これらの腫瘍マーカーの検出試薬又は検出方法の制限により、これらの腫瘍マーカーの感度及び特異性は要求を満たすことができない。そのため、現在、当該技術分野では、肺がんに確実に適用できるスクリーニング手段をさらに研究する必要がある。しかし、非侵襲的スクリーニングは、サンプリング上で独特な利点を有するが、他の側面ではいくつかの制限がある。例えば、肺がんの中の腺がんについては、肺の深部にある脱落した細胞が喀痰により出るのが困難であるため、一般的には、当業者は、この種類の肺がんは非侵襲的スクリーニングに適さないと考えている。一方、他の種類の肺がんについても、現在報告されている非侵襲的スクリーニング方法では、臨床使用の要求を満たすことは困難である。関連研究は長年にわたって進められてきたが、臨床に適用可能な非侵襲的な肺がんのスクリーニング方法はまだない。
本発明は、ＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化検出試薬を含む多遺伝子メチル化組合せ検出試薬又はキットをさらに提供する。
「メチル化検出試薬」は、前記遺伝子又は遺伝子内容のより小さい／短い任意の配列を検出する試薬を含む。つまり、前記遺伝子の中の任意部位（例えば、より小さい断片）に対する任意の検出及び検出試薬は、いずれも本発明の保護範囲に含まれる。
本発明の遺伝子マーカーＨＯＸＢ４及びＳＣＲＩＮ１は、組み合わせて検出され、つまり、本発明のいくつかの遺伝子マーカーは、同時に検出される。
本明細書において、「検出」と「診断」は、同じであり、肺がんの早期診断に加えて、肺がんの中期及び晩期診断を含み、肺がんの選別、リスクの評価、予後、疾患の識別、病期の診断及び治療標的の選択も含む。
肺がんマーカーであるＨＯＸＢ４及びＳＣＲＩＮ１の組み合わせにより、肺がんの早期診断は可能となる。がん細胞におけるメチル化遺伝子が臨床的又は形態学的に正常に発現する細胞においてメチル化されたことが確定された場合、この正常に発現する細胞はがんに発展していることが示されている。そのため、肺がんは、正常に発現する細胞における肺がん特異性ＨＯＸＢ４及びＳＣＲＩＮ１遺伝子組み合わせのメチル化により早期に診断することができる。
早期診断は、転移前、好ましくは組織又は細胞の形態学的変化の前にがんに罹患する可能性を発見することを含む。
肺がんの早期診断に加え、本発明の試薬／キットは、肺がんの選別、リスクの評価、予後診断、疾患識別、病期での診断、及び治療標的の選択にも適用できる。
病期で選択可能な実施形態として、肺がんの異なる段階又は時期での進行に応じてサンプルから得られるＨＯＸＢ４及びＳＣＲＩＮ１遺伝子組み合わせのメチル化程度の測定により診断することができる。肺がんの各段階のサンプルから単離された核酸のＨＯＸＢ４及びＳＣＲＩＮ１遺伝子組み合わせのメチル化程度と異常な細胞増殖がない組織のサンプルから単離された１つ又は複数の核酸のＨＯＸＢ４及びＳＣＲＩＮ１遺伝子組み合わせのメチル化程度とを比較することにより、サンプルにおける肺がんの具体的な段階を確定することができる。
一般的に、ＣｐＧアイランドとは、ＣｐＧジヌクレオチドが大量に含まれる領域を指し、通常、プロモーター及びその近傍の領域に位置する。本発明のメチル化の検出部位は、本発明のＣｐＧアイランドは、ＣｐＧジヌクレオチドが大量に含まれるプロモーター及びその近傍領域のみならず、ヘテロメチル化のＣｐＧ部位、又は独立したＣｐＧ部位も含む。
前記ＨＯＸＢ４及びＳＣＲＩＮ１遺伝子組み合わせのメチル化組合せ検出試薬は、従来技術におけるメチル化検出試薬であってもよい。従来技術には、標的遺伝子のメチル化を検出可能な方法が多くなり、例えば、メチル化特異性ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化特異的定量ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質のＰＣＲ、定量ＰＣＲ及びＤＮＡチップ、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ、バイサルファイトシークエンス法又はパイロシーケンス法などがある。他のメチル化検出方法として、特許ＵＳ６２００７６８７に記載の方法が挙げられる。それぞれの検出方法には、対応する試薬があり、これらの試薬はいずれも本発明のＨＯＸＢ４及びＳＣＲＩＮ１遺伝子組み合わせのメチル化検出に適用できる。
本発明は、ＨＯＸＢ４及びＳＣＲＩＮ１遺伝子組み合わせのメチル化組合せ検出試薬をさらに提供する。ＨＯＸＢ４及びＳＣＲＩＮ１遺伝子組み合わせにおけるそれぞれの遺伝子に対するプライマー及び／又はプローブを含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、ＨＯＸＢ４及びＳＣＲＩＮ１遺伝子組み合わせにおけるそれぞれの遺伝子のＣｐＧアイランドに対して得られるプライマー及び／又はプローブを含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、プライマー及び／又はプローブは、定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）によりＨＯＸＢ４及びＳＣＲＩＮ１遺伝子組み合わせにおけるそれぞれの遺伝子のメチル化を検出する。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明で提供されるメチル化検出試薬は、ＨＯＸＢ４及びＳＣＲＩＮ１遺伝子組み合わせにおけるそれぞれの遺伝子の遺伝子本体、遺伝子間領域又はプロモーター領域及びプロモーター領域の近傍領域のメチル化レベルを検出する。
いくつかの実施形態において、本発明で提供されるメチル化検出試薬は、ＨＯＸＢ４及びＳＣＲＩＮ１遺伝子組み合わせにおけるそれぞれの遺伝子のプロモーター領域又は前記プロモーター領域の近傍領域のＣｐＧアイランドに対して得られるプライマー及び／又はプローブを含む。
いくつかの実施形態において、本発明で提供されるメチル化検出試薬では、前記ＨＯＸＢ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
Ｉ：配列番号１、配列番号１６及び配列番号１９に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＩＩ：Ｉに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＨＯＸＢ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＩＩＩ：配列番号２、配列番号１７及び配列番号２０に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＩＶ：ＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
Ｖ：配列番号４及び配列番号２２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＶＩ：Ｖに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＶＩＩ：配列番号５に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＶＩＩＩ：ＶＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記ＨＯＸＢ４遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１及び配列番号２に示される。
いくつかの実施形態において、前記ＨＯＸＢ４遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１６及び配列番号１７に示される。
前記ＨＯＸＢ４遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１９及び配列番号２０に示される。
いくつかの実施形態において、前記ＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号４及び配列番号５に示される。
いくつかの実施形態において、前記ＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号２２及び配列番号５に示される。
いくつかの実施形態において、前記ＨＯＸＢ４遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＩＸ：配列番号３、配列番号１８及び配列番号２１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
Ｘ：ＩＸに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＩ：配列番号６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＩＩ：ＸＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記肺がんは、小細胞肺がん及び非小細胞肺がんから選択される。
いくつかの実施形態において、前記非小細胞肺がんは、扁平上皮がん、腺がんから選択される。
本発明は、前記メチル化組合せ検出試薬を含む肺がんの検出キットをさらに提供する。
いくつかの実施形態において、本発明で提供されるキットは、キットに一般的に使用される試薬をさらに含む。例えば、ｑＭＳＰに一般的に使用される転換剤は、メチル化されていないシトシン塩基をウラシルに転換するが、メチル化されたシトシン塩基が変化しない。前記転換剤には特に制限がなく、従来技術に開示のシトシンからウラシルへの転換を実現できる試薬であればよく、例えば、ヒドラジン塩、重亜硫酸塩及び亜硫酸水素塩（例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素セシウム、亜硫酸水素アンモニウムなど）のうちの１種又は複数種が挙げられる。また、遺伝子増幅に一般的に使用されるＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、Ｍｇ２＋イオン及び緩衝液などがある。
いくつかの実施形態において、前記試薬又はキットは、内部標準遺伝子の検出試薬をさらに含む。
いくつかの実施形態において、前記内部標準遺伝子は、β－アクチンである。
いくつかの実施形態において、前記内部標準遺伝子の検出試薬は、内部標準遺伝子に対するプライマー及びプローブである。
いくつかの実施形態において、前記内部標準遺伝子の検出試薬は、配列番号１３及び配列番号１４に示されるプライマーペア及び配列番号１５に示されるプローブである。
本発明は、肺がん検出試薬又はキットの製造におけるＨＯＸＢ４及びＳＣＲＩＮ１遺伝子のメチル化組合せ検出試薬の使用を提供する。
本発明は、プライマーを提供する。前記プライマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列、又はそれの相補配列から選択される少なくともいずれか１つである。
本発明は、プライマーを提供する。前記プライマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列から選択される少なくともいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、前記プライマーは、配列番号１及び配列番号２、配列番号４及び配列番号５に示される少なくとも１対のプライマーペアから選択される。
いくつかの実施形態において、前記プライマーは、配列番号１及び配列番号２、配列番号４及び配列番号５に示されるプライマーペアから選択される。
前記プライマーは、前記核酸断片を増幅するために使用される。当該技術分野では、プライマーを成功に設計するのは、ＰＣＲにとって極めて重要である。一般的なＰＣＲに対して、メチル化の検出では、プライマー設計の影響はより重要である。これは、メチルチオール化がＤＮＡ鎖における「Ｃ」を「Ｕ」に変換させることでＧＣの含有量が減少し、ＰＣＲ反応後に配列に長くて連続した「Ｔ」が形成されるため、ＤＮＡ鎖の断裂が引き起こされやすく、これによって、適切なＴｍ値を有しかつ安定したプライマーを選択するのが困難であるためである。一方、チオール化処理されたＤＮＡ、チオール化処理されていないＤＮＡ、及び不完全に処理されたＤＮＡを区別するためには、プライマーに十分な数の「Ｃ」がある必要がある。これによっても、安定したプライマーの選択はより困難になる。したがって、ＤＮＡメチル化検出では、プライマーに対する増幅断片の選択（例えば、増幅断片の長さ及び位置）及びプライマーの選択などは、いずれも検出の感度及び特異性に影響を与えている。本発明者らは、実験により異なる増幅目的断片及びプライマーの検出効果には違いがあることを見出した。多くの場合、特定の遺伝子又は核酸断片の腫瘍と非腫瘍における発現が違うことを見出したが、腫瘍のマーカーとして臨床応用するにはまだ長い道のりがある。最も主要な原因は、検出試薬に制限があることで、この潜在的な腫瘍マーカーの検出感度及び特異性が検出要求に満たしにくいか、又は検出方法の操作が複雑でコストが高く、大規模な臨床応用が困難であることにある。
別の態様では、本発明は、核酸プローブをさらに提供する。前記核酸プローブは、配列番号３、配列番号６、配列番号１８及び配列番号２１に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列から選択される少なくともいずれか１つである。
本発明の好ましい実施形態として、前記核酸プローブは、配列番号３及び配列番号６に示される配列から選択される。
いくつかの実施形態において、本発明で提供されるキットは、増幅用のプライマーペアを含む第１容器と、プローブを含む第２容器とを含む。
いくつかの実施形態において、前記キットは、説明書をさらに含む。
いくつかの実施形態において、前記キットは、核酸抽出試薬をさらに含む。
いくつかの実施形態において、前記キットは、サンプリング装置をさらに含む。
本発明は、メチル化検出試薬若しくはキット又は肺がんの検出試薬若しくはキットの製造における前記メチル化検出試薬、キット、プライマー、プローブの使用を提供する。
本発明は、メチル化検出又は肺がん検出における前記メチル化検出試薬、キット、プライマー、プローブの使用をさらに提供する。
本発明は、肺がん検出システムをさらに提供する。前記システムは、
(１）ＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化組合せ検出部と、
(２）データ処理部と、
(３）結果出力部と、
を含む。
いくつかの実施形態において、前記メチル化検出部は、メチル化検出機器を含む。
いくつかの実施形態において、前記メチル化検出部は、前記メチル化組合せ検出試薬、キット、プライマー、プローブをさらに含む。
いくつかの実施形態において、前記メチル化検出機器は、蛍光定量ＰＣＲ装置、ＰＣＲ装置、シーケンサーのうちの１種又は複数種を含む。
いくつかの実施形態において、前記データ処理部は、データ処理装置を含む。
前記データ処理装置は、当業者が使用できるデータ処理可能な任意の設備、機器又は装置を含む。
いくつかの実施形態において、前記データ処理装置は、計算器、コンピュータのうちの１種又は複数種を含む。
前記コンピュータには、当業者が使用できるデータ処理又は統計分析可能な任意のソフトウェア又はプログラムが搭載されている。
いくつかの実施形態において、前記コンピュータは、ＳＰＳＳ、ＳＡＳ、Ｅｘｃｅｌのうちの１種又は複数種のソフトウェアが搭載されたコンピュータを含む。
いくつかの実施形態において、前記結果出力部は、結果出力装置を含む。
前記出力装置は、データ処理結果を読み取り可能なコンテンツとして表示可能な設備、機器又は装置を含む。
いくつかの実施形態において、前記メチル化検出部は、前記多遺伝子のメチル化組合せ検出試薬をさらに含む。
いくつかの実施形態において、前記結果出力装置は、スクリーン、紙報告書のうちの１種又は複数種を含む。
いくつかの実施形態において、前記データ処理装置は、ａ．検出サンプル及び正常対照サンプルのテストデータを受信し、ｂ．検出サンプル及び正常対照サンプルのテストデータを記憶し、ｃ．同じタイプの検出サンプルと正常対照サンプルとのテストデータを比較し、ｄ．比較結果に基づいて被験体が肺がんに罹患する確率又は可能性を判断するように構成される。
いくつかの実施形態において、前記結果出力部は、被験体の肺がんの罹患確率又は可能性を出力するものである。
いくつかの実施形態において、データ処理部の判断標準は、限界値に基づいて肺がんサンプル及び正常サンプルを判断することである。
いくつかの実施形態において、本発明のＨＯＸＢ４とＳＲＣＩＮ１の組合せ検出は、マルチプレックスＰＣＲにより実現され得る。
いくつかの実施形態において、目的遺伝子であるＨＯＸＢ４、ＳＲＣＩＮ１のＣｐ値及び／又は△Ｃｐ値（△Ｃｐ値＝Ｃｐ標的遺伝子－Ｃｐ内部標準遺伝子）に基づいてサンプルのメチル化レベルを判断する。
いくつかの実施形態において、そのうちの１つの遺伝子の前記組織サンプルにおける△Ｃｐ値が前記△Ｃｐ値の限界値よりも低くければ、肺がんサンプルとして判断され、２つの遺伝子の前記組織サンプルにおける△Ｃｐ値がいずれも前記△Ｃｐ値の限界値以上である場合、正常サンプルとして判断される。
いくつかの実施形態において、サンプルにおけるＣｐ値の限界値の範囲は３５～３９であり、△Ｃｐ値の限界値の範囲は４～１２である。
いくつかの実施形態において、ＨＯＸＢ４とＳＲＣＩＮ１の組合せ検出では、組織サンプルにおいて、ＨＯＸＢ４の△Ｃｐ値の限界値は５．４であり、ＳＲＣＩＮ１の△Ｃｐ値の限界値は６．５である。
いくつかの実施形態において、ＨＯＸＢ４とＳＲＣＩＮ１の組合せ検出では、喀痰サンプルにおいて、ＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１の閾値線Ｃｐ値は、それぞれ３６．９及び３７．０である。単一の遺伝子検出結果の中の１項が前記閾値よりも低い場合、陽性（即ち、肺がんサンプル）として判断され、検出結果の中の２項の結果がいずれも対応する閾値以上である場合、陰性（即ち、正常サンプル）として判断され得る。
いくつかの実施形態において、ＨＯＸＢ４とＳＲＣＩＮ１のマルチプレックスＰＣＲ検出では、喀痰サンプルにおけるＣｐ値の限界値は３６．７であり、洗浄液サンプルにおけるＣｐ値の限界値は３７．２であり、△Ｃｐ値の限界値は９である。
いくつかの実施形態において、ＨＯＸＢ４とＳＲＣＩＮ１のマルチプレックスＰＣＲ検出では、前記喀痰サンプルにおけるＣｐ値が前記Ｃｐ値の限界値よりも低い場合、肺がんサンプルとして判断あれ、前記喀痰サンプルのＣｐ値が前記Ｃｐ値の限界値以上である場合、正常サンプルとして判断される。
いくつかの実施形態において、ＨＯＸＢ４とＳＲＣＩＮ１のマルチプレックスＰＣＲ検出では、前記洗浄液サンプルにおけるＣｐ値及び△Ｃｐ値のいずれか前記Ｃｐ値及び△Ｃｐの限界値よりも低い場合、肺がんサンプルとして判断され、前記洗浄液サンプルのＣｐ値及び△Ｃｐ値がいずれも前記Ｃｐ値及び△Ｃｐ値の限界値以上である場合、正常サンプルとして判断される。
いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、肺がんである。
いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、小細胞肺がん及び非小細胞肺がんである。
いくつかの実施形態において、前記非小細胞肺がんは、扁平上皮がん、腺がんから選択される。
いくつかの実施形態において、前記検出サンプル又はサンプルのタイプは、肺胞洗浄液、組織、胸水、喀痰、血液、血清、血漿、尿液、前立腺液又は糞便から選択される少なくとも１種である。
いくつかの実施形態において、本発明に記載のサンプルは、肺胞洗浄液、組織、喀痰から選択される少なくとも１種である。
いくつかの実施形態において、本発明に記載のサンプルは、肺胞洗浄液又は喀痰から選択される少なくとも１種である。
本発明は、肺がんの診断方法をさらに提供する。前記方法は、以下のステップ（１）から（３）を含む。
ステップ（１）：被験体に由来の検出サンプルのＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化レベルを検出し、
ステップ（２）：検出サンプルと正常対照サンプルとのＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化レベルを比較し、
ステップ（３）：検出サンプルと正常対照サンプルのメチル化レベルのずれに基づいて肺がんを診断する。
いくつかの実施形態において、本発明は、肺がんの診断方法を提供する。前記方法は、以下のステップ（１）から（３）を含む。ステップ（１）：被験体に由来の検出サンプルＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化レベルを検出し、前記検出は、被検体の検出サンプルとＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化レベルを検出する検出試薬とを接触させ、ステップ（２）：検出サンプルと正常対照サンプルとのＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化レベルを比較し、ステップ（３）：検出サンプルと正常対照サンプルのメチル化レベルのずれに基づいて肺がんを診断する。
いくつかの実施形態において、本発明は、肺がんの診断方法を提供する。前記方法は、以下のステップを含む。即ち、遺伝子のメチル化検出試薬を被検体に由来の検出サンプルに加え、この検出サンプルにおけるＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化レベルを検出し、検出サンプルと正常対照サンプルとのＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子メチル化レベルと比較し、検出サンプルと正常対照サンプルのメチル化レベルのずれに基づいて肺がんを診断する。
いくつかの実施形態において、前記ステップ（３）においける前記ずれとは、ＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１の２つの遺伝子のうちのいずれか１つのメチル化レベルのずれを指す。
いくつかの実施形態において、前記ステップ（１）において、前記検出は、被検体の検出サンプルと、ＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化レベルの検出試薬とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態において、メチル化特異的定量ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）によりＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化レベルを検出する。
いくつかの実施形態において、結果に基づいて検出サンプルと正常サンプルとのメチル化結果を比較し、検出サンプルと正常サンプルとのメチル化に顕著な違い又は極めて顕著な違いがある場合、結果として検出サンプルの罹患リスクが高いと判断される。
本発明の診断方法は、肺がん治療の前後に使用することができるか又は肺がん治療と併用することができる。治療後の使用として、例えば、治療成功の評価、又は治療後の肺がんの緩和、再発及び／若しくは進行（転移を含む）の監視がある。
また、肺がんの治療方法をさらに提供する。前記方法は、以下のステップ（１）から（４）を含む。
ステップ（１）：被験体に由来の検出サンプルＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化レベルを検出し、
ステップ（２）：検出サンプルと正常対照サンプルとのＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化レベルを比較し、
ステップ（３）：検出サンプルと正常対照サンプルのメチル化レベルのずれに基づいて肺がんを診断し、
ステップ（４）：肺がんとして診断された被検体に肺がん治療薬を投与する。
本発明の別の態様では、肺がんの治療方法が提供される。前記方法は、前記診断方法により肺がんとして診断された患者に対して、手術、化学療法、放射線療法、放射線化学療法、免疫療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、当該技術分野で使用される他のタイプの肺がんの治療方法、又はこれらの治療方法の組み合わせを実施することを含む。
本発明では、研究により、いくつかの具体的な実施形態において、HOXB4及びSRCIN1遺伝子の組み合わせを検出することにより、サンプルから肺がんサンプルを良好に区別することができ、肺がんに対する検出感度及び特異性は非常高いことを見出した。
組織サンプルにおいて異なるマーカー組成物を検出して得られたＲＯＣ曲線である。 喀痰サンプルにおいて異なるマーカー組成物を検出して得られたＲＯＣ曲線である。 洗浄液サンプルにおいてＨＯＸＢ４とＳＲＣＩＮ１の組み合わせを検出して得られた増幅曲線である。
以下、具体的な実施例により本発明の技術的手段をさらに説明する。具体的な実施例は、本発明の保護範囲を制限するものではない。当業者が本発明の思想に基づいて加えた非本質的な修正及び調整も本発明の保護範囲に含まれる。
本発明において、「プライマー」又は「プローブ」とは、オリゴヌクレオチドを指し、標的分子（例えば、標的核酸断片）の少なくとも６つの連続したヌクレオチドの配列と相補的な領域を含む。いくつかの実施形態において、前記プライマー又はプローブの少なくとも一部の配列は、増幅される配列と相補的ではない。いくつかの実施形態において、プライマー又はプローブは、標的分子の少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９又は少なくとも２０個の連続したヌクレオチドの配列と相補的な領域を含む。プライマー又はプローブが「標的分子の少なくともｘ個の連続したヌクレオチドと相補」的な領域を含む場合、前記プライマー又はプローブは、標的分子の少なくともｘ個の連続又は非連続のブロック化ヌクレオチドの少なくとも９５％と相補的である。いくつかの実施形態において、プライマー又はプローブは、標的分子の少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％と相補的である。
本発明において、「正常」サンプルとは、前記がん又は腫瘍がないと知られている個体から単離された同じタイプのサンプルを指す。
本発明のメチル化検出サンプルは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ含有ＤＮＡ及びＲＮＡサンプル、又はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含むが、これらに限定されない。ＤＮＡ又はＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
本発明において、前記「被験体」は、哺乳動物、例えば、ヒトである。
本発明において、「メチル化レベル」は、「メチル化程度」と同義であり、通常、メチル化シトシンの百分率として表すことができ、メチル化シトシンの数をメチル化シトシンの数と非メチル化シトシンの数との和で割った値である。現在、一般的に、メチル化標的遺伝子の数を内部参照遺伝子の数で割る方法によりメチル化レベルを表している。従来技術においてメチル化レベルを表す他の方法を使用してもよい。
本発明において、「サンプル」は、「検体」と同義である。
本発明で使用されている用語「及び／又は」とは、是指并且涵盖１つ又は複数の関連する列挙項目の任意及び全ての可能な組み合わせを含むことを指す。２つ又は複数の項目のリストで使用される場合、用語「及び／又は」は、列挙項目のうちのいずれか１つを単独で使用することができ、又は２つ若しくは複数の列挙項目の任意の組み合わせを使用することができることを示す。例えば、組成物、組み合わせ、構造などが成分Ａ、Ｂ、Ｃ及び／又はＤを含む（又は包含する）として記述される場合、この組成物は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、Ｄ単独、ＡとＢの組み合わせ、ＡとＣの組み合わせ、ＡとＤの組み合わせ、ＢとＣの組み合わせ、ＢとＤの組み合わせ、ＣとＤの組み合わせ、ＡとＢとＣの組み合わせ、ＡとＢとＤの組み合わせ、ＡとＣとＤの組み合わせ、ＢとＣとＤの組み合わせ、又はＡとＢとＣとＤの組み合わせを含んで使用することができる。
実施例１
本発明者らは、組織サンプルにおいて、数百の遺伝子をスクリーニングし、β－アクチン遺伝子を内部標準遺伝子としてＨＯＸＢ４、ＳＲＣＩＮ１、ＰＣＤＨＧＡ１２、ＨＯＸＤ８遺伝子の２つずつの組み合わせの検出結果を比較した。各遺伝子検出プライマー及びプローブは、以下の通りである。
ＨＯＸＢ４の検出プライマー及びプローブ：
配列番号１ ＨＯＸＢ４－Ｆ１ プライマーＦ：ＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＡＴＣＡＴＴＣ
配列番号２ ＨＯＸＢ４－Ｒ１ プライマーＲ：ＴＡＣＴＡＡＣＣＧＣＣＴＣＧＣＴＡＣ
配列番号３ ＨＯＸＢ４－Ｐ１ プローブＰ：ＦＡＭ－ＣＧＧＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＴＴＡＴＴＣＧＴＣ－ＢＱ１
ＳＲＣＩＮ１の検出プライマー及びプローブ：
配列番号４ ＳＲＣＩＮ１ プライマーＦ：ＴＣＧＴＧＴＧＴＣＧＴＣＧＴＴＣＡＧＡＣ
配列番号５ ＳＲＣＩＮ１ プライマーＲ：ＧＡＡＡＴＡＣＣＣＧＣＧＡＡＡＡＴＡＣＴＧ
配列番号６ ＳＲＣＩＮ１ プローブＰ：ＦＡＭ－ＡＧＴＴＴＴＡＣＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＣＧＴＣＧＧ－ＢＱ１
ＰＣＤＨＧＡ１２の検出プライマー及びプローブ：
配列番号７ ＰＣＤＨＧＡ１２ プライマーＦ：ＴＴＧＧＴＴＴＴＴＡＣＧＧＴＴＴＴＣＧＡＣ
配列番号８ ＰＣＤＨＧＡ１２ プライマーＲ：ＡＡＡＴＴＣＴＣＣＧＡＡＡＣＧＣＴＣＧ
配列番号９ ＰＣＤＨＧＡ１２ プローブＰ：ＦＡＭ－ＡＴＴＣＧＧＴＧＣＧＴＡＴＡＧＧＴＡＴＣＧＣＧＣ－ＢＱ１
ＨＯＸＤ８の検出プライマー及びプローブ：
配列番号１０ ＨＯＸＤ８ プライマーＦ：ＴＴＡＧＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＴＡＧＣ
配列番号１１ ＨＯＸＤ８ プライマーＲ：ＣＣＴＡＡＡＡＣＣＧＡＣＧＣＧＡＴＣＴＡ
配列番号１２ ＨＯＸＤ８ プローブＰ：ＦＡＭ－ＡＡＡＡＣＴＴＡＣＧＡＴＣＧＴＣＴＡＣＣＣＴＣＣＧ－ＢＱ１
β－アクチンの検出プライマー及びプローブ：
配列番号１３ β－アクチン プライマーＦ：ＧＧＡＧＧＴＴＴＡＧＴＡＡＧＴＴＴＴＴＴＧＧＡＴＴ
配列番号１４ β－アクチン プライマーＲ：ＣＡＡＴＡＡＡＡＣＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴＡ
配列番号１５ β－アクチン プローブＰ：ＦＡＭ－ＴＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴ－ＢＱ１
実験過程
１、ＤＮＡ抽出
肺がんとして診断された患者のサンプル及び非肺がん患者のサンプル（それぞれパラフィン組織サンプル、喀痰サンプル、洗浄液サンプルを含む）を収集した。サンプルを前処理して細胞を分離した後、美基生物会社製のキット（ＨｉＰｕｒｅ ＦＦＰＥ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｄ３１２６－０３））の説明書に従ってＤＮＡを抽出した。
２、ＤＮＡ修飾
ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ生物会社製のキット（ＥＺ ＤＮＡ ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＴＭ ＫＩＴ（Ｄ５００２）の説明書に従って亜硫酸水素塩修飾を行った。
３、増幅と検出
Figure 2023527868000002
増幅系：遺伝子を検出する増幅系を表２、表３に示す。
Figure 2023527868000003
Figure 2023527868000004
４、検出結果
サンプル情報
肺組織サンプルは、合計１６９例あり、そのうち、正常組織サンプル９１例、がん組織サンプル７８例あり、７８例のがん群サンプルのうち、扁平上皮がん２７例、腺がん３８例、小細胞がん３例、大細胞がん４例、複合がん１例、明確に分類されていない肺がん５例あり、そのうち、腫瘍と腫瘍周辺対照サンプルが７７対ある。
ＡＣＴＢを内部標準遺伝子とし、標的遺伝子であるＨＯＸＢ４、ＳＲＣＩＮ１の△Ｃｐ値（△Ｃｐ値＝Ｃｐ標的遺伝子－ＣｐＡＣＴＢ）に基づいてサンプルのメチル化レベルを判断した。ＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１の閾値線は、それぞれ△Ｃｐ値＝５．４、△Ｃｐ値＝６．５であった。検出結果の中の１項が上記閾値よりも低い場合、陽性として判定され、検出結果の中の２項がいずれも対応する閾値以上である場合、陰性として判定され得る。
ＰＣＤＨＧＡ１２の閾値線は、Ｃｐ値＝２５．９であり、ＨＯＸＤ８の閾値線は、Ｃｐ値＝２７．４であった。各マーカーの検出結果が対応する閾値線以上である場合、陰性として判定され、マーカーの検出結果が対応する閾値線よりも低い場合、陽性として判定され得る。
全ての組織サンプルにおいてＨＯＸＢ４とＳＲＣＩＮ１の組み合わせ、ＨＯＸＢ４とＰＣＤＨＧＡ１２の組み合わせ、ＨＯＸＢ４とＨＯＸＤ８の組み合わせを検出して得られたＲＯＣ曲線を図１に示す。各遺伝子の組織における検出統計結果を表３に示す。
Figure 2023527868000005
上記結果から分かるように、組織サンプルにおけるＨＯＸＢ４とＳＲＣＩＮ１の組合せ検出では、正常群と全部がん群とを比較した結果、特異性は９７．８％、感度は８９．７％であり、他の２群の組合せ検出と比較して、ＨＯＸＢ４とＳＲＣＩＮ１の組合せ検出は、特異性が一致した場合、感度がより高かった。また、ＨＯＸＢ４とＳＲＣＩＮ１の組合せ検出は、ＨＯＸＢ４、ＳＲＣＩＮ１の単独検出と比較して、予想外に感度を顕著に向上させた。
以上の結果から分かるように、ＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１は組織サンプルにおいて、高特異性でありながら比較的高い感度を有した。特に組合せ検出により特異性にほぼ影響を与えずに感度を非常に大きく向上させた。喀痰は、非侵襲的な検出サンプルとして肺がんの診断上で重要な意味を持っている。そのため、本発明者らは、喀痰におけるＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１の２つのマーカーを検出した。
実施例２：喀痰におけるＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子の検出
サンプル情報：試験喀痰サンプルは、合計１０７例あり、そのうち、正常対照群サンプル５１例、がん群サンプル５６例あり、５６例のがん群サンプルには扁平上皮がん２０例、小細胞がん８例、腺がん２０例、大細胞がん１例、巨細胞がん１例、明確に分類されていない肺がん６例がある。
試験過程
ａ．肺がんとして診断された患者及び非肺がん患者の喀痰サンプルを収集し、ＮａＯＨで減粘した後、遠心分離して沈殿した細胞を取り、ＰＢＳで２回洗浄し、その後、美基生物（Ｍａｇｅｎ）会社のＤＮＡ抽出キット（ＨｉＰｕｒｅ ＦＦＰＥ ＤＮＡ Ｋｉｔ，Ｄ３１２６－０３）によりＤＮＡを抽出した。
ｂ．ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ生物会社のＤＮＡ変換キット（ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｄ５００２）によりＤＮＡの亜硫酸水素塩修飾を行った。
ｃ．各遺伝子マーカーのプライマー及びプローブ配列、反応液配合系、並びに増幅系は、実施例１と同様であった。
ｄ．標的遺伝子であるＨＯＸＢ４、ＳＲＣＩＮ１のＣｐ値に基づいてサンプルのメチル化レベルを判断し、ＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１の閾値線Ｃｐ値はそれぞれ３６．９及び３７．０であった。単一の遺伝子検出結果の中の１項が前記閾値よりも低い場合、陽性として判定され、検出結果の２つの結果がいずれも対応する閾値以上である場合、陰性として判定され得る。
ＰＣＤＨＧＡ１２、ＨＯＸＤ８：ＰＣＤＨＧＡ１２の閾値線は、Ｃｐ値＝２３．４８であり、ＨＯＸＤ８の閾値線は、Ｃｐ値＝２６．４であった。各マーカーの検出結果が対応する閾値線以上である場合、陰性として判定され、マーカーの検出結果が対応する閾値線よりも低い場合、陽性として判定され得る。
ｅ．検出結果は以下に示される。
Figure 2023527868000006
喀痰サンプルにおいてＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１を検出して得られたＲＯＣ曲線を図２に示し、統計結果を表４に示す。上記の結果から分かるように、喀痰サンプルにおいて、ＨＯＸＢ４とＳＲＣＩＮ１の組合せ検出では、正常群と全部がん群とを比較した結果、肺がんに対する感度は７６．８％に達し、正常群と全部小細胞がん群と比較した結果、感度は１００％に達した。単一の遺伝子マーカーに対して、ＨＯＸＢ４の検出率は６４．３％であり、ＳＲＣＩＮ１の検出率は４８．２％であり、両者の組合せ検出では、肺がんに対する感度は７６．８％まで向上し、両者は相乗効果を奏した。
実施例３：ＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のマルチプレックスＰＣＲ系の最適化
上記の結果により、ＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子の組合せ検出は、肺がんの検出率を顕著に向上できることが示されている。本発明者らは、マルチプレックスＰＣＲ方式によりＰＣＲ系を最適化することで検出プロセスを簡素化し、実施例２のサンプルをもとに検証した。各遺伝子の検出プライマー及びプローブは以下の通りである。
ＨＯＸＢ４、ＳＲＣＩＮ１及びβ－アクチンの検出プライマー及びプローブ配列は、実施例１と同様であった。
ａ．喀痰サンプルの処理は実施例２と同様であった。
ｂ．反応液配合系を下表に示す。
Figure 2023527868000007
ｃ．増幅系は実施例１の表２に示される増幅系と同様であった。
ｄ．標的遺伝子であるＨＯＸＢ４、ＳＲＣＩＮ１のマルチプレックスＰＣＲのＣｐ値に基づいてサンプルのメチル化レベルを判断した。ＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１のマルチプレックスＰＣＲにより検出された閾値線Ｃｐ値は３６．７であった。単一の遺伝子検出結果の中の１項が前記閾値よりも低い場合、陽性として判定され、検出結果が閾値以上である場合、陰性として判定され得る。
ｅ．検出結果を下表６に示す。
Figure 2023527868000008
結果から分かるように、ＨＯＸＢ４とＳＲＣＩＮ１のマルチプレックスＰＣＲ系の検出結果は、実施例２の検出結果とほぼ一致した。このマルチプレックスＰＣＲ系の検出結果は、ＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子組み合わせによる肺がん検出結果の判定として適用できることを示している。
実施例４：ＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子の洗浄液における検出
サンプル情報
試験肺胞洗浄液サンプルは、合計３８７例あり、そのうち、正常対照群サンプル３０３例、がん群対照サンプル８４例があり、８４例のがん群サンプルには、扁平上皮がん２１例、腺がん４０例、小細胞がん１０例、不明な肺がんタイプ１３例があった。
ＨＯＸＢ４、ＳＲＣＩＮ１、β－アクチンの検出プライマー及びプローブ配列は実施例１と同様であった。
試験過程
ａ．肺がんとして診断された患者及び非肺がん患者の肺胞洗浄液サンプルを収集し、細胞を遠心分離し、その後、美基生物会社製のＤＮＡ提取キット（ＨｉＰｕｒｅ ＦＦＰＥ ＤＮＡ Ｋｉｔ，Ｄ３１２６－０３）によりＤＮＡを抽出した。
ｂ．ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ生物会社のＤＮＡ変換キット（ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｄ５００２）によりＤＮＡの亜硫酸水素塩修飾を行った。
ｃ．反応液配合系及び増幅系は、実施例３と同様であった。
ｄ．検出結果は以下に示される。
ＡＣＴＢを内部標準遺伝子として標的遺伝子であるＨＯＸＢ４、ＳＲＣＩＮ１のＣｐ値及び△Ｃｐ値（△Ｃｐ値＝Ｃｐ標的遺伝子－ＣｐＡＣＴＢ）に基づいてサンプルのメチル化レベルを判断した。ＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１の閾値線は、Ｃｐ値＝３７．２であり、△Ｃｐ値＝９であった。検出結果の中の１項が上記閾値よりも低い場合、陽性として判定され、検出結果のうちの２項の結果がいずれも閾値以上である場合、陰性として判定された。３８７例の洗浄液サンプルの検出結果を下表に示す。
Figure 2023527868000009
全ての洗浄液サンプルにおいてＨＯＸＢ４とＳＲＣＩＮ１の組み合わせを検出した増幅曲線を図３に示し、統計結果を表７に示す。上記の結果から分かるように、ＨＯＸＢ４とＳＲＣＩＮ１の組合せ検出は、９６．０％の高特異性下で感度が７７．４％に達した。肺がんのサブタイプに応じて比較分析した結果、扁平上皮がん群ではＨＯＸＢ４とＳＲＣＩＮ１の組合せ検出の検出率は７１．４％であった。特に、腺がんに対する検出効果では、ＨＯＸＢ４とＳＲＣＩＮ１の組合せ検出の感度は７５．０％と高かった。これは、腺がんの検出に対して重大な意味を持っている。腺がんは、一般的に末梢型であり、気管支の木のような生理学的構造のため、肺胞洗浄液は、肺の深部にある肺胞又はがん組織に接触しにくい。
実施例５：異なるマーカー組み合わせの喀痰サンプルにおける検出結果
本発明者らは、異なるマーカー組み合わせの喀痰サンプルにおける検出状況を比較した。比較のグループは以下の通りである。
組み合わせ１：ＨＯＸＢ４＋ＳＲＣＩＮ１
組み合わせ２：ＨＯＸＢ４＋ＰＣＤＨＧＡ１２
組み合わせ３：ＳＲＣＩＮ１＋ＰＣＤＨＧＡ１２
組み合わせ４：ＨＯＸＢ４＋ＨＯＸＤ８
組み合わせ５：ＳＲＣＩＮ１＋ＨＯＸＤ８
組み合わせ６：ＳＲＣＩＮ１＋ＰＣＤＨＧＡ１２＋ＨＯＸＤ８
組み合わせ７：ＳＲＣＩＮ１＋ＨＯＸＢ４＋ＨＯＸＤ８
具体的な実験条件及び操作は実施例２と同様であった。
１０７例の喀痰サンプルにおいて異なるマーカーの組み合わせを検出した。正常対照群サンプルは５１例、がん群サンプルは５６例であり、各組み合わせの検出結果を表８に示す。
Figure 2023527868000010
表８の結果から分かるように、異なるマーカーの組み合わせは喀痰サンプルの肺がん検出率に対して比較的大きい影響を与えた。組み合わせ１、組み合わせ２、組み合わせ３、組み合わせ４及び組み合わせ５を分析した結果、異なるマーカーのペアごとの組み合わせ間の検出結果には違いが大きく、組み合わせ１では、ＨＯＸＢ４とＳＲＣＩＮ１を組み合わせて検出することにより、特異性は９２．２％、感度は７６．８％であり、総合的な検出性能は、他の４つの組み合わせよりも遥かに高かった。組み合わせ３、組み合わせ５、組み合わせ６又は組み合わせ１、組み合わせ７を分析した結果、マーカーを追加しても必ずしも検出率が向上するわけではなく、特異性の低下を招く可能性もある。結果から分かるように、いかなる遺伝子マーカーの組み合わせでも本発明の組み合わせ１のように感度、特異性及びＡＵＣの３つ指標の最適な総合的効果を得ることができるわけではない。予想外に、目的遺伝子マーカーの数を増加させて組合せ検出（例えば、組み合わせ６，７）したとしても、特異性及び感度は対応して向上しなかった。
実施例６：プライマー・プローブ組み合わせの選択
プライマー及びプローブも腫瘍マーカーの検出効果に対して極めて大きい影響を与える。本発明者らは、本発明の検出試薬が臨床検出に実際に適用できるように、検出感度及び特異性をできるだけ向上させるプローブ及びプライマーを探すために、研究の過程において複数ペアのプライマー及び対応するプローブを設計した。
４０例の喀痰サンプルにおいて異なるプライマー・プローブ組み合わせを検出した。ここで、正常対照群サンプルは１５例、がん群対照サンプルは２５例あった。
Figure 2023527868000011
各反応液配合系は一致し、反応液配合系、各増幅プロセスは一致し、増幅プロセスは実施例２と同様であった。
検出結果を表１０、１１に示す。
Figure 2023527868000012
Figure 2023527868000013
上記の結果から分かるように、同一領域の異なるプライマーペアは、検出結果に影響を与える。特異性が一致する場合、ＨＯＸＢ－Ｆ１、ＨＯＸＢ－Ｒ１、ＨＯＸＢ－Ｐ１及びＳＲＣＩＮ１－Ｆ１、ＳＲＣＩＮ１－Ｒ１、ＳＲＣＩＮ１－Ｐ１のプライマーとプローブの組み合わせは、感度がより高かった。

Claims (12)

  1. 遺伝子マーカー組成物であって、
    前記遺伝子マーカーは、ＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１を含む、遺伝子マーカー組成物。
  2. 肺がん検出試薬又はキットの製造における多遺伝子のメチル化組合せ検出試薬の使用であって、前記遺伝子は、ＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１を含む、使用。
  3. ＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化検出試薬を含む、多遺伝子メチル化組合せ検出試薬／キット。
  4. 前記多遺伝子メチル化組合せ検出試薬は、それぞれの遺伝子のメチル化検出プライマー及び／又はプローブを含み、
    選択的に、それぞれの遺伝子のＣｐＧアイランドに対して得られるプライマー及び／又はプローブを含み、
    選択的に、それぞれの遺伝子的遺伝子本体、遺伝子間領域、プロモーター領域又は前記プロモーター領域の近傍領域のＣｐＧアイランドに対して得られるプライマー及び／又はプローブを含むことを特徴とする、請求項２に記載の使用又は請求項３に記載の試薬。
  5. 前記ＨＯＸＢ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
    Ｉ：配列番号１、配列番号１６及び配列番号１９に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    ＩＩ：Ｉに示される配列の相補配列；
    のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
    及び／又は、前記ＨＯＸＢ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
    ＩＩＩ：配列番号２、配列番号１７及び配列番号２０に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    ＩＶ：ＩＩＩに示される配列の相補配列；
    のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
    及び／又は、前記ＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
    Ｖ：配列番号４及び配列番号２２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    ＶＩ：Ｖに示される配列の相補配列；
    のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
    及び／又は、前記ＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
    ＶＩＩ：配列番号５に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    ＶＩＩＩ：ＶＩＩに示される配列の相補配列；
    のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
    選択的に、前記ＨＯＸＢ４遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１及び配列番号２に示され、
    選択的に、前記ＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号４及び配列番号５に示され、
    選択的に、前記ＨＯＸＢ４遺伝子のメチル化検出プローブは、
    ＩＸ：配列番号３、配列番号１８及び配列番号２１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    Ｘ：ＩＸに示される配列の相補配列；
    のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
    及び／又は、前記ＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化検出プローブは、
    ＸＩ：配列番号６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    ＸＩＩ：ＸＩに示される配列の相補配列；
    のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項２に記載の使用又は請求項３に記載の試薬。
  6. 前記肺がんは、小細胞肺がん及び非小細胞肺がんから選択され、より好ましくは、前記非小細胞肺がんは、扁平上皮がん、腺がんから選択される請求項１に記載の遺伝子マーカー組成物、請求項２に記載の使用、又は請求項３に記載の試薬。
  7. 前記検出試薬の対象となる検出サンプルは、肺胞洗浄液、組織、胸水、喀痰、血液、血清、血漿、尿液、前立腺液又は糞便から選択される少なくとも１種であり、
    好ましくは、前記サンプルは、肺胞洗浄液、組織、喀痰から選択される少なくとも１種であり、
    より好ましくは、前記サンプルは、肺胞洗浄液又は喀痰から選択される少なくとも１種である請求項１に記載の遺伝子マーカー組成物、請求項２に記載の使用、又は請求項３に記載の試薬。
  8. 肺がん検出システムであって、
    前記システムは、
    (１）ＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化組合せ検出部と、
    (２）データ処理部と、
    (３）結果出力部と、
    を含み、
    好ましくは、前記メチル化検出部は、メチル化検出機器を含み、
    好ましくは、前記メチル化検出機器は、蛍光定量ＰＣＲ装置、ＰＣＲ装置、シーケンサーのうちの１種又は複数種を含み、
    好ましくは、前記データ処理部は、データ処理装置を含み、
    好ましくは、前記データ処理装置は、計算器及びコンピュータのうちの１種又は複数種を含み、
    好ましくは、前記コンピュータは、ＳＰＳＳ、ＳＡＳ、Ｅｘｃｅｌのうちの１種又は複数種のソフトウェアが搭載されたコンピュータを含み、
    好ましくは、前記結果出力部は、結果出力装置を含み、
    好ましくは、前記結果出力装置は、スクリーン及び紙報告書のうちの１種又は複数種を含み、
    好ましくは、前記メチル化検出部は、請求項３から５のいずれか１項に記載の多遺伝子のメチル化組合せ検出試薬をさらに含み、
    好ましくは、前記データ処理部は、ａ．検出サンプル及び正常対照サンプルのテストデータを受信し、ｂ．検出サンプル及び正常対照サンプルのテストデータを記憶し、ｃ．同じタイプの検出サンプルと正常対照サンプルのテストデータを比較し、ｄ．比較結果に基づいて被験体が肺がんに罹患する確率又は可能性を判断するように構成され、
    好ましくは、前記結果出力部は、被験体が肺がんに罹患する確率又は可能性を出力するものであり、
    好ましくは、前記データ処理部の判断標準では、結果に基づいて検出サンプルと正常サンプルとのメチル化結果を比較し、検出サンプルと正常サンプルとのメチル化に顕著な違い又は極めて顕著な違いがある場合、結果として検出サンプルの罹患リスクが高いと判断されることを特徴とする、肺がん検出システム。
  9. 前記肺がんは、小細胞肺がん及び非小細胞肺がんから選択され、より好ましくは、前記非小細胞肺がんは、扁平上皮がん、腺がんから選択されることを特徴とする、請求項７に記載の肺がん検出システム。
  10. 前記検出システムの対象となる検出サンプルは、肺胞洗浄液、組織、胸水、喀痰、血液、血清、血漿、尿液、前立腺液又は糞便から選択される少なくとも１種であり、
    好ましくは、前記サンプルは、肺胞洗浄液、組織、喀痰から選択される少なくとも１種であり、
    より好ましくは、前記サンプルは、肺胞洗浄液又は喀痰から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項７に記載の肺がん検出システム。
  11. 以下のステップ（１）から（３）を含む肺がんの診断方法であって、
    ステップ（１）：被験体に由来の検出サンプルにおけるＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化レベルを検出し、
    ステップ（２）：検出サンプルと正常対照サンプルとのＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化レベルを比較し、
    ステップ（３）：検出サンプルと正常対照サンプルとのメチル化レベルのずれに基づいて肺がんを診断し、
    選択的に、メチル化特異的定量ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）によりＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化レベルを検出し、
    選択的に、前記ステップ（１）において、前記検出は、被検体の検出サンプルと、ＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化レベルの検出試薬とを接触させることを含み、
    選択的に、結果に基づいて検出サンプルと正常サンプルとのメチル化結果を比較し、検出サンプルと正常サンプルとのメチル化に顕著な違い又は極めて顕著な違いがある場合、結果として検出サンプルの罹患リスクが高いと判断され、
    選択的に、前記検出サンプルは、肺胞洗浄液、組織、胸水、喀痰、血液、血清、血漿、尿液、前立腺液及び糞便から選択される少なくとも１種であり、
    選択的に、前記サンプルは、肺胞洗浄液、喀痰、組織から選択される少なくとも１種であり、
    選択的に、前記サンプルは、肺胞洗浄液又は喀痰から選択される少なくとも１種であり、
    選択的に、前記肺がんは、小細胞肺がん及び非小細胞肺がんから選択され、
    選択的に、前記非小細胞肺がんは、扁平上皮がん、腺がんから選択され、
    選択的に、前記ステップ（１）において、多遺伝子メチル化組合せ検出試薬によりＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化レベルを検出し、前記組合せ検出試薬は、それぞれの遺伝子のメチル化検出プライマー及び／又はプローブを含み、
    選択的に、それぞれの遺伝子のＣｐＧアイランドに対して得られるプライマー及び／又はプローブを含み、
    選択的に、それぞれの遺伝子の遺伝子本体、遺伝子間領域、プロモーター領域又は前記プロモーター領域の近傍領域のＣｐＧアイランドに対して得られるプライマー及び／又はプローブを含み、
    選択的に、前記ＨＯＸＢ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
    Ｉ：配列番号１、配列番号１６及び配列番号１９に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    ＩＩ：Ｉに示される配列の相補配列；
    のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
    及び／又は、前記ＨＯＸＢ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
    ＩＩＩ：配列番号２、配列番号１７及び配列番号２０に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    ＩＶ：ＩＩＩに示される配列の相補配列；
    のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
    及び／又は、前記ＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
    Ｖ：配列番号４及び配列番号２２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    ＶＩ：Ｖに示される配列の相補配列；
    のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
    及び／又は、前記ＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
    ＶＩＩ：配列番号５に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    ＶＩＩＩ：ＶＩＩに示される配列の相補配列；
    のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
    選択的に、前記ＨＯＸＢ４遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１及び配列番号２に示され、
    選択的に、前記ＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号４及び配列番号５に示され、
    選択的に、前記ＨＯＸＢ４遺伝子のメチル化検出プローブは、
    ＩＸ：配列番号３、配列番号１８及び配列番号２１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    Ｘ：ＩＸに示される配列の相補配列；
    のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
    及び／又は、前記ＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化検出プローブは、
    ＸＩ：配列番号６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    ＸＩＩ：ＸＩに示される配列の相補配列；
    のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、診断方法。
  12. 以下のステップ（１）から（４）を含む肺がんの治療方法であって、
    (１）被験体に由来の検出サンプルにおけるＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化レベルを検出し、
    (２）検出サンプルと正常対照サンプルとのＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化レベルを比較し、
    (３）検出サンプルと正常対照サンプルとのメチル化レベルのずれに基づいて肺がんを診断し、
    (４）肺がんとして診断された被検体に肺がん治療薬を投与し、
    選択的に、メチル化特異的定量ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）によりＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化レベルを検出し、
    選択的に、結果に基づいて検出サンプルと正常サンプルとのメチル化結果を比較し、検出サンプルと正常サンプルとのメチル化に顕著な違い又は極めて顕著な違いがある場合、結果として検出サンプルの罹患リスクが高いと判断され、
    選択的に、メチル化特異的定量ＰＣＲにより遺伝子のメチル化レベルを検出し、
    選択的に、前記検出サンプルは、肺胞洗浄液、組織、胸水、喀痰、血液、血清、血漿、尿液、前立腺液又は糞便から選択される少なくとも１種であり、
    選択的に、前記サンプルは、肺胞洗浄液、喀痰、組織から選択される少なくとも１種であり、
    選択的に、前記サンプルは、肺胞洗浄液又は喀痰から選択される少なくとも１種であり、
    選択的に、前記肺がんは、小細胞肺がん及び非小細胞肺がんから選択され、
    選択的に、前記非小細胞肺がんは、扁平上皮がん、腺がんから選択され、
    選択的に、前記ステップ（１）において、多遺伝子メチル化組合せ検出試薬によりＨＯＸＢ４及びＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化レベルを検出し、前記組合せ検出試薬は、それぞれの遺伝子のメチル化検出プライマー及び／又はプローブを含み、
    選択的に、それぞれの遺伝子のＣｐＧアイランドに対して得られるプライマー及び／又はプローブを含み、
    選択的に、それぞれの遺伝子の遺伝子本体、遺伝子間領域、プロモーター領域又は前記プロモーター領域の近傍領域のＣｐＧアイランドに対して得られるプライマー及び／又はプローブを含み、
    選択的に、前記ＨＯＸＢ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
    Ｉ：配列番号１、配列番号１６及び配列番号１９に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    ＩＩ：Ｉに示される配列の相補配列；
    のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
    及び／又は、前記ＨＯＸＢ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
    ＩＩＩ：配列番号２、配列番号１７及び配列番号２０に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    ＩＶ：ＩＩＩに示される配列の相補配列；
    のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
    及び／又は、前記ＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
    Ｖ：配列番号４及び配列番号２２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    ＶＩ：Ｖに示される配列の相補配列；
    のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
    及び／又は、前記ＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
    ＶＩＩ：配列番号５に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    ＶＩＩＩ：ＶＩＩに示される配列の相補配列；
    のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
    選択的に、前記ＨＯＸＢ４遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１及び配列番号２に示され、
    選択的に、前記ＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号４及び配列番号５に示され、
    選択的に、前記ＨＯＸＢ４遺伝子のメチル化検出プローブは、
    ＩＸ：配列番号３、配列番号１８及び配列番号２１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    Ｘ：ＩＸに示される配列の相補配列；
    のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
    及び／又は、前記ＳＲＣＩＮ１遺伝子のメチル化検出プローブは、
    ＸＩ：配列番号６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    ＸＩＩ：ＸＩに示される配列の相補配列；
    のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、治療方法。
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