ES2842205T3 - Integración de la purificación del ADN y la medición de su metilación y la medición conjunta de mutaciones y/o niveles de expresión de ARNm en un cartucho de reacción automático - Google Patents

Integración de la purificación del ADN y la medición de su metilación y la medición conjunta de mutaciones y/o niveles de expresión de ARNm en un cartucho de reacción automático

Info

Publication number
ES2842205T3
ES2842205T3 ES16732159T ES16732159T ES2842205T3 ES 2842205 T3 ES2842205 T3 ES 2842205T3 ES 16732159 T ES16732159 T ES 16732159T ES 16732159 T ES16732159 T ES 16732159T ES 2842205 T3 ES2842205 T3 ES 2842205T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cartridge
dna
methylation
chamber
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16732159T
Other languages
English (en)
Inventor
Edwin W Lai
Andrew Kohlway
Reuel Vanatta
Russell Higuchi
Alexander Gall
Kriszten Kocmond
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cepheid
Original Assignee
Cepheid
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=56204035&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2842205(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Cepheid filed Critical Cepheid
Application granted granted Critical
Publication of ES2842205T3 publication Critical patent/ES2842205T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/087—Multiple sequential chambers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Un cartucho para determinar el estado de metilación de un ácido nucleico, dicho cartucho comprende: (i) una primera columna que comprende un primer material de matriz, (ii) una cámara de recepción de muestras, (iii) un canal o cámara de temperatura controlada, (iv) una pluralidad de cámaras que contienen reactivos y/o tampones, y en donde cuando el cartucho está en uso, al menos una de dichas cámaras contiene un reactivo bisulfito, y al menos una de dichas cámaras contiene un tampón de desulfonación/elución, en donde dicho cartucho opcionalmente comprende una segunda columna que comprende un segundo material de matriz, en donde dicha cámara de recepción de muestras, dicha primera y segunda columna(s) opcional(es), dicha pluralidad de cámaras y dicho canal o cámara de calentamiento de temperatura controlada, están selectivamente en comunicación de fluidos mediante canales y válvulas microfluídicos.

Description

DESCRIPCIÓN
Integración de la purificación del ADN y la medición de su mutilación y la medición conjunta de mutaciones y/o niveles de expresión de ARNm en un cartucho de reacción automático
Antecedentes
Los genomas de los eucariotas superiores contienen el nucleósido modificado 5-metil citosina (5-meC). Esta modificación usualmente se encuentra como parte del dinucleótido CpG en el cual la citosina se convierte en 5-metilcitosina en una reacción que implica cambiar una citosina diana desde una doble hélice intacta y la transferencia de un grupo metilo de S-adenosilmetionina por una enzima metiltransferasa (ver, p. ej., Klimasauskas y otros (1994) Cell 76: 357-369). Esta conversión enzimática es la modificación epigenética primaria del ADN que se sabe que existe en los vertebrados y es esencial para el desarrollo embrionario normal (ver, por ejemplo, Bird (1992) Cell 70: 5-8; Laird y Jaenisch (1994) Human Mol. Genet. 3: 1487-1495; y Li y otros. (1992) Cell 69: 915-926).
En eucariotas, la metilación del ADN regula los procesos celulares normales tales como la impronta genómica, la inestabilidad cromosómica y la inactivación del cromosoma X. Típicamente, la metilación del ADN se produce en la posición del quinto carbono de la citosina en los sitios dinucleótidos 5'-CpG-3' en o cerca de los promotores de genes denominados islas o costas CpG. La metilación controla la expresión génica al regular negativamente la transcripción, ya sea al inhibir directamente la maquinaria transcripcional o indirectamente a través del reclutamiento de proteínas remodeladoras de la cromatina. Los patrones de metilación cromosómica cambian dinámicamente durante el desarrollo embrionario y los patrones de metilación correctos deben mantenerse durante toda la vida de un individuo. Los cambios en los patrones de metilación están relacionados con el envejecimiento, y los errores en la metilación del ADN se encuentran entre los primeros cambios que ocurren durante la oncogénesis. Así, la detección de metilación en los promotores de genes es importante, entre otros, para el diagnóstico y/o el monitoreo de pacientes con cáncer.
Las alteraciones epigenéticas, incluida la metilación del ADN, interrumpen el eje ADN-ARN-proteína que describe cómo se transcribe la información genética en ARN mensajeros (ARNm). La correlación entre la variación del ADN genómico, el número de copias de ARNm y los niveles de proteínas puede describirse mediante los niveles de metilación del ADN. Así, la medición conjunta de los niveles de metilación del ADN y los correspondientes niveles de ARNm aguas abajo pueden ser importantes para comprender el mecanismo de regulación celular epigenética.
Se han desarrollado varios métodos para detectar y cuantificar la metilación de manera eficiente y precisa. La técnica más común es el método de conversión de bisulfito que convierte las citosinas no metiladas en uracilo. Una vez convertido, el perfil de metilación del ADN puede determinarse mediante técnicas de PCR estándar, métodos de secuenciación y similares.
Hay varios estuches de metilación de ADN adecuados para la conversión de bisulfito y la limpieza del ADN (p. ej., Kits EZ DNA Methylation™ de Zymo Research). La mayoría de los estuches implican varias etapas, reactivos y tiempos de incubación y, a menudo, requieren ADN purificado antes de la conversión, aunque algunos estuches pueden usar tejido o plasma/suero como material de partida.
Típicamente, el proceso de conversión de bisulfito requiere al menos cuatro etapas: 1) Desnaturalización del ADN; 2) Incubación con bisulfito; 3) Purificación de ADN; y 4) Desulfonación. La etapa final de desulfonación puede completarse en columna o en solución seguida de una precipitación con etanol. Actualmente no existen estuches de metilación que permitan al usuario completar todo el proceso- purificación de ADN, incubación con bisulfito, desulfonación, segunda purificación de ADN y PCR específica de metilación, todo en una sola etapa.
El documento núm. Wo 98/56952 A1 describe un método de diagnóstico de cáncer basado en diferencias de metilación de ADN en sitios CpG específicos. El método comprende el tratamiento del ADN con bisulfito, seguido de la extensión del cebador de un solo nucleótido sensible a la metilación para la determinación del estado de metilación específico de la cadena en los residuos de citosina.
Nucleic Acids Res 1994, 22, 2990-2997 describe una técnica de secuenciación genómica que es capaz de detectar cada citosina metilada en ambas cadenas de una secuencia diana. El bisulfito de sodio se usa para convertir residuos de citosina en residuos de uracilo en el ADN monocatenario, que se amplifica con cebadores específicos y se secuencia. Nucleic Acids Res 2005, 33, 5868-5877 describe la secuenciación de bisulfito de representación reducida (RRBS) para analizar y comparar patrones de metilación genómica.
El documento núm. Wo 2004/096825 A1 describe métodos para tratar ácidos nucleicos, el método puede incluir las etapas de (a) proporcionar un entorno desnaturalizante a una muestra de ácido nucleico; (b) hacer reaccionar la muestra de ácido nucleico con un reactivo bisulfito e incubar la reacción; (c) diluir la muestra de ácido nucleico tratada; (d) precipitar el ácido nucleico tratado diluido; y (e) llevar a cabo la desulfonación del ácido nucleico tratado precipitado.
El documento núm. WO 2009/024019 A1 describe métodos y composiciones para producir moldes de ADN adecuados para modificaciones químicas y secuenciación de ADN bisulfito de alto rendimiento.
Clin. Chem. 2010, 56, 1022-1025 describe la metilación en perlas (MOB) que es una técnica que integra extracción de ADN, conversión de bisulfito y PCR en un solo tubo mediante el uso de perlas superparamagnéticas de sílice (SSB). PLOS ONE 2014, 9, e93933 describe un estudio del rendimiento de estuches para análisis de metilación del ADN, incluido el estuche innuCONVERT Bisulfite All-In-One.
El documento núm. WO 2007/068437 A1 describe un método para realizar una reacción de bisulfito para determinar las posiciones de metilación en un ácido nucleico.
Transducers & Eurosensors XXVII 2013, 2181-2184 describe un cartucho de gotitas autónomo accionado magnéticamente para el tratamiento del ADN genómico con bisulfito.
El documento núm. WO 00/73412 A2 describe un cartucho para separar un analito deseado de una muestra de fluido. El documento núm. US 2014/272997 A1 describe un dispositivo para aislar ADN de una muestra que contiene células. Además, se describen sistemas y métodos para aislar a Dn de una muestra que contiene células y sistemas y métodos para amplificar y aislar ADN monocatenario de una muestra que contiene ADN.
El documento núm. WO 99/33559 A1 describe un cartucho de manipulación de fluidos para separar un analito deseado, tal como un ácido nucleico, de una muestra de fluido
Los documentos núms. WO 2006/136990 A2 y WO 2007/004103 A1 describen un cartucho para la detección de la presencia, ausencia y/o cantidad de una secuencia de nucleótidos diana en una muestra que comprende una o más secuencias de ácido nucleico.
El documento núm. EP 2 218 793 A1 describe un método para cuantificar el alelo metilado del ADN promotor de 06-metilguanina-ADN metiltransferasa (MGMT) en células cancerosas.
Cancer Res. 1997, 57, 3672-3677 describe que, en células Mer-, el promotor MGMT contiene puntos calientes de metilación de CpG específicos que están estrechamente ligados y son marcadores potenciales del silenciamiento génico. Cancer Res. 1999, 59, 67-70 describe la detección de la hipermetilación del promotor aberrante de los genes supresores de tumores en el cáncer de pulmón de células no pequeñas.
Mol. Cell Bio. 1997, 17, 5612-5619 describe que regiones discretas de la isla MGMT CpG están asociadas con el silenciamiento del gen.
El documento núm. WO 2014/052551 A1 describe métodos y reactivos para la extracción de ácidos nucleicos de una muestra fijada incluida en parafina.
J. Clin. Pathol. 2009, 62, 715-723 describe un ensayo de PCR específico de metilación para la detección de metilación de MGMT en linfoma difuso de células B grandes
Resumen
La presente invención proporciona un cartucho para determinar el estado de metilación de un ácido nucleico, dicho cartucho comprende:
(i) una primera columna que comprende un primer material de matriz,
(ii) una cámara de recepción de muestras,
(iii) un canal o cámara de temperatura controlada,
(iv) una pluralidad de cámaras que contienen reactivos y/o tampones, y
en donde cuando el cartucho está en uso, al menos una de dichas cámaras contiene un reactivo bisulfito,
y al menos una de dichas cámaras contiene un tampón de desulfonación/elución, en donde dicho cartucho opcionalmente comprende una segunda columna que comprende un segundo material de matriz,
en donde dicha cámara de recepción de muestras, dicha primera y segunda columna(s) opcional(es), dicha pluralidad de cámaras y dicho canal o cámara de calentamiento de temperatura controlada, están selectivamente en comunicación de fluidos mediante canales y válvulas microfluídicos.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A ilustra los componentes principales de un cartucho (por ejemplo, un cartucho GENEXPERT®) adecuado para su uso con los métodos descritos en la presente descripción. La figura 1B muestra una vista superior del cartucho que ilustra cámaras dispuestas alrededor de una válvula central. La figura 1C muestra un flujo de trabajo ilustrativo para la determinación de la metilación del ADN mediante el uso del cartucho de reacción.
La Figura 2, paneles A-C, ilustra una modalidad de un cartucho GENEXPERT® adecuado para la determinación de la metilación del ADN como se describe en la presente descripción.
Las Figuras 3A-3C muestran modalidades ilustrativas, pero no limitantes de los módulos y sistemas (por ejemplo, unidades de procesamiento) para la determinación de la metilación del ADN. La figura 3A ilustra un módulo para el funcionamiento de un cartucho GENEXPERT®. La figura 3B ilustra algunos componentes de una modalidad de un módulo para el funcionamiento de un cartucho para el análisis de la metilación del ADN. La Figura 3C ilustra un sistema (p. ej., unidad de procesamiento) que incorpora una pluralidad de módulos.
Las Figuras 4A-4D ilustran diversas estrategias para el uso de protocolos MethyLight para detectar/cuantificar la fosforilación del ADN. La Figura 4A, modificada de Eads y otros 92000) Nucleic Acids. Res., 28 (8): e32) ilustra esquemáticamente la tecnología MethyLight. El ADN es modificado por bisulfito de sodio que genera diferencias de secuencia dependientes de metilación, p. ej., en dinucleótidos CpG mediante la conversión de residuos de citosina no metilados (ubicaciones indicadas por círculos blancos) en uracilo, mientras que los residuos de citosina metilados (ubicaciones indicadas por círculos negros) se retienen como citosina. A continuación, se realiza una PCR basada en fluorescencia con cebadores que se superponen con los sitios de metilación o que no se superponen con ningún sitio de metilación. La discriminación de secuencia puede ocurrir ya sea a nivel del proceso de amplificación de PCR (panel D) o a nivel del proceso de hibridación de la sonda (panel B), o ambos. La discriminación de la secuencia en el nivel de amplificación por PCR usa cebadores y sondas (panel D), o solo cebadores (panel C), para superponer los sitios de mutilación potenciales (por ejemplo, Dinucleótidos CpG). Solo se muestran dos (completamente metiladas (M) y completamente no metiladas (U)) de las muchas permutaciones teóricas de metilación. El ensayo MethyLight puede, además, diseñarse de manera que no se produzca discriminación de secuencia en el nivel de amplificación por PCR. Si ni los cebadores ni la sonda se superponen con los sitios de metilación (p. ej., dinucleótidos CpG) (panel A), entonces no ocurre discriminación de secuencia dependiente de metilación en el nivel de amplificación por PCR o hibridación de sonda. Esta reacción representa la amplificación del ADN genómico convertido sin sesgo al estado de metilación, que puede servir como control de la cantidad de ADN de entrada. Cuando solo la sonda se superpone a los sitios de metilación (panel B), la discriminación de secuencia puede ocurrir a través de la hibridación de la sonda. La figura 4B ilustra un enfoque de MethyLight mediante el uso de una sola p. ej., sonda específica de metilación (PR3) junto con cebadores directos (FW) e inversos (RV) específicos de metilación. La Figura 4C ilustra un enfoque de MethyLight mediante el uso de múltiples sondas (PR1... PR5) que cada una tiene como diana diferentes regiones. La Figura 4D ilustra un enfoque de MethyLight mediante el uso de múltiples sondas (PR1... PR5) que cada una tiene como diana la misma región, pero proporciona señales para diferentes patrones de metilación.
La Figura 5 ilustra los resultados de un ensayo GeneXpert representativo de 300 ng de HGDNA que muestra una curva ACTB de qPCR y una curva HMBS de qPCR.
Las Figuras 6A y 6B ilustran los resultados de una titulación para conversión de bisulfito ACTB mediante el uso de ADN genómico humano (hgDNA) en una qPCR anidada de 15 ciclos (Figura 6A) y una qPCR anidada de 20 ciclos (Figura 6B).
Las Figuras 7A-7C muestran el resultado de 20 ciclos de qPCR anidada (en el cartucho) para seis dianas metiladas (AKR1B1, HOXB4, TM6SF1, RAASGRF2, y RASSF1A). La Figura 7A muestra los resultados para 25 ng de HSDNA o 5000 células sin conversión de bisulfito. La Figura 7B muestra los resultados de 20 ciclos de qPCR anidada para las dianas metiladas convertidas con bisulfito mediante el uso de ADN de células MBA-453. La Figura 7C muestra los resultados de 20 ciclos de qPCR anidada para las dianas metiladas convertidas con bisulfito mediante el uso de ADN de células MBA-453 en un portador (1 |jg de SS y 10 ng de ADN de HS). Las precipitaciones se producen alrededor de las 25-50 copias o alrededor de 100 células.
La Figura 8 ilustra los resultados de una determinación de la eficiencia de conversión. La eficiencia de conversión es aproximadamente 66 % (~1 Ct) de la diferencia entre HMBS no convertido y ACTB convertido.
La Figura 9 ilustra el aumento de la especificidad por el ADN convertido producido por qPCR anidada.
La Figura 10 ilustra la especificidad del cartucho de metilación. No hay descebado del ADN no convertido (panel superior) o del ADN no metilado (panel inferior) excepto para HIST1H3C.
La Figura 11 muestra flujos de trabajo ilustrativos pero no limitantes para el análisis de metilación mediante el uso de un cartucho (por ejemplo, un cartucho GENEXPERT®). Arriba se ilustra un flujo de trabajo para el análisis de la metilación del ADN en una muestra de suero o plasma. La parte inferior ilustra un flujo de trabajo para el análisis de la metilación del ADN en una sección de tejido (por ejemplo, sección congelada o incluida en parafina fijada con formalina (FFPE)).
La Figura 12 ilustra los resultados de un botón de células FFPE para ALU (azul) convertido y RASSF1A metilado (gris).
La Figura 13A ilustra un diseño de cartucho y la Figura 13B ilustra un diagrama de flujo del protocolo usado en el Ejemplo 4.
La Figura 14 ilustra una corrida en la que algunas muestras contienen contaminación por bisulfito.
La Figura 15A ilustra los resultados de 1000 células MBA-453 con conversión de bisulfito. La Figura 15B ilustra los resultados de 25 ng de control de ADN HS.
La Figura 16 ilustra la estructura de DABSO (1,4-diazoniabiciclo[2.2.2]octano-1,4-disulfinato).
La Figura 17 ilustra una modalidad de un cartucho de preparación de muestras de ADNcf. El cartucho es eficaz para el aislamiento de ADN y ARN. El cartucho proporciona tres lavados con GTC-etanol (los lavados con GTC-etanol son típicamente tiocianato de guanidinio 1,25 M, Tris 25 mM pH 7,0, etanol al 50 %), un enjuague PEG200 y una elución de KOH 15 mM.
La Figura 18 ilustra los controles para la extracción de ADNcf.
La Figura 19A muestra una comparación de la preparación de ADNcf mediante el uso de un cartucho de preparación de muestras como se describe en la presente descripción en comparación con un tubo de llenado estándar (es decir estuche a base de tubos). El rendimiento de la preparación con cartucho es muy comparable al obtenido mediante el uso del método de llenado de tubos. La Figura 19B muestra una comparación de la cantidad de ADN extraído detectado mediante el uso de una limpieza de ADN basada en cartucho en comparación con un llenado de tubo estándar en función de la cantidad de ADN. El método basado en cartuchos está de manera conservadora dentro de 1 Ct de los métodos de llenado de tubos y se cree que está más cerca con una mayor concentración de ADN.
La Figura 20A ilustra una modalidad de un cartucho de preparación de muestras de alto volumen (HVSP) (p. ej., hasta 12 ml) que puede usarse con un cartucho de qPCR y/o con un cartucho de detección de metilación. La Figura 20B ilustra esquemáticamente una variación de los flujos de trabajo en el cartucho HVSP cuando se usa en combinación con un cartucho de qPCR para realizar un análisis de metilación.
La Figura 21 ilustra la detección de HBMS o p-globina mediante el uso de una limpieza de dos cartuchos mediante el uso de un cartucho de preparación de muestras de alto volumen (ver, por ejemplo, Figura20) donde la muestra se transfiere desde el cartucho de alto volumen al cartucho de análisis de PCR en comparación con la detección mediante el uso de una muestra aplicada a un solo cartucho de análisis de PCR, lo que da como resultado menos volumen de muestra.
La Figura 22 ilustra los resultados de la conversión de bisulfito mediante el uso de múltiples etapas de calentamiento (panel inferior) en comparación con una sola etapa de calentamiento (panel superior).
La Figura 23A ilustra las etapas y el tiempo de trabajo para un análisis de metilación mediante el uso de un estuche de purificación de ADN estándar de Qiagen combinado con un estuche de metilación de ADN Zymo (derecha) en comparación con un análisis de metilación mediante el uso de un cartucho de análisis de metilación descrito en la presente descripción. La Figura 23B muestra una comparación de los resultados obtenidos mediante el uso de los dos protocolos diferentes.
La Figura 24 muestra una comparación de la conversión de ADN mediante el uso de DABSO como reactivo de conversión en comparación con la conversión de ADN mediante el uso del reactivo Zymo de conversión de bisulfito.
La Figura 25, paneles A y B, ilustra la sensibilidad de detección de ADN metilado. El panel A muestra una serie de diluciones de ADN metilado (MGMT). El panel B ilustra la sensibilidad de detección de marcadores de cáncer de páncreas metilados.
La Figura 26 ilustra los resultados de un ensayo en formato múltiple de complemento inverso para ambas cadenas.
La Figura 27A ilustra la detección de ADN metilado y mutaciones en el mismo cartucho. El panel superior ilustra la detección de ADN metilado y una mutación de Kras G12D en un cartucho, mientras que el panel inferior ilustra la detección de ADN metilado y Kras de tipo silvestre en un cartucho. La Figura 27B ilustra la detección de ADN metilado y mutaciones I en el mismo cartucho en dos líneas celulares de cáncer de páncreas: Células PANC-1 (panel superior) y células MIA-PaCa (panel inferior).
La Figura 28 ilustra la optimización de la temperatura para el análisis de metilación en formato múltiple de ADAMTSIy BNC1 de una cadena directa (arriba) y una cadena inversa (abajo) de ADN convertido con bisulfito.
La Figura 29 ilustra la capacidad de hacer en formato múltiple los conjuntos de cebadores y sondas MSP para BNC1, ADAMTSIy un gen control ACTB. Las sondas se combinaron en dos conjuntos según las condiciones preferidas.
La Figura 30 ilustra un conjunto de cebadores y sondas usados para la detección de la metilación de MGMT. Interno directo 22150 (SEQ ID NO: 266); Externo directo 22422 (SEQ ID NO: 263); Sonda 22419 (SEQ ID NO: 268), Interno reverso 22151 (SEQ ID NO: 267); externo reverso 22423 (SEQ ID NO: 265); molde (SEQ ID NO: 1).
La Figura 31 muestra los resultados de una comparación entre la pirosecuenciación de bisulfito y un cartucho de metilación MGMT para el ADN extraído (arriba) y para una muestra de FFPET (abajo).
La Figura 32 ilustra BRCA1 optimización del conjunto de cebadores y sondas de ACt entre ADN convertido metilado y no metilado convertido.
La Figura 33 ilustra un ensayo de una diana para la metilación de BRCA1 probado con el gen control ACTB. Como se muestra, se probaron ocho líneas celulares diferentes y se comparó el efecto de agregar NH4.
La Figura 34 ilustra los resultados de un ensayo de metilación de tres dianas para genes cuya metilación está asociada con el cáncer de pulmón (SOX17, CD01, TAC1) en un fondo de plasma normal y en tres líneas celulares diferentes de cáncer de pulmón.
Definiciones
Para facilitar una comprensión de la presente invención, más abajo se definen un número de términos y frases:
Como se usa en la presente descripción, los términos "detectar", o "detección" pueden describir el acto general de descubrir o discernir o la observación específica de una composición marcada de manera detectable.
Como se usa en la presente descripción, el término "detectablemente diferente" o "espectralmente distinguible" se refiere a un conjunto de marcadores (tales como colorantes/fluoróforos) que pueden detectarse y distinguirse simultáneamente.
La metilación del ADN se refiere a la adición de un grupo metilo (CH3) de manera covalente a la base citosina (C) típicamente en el dinucleótido 5'-CpG-3'. El término CpG se refiere a la base citosina (C) unida por un enlace fosfato a la base guanina (G) en la secuencia de nucleótidos del ADN.
El término "reactivo de conversión" se refiere a un reactivo que desamina la citosina a uracilo en el ADN monocatenario, mientras que deja el 5-MeC esencialmente intacto. Los reactivos de conversión ilustrativos incluyen bisulfitos (p. ej., metabisulfito de sodio, bisulfito de potasio, bisulfito de cesio, bisulfito de amonio, etc.) y/o compuestos que pueden producir un bisulfito en condiciones de reacción apropiadas (p. ej., DABSO).
La frase "detectar la metilación de un gen" generalmente se refiere a la detección de la metilación de citosina, típicamente en islas CPG, en la región promotora del gen.
Como se usa en la presente descripción, los términos "paciente" y "sujeto" se usan típicamente de manera intercambiable para referirse a un ser humano. En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse en muestras de animales no humanos, p. ej., un primate no humano, canino, equino, felino, porcino, bovino, lagomorfo y similares.
Como se usa en la presente descripción, los términos "oligonucleótido", "polinucleótido", "molécula de ácido nucleico" y similares, se refieren a moléculas que contienen ácido nucleico, que incluyen, pero no se limitan a, ADN. Los términos abarcan secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases conocidos de ADN y ARN que incluyen, entre otros, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetil-guanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiamino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5-metoxicarbonilmetiluracilo, 5'-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.
Como se usa en la presente descripción, el término "oligonucleótido" se refiere a un polinucleótido monocatenario que típicamente tiene menos de 500 nucleótidos. En algunas modalidades, un oligonucleótido tiene una longitud de 8 a 200, 8 a 100, 12 a 200, 12 a 100, 12 a 75 o 12 a 50 nucleótidos. Los oligonucleótidos pueden denominarse por su longitud, por ejemplo, un oligonucleótido de 24 residuos puede denominarse "24-mer."
Como se usa en la presente descripción, el término "complementario" a un gen diana (o región diana del mismo), y el porcentaje de "complementariedad" de la secuencia de la sonda a la secuencia del gen diana es el porcentaje de "identidad" a la secuencia del gen diana o al complemento de la secuencia del gen diana. Para determinar el grado de "complementariedad" entre las sondas que se usan en las composiciones descritas en la presente descripción (o regiones de las mismas) y un gen diana, como los descritos en la presente descripción, el grado de "complementariedad" se expresa como el porcentaje de identidad entre la secuencia de la sonda (o región de la misma) y la secuencia del gen diana o el complemento de la secuencia del gen diana que mejor se alinea con eso. El porcentaje se calcula al contar el número de bases alineadas que son idénticas entre las 2 secuencias, dividir por el número total de nucleótidos contiguos en la sonda y multiplicar por 100. Cuando se usa el término "complementario", el oligonucleótido sujeto es al menos 90 % complementario a la molécula diana, a menos que se indique de cualquier otra manera. En algunas modalidades, el oligonucleótido sujeto es al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % complementario a la molécula diana.
Un "cebador" o "sonda", como se usa en la presente descripción, se refiere a un oligonucleótido que comprende una región que es complementaria a una secuencia de al menos 8 nucleótidos contiguos de una molécula de ácido nucleico diana, tal como un gen diana. En algunas modalidades, un cebador o sonda comprende una región que es complementaria a una secuencia de al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, al menos 29, al menos 30, al menos 319, al menos 32, al menos 33, al menos 34, al menos 35, al menos 36, al menos 37, al menos 38, al menos 39 o al menos 40, nucleótidos contiguos de una molécula diana. Cuando un cebador o sonda comprende una región que es "complementaria de al menos x nucleótidos contiguos de una molécula diana", el cebador o sonda es al menos 95 % complementario de al menos x nucleótidos contiguos de la molécula diana. En algunas modalidades, el cebador o sonda es al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % complementario a la molécula diana.
El término "amplificación de ácido nucleico" abarca cualquier medio por el cual se reproduce al menos una parte de al menos un ácido nucleico diana, típicamente de una manera dependiente del molde, que incluye, sin limitación, una amplia gama de técnicas para amplificar secuencias de ácido nucleico, ya sea de forma lineal o exponencial. Los medios ilustrativos para realizar una etapa de amplificación incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la reacción de detección de ligasa (LDR), la amplificación de la sonda dependiente de la ligadura múltiple (MLPA), la ligadura seguida de amplificación de Q-replicasa, la extensión del cebador, amplificación de desplazamiento de cadena (SDA), amplificación de desplazamiento de cadena hiperramificada, amplificación de desplazamiento múltiple (MDA), amplificación basada en cadena de ácido nucleico (NASBA), amplificaciones en formato múltipleadas de dos etapas, amplificación de círculo rodante (RCA) y similares, incluidas las versiones en formato múltiple y sus combinaciones, por ejemplo, entre otros, OLA/PCR, PCR/OLa , LDR/PCR, PCR/PCR/LDR, PCR/LDR, LCR/PCR, PCR/LCR (conocido, además, como reacción en cadena combinada--CCR), amplificación digital y similares. Las descripciones de tales técnicas pueden encontrarse, entre otras fuentes, Ausbel y otros; PCR Primer: A Laboratory Manual, Diffenbach, Ed., Cold Spring Harbor Press (1995); The Electronic Protocol Book, Chang Bioscience (2002); Msuih y otros, J. Clin. Micro. 34:501-07 (1996); The Nucleic Acid Protocols Handbook, R. Rapley, ed., Humana Press, Totowa, N.J. (2002); Abramson y otros, Curr Opin Biotechnol. Febrero de 1993; 4(1):41-7, Patente de EE. UU. núm. 6,027,998; patente de EE. UU. núm. 6,605,451, Barany y otros, PCT Publicación núm. WO 97/31256; Wenz y otros, PCT Publicación núm. WO 01/92579; Day y otros, Genomics, 29(1): 152-162 (1995), Ehrlich y otros, Science 252:1643-50 (1991); Innis y otros, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990); Favis y otros, Nature Biotechnology 18:561-64 (2000); y Rabenau y otros, Infection 28:97-102 (2000); Belgrader, Barany, y Lubin, Development of a en formato múltiple Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay, Sixth International Symposium on Human Identification, 1995 (disponible en Internet en: promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html); LCR Kit Instruction Manual, Cat. #200520, Rev. #050002, Stratagene, 2002; Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:188-93 (1991); Bi y Sambrook, Nucl. Acids Res. 25:2924-2951 (1997); Zirvi y otros, Nucl. Acid Res. 27:e40i-viii (1999); Dean y otros, Proc Natl Acad Sci USA 99:5261-66 (2002); Barany y Gelfand, Gene 109:1-11 (1991); Walker y otros, Nucl. Acid Res. 20:1691-96 (1992); Polstra y otros, BMC Inf. Dis. 2:18-(2002); Lage y otros, Genome Res. 2003 Febrero; 13(2):294-307, y Landegren y otros, Science 241:1077-80 (1988), Demidov, V., Expert Rev Mol Diagn. 2002 noviembre; 2(6):542-8., Cooky otros, J Microbiol Methods. Mayo de 2003; 53(2):165-74, Schweitzer y otros, Curr Opin Biotechnol. Febrero de 2001; 12(1):21-7, Patente de EE. UU. núm. 5,830,711, Patente de EE. UU. núm. 6,027,889, Patente de EE. UU. núm. 5,686,243, PCT Publicación núm. W00056927A3, y PCT Publicación núm. W09803673A1.
En algunas modalidades, la amplificación comprende al menos un ciclo de los procedimientos secuenciales de: hibridación de al menos un cebador con secuencias complementarias o sustancialmente complementarias en al menos un ácido nucleico diana; sintetizar al menos una cadena de nucleótidos de una manera dependiente del molde mediante el uso de una polimerasa; y desnaturalizar el dúplex de ácido nucleico recién formado para separar las cadenas. El ciclo puede repetirse o no. La amplificación puede comprender termociclado o, en determinadas modalidades, puede realizarse de forma isotérmica.
El término "hibridar" se usa típicamente en la presente descripción para referirse a "hibridación específica" que es la unión, duplicación o hibridación de una molécula de ácido nucleico preferentemente con una secuencia de nucleótidos particular, en algunas modalidades, en condiciones rigurosas. El término "condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones en las cuales una sonda se hibridará preferentemente con su secuencia diana y, en menor grado, o nada, con otras secuencias. Una "hibridación rigurosa" y "condiciones rigurosas de lavado de hibridación" en el contexto de la hibridación de ácidos nucleicos son dependientes de la secuencia y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. Una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en p. ej., Tijssen, (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I, Ch. 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," Elsevier, N.Y. ("Tijssen"). Generalmente, las condiciones rigurosas de hibridación y de lavado para hibridaciones de filtro se seleccionan para ser aproximadamente 5 °C más baja que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y pH definidos) a la que 50 % de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente coincidente. En determinadas modalidades, se seleccionan condiciones muy rigurosas para que sean iguales a la Tm para una sonda en particular. La dependencia de la rigurosidad de la hibridación en la composición del tampón, la temperatura y la longitud de la sonda son bien conocidas por los expertos en la técnica (ver, p. ej., Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY).
Una "muestra", como se usa en la presente descripción, generalmente se refiere a una muestra biológica que incluye fluidos biológicos (p. ej., sangre o fracciones de sangre, suero, plasma, jugo pancreático, líquido cefalorraquídeo, líquido oral, linfa, líquido intraoculary similares) y/o muestras de tejido que incluyen, entre otras, muestras de biopsia, muestras de tejido congelado, muestras fijadas con formalina e incluidas parafina(FFPE) de varios tejidos que incluyen, entre otros, tejido mamario, tejido endocervical, tejido vaginal, tejido de colon/recto, tejido de garganta y otros tipos de muestras humanas, tales como muestras de sangre, heces y biopsias. El término muestra incluye, además, formas diluidas y/o tamponadas de las muestras anteriores, por ejemplo, un tampón en el que se ha colocado una muestra de hisopado, una muestra de orina a la que se ha añadido un tampón y similares.
Como se usa en la presente descripción, la frase "es indicativo de la presencia de un cáncer o de una predisposición a un cáncer" significa que un resultado particular tiende a indicar que un cáncer está presente y/o una condición precancerosa está presente o probablemente presente. Esta frase no implica una determinación definitiva de que la condición está presente. Puede tomarse una determinación definitiva sobre la base de un examen o prueba adicional que un médico considere apropiado. Además, esta frase no requiere que se haga una determinación sobre qué condición puede estar presente basado únicamente en el resultado particular. Más bien, se contempla que se considerará un resultado positivo a la luz de otros resultados de exámenes o textos para llegar a un diagnóstico diferencial.
El término "procedimiento de llenado de tubos" se refiere a un procedimiento que se corre mediante el uso de instrumentación estándar de laboratorio en lugar de un casete (p. ej., en lugar de con un GENEXPERT®, o un cartucho GENEXPERT® modificado descrito en la presente descripción).
Descripción detallada
En diversas modalidades, se proporcionan dispositivos y métodos que facilitan la detección rápida y/o caracterización de la metilación en muestras de a Dn . En ciertas modalidades, se proporcionan cartuchos de reacción automatizados así como métodos que usan el cartucho de reacción automatizado para facilitar el análisis de la metilación de una muestra de ADN y, opcionalmente, para medir los niveles de ARNm junto con la determinación de la metilación del ADN. En varias modalidades, la metilación del ADN se determina mediante la conversión de bisulfito y el análisis del ADN convertido con bisulfito (p. ej., mediante PCR específica de metilación, secuenciación de ácidos nucleicos, análisis del punto de fusión y similares). En ciertas modalidades, el cartucho realiza toda o una parte de la conversión de bisulfito del ADN y todo o una parte del análisis del ADN convertido con bisulfito. En determinadas modalidades, el cartucho realiza todas las etapas implicadas en la conversión de bisulfito y todo o una parte del análisis del ADN convertido con bisulfito. En ciertas modalidades, el cartucho realiza todas las etapas implicadas en la conversión de bisulfito y todo el análisis del ADN convertido con bisulfito. En ciertas modalidades, el cartucho adicionalmente realiza un aislamiento y purificación del ADN a analizar.
La automatización del análisis de metilación tiene varias ventajas que incluyen, por ejemplo, la reducción del tiempo total de procesamiento, las mejoras en la eficiencia, la disminución del error y la variabilidad del usuario, la minimización de la pérdida entre etapas y una capacidad mejorada para usar cantidades más pequeñas de muestra. El uso de un proceso basado en cartuchos, como se describe en la presente descripción, permite realizar pruebas rápidas y fáciles no solo de múltiples tipos de muestras, sino además, para evaluar los cambios de metilación que se observan en varios tipos diferentes de cánceres, incluidos, entre otros, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de próstata y cáncer de pulmón.
Los métodos basados en cartuchos descritos en la presente descripción permiten, además, la medición del ARNm derivado de la misma muestra. La medición del ARNm correspondiente aguas arriba y/o aguas abajo, implicado en la metilación del ADN, puede ser importante para comprender el mecanismo y la actividad de la modificación epigenética. Por ejemplo, la medición del ARNm de metiltransferasas de ADN (DNMT) se ha estudiado junto con la metilación del ADN para varios cánceres (ver Tabla 1).
Tabla 1. Metiltransferasas de ADN ilustrativas y su importancia en cánceres particulares (de Subramaniam y otros (2014) Front Oncol., 4: Article 80, doi: 10,3389/fonc.20 14.00080).
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
A menudo, se usan extracciones separadas independientes para ADN o ARN para estudiar y medir genes y transcritos. La detección conjunta a partir de la misma preparación de muestra sería ideal para minimizar la variabilidad de la preparación de la muestra, ensayo a ensayo, muestra a muestra y célula a célula.
Conversión de ADN con bisulfito basada en cartucho
En determinadas modalidades, la extracción de ADN, la conversión de bisulfito y la PCR específica de metilación se realizan todas en el cartucho. En una modalidad ilustrativa, el usuario agregará la muestra a un reactivo de lisis/unión, luego mezclará/agitará brevemente el reactivo y luego agregará la muestra a un puerto o cámara de muestra en el cartucho. Los reactivos de lisis ilustrativos, pero no limitantes (incluidos los reactivos particularmente adecuados para secciones FFPE) se describen en la publicación de patente PCT núm: WO/2014/052551 (PCT/US2013/061863).
En el Ejemplo se muestran reactivos de lisis ilustrativos adicionales para suero o plasma y para muestras incluidas en parafina fijadas con formalina (FFPE) (Tablas 11 y 12, respectivamente).
En ciertas modalidades, el cartucho se coloca en un módulo de procesamiento y el ensayo se inicia al hacer clic en un conjunto de selecciones dentro del software que controla el módulo de procesamiento (ver, por ejemplo, Figuras 11Ay 11B). El cartucho luego realiza el proceso de conversión de bisulfito y el análisis del ADN convertido con bisulfito. En determinadas modalidades se determina, además, el ARNm. Mientras que en ciertas modalidades, todas las operaciones se realizan en el cartucho, en otras modalidades, se realizan subconjuntos de las diversas operaciones en el cartucho como se describe a más abajo.
La muestra puede comprender cualquier muestra biológica que contenga ADN cuyo estado de metilación deba evaluarse. Las muestras ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, ADN aislado y/o ácidos nucleicos totales aislados, una célula, un tejido, un fluido biológico que contiene un ácido nucleico y similares. En determinadas modalidades, la muestra biológica comprende un fluido biológico que se selecciona del grupo que consiste en plasma, suero, líquido amniótico, saliva, moco, orina, jugo pancreático y líquido cefalorraquídeo. En determinadas modalidades, la muestra comprende una muestra de tejido de un tejido sano o una muestra de tejido de una muestra enferma. En determinadas modalidades, la muestra de tejido procede de un feto, un recién nacido, un niño, un adolescente o un adulto. En determinadas modalidades, la muestra de tejido comprende una célula tumoral y/o se deriva de una biopsia de un tumor (p. ej., un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un cáncer de cerebro, un cáncer de cuello uterino, un cáncer de ovario, un cáncer de páncreas, un cáncer de colon, un cáncer gástrico, un cáncer hepatocelular y similares. En ciertas modalidades, la muestra comprende un tejido fijado, p. ej., una muestra de tejido fijada con formalina. En ciertas modalidades, la muestra comprende una muestra de tejido incluida (p. ej., una muestra de tejido incluida en parafina fijada con formalina (FFPE)).
La conversión de bisulfito del ADN típicamente implica cuatro etapas:
1) purificación del ADN;
2) desnaturalización del ADN;
3) conversión del ADN (p. ej., desaminación con bisulfito); y
4) desulfonación con álcali.
Típicamente, la conversión de ADN (p. ej., mediante el uso de un reactivo de conversión como un bisulfito) implica: 1) Sulfonación: La adición de bisulfito al doble enlace 5-6 de la citosina; y 2) Desaminación Hidrólica: desaminación hidrolítica del derivado de citosina-bisulfito resultante para dar un derivado de uracilo-bisulfito. A esto le sigue la desulfonación alcalina: Eliminación del grupo sulfonato mediante un tratamiento alcalino, para dar uracilo como se indicó anteriormente.
Como se indicó anteriormente, en ciertas modalidades, la purificación del ADN puede realizarse antes de colocar una muestra en el cartucho, o alternativamente, puede realizarse con el propio cartucho. En consecuencia, en determinadas modalidades, la muestra se añade directamente al cartucho de reacción, mientras que en otras modalidades, la muestra se mezcla con uno o más reactivos. En ciertas modalidades, la preparación de ADN típicamente implica la preparación de ADN sustancialmente aislado. Esto puede implicar lisar células para liberar ADN, eliminar partículas y restos celulares y/o eliminar componentes proteicos para proporcionar una muestra que comprenda ácidos nucleicos sustancialmente puros (p. ej., ADN sustancialmente puro y/o una combinación sustancialmente pura de ADN y ARN). En una modalidad ilustrativa, pero no limitante, la muestra (p. ej., una muestra de tejido) se agrega a un reactivo de lisis, se agita y luego se inserta en el cartucho para su posterior procesamiento.
En ciertas modalidades, todos los reactivos necesarios para realizar la conversión de bisulfito del ADN se proporcionan en el cartucho. En ciertas modalidades, para evitar la degradación de los reactivos con el tiempo en el cartucho, pueden añadirse ciertos reactivos al cartucho inmediatamente antes de su uso. Así, por ejemplo, en ciertas modalidades, se contempla que el cartucho pueda cargarse con un reactivo de conversión (p. ej., un reactivo bisulfito) y/o un reactivo de tiocianato de guanidio (p. ej., GTC-EtOH-Tween) en el momento o aproximadamente en el momento en que se carga la muestra en el cartucho. En ciertas modalidades, el reactivo de tiocianato de guanidinio (p. ej., GTC-EtOH-Tween) se combina con la muestra y se agrega al cartucho en la cámara receptora de la muestra (p. ej., cámara 2 del cartucho GENEXPERT®).
En ciertas modalidades, al realizar la conversión de bisulfito de ADN mediante el uso de un cartucho de reacción (p. ej., Cartucho GENEXPERT®), el método comprende
i) poner en contacto una muestra biológica que comprende un ácido nucleico con un primer material de matriz que comprende una primera columna o filtro donde dicho material de matriz se une y/o filtra los ácidos nucleicos en dicha muestra y de ese modo purifica el ADN;
ii) eluir el ADN unido del primer material de matriz (p. ej., mediante el uso de una solución alcalina) y desnaturalizar el ADN para producir ADN desnaturalizado eluido;
iii) calentar el ADN eluido en presencia de un reactivo de conversión (p. ej., un reactivo que proporciona iones bisulfito) para producir un ácido nucleico (p. ej., desaminado);
iv) poner en contacto el ácido nucleico convertido con un segundo material de matriz que comprende una segunda columna para unir dicho ácido nucleico desaminado a dicho segundo material de matriz (obsérvese que en ciertas modalidades la segunda columna puede ser una columna diferente a la primera columna, o en otras modalidades, la misma columna usada por segunda vez);
v) desulfonar el ácido nucleico desaminado unido y/o eluir y desulfonar simultáneamente el ácido nucleico al poner en contacto el ácido nucleico desaminado con una solución alcalina para producir un ácido nucleico (p. ej., convertido por bisulfito); y
vi) eluir el ácido nucleico convertido de dicho segundo material de matriz, en donde al menos las etapas iv) a la vi) se realizan en un cartucho de reacción.
En ciertas modalidades, el método incluye, además, el análisis del ADN convertido. En ciertas modalidades, el método comprende, además:
vii) realizar PCR específica de metilación y/o secuenciación de ácidos nucleicos, y/o análisis de fusión de alta resolución (HRM) en el ácido nucleico convertido para determinar la metilación del ácido nucleico, en donde al menos las etapas iv) a vi) se realizan en un cartucho de reacción único.
En ciertas modalidades, al menos las etapas iii) a vi) se realizan en un cartucho de reacción.
En ciertas modalidades, al menos las etapas ii) a vi) se realizan en un cartucho de reacción.
En ciertas modalidades, al menos las etapas i) a vi) se realizan en un cartucho de reacción.
En ciertas modalidades, al menos las etapas i) a vii) se realizan en un cartucho de reacción.
Cabe señalar que la primera columna y, cuando está presente, la segunda columna pueden referirse a columnas discretas. Sin embargo, particularmente cuando se integra en un cartucho de reacción, la "columna" puede ser simplemente un material de matriz dispuesto en una cámara o canal en el cartucho. En varias modalidades, las "columnas" actúan como filtros y/o como columnas de afinidad que se unen a ácidos nucleicos. En consecuencia, en ciertas modalidades la columna contiene un material de matriz que se une a un ácido nucleico (p. ej., ADN y/o ARN). Los materiales de matriz ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, vidrio (sílice), una resina de intercambio iónico, hidroxiapatita y similares. Se reconocerá que los materiales de la matriz pueden adoptar varias formas. Así, en ciertas modalidades, el material de matriz comprende un material fibroso y un material particulado (p. ej., microperlas, nanoperlas, etc.), un material estructurado (p. ej., sistema de "deflector" poroso, un canal serpenteante y similares). En ciertas modalidades, la primera columna y la segunda columna son columnas diferentes (cámaras o canales). En otras modalidades, la primera columna y la segunda columna son la misma columna (cámara o canal) que se usa dos veces (p. ej., una primera vez y una segunda vez).
En ciertas modalidades se contempla el uso de uno o más filtros adicionales, p. ej., para limpiar la muestra inicial antes de que entre en contacto con el primer material de matriz. Así, por ejemplo, en ciertas modalidades, una matriz de filtro (p. ej., filtro de policarbonato, filtro de nailon, filtro de polipropileno, filtro de poliéster, filtro de nailon, filtro de cerámica, filtro de politetrafluoroetileno, y similares) se dispone en la cámara de recepción de muestras o "aguas abajo" de la cámara de recepción de muestras y antes de la primera "columna". Se reconoce, además, que en determinadas modalidades, la muestra puede lisarse y/o filtrarse antes de depositarse en una cámara de recepción de muestras.
En ciertas modalidades ilustrativas, pero no limitantes, los métodos descritos en la presente descripción pueden realizarse mediante el uso de un cartucho GENEXPERT® (Cepheid, Inc., Sunnyvale, CA) o una variante del mismo. En varias modalidades, la extracción y/o amplificación de muestras y/o la conversión de ADN y/o la detección pueden llevarse a cabo dentro de este "laboratorio en un cartucho" autónomo (ver, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. núms. 5,958,349, 6,403,037, 6,440,725, 6,783,736, y 6,818,185). En varias modalidades, los componentes del cartucho pueden incluir, pero no se limitan a, cámaras de procesamiento que contienen reactivos, filtros y tecnologías de captura útiles para extraer, purificar y amplificar ácidos nucleicos diana. Una válvula permite la transferencia de fluido de una cámara a otra y contiene componentes de lisis y filtración de ácidos nucleicos. Una ventana óptica permite la detección óptica en tiempo real (por ejemplo, de productos de amplificación por PCR). Puede proporcionarse un tubo de reacción que permita un calentamiento y/o ciclos térmicos muy rápidos.
En ciertas modalidades, un cartucho GENEXPERT® ilustrativo comprende una pluralidad de cámaras dispuestas alrededor de un conjunto de válvula central y selectivamente en comunicación de fluidos con el conjunto de válvula central donde el conjunto de válvula central está configurado para acomodar un émbolo que es capaz de extraer fluido dentro o fuera de una cámara en comunicación de fluidos con la válvula central. La rotación del conjunto de la válvula determina qué cámara está en comunicación de fluidos con la válvula central. Un cartucho GENEXPERT® ilustrativo se ilustra en la Figura 1A que muestra el cartucho, las cámaras de procesamiento/reactivo, un tubo de reacción (p. ej., tubo de calentamiento y/o termociclado), ventanas ópticas opcionales y una válvula que facilita la transferencia de fluido de una cámara a otra.
En la Figura 1B se muestra un diseño ilustrativo del cartucho que proporciona una vista superior del cartucho que identifica varias cámaras por número. En una modalidad ilustrativa, pero no limitante, los componentes de las cámaras que comprenden el cartucho son los que se enumeran en la Tabla 2. Se reconocerá que esta disposición de reactivos y cámara es ilustrativa y no limitante. Mediante el uso de las enseñanzas proporcionadas en la presente descripción, los expertos en la técnica dispondrán de otras disposiciones de reactivos y/u otras configuraciones de cámara.
Tabla 2. Una modalidad ilustrativa que muestra el contenido de la cámara para el uso de un cartucho GENEXPERT® para medir la metilación del ADN.
Figure imgf000011_0001
En la Figura 1C se muestra una modalidad de un flujo de trabajo etapa a etapa para la determinación de la metilación del ADN mediante el uso de un cartucho de este tipo. En esta configuración de cartucho, hay cinco cámaras que, en uso (p. ej., cuando el cartucho está en funcionamiento para determinar la metilación del ADN), contendrá reactivos y tampones (p. ej., cámaras 3, 4, 5, 8 y 10), una cámara que contendrá la muestra añadida por el usuario (p. ej., cámara 2), y una o dos (o más) cámaras que contienen reactivos de análisis (p. ej., reactivos MSP como reacción enzimática, reacción específica de molde y/o Tris 200 mM pH 7,0, p. ej., como perlas) (p. ej., cámaras 9 y 11). En ciertas modalidades, los reactivos (p. ej., polimerasa, transcriptasa inversa, cebador, sonda) se proporcionan en solución. En ciertas modalidades, los reactivos se proporcionan como polvos liofilizados. En ciertas modalidades, los reactivos se proporcionan como perlas liofilizadas. Las perlas pueden comprender, además, agentes que mejoren la estabilidad y/o actividad de los reactivos (ver, por ejemplo, Publicación de Patente de EE. UU. núm.: 2006/0068399).
En ciertas modalidades, el cartucho, como se proporciona, contiene todos los reactivos necesarios para ejecutar el cartucho y solo la muestra (p. ej., muestra en solución tampón/lisis/precipitación) se añade al cartucho. En ciertas modalidades, el cartucho se proporciona sin los reactivos GTC-EtOH y/o bisulfito y se añaden uno o ambos en el momento del uso. Así, en ciertas modalidades, el reactivo GTC-EtOH se añade al cartucho en el momento del uso, en ciertas modalidades el reactivo bisulfito (además de la muestra) se añade a la cámara en el momento del uso, y en ciertas modalidades, tanto el GTC-EtOH como el reactivo bisulfito (además de la muestra) se añaden al cartucho en el momento del uso. En ciertas modalidades, estos reactivos se añaden directamente a las cámaras deseadas (ver, por ejemplo, Tabla 2). En ciertas modalidades, se proporcionan puertos para cargar los reactivos y los puertos están configurados para suministrar el(los) reactivo(s) a las cámaras deseadas.
Al comienzo del ensayo, el cartucho dispensa la muestra, por ejemplo de la cámara 2 sobre una columna de fibra de vidrio (por ejemplo la primera columna) en el cartucho. El ADN se eluye de la columna y simultáneamente se desnaturaliza con una solución alcalina, p. ej., una baja concentración de hidróxido de potasio de la cámara 10 en un reactivo de bisulfito concentrado (p. ej., bisulfito de amonio concentrado) en la Cámara 4. En ciertas modalidades, el ADN se eluye con una solución alcalina de KOH con un pH superior a aproximadamente 10,5 o un pH superior a aproximadamente pH 12. En ciertas modalidades, el ADN se eluye con KOH 10-15 mM.
Como se indicó anteriormente, el ADN se eluye (opcionalmente con una ráfaga de sonicación) en el reactivo bisulfito. En varias modalidades, el reactivo de conversión (p. ej., reactivo bisulfito) está presente en una concentración que varía de aproximadamente 4 M a aproximadamente 10 M, o de aproximadamente 5 M a aproximadamente 8 M, o de aproximadamente 6 M o aproximadamente 7 M. En determinadas modalidades, la solución de bisulfito comprende metabisulfito de sodio, o bisulfito de potasio, o bisulfito de amonio, o bisulfito de cesio, o DABSO (1,4-diazoniabiciclo[2.2.2]octano-1,4-disulfinato, ver, por ejemplo, Figura 16). En ciertas modalidades, el reactivo de conversión (p. ej., reactivo bisulfito) contiene captadores de radicales, que incluyen, entre otros, uno o más productos químicos para evitar la oxidación del sulfito a sulfato (TROLOX e hidroquinona) y/o catalizadores (poliaminas).
La mezcla de ADN-bisulfito (ADN/reactivo de conversión) se introduce luego en una cámara o canal de temperatura controlada y se incuba a una temperatura que varía de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 95 °C. En ciertas modalidades, la mezcla se incuba a temperatura constante, mientras que, en otras modalidades, p. ej., donde la cámara o canal de temperatura controlada es una cámara o canal de termociclado (p. ej., un tubo smartcycler en la parte posterior del cartucho), la mezcla se cicla térmicamente (p. ej., entre 60 °C y 95 °C). La mezcla se incuba hasta que el ADN se convierte (p. ej., desaminado). En ciertas modalidades, la incubación es durante un período de tiempo que varía de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 4 horas, o preferentemente de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 45 minutos.
Después de la incubación, la solución de ADN/reactivo de conversión (p. ej., ADN-bisulfito) se mezcla con tiocianato de guanidinio-EtOH nuevo, p. ej., de la cámara 3 y se distribuye sobre un material de matriz. En ciertas modalidades, la primera columna se reutiliza, por lo tanto, solo hay una columna y la segunda columna y la primera columna son iguales. En ciertas modalidades, la segunda columna es una columna separada diferente de la primera columna.
El ADN unido al material de matriz de la segunda columna se lava con GTC-EtOH nuevo (p. ej., de la cámara 3) y se enjuaga (p. ej., con un enjuague PEG 200, p. ej., de la cámara 8). A continuación, el ADN se desulfona en la columna, o se eluye y desulfona simultáneamente al poner en contacto el ácido nucleico desaminado con una solución alcalina (p. ej., KOH de la cámara 10 para producir un ácido nucleico convertido con bisulfito. En ciertas modalidades, la incubación es durante un período de tiempo que varía de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 1 hora, o de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 30 minutos, o de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 20 minutos, o durante aproximadamente 15 minutos.
Cuando la incubación inicial fue en una cámara de termociclado que se va a usar más adelante, la cámara o canal de termociclado se lava con un tampón para eliminar el bisulfito residual y neutralizar el pH. Fue un descubrimiento sorprendente que la incubación con un reactivo de conversión (p. ej., un reactivo bisulfito), y/o la desulfonación pueden realizarse en un canal o cámara que luego se usa para PCR sin que la contaminación por bisulfito interfiera sustancialmente con la reacción o reacciones de PCR posteriores.
El ADN eluido convertido con bisulfito y desulfonado puede mezclarse con un tampón apropiado y analizarse para metilación. En ciertas modalidades, el ADN convertido se mezcla con Tris concentrado, reacción enzimática y perlas específicas de molde (p. ej., perlas que comprenden cebadores y/o sondas para PCR o reacción de PCR anidada) en las cámaras 9 y 11, y la mezcla final se aspira al tubo o cámara de termociclado para la reacción de PCR cuantitativa específica de metilación.
La contaminación por bisulfito durante la etapa de qPCR puede ser el modo de falla principal del cartucho de metilación. El bisulfito residual puede resultar de la contaminación directa del tubo de reacción de p Cr (p. ej., durante la etapa de conversión de bisulfito) o por contaminación indirecta (e.g. contaminación cruzada durante los movimientos fluídicos de bisulfito entre cámaras). La contaminación residual por bisulfito, si está presente, puede medirse mediante la escisión de la sonda mediada por bisulfito durante la etapa de qPCR, lo que da como resultado un aumento de la fluorescencia durante los ciclos tempranos de qPCR (ciclos 1-10) que típicamente se usan para sustracción de fondo. En consecuencia, en ciertas modalidades, el cartucho comprende perlas que proporcionan una o más sondas que pueden escindirse durante la PCR si está presente bisulfito. Los resultados de una corrida que contiene contaminación por bisulfito se muestran en la Figura 14.
Mientras que los métodos anteriores (y en el Ejemplo 4, ver, por ejemplo, Figura 13A) se describen con respecto a cámaras específicas en el cartucho GENEXPERT®, se reconocerá que las asignaciones particulares de reactivo/cámara pueden variar en dependencia de las particularidades del protocolo de análisis de metilación aplicado.
Así, por ejemplo, el funcionamiento de un cartucho de análisis de metilación (p. ej., un cartucho GENEXPERT® puede describirse generalmente mediante un diagrama de flujo (ver, p. ej., Figuras 1C y 13B). En la modalidad ilustrativa, pero no limitante que se muestra en la Figura 13B, la muestra de ADN se proporciona en un tampón de unión (p. ej., un tampón que comprende GTC-EtoH, en ciertas modalidades después de que la muestra se procesa con proteinasa K y/o una solución de lisis). En ciertas modalidades, la muestra se obtiene de un cartucho de preparación de muestras como se describe en la presente descripción (ver, p. ej., Figura 20).
La muestra en tampón de unión se introduce en una cámara de recepción de muestras del cartucho. En funcionamiento, el cartucho se hace funcionar para entregar la solución de muestra a una matriz ("columna") que une el ADN. A continuación, el ADN unido se eluye de la columna mediante el uso de un reactivo alcalino (p. ej., solución de KOH) combinado con un reactivo de bisulfito y trasladado a un tubo de calentamiento (típicamente el tubo de reacción de PCR) en el cartucho donde procede la reacción de bisulfito (p. ej., a aproximadamente 50 °C o aproximadamente 60 °C a aproximadamente 90 °C durante aproximadamente 45 minutos (o hasta aproximadamente 90 minutos), en este protocolo ilustrativo). El ADN reaccionado se combina con un tampón de unión (p. ej., Tiocianato de guanidinio 2,25 M, Tris 22,5 mM pH 7,0, Tween20 al 0,5 %, etanol al 50 % y antiespumante s E-15 al 0,005 % (una emulsión al 10 % de un antiespumante de silicio activo y emulsionantes no iónicos)) y regresa a la misma columna, o a una columna diferente, donde de nuevo se une a la matriz de la columna. El ADN reaccionado se lava con GTC-EtOH, se enjuaga con PEG (p. ej., PEG200) y se eluye nuevamente de la columna mediante el uso de un reactivo alcalino (p. ej., KOH) que, además, desulfona el ADN. Mientras el ADN se desulfona el tubo de reacción (p. ej., tubo de reacción de PCR) puede calentarse y enjuagarse (p. ej., 10 x enjuagues) para eliminar cualquier reactivo bisulfito. El ADN eluido (o una porción del mismo) puede desplazarse a un tubo de reacción para PCR y/o PCR anidada.
Se apreciará que estas operaciones pueden realizarse en toda la muestra o en una porción de la muestra de ADN. En el último caso, una porción de la muestra puede almacenarse en una o más cámaras y usarse como control, o someterse a un análisis/protocolo diferente.
Purificación conjunta y detección tanto de la expresión de ARN como de la metilación del ADN.
En ciertas modalidades, se proporcionan métodos para la purificación conjunta y detección de la expresión alterada de genes de ARN junto con la metilación del ADN (MSP) en un ensayo basado en cartucho (p. ej., mediante el uso de un cartucho GENEXPERT®). En ciertas modalidades, estos ensayos identificarían la expresión alterada de por ejemplo DNMT que se correlacionó con la metilación específica del tumor de la misma preparación de muestra. En ciertas modalidades, estos ensayos pueden usarse para verificar el estado de expresión y metilación.
Nosotros hemos demostrado que podemos eluir los ácidos nucleicos de la columna mediante el uso de una elución tamponada con Tris que retiene una porción de los ácidos nucleicos en la columna. En una modalidad ilustrativa, se eluye y se retiene una fracción de ARN, p. ej., en una cámara en el cartucho mediante el uso de una solución Tris.
Después de guardar la fracción de ARN, la elución de NaOH o KOH se separará de la columna y se eluirá y desnaturalizará el ADN que iría al bisulfito para su conversión como se describió arriba. Luego, ya sea mediante el uso de la fracción de elución de ARN para eluir el ADN convertido con bisulfito de la columna o mediante el uso de la mezcla de elución de KOH, las dos fracciones (ARN y productos de ADN convertidos) se mezclan para obtener ARN más qRT-PCR convertido con bisulfito. Esto implica incorporar una etapa de transcriptasa inversa (Rt ) para el ARN más MSP (u otro método analítico) en el mismo tubo de la misma muestra. Los métodos alternativos incluyen, entre otros, realizar la etapa de RT de manera independiente antes de mezclar con ADN (combinar ADNc y ADN) para qPCR, o PCR para ADN o RT ARN puede realizarse de manera independiente/en serie mediante el uso de un tubo/cámara de termociclado o simultáneamente mediante el uso de múltiples tubos/cámaras de termociclado en el cartucho.
Análisis del ADN convertido
Pueden realizarse numerosos métodos analíticos en el cartucho para evaluar la metilación del ADN. Alternativamente, en ciertas modalidades, el cartucho puede acoplarse a otro dispositivo y/o sistema para un análisis adicional del ADN convertido (p. ej., convertido con bisulfito o DABSO). Los métodos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, PCR específica de metilación (MSP), secuenciación directa, análisis de fusión de alta resolución (HRM), pirosecuenciación (secuenciación por adición), análisis de escisión específica de base (e.g. MALDI-TOF específico de base) y similares.
PCR específica de metilación (MSP).
En diversas modalidades, puede usarse PCR específica de metilación para evaluar el estado de metilación del ADN diana. MSP usó conjuntos de cebadores y/o sondas diseñados para ser "metilados específicos" al incluir secuencias que complementan solo 5-metilcitosinas no convertidas o, por el contrario, "no metiladas específicas", que complementan timinas convertidas a partir de citosinas no metiladas. Luego, la metilación se determina por la capacidad del cebador específico para lograr la amplificación. Este método es particularmente eficaz para interrogar islas CpG en regiones de alta densidad de metilación, porque un mayor número de metilcitosinas no convertidas dentro de la diana a amplificar aumenta la especificidad de la p Cr . En ciertas modalidades, colocar el par CpG en el extremo 3' del cebador, además, mejora la especificidad.
En ciertas modalidades, la metilación se evalúa mediante el uso de un método MethyLight. El método MethyLight se basa en MSP, pero proporciona un análisis cuantitativo mediante el uso de PCR cuantitativa (ver, p. ej., Eades y otros. (2000) Nucleic Acids Res., 28(8): E32. doi:10,1093/nar/28.8.e32). Se usan cebadores específicos metilados y además, se usa una sonda indicadora de fluorescencia específica metilada que se hibrida con la región amplificada. De forma alternativa, los cebadores o la sonda pueden diseñarse sin especificidad de metilación si se necesita discriminación entre los pares CpG dentro de las secuencias implicadas. La cuantificación puede realizarse en referencia a un ADN metilado de referencia. Una modificación de este protocolo para aumentar la especificidad de la PCR para el ADN convertido exitosamente con bisulfito (ConLight-MSP) usa una sonda adicional para el ADN sin convertir con bisulfito para cuantificar esta amplificación no específica (ver, por ejemplo, Rand y otros. (2002) Methods 27(2): 114-120).
En diversas modalidades, los métodos MethyLight usan la tecnología TAQMAN®, que se basa en la escisión de una sonda de hibridación fluorogénica con doble marcaje mediante la actividad nucleasa 5' de la polimerasa Taq durante la amplificación por PCR (Eads y otros (1999) Cancer Res., 59: 2302-2306; Livak y otros (1995) PCR Meth. Appl., 4: 357­ 362; Lee y otros (1993) Nucleic Acids Res., 21: 3761-3766; Fink y otros (1998) Nat. Med., 4: 1329-1333). El uso de tres oligonucleótidos diferentes en la tecnología TAQMAN® (cebadores de PCR directa e inversa y la sonda de hibridación fluorogénica) ofrece la oportunidad para varias estrategias de detección de secuencias.
Por ejemplo, la discriminación de secuencia puede ocurrir a nivel del proceso de amplificación por PCR (ver, por ejemplo, Figura 4A, panel C) y/o al nivel de la hibridación de la sonda fluorogénica (ver, por ejemplo, Figura 4A, panel B). En ambas etapas, la discriminación se basa en el hibridación diferencial de los oligonucleótidos perfectamente emparejados versus los mal emparejados. En la tecnología MethyLight, la discriminación de secuencia al nivel de amplificación por PCR se produce al diseñar los cebadores y la sonda, o solo cebadores, o solo sondas, para superponerse a sitios potenciales de metilación del ADN (p. ej., dinucleótidos CpG). Un enfoque es simplemente una versión basada en fluorescencia de la técnica MSP (Herman y otros. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 9821-9826). Cada oligonucleótido (cebadores y sonda) puede cubrir desde cero hasta múltiples dinucleótidos CpG. Cada dinucleótido CpG puede dar como resultado dos variaciones de secuencia diferentes después de la conversión con bisulfito, en dependencia de si ese sitio en particular estaba metilado (mCpG) o no metilado (UpG). Por ejemplo, si un oligonucleótido se superpone a dos dinucleótidos CpG, entonces el número de posibles variantes de secuencia en el ADN genómico dentro de la región cubierta por ese oligonucleótido es 2 x 2 = 4. Si ambos cebadores y la sonda se superponen cada uno con dos CpG, entonces el número total de variantes contenidas dentro de la secuencia cubierta por los oligonucleótidos es 4 x 4 x 4 = 64. En teoría, podrían diseñarse reacciones de PCR separadas para analizar las cantidades relativas de cada una de estas 64 variantes potenciales de secuencias. Sin embargo, puede derivarse información significativa de metilación a partir del análisis de un número mucho menor de variantes al diseñar reacciones para las moléculas completamente metiladas y completamente no metiladas, que representan las dos variantes de secuencia más extremas en este ejemplo hipotético. La relación entre estas dos reacciones o la relación entre la reacción metilada y una reacción control proporciona una medida de la prevalencia de moléculas metiladas en este locus.
La tecnología MethyLight puede modificarse, además, para evitar la discriminación de secuencia en el nivel de amplificación por PCR. Si ni los cebadores ni la sonda se superponen a ningún dinucleótido CpG, entonces la reacción representa una amplificación no sesgada y puede servir como control para la cantidad de ADN de entrada. Una reacción de control útil ilustrativa es aquella en la que todo el amplicón está desprovisto de dinucleótidos CpG en la secuencia genómica no convertida. Cuando solo la sonda está diseñada para cubrir dinucleótidos CpG, la discriminación de secuencia se produce únicamente al nivel de hibridación de la sonda. En esta versión, todas las variantes de secuencia resultantes de la etapa de conversión con bisulfito de sodio se amplifican con la misma eficiencia, siempre que no haya sesgo de amplificación (ver, por ejemplo, Wamecke y otros, (1997) Nucleic Acids Res., 25: 4422-1426). En este caso, el diseño de sondas separadas para cada una de las diferentes variantes de secuencia asociadas a un patrón de metilación particular (2 x 2 = 4 sondas en el caso de dos CpG) permite una determinación cuantitativa de la prevalencia relativa de cada permutación de secuencia en el conjunto mixto de productos de PCR.
En ciertas modalidades los métodos de análisis proporcionan, además, una PCR específica para ADN no convertido. Esta PCR puede interrogar los SNP, mutaciones y/o translocaciones, etc. Con respecto a esto, se observa que la detección de mutaciones y metilación en un solo cartucho se ilustra en el Ejemplo 12 (ver, por ejemplo, Figuras 27Ay 27B). La detección de SNP, mutaciones, translocaciones y similares puede lograrse fácilmente mediante la inclusión de conjuntos de cebadores y sondas específicos para la detección de estas dianas.
Ensayos de PCR anidadas y PCR en formato múltiple.
En ciertas modalidades, el ADN metilado puede detectarse mediante el uso de métodos de PCR bien conocidos por los expertos en la técnica. En ciertas modalidades, se usa una reacción de PCR anidada para detectar dianas de metilación. En una modalidad ilustrativa, pero no limitante (ver, por ejemplo, Ejemplo 4), puede usarse un protocolo de PCR anidada donde la primera reacción de PCR de 15-20 ciclos no es específica para la metilación sino solo las secuencias de ADN convertidas (es decir, no cruzan CpG o, en los casos en que lo hacen, se usa R = purina o Y = pirimidina para atrapar secuencias molde tanto metiladas como no metiladas). La segunda reacción de qPCR (p. ej., una reacción de qPCR de 45 ciclos) puede contener cebadores y sondas que son específicos para 2-3 CpG metilados típicamente.
Se observará que, en ciertas modalidades, se realiza un análisis de MethyLight mediante el uso de una única sonda (ver, por ejemplo, Figura 4B). En este enfoque, mediante el uso de una única sonda, por ejemplo, específica de metilación, (PR3) junto con cebador directo (FW) e inverso (RV) específicos de metilación, la PCR específica de metilación para la sonda (PR3) proporciona una señal que depende de la metilación y la conversión de bisulfito para secuencias FW, RV y PR3.
En diversas modalidades, se contemplan ensayos de PCR en formato múltipleados. A modo de ilustración, la Figura 4C ilustra un enfoque de MethyLight mediante el uso de múltiples sondas (PR1, PR2,... PR5) que cada una tiene como diana regiones diferentes. La señal combinada de todas las sondas (PR1, PR2, PR3, PR4 y p R5) produce una medida de la cantidad/grado de metilación. En ciertas modalidades, cada sonda tiene su propio colorante/flúor específico de modo que sea detectable independientemente de las otras sondas. Así, incluso cuando una diana no está metilada, aún puede detectarse una señal, por ejemplo, si PR3 no está metilado, no habrá señal o habrá menos señal de las sondas restantes. La Figura 4D ilustra un enfoque de MethyLight mediante el uso de múltiples sondas (PR1 ... PR5) que cada una se dirige a la misma región, pero proporciona señales para diferentes patrones de metilación. Si bien el enfoque ilustrado en la Figura 4C puede proporcionar detección desde una región más grande, este enfoque de múltiples sondas en una única región más pequeña podría lograrse con cebadores o sondas específicas de secuencia que interroguen el grado de metilación en una secuencia específica después de la conversión de bisulfito.
En ciertas modalidades, puede usarse un ensayo en formato múltiple de complemento inverso para ambas cadenas (ver, por ejemplo, Figura 26). Después de la conversión de bisulfito, ambas cadenas pierden su complementariedad. Así, los conjuntos de cebadores y sondas pueden diseñarse para una cadena o la otra y dar como resultado amplicones únicos. Además de proporcionar "más oportunidades" para la detección, este enfoque potencialmente puede ayudar con la sensibilidad (en LOD, si solo una cadena u otra termina en el tubo, este enfoque aseguraría que se capte la señal). Este enfoque permite expandir el ensayo en formato múltiple para detectar diferentes CpG en el mismo sitio promotor. El en formato múltiple del complemento inverso proporciona más oportunidades para detectar la metilación de la diana y para captar la metilación heterogénea.
Los métodos anteriores son ilustrativos y no limitantes. Mediante el uso de las enseñanzas proporcionadas en la presente descripción, un experto en la técnica dispondrá de numerosas variaciones del análisis de m Sp y/o MethyLight, que podrán implementarse en un cartucho de reacción. e.g. como se describe en la presente descripción.
Secuenciación directa
En ciertas modalidades, el estado de metilación del ADN puede determinarse mediante el uso de métodos de secuenciación directa. En ciertas modalidades, el método puede usar PCR y secuenciación de ADN de didesoxinucleótidos estándar para determinar directamente los nucleótidos resistentes a la conversión de bisulfito (ver, por ejemplo, Frommer y otros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(5): 1827-1831). En varias modalidades, los cebadores están diseñados para ser específicos de cadena, así como también específicos de bisulfito (p. ej., cebadores que contienen citosinas que no son CpG de manera que no son complementarias al ADN no tratado con bisulfito), que flanquean (pero sin involucrar) el sitio de metilación de interés. Por lo tanto, amplificarán tanto las secuencias metiladas como las no metiladas, en contraste con la PCR específica de metilación. Todos los sitios de citosinas no metiladas se presentan como timinas en la secuencia amplificada resultante en la cadena sentido y como adeninas en la cadena antisentido amplificada. En ciertas modalidades, pueden usarse métodos de PCR anidada para mejorar el producto para la secuenciación.
En ciertas modalidades, la secuenciación puede realizarse en el cartucho. En otras modalidades, el cartucho puede acoplarse (p. ej., acoplado fluídico) a una máquina de secuenciación para proporcionar el análisis de secuenciación. Alternativamente, en ciertas modalidades, el producto amplificado puede transferirse manualmente desde el cartucho al sistema de secuenciación.
Análisis de fusión de alta resolución (HRM)
En ciertas modalidades, el análisis de fusión de alta resolución (HRM) puede usarse para diferenciar el ADN convertido del tratado con bisulfito no convertido. HRM es una técnica de PCR cuantitativa en la que los amplicones de PCR se analizan directamente mediante aumento de temperatura y la liberación resultante de un colorante fluorescente intercalado durante la fusión (ver, por ejemplo, Wojdacz y Dobrovic (2007) Nucleic Acids Res. 35 (6): e41). El grado de metilación, representado por el contenido de C-a-T en el amplicón, determina la rapidez de fusión y la consiguiente liberación del colorante. Este método permite la cuantificación directa, pero evalúa la metilación en la región amplificada como un todo en lugar de en sitios CpG específicos.
Pirosecuenciación
En determinadas modalidades, la pirosecuenciación (secuenciación por síntesis) puede usarse para analizar el ADN tratado con bisulfito sin usar la PCR específica de metilación (ver, por ejemplo, Colella y otros (2003). BioTechniques 35(1): 146-150; Tost y otros (2003) BioTechniques 35(1): 152-156; y similares). La secuenciación por síntesis difiere de la secuenciación de Sanger en que usa la detección de la liberación de fosfato en la incorporación de nucleótidos, en lugar de la terminación de la cadena con didesoxinucleótidos. La secuencia de ADN puede determinarse mediante la luz emitida tras la incorporación del siguiente nucleótido complementario por el hecho de que típicamente solo uno de cada cuatro de los posibles nucleótidos A/T/C/G se añade y está disponible a la vez, de modo que solo uno letra puede incorporarse en la plantilla monocatenaria (que es la secuencia a determinar).
Después de la amplificación por PCR de la región de interés, la pirosecuenciación puede usarse para determinar la secuencia convertida con bisulfito de regiones específicas (p. ej., sitios CpG). En ciertas modalidades, la relación de C-a-T en sitios individuales puede determinarse cuantitativamente basado en la cantidad de incorporación de C y T durante la extensión de la secuencia.
Una modificación de esta técnica puede usar cebadores específicos de alelos que incorporan polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en la secuencia de los cebadores de secuenciación, lo que permite un análisis por separado de los alelos maternos y paternos (ver, por ejemplo, Wong y otros (2006) BioTechniques 41(6): 734-739). Esta modificación es particularmente útil para el análisis de impronta genómica.
Análisis de escisión de base específica
En ciertas modalidades, la escisión específica de base/MALDI-TOF aprovecha las conversiones de bisulfito al añadir una etapa de escisión específica de base para mejorar la información obtenida de los cambios de nucleótidos (Ehrich y otros (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102 (44): 15785-15790). Al usar primero la transcripción in vitro de la región de interés en ARN (mediante la adición de un sitio promotor de la ARN polimerasa al cebador de PCR en la amplificación inicial), la RNasa A puede usarse para escindir el transcrito de ARN en sitios específicos de bases. La RNasa A escinde el ARN específicamente en los ribonucleótidos de citosina y uracilo y la especificidad de base se logra al añadir dTTP resistente a la escisión, e incorporarlo cuando se desea una escisión específica de citosina (específica de C) e incorporar dCTP cuando se desea la escisión específica de uracilo (específica de U). Los fragmentos escindidos pueden analizarse luego mediante MALDI-TOF u otros métodos. El tratamiento con bisulfito da como resultado la introducción/eliminación de sitios de escisión mediante conversiones de C-en-U o un cambio en la masa del fragmento mediante conversiones de G-en-A en la cadena inversa amplificada. La escisión específica de C cortará específicamente en todos los sitios CpG metilados. Al analizar los tamaños de los fragmentos resultantes (p. ej., mediante el uso de MALDI-TOF, electroforesis capilar, electroforesis en microchip y similares), es posible determinar el patrón específico de metilación del ADN de los sitios CpG dentro de la región, en lugar de determinar el grado de metilación de la región como un todo.
Análisis de conformación monocatenaria sensible a metilación (MS-SSCA)
El análisis de conformación de una sola cadena sensible a metilación (MS-SSCA) se basa en el método de análisis de conformación de polimorfismo de una sola cadena (SSCA) desarrollado para el análisis de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) (Bianco y otros (1999) Hum. Mutat. 14(4): 289-293). Ss CA diferencia entre fragmentos de ADN monocatenario de tamaño idéntico pero secuencia distinta basado en la migración diferencial en la electroforesis no desnaturalizante. En MS-SSCA, esto se usa para distinguir entre regiones amplificadas por PCR tratadas con bisulfito que contienen los sitios CpG de interés. Aunque SSCA carece de sensibilidad cuando sólo está presente una diferencia de un solo nucleótido, el tratamiento con bisulfito con frecuencia produce una serie de conversiones de C-a-T en la mayoría de las regiones de interés, y la sensibilidad resultante puede ser alta. En ciertas modalidades, MS-SSCA puede proporcionar, además, un análisis semicuantitativo del grado de metilación del ADN en base a la relación de intensidades de banda. Típicamente, sin embargo, MS-SSCA evalúa todos los sitios CpG como un todo en la región de interés en lugar de los sitios de metilación individuales.
Dianas de metilación
Como se señaló anteriormente, la metilación del ADN es de interés en un amplio número de contextos. En ciertas modalidades, la cantidad de metilación del ADN es de interés clínico, particularmente en oncología. Los patrones de mutilación del ADN aberrantes (hipermetilación e hipometilación en comparación con el tejido normal) se han asociado con un gran número de neoplasias malignas humanas. La hipermetilación ocurre típicamente en islas CpG en la región promotora y está asociada con la inactivación de genes. Un nivel más bajo de metilación del ADN de los leucocitos se asocia con muchos tipos de cáncer (Zhang y otros (2011) Epigenetics, 6(3): 293-299). Además, la hipometilación global se ha implicado en el desarrollo y progresión del cáncer a través de diferentes mecanismos. Típicamente, hay hipermetilación de genes supresores de tumores e hipometilación de oncogenes (ver, por ejemplo, Lund y otros (2004) J. Biol. Chem. 279(28): 29147-29154).
Con respecto a esto, se observa que la metilación del ADN proporciona un indicador de pronóstico para el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) en Estadio I. En particular, se descubrió que la hipermetilación de cinco genes estaba asociada significativamente con una supervivencia sin recaída (RFS) más corta en el NSCLC en Estadio I: HIST1H4F, PCDHGB6, NPBWR1, ALX1, y HOXA9. Una firma basada en el número de eventos hipermetilados distinguió a los pacientes con NSCLC en estadio I de alto y bajo riesgo (ver, por ejemplo, Sandoval y otros (2013) J. Clin. Oncol., 4140-4147).
De manera similar, se ha observado que los gliomas malignos pueden tener el gen MGMT inactivado debido a la metilación de su región promotora. La predicción, nacida de la investigación actual, es que al metilar el gen MGMT, puede ocurrir una mejor respuesta a la quimioterapia (ya que el tumor no tiene medios para reparar el daño del ADN inducido por el agente alquilante). En los gliomas, la metilación del promotor MGMT es un marcador pronóstico favorable en el contexto de radiación o quimioterapia (ver, por ejemplo, //neurosurgery.ucsd.edu/brain-tumor-research-mgmt/).
A modo de ilustración adicional, la Tabla 3 ilustra varios genes que están hipermetilados en ciertos cánceres.
La Tabla 3 muestra ejemplos ilustrativos, pero no limitantes, de genes hipermetilados en cánceres esporádicos (ver, por ejemplo, Baylin (2005) Nature Clinical Practice Oncology, 2: S4-S11).
Figure imgf000017_0001
En diversas modalidades ilustrativas, pero no limitantes, se contempla la medición de la metilación de uno o más de los promotores de los siguientes genes: APC, ARF, CDKN2B, CDKN2A, BRCA1, VLH, hMLHI, MGMT. RASSF1A, ADAMTS1, BNC1, HIST1H3C, HOXB4, RASGRF2, TM6SF1, AKR1B1, HIST1H4F, PCDHGB6, NPBWR1, ALX1, y HOXA9.
Cáncer pancreático.
En ciertas modalidades, el estado de metilación se determina para uno o más promotores en los que el estado de metilación es un marcador de la presencia y/o pronóstico de cáncer de páncreas. Se determinó que la frecuencia de metilación de uno o más de ADAMTS1o BNC1, puede usarse para detectar y/o estadificar el cáncer de páncreas. Así, los marcadores de metilación ilustrativos, pero no limitantes para el cáncer de páncreas incluyen, pero no se limitan a ADAMTS1 y/o BNC1. Los cebadores y sondas ilustrativos para la detección de metilación en los promotores de estos genes se muestran en la Tabla 4, más abajo (se hace referencia a la Tabla 5 para secuencias particulares), y en la Tabla 10 en el Ejemplo 4). En ciertas modalidades, se proporcionan cebadores y sondas para la detección de metilación en la cadena directa del ADN convertido y/o para la detección de metilación en la cadena inversa del ADN convertido.
Cáncer de mama.
En ciertas modalidades, el estado de metilación se determina para uno o más promotores en los que el estado de metilación es un marcador de la presencia y/o pronóstico de cáncer de mama. Los marcadores de metilación ilustrativos para el cáncer de mama incluyen, pero no se limitan a RASSF1A, y/o AKR1B1, y/o HOXB4, y/o HIST1H3C, y/o RASGRF2, y/o TM6SF1. Los cebadores y sondas ilustrativos para la detección de metilación en los promotores de estos genes se muestran en la Tabla 4, más abajo (se hace referencia a la Tabla 5 para secuencias particulares), y en la Tabla 9 en el Ejemplo 4.
En ciertas modalidades, el estado de mutilación se determina para uno o más promotores en los que el estado de mutilación es un marcador de la presencia o probabilidad de cáncer de pulmón. Los marcadores de metilación ilustrativos para el cáncer de pulmón incluyen, pero no se limitan a CDO1, SOX17, TAC1, y/o HOXA7.
Los métodos descritos en la presente descripción no se limitan a determinar la metilación de los promotores de estos genes. Mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción, es posible la metilación de esencialmente cualquier diana de interés.
Sin embargo, se observará que la medición de la metilación del ADN no necesita limitarse a la medición de la metilación en islas CPG en los promotores. Por ejemplo, se ha demostrado que la metilación del cuerpo génico puede, además, alterar la expresión génica y puede proporcionar una diana terapéutica en el cáncer (ver, por ejemplo, Yang y otros (2014) CancerCell, 26(4): 577-590).
Adicionalmente, la medición de la metilación del ADN tiene aplicaciones pronósticas/terapéuticas para patologías distintas del cáncer. Por ejemplo, la metilación aberrante en regiones de los cromosomas 13, 18, 21, X e Y puede usarse para diagnosticar el síndrome de Down (ver, por ejemplo, Patsalis y otros (2012) Exp. Opin. Biol. Ther. 12(Supl. 1): S155-S161). Debido a que el ADN fetal y el ADN materno están metilados de manera diferencial, el ADN libre de células en el plasma materno puede proporcionar una fuente de ADN fetal, que puede obtenerse de forma no invasiva y usarse para evaluar el estado de metilación de los cromosomas antes mencionados (u otros cromosomas o genes).
Como se indicó anteriormente, en ciertas modalidades, los cartuchos y métodos descritos en la presente descripción se usan, además, para determinar los niveles de ARNm, por ejemplo, para determinar la expresión de varias metiltransferasas. En ciertas modalidades, el nivel de expresión del ARN se determina para una metiltransferasa seleccionada del grupo que consiste en DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B, y TNMT3L.
Cebadores/Sondas y análisis en formato múltiple
En varias modalidades, los métodos descritos en la presente descripción pueden implicar reacciones de PCR anidadas y los cartuchos descritos en la presente descripción pueden contener reactivos (p. ej., cebadores y sondas) para tales reacciones de PCR anidadas. Por ejemplo, en ciertas modalidades, se detecta la metilación de uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis genes (genes promotores). Dado que la conversión con bisulfito de un ADN cambia los residuos de citosina en uracilo, pero no se afectan los residuos de 5-metil citosina, las cadenas directa e inversa del ADN convertido (convertido con bisulfito) ya no son complementarias. En consecuencia, es posible interrogar las cadenas de avance y retroceso de forma independiente (p. ej., en una reacción de PCR en formato múltiple) para proporcionar especificidad y sensibilidad adicionales a la detección de metilación. En tales casos, el ensayo de una única diana puede implicar un ensayo en formato múltiple doble, mientras que el ensayo de dos, tres, cuatro, cinco o seis genes diana puede implicar ensayos en formato múltiple cuádruple, séxtuple, 8-ple, 10-ple o 12-ple. En ciertas modalidades, los ensayos pueden dividirse en dos reacciones en formato múltiple, p. ej., para analizar de manera independiente las cadenas directas e inversas. Sin embargo, se reconocerá que cuando se dividen en múltiples ensayos en formato múltiple, la agrupación de ensayos no necesita ser directa o inversa, sino que puede incluir simplemente conjuntos de cebadores/sondas que son más compatibles para condiciones particulares de reacción de PCR.
Como se indicó anteriormente, pueden identificarse numerosos cánceres y/o estadificarlos y/o un pronosticarlos, determinado por la detección/caracterización del estado de metilación en la cadena directa y/o inversa de los promotores de genes cuya metilación (o falta de ella) está asociada con un cáncer. Dianas de genes (promotores) ilustrativos asociados con varios cánceres se describieron anteriormente y se muestran a continuación en la Tabla 4. Se reconocerá que la metilación (cadena directa y/o cadena inversa) de uno o más de los genes que se muestran en la Tabla 4 para cada cáncer, puede determinarse para identificar y/o estadificar y/o proporcionar un pronóstico para el cáncer indicado. En ciertas modalidades, el estado de metilación de todos los genes mostrados para un cáncer particular (cadena directa y/o inversa) puede determinarse en una única reacción de PCR múltiple.
Tabla 4. Cebadores y sondas ilustrativos para la detección de metilación en los promotores de genes asociados con varios cánceres mediante el uso de los dispositivos y métodos descritos en la presente descripción. Los números de cebador y sonda se refieren a los números de cebador/sonda (núm. de cebador/sonda) que se muestran en la Tabla 5, más abajo.
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000019_0001
Los cebadores y sondas ilustrativos para la detección de mutilación en los promotores de varios genes se muestran más abajo en la Tabla 5, más abajo, y en las Tablas 9 y 10 en el Ejemplo 4. En ciertas modalidades, estos cebadores y/o sondas son particularmente adecuados para su uso en una amplificación en formato múltiple.
Tabla 5. Cebadores y sondas ilustrativos para la detección de la metilación de varios promotores de genes. Tenga en cuenta que Y es C/T; R es A/G; C* es un funcionalizado opcionalmente (p. ej., para alterar la sonda Tm) C; T* es un funcionalizado opcionalmente (p. ej., para alterar la sonda Tm) T; A* es un funcionalizado opcionalmente (p. ej., para alterar la sonda Tm) A; N* es un nucleótido, opcionalmente un inactivador; dP es una pirimidina universal; dK es una purina universal.
Figure imgf000019_0002
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
Se observa que estos cebadores y sondas identifican las ubicaciones de varios fluoróforos e inactivadores. Sin embargo, se reconocerá que los fluoróforos e inactivadores particulares son ilustrativos y no limitantes y pueden emplearse numerosas estrategias de amplificación y/o detección en los cartuchos descritos en la presente descripción. En consecuencia, en diversas modalidades, los métodos y dispositivos descritos en la presente descripción pueden emplear muchas sondas de hibridación de ácidos nucleicos diferentes. Típicamente, para la generación de señales, las sondas usan un cambio en la fluorescencia de un fluoróforo debido a un cambio en su interacción con otra molécula o resto provocado por el cambio de la distancia entre el fluoróforo y la molécula o resto que interactúa. Alternativamente, se contemplan otros métodos para detectar un polinucleótido en una muestra, que incluyen, pero no se limitan, al uso de sondas marcadas radiactivamente.
Los ensayos basados en fluorescencia típicamente se sustentan en la generación de señales en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, o "FRET", de acuerdo con la cual un cambio en la fluorescencia es causado por un cambio en la distancia que separa un primer fluoróforo de un aceptor de energía de resonancia que interactúa, ya sea otro fluoróforo o un inactivador. Las combinaciones de un fluoróforo y una molécula o resto en interacción, incluidas las moléculas o restos inactivadores, se conocen como "pares FRET." El mecanismo de interacción del par FRET típicamente requiere que el espectro de absorción de un miembro del par se superponga al espectro de emisión del otro miembro, el primer fluoróforo. Si la molécula o resto que interactúa es un inactivador, su espectro de absorción típicamente se superpone al espectro de emisión del fluoróforo (ver, por ejemplo, Stryer (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 819-846; Selvin (1995) Meth. Enzymol. 246: 300-335; y similares). La interacción FRET eficiente se logra típicamente cuando los espectros de absorción y emisión del par tienen un gran grado de superposición. La eficiencia de la interacción FRET es linealmente proporcional a esa superposición. Típicamente, una gran magnitud de señal (i.e., se desea un alto grado de superposición). Los pares FRET, incluidos los pares fluoróforo-inactivador, se eligen típicamente sobre esa base.
Se conocen diversas sondas de hibridación de ácido nucleico marcadas y ensayos de detección que usan FRET y pares FRET. Uno de estos esquemas es el descrito por Cardullo y otros. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8790-8794y en Heller y otros EP 0070685. Usa una sonda que comprende un par de oligodesoxinucleótidos complementarios a regiones contiguas de una cadena de ADN diana. Una molécula sonda contiene un marcador fluorescente, un fluoróforo, en su extremo 5', y la otra molécula sonda contiene un marcador fluorescente diferente y un fluoróforo, en su extremo 3'. Cuando la sonda se hibrida con la secuencia diana, las dos etiquetas se acercan mucho entre sí. Cuando la muestra es estimulada por luz de una frecuencia apropiada, ocurre la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de una etiqueta a la otra. FRET produce un cambio medible en la respuesta espectral de las etiquetas, lo que indica la presencia de dianas. Una etiqueta podría ser "inactivador", que puede ser, entre otros, un resto interactivo (o molécula) que libera la energía aceptada en forma de calor.
Otro tipo de ensayo de sonda de hibridación de ácido nucleico que usa un par FRET es el ensayo "TaqMan®" descrito en Gelfand y otros Patente de EE. UU. núm. 5,210,015, y Livak y otros Patente de EE. UU. núm. 5,538,848. La sonda es típicamente un oligonucleótido monocatenario marcado con un par FRET. En un ensayo TaqMan®, una ADN polimerasa libera uno o múltiples nucleótidos mediante la escisión de la sonda oligonucleotídica cuando se hibrida con una cadena diana. Esa liberación proporciona una forma de separar la etiqueta del inactivador y la etiqueta del fluoróforo del par FRET.
En ciertas modalidades, sondas fluorescentes no FRET, como las descritas en, p. ej., Tyagi y otros, Patente de EE. UU. núm. 6,150,097 también pueden usarse. Por ejemplo, la patente de Tiyagi y otros describe cómo los cambios en los espectros de absorción del par de marcadores pueden usarse como una señal detectable como una alternativa al cambio en la fluorescencia. Cuando se usa un cambio en la absorción, el par de marcadores puede incluir dos cromóforos cualesquiera, es decir, fluoróforos, inactivadores y otros cromóforos. El par de etiquetas puede ser incluso cromóforos idénticos.
En algunas modalidades, se introducen colorantes y otros restos, tales como inactivadores, en cebadores y/o sondas que se usan en los métodos y cartuchos descritos en la presente descripción. En ciertas modalidades, tales colorantes e inactivadores incluyen, pero no se limitan a colorantes (flúores) adecuados para su uso como sondas FRET. En ciertas modalidades, los colorantes y/o inactivadores comprenden nucleótidos modificados. Un "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido que ha sido modificado químicamente, pero que aún funciona como nucleótido. En algunas modalidades, el nucleótido modificado tiene un resto químico, tal como un colorante o inactivador, unido covalentemente, y puede introducirse en un polinucleótido, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida del polinucleótido. En algunas modalidades, el nucleótido modificado incluye uno o más grupos reactivos que pueden reaccionar con un colorante o inactivador antes, durante o después de la incorporación del nucleótido modificado en el ácido nucleico. En algunas modalidades, el nucleótido modificado es un nucleótido modificado con amina, es decir, un nucleótido que ha sido modificado para tener un grupo amina reactivo. En algunas modalidades, el nucleótido modificado comprende un resto de base modificado, tal como uridina, adenosina, guanosina y/o citosina. En algunas modalidades, el nucleótido modificado con amina se selecciona de 5-(3-aminoalil)-UTP; 8-[(4-amino)butil]-amino-ATP y 8-[(6-amino)butil-amino-ATP; N6-(4-amino)butil-ATP, N6-(6-amino)butil-ATP, N4-[2,2-oxi-bis-(etilamina)]-CTP; N6-(6-Amino)hexil-ATP; 8-[(6-amino)hexil]-amino-ATP; 5-propargilamino-CTP, 5-propargilamino-UTP. En algunas modalidades, los nucleótidos con diferentes restos de nucleobase se modifican de manera similar, por ejemplo, 5-(3-aminoalil)-GTP en lugar de 5-(3-aminoalil)-UTP. Muchos nucleótidos modificados con amina están disponibles comercialmente en, por ejemplo, Applied Biosystems, Sigma, Jena Bioscience y TriLink. En la Tabla 6 se muestra una lista ilustrativa, pero no limitante, de flúores adecuados.
Tabla 6. Fluoróforos ilustrativos, pero no limitantes (marcadores fluorescentes) para usar en los cebadores y/o sondas descritos en la presente descripción.
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
Si el ensayo está diseñado para detectar una secuencia de ADN diana, entonces solo se necesita usar una sonda de hibridación fluorescente y, en ciertas modalidades, FAM, TET o HEX (o una de sus alternativas enumeradas en la Tabla 7) será un buen fluoróforo para etiquetar la sonda. Estos fluoróforos pueden excitarse y detectarse fácilmente en varios termocicladores espectrofluorométricos. Además, debido a la disponibilidad de derivados de fosforamiditas de estos fluoróforos y la disponibilidad de columnas de vidrio de poro controlado enlazadas con inactivador, las sondas de hibridación fluorescentes con estos marcadores pueden sintetizarse completamente en un proceso de síntesis de ADN automatizado, con la ventaja de ser relativamente menos costosas y la fabricación de sondas que requiere menos mano de obra.
Tabla 7. Marcadores de fluoróforos ilustrativos adicionales para sondas de hibridación fluorescentes.
Figure imgf000034_0002
En ciertas modalidades, se detectan múltiples genes diana en una única reacción en formato múltiple. En algunas modalidades, cada sonda que se dirige a un gen diferente es espectralmente distinguible (detectablemente diferente) de las otras sondas usadas en la reacción en formato múltiple. Los expertos en la técnica conocen combinaciones de sondas adecuadas para la detección en formato múltiple. Por ejemplo, las combinaciones ilustrativas de fluoróforos detectablemente diferentes en cuatro sistemas en formato de múltiples dianas incluyen, pero no se limitan a:
1) FAM, TMR, Texas Rojo y Cy5;
2) FAM, TET, TMR y Texas Rojo;
3) FAM, HEX, Texas Rojo y Cy5; y
4) FAM, Cy3, Texas Rojo y Cy5.
Una combinación ilustrativa de fluoróforos diferentes detectables en un sistema en formato múltiple de cinco dianas es FAM, TET, TMR, Texas Rojo y Cy5. Las combinaciones ilustrativas de diferentes fluoróforos detectables en un sistema en formato múltiple de seis dianas incluyen, pero no se limitan a:
1) FAM, TET, HEX, TMR, ROXyTexas Rojo; y
2) FAM, HEX, LC rojo 610, LC rojo 640, LC rojo 670 y LC rojo 705.
Se reconocerá que estas combinaciones de fluoróforos son ilustrativas y no limitantes, y los expertos en la técnica dispondrán de muchos otros fluoróforos.
Como se indicó anteriormente, para el diseño de sondas de hibridación fluorescentes que usan transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), se deben elegir pares de inactivador-fluoróforo que tengan suficiente superposición espectral. Los fluoróforos con un máximo de emisión entre 500 y 550 nm, tales como FAM, TET y HEX, se inactivan mejor con inactivadores con máximos de absorción entre 450 y 550 nm, tales como dabcilo, BHQ-1 y similares (ver, por ejemplo, Tabla 8 para etiquetas ilustrativas de inactivadores). Los fluoróforos con un máximo de emisión superior a 550 nm, tales como las rodaminas (incluidas TMR, ROX y Texas Rojo) y los colorantes Cy (incluidos Cy3 y Cy5) se inactivan eficazmente mediante inactivadores con máximos de absorción superiores a 550 nm (incluido BHQ-2).
Para el diseño de sondas de hibridación fluorescentes que usan inactivación por contacto, cualquier inactivador no fluorescente puede servir como un buen aceptor de energía del fluoróforo. Por ejemplo, Cy3 y Cy5 son efectivamente inactivados por los inactivadores BHQ-1 y BHQ-2.
Tabla 8. Etiquetas de inactivador ilustrativas para sondas de hibridación fluorescentes.
Figure imgf000035_0001
En ciertas modalidades, los nucleótidos pueden inactivar la fluorescencia de los fluoróforos, y la guanosina el inactivador más eficaz, seguido de la adenosina, la citidina y la timidina. Generalmente, los fluoróforos con una longitud de onda de excitación entre 500 y 550 nm se inactivan más eficazmente con nucleótidos que los fluoróforos con longitudes de onda de excitación más largas. Al diseñar sondas de hibridación fluorescentes, puede ser conveniente evitar colocar un marcador de fluoróforo directamente al lado de una guanosina, para asegurar señales de fluorescencia más altas del fluoróforo.
El efecto estabilizador de algunos pares de inactivadores-fluoróforos que interactúan mediante inactivación por contacto puede tener consecuencias importantes para el diseño de sondas de hibridación (ver, por ejemplo, Marras y otros (2002) Nucleic Acids Res. 30: e122; Johansson y otros (2002) J. Am. Chem. Soc. 124: 6950-6956). Por ejemplo, se ha observado que las sondas de hibridación marcadas con un fluoróforo inactivado por BHQ-1 o BHQ-2 muestran un aumento en la temperatura de fusión del híbrido de aproximadamente 4 °C, en comparación con las sondas de hibridación con la misma secuencia de sonda, pero marcadas con fluoróforos inactivados por dabcilo. Además, se ha observado una fuerte afinidad entre los colorantes Cy, Cy3 y Cy5, y los inactivadores Black Hole, BHQ-1 y BHQ-2.
En vista de lo anterior y de los Ejemplos y enseñanzas proporcionados en la presente descripción, estarán disponibles numerosas combinaciones de cebador/sonda para usar en los métodos y cartuchos descritos en la presente descripción.
Cartucho, módulos y sistemas para análisis de metilación del ADN.
En ciertas modalidades, se proporcionan cartuchos para realizar los métodos descritos en la presente descripción (por ejemplo, determinación de la metilación del ADN y, opcionalmente, expresión del ARN). En ciertas modalidades, el cartucho comprende una columna que comprende un primer material de matriz, una cámara de recepción de muestras, un canal o cámara de temperatura controlada, una pluralidad de cámaras que contienen reactivos y/o tampones, y cuando está en uso, al menos una de dichas cámaras contiene un reactivo de conversión de ADN por ejemplo, DABSO y/o un reactivo bisulfito), y al menos una de dichas cámaras contiene un tampón de desulfonación/elución, y en donde dicho cartucho comprende opcionalmente una segunda columna que comprende dicho segundo material de matriz. En ciertas modalidades, el cartucho está configurado de modo que, en uso, el cartucho comprende una cámara que contiene un reactivo que comprende tiocianato de guanidinio etanol (GTC-EtOH). En ciertas modalidades, la segunda columna está ausente, mientras que en otras modalidades está presente la segunda columna. En ciertas modalidades, el canal o cámara de temperatura controlada puede ser simplemente un canal o cámara de calentamiento, o puede ser un canal o cámara de termociclado. En ciertas modalidades, el cartucho comprende, además, un segundo canal o cámara de calentamiento (por ejemplo, un segundo canal o cámara de termociclado). En ciertas modalidades, el cartucho está configurado para que se produzca una etapa de conversión de ADN (por ejemplo, incubación con bisulfito) y/o una etapa de desulfonación en el mismo tubo o cámara de reacción en la cual se realizan posteriormente una o más reacciones de PCR.
En ciertas modalidades, el reactivo bisulfito se proporciona como un componente del cartucho. En otras ciertas modalidades, el cartucho está configurado para que el reactivo bisulfito se añada al cartucho en el momento en que se coloca la muestra en el cartucho o cerca de ese momento. En ciertos casos, el reactivo bisulfito se añade directamente a una cámara en el cartucho, mientras que en otras modalidades, el reactivo bisulfito se introduce en un puerto de carga en el cartucho (por ejemplo, un puerto de inyección) para introducir el reactivo bisulfito en el cartucho. En ciertas modalidades, el reactivo bisulfito se introduce en el cartucho por el sistema que opera el cartucho (por ejemplo, un módulo de procesamiento) mientras el cartucho está en funcionamiento para determinar la metilación del ADN.
En ciertas modalidades, el reactivo que comprende tiocianato de guanidinio (por ejemplo, GTC-EtOH) se proporciona como un componente del cartucho. En ciertas otras modalidades, el cartucho está configurado para que el reactivo que comprende tiocianato de guanidinio se añada al cartucho en el momento o cerca del momento en que se coloca la muestra en el cartucho. En ciertos casos, el reactivo que comprende tiocianato de guanidinio se añade directamente a una cámara en el cartucho, mientras que en otras modalidades, el reactivo que comprende tiocianato de guanidinio se introduce en un puerto de carga en el cartucho (por ejemplo, un puerto de inyección) para introducir el reactivo bisulfito en el cartucho. En ciertas modalidades, el reactivo que comprende tiocianato de guanidinio se introduce en el cartucho por el sistema que opera el cartucho (por ejemplo, un módulo de procesamiento) mientras el cartucho está en funcionamiento para determinar la metilación del ADN.
En varias modalidades ilustrativas, pero no limitantes, el reactivo de conversión (por ejemplo, reactivo bisulfito) comprende un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en metabisulfito de sodio, bisulfito de potasio, bisulfito de cesio, DABSO y bisulfito de amonio. En ciertas modalidades, el bisulfito se proporciona en una mezcla de reactivos que comprende captadores (por ejemplo, Trolox, hidroquinona, etc.) para prevenir la oxidación de sulfitos y/o catalizadores. En ciertas modalidades, el bisulfito se proporciona en una mezcla de reactivos que comprende poliaminas como catalizadores.
En diversas modalidades, el primer material de matriz y/o dicho segundo material de matriz, cuando están presentes, comprenden un material que se selecciona del grupo que consiste en vidrio o sílice, una resina de intercambio iónico e hidroxiapatita.
En varias modalidades, el cartucho comprende una o más cámaras (por ejemplo, 1 cámara, 2 cámaras, 3 cámaras, 4 cámaras, etc.) cada una contiene uno o más reactivos que se seleccionan del grupo que consiste en cebadores de PCR específicos de metilación, sondas de PCR específicas de metilación, enzima(s) de PCR (por ejemplo, polimerasa), transcriptasa inversa y tampón de reacción de PCR.
En ciertas modalidades, el cartucho contiene una o más cámaras que contienen cebadores específicos para secuencias metiladas y/o no metiladas convertidas con bisulfito. En ciertas modalidades, el cartucho comprende una o más cámaras que contienen cebadores y sondas para un protocolo de PCR MethyLight. En ciertas modalidades, el cartucho comprende una o más cámaras que contienen reactivos para las reacciones PCR TaqMan. En ciertas modalidades, el cartucho comprende una o más cámaras que contienen una o más sondas fluorescentes que son marcadores de secuencias metiladas amplificadas y/o una o más sondas fluorescentes que son marcadores de secuencias no metiladas amplificadas. En ciertas modalidades, las sondas comprenden un colorante indicador fluorescente y un colorante inactivador, donde las sondas proporcionan una señal tras la escisión por la actividad nucleasa 5'a 3' de la ADN polimerasa Taq. En ciertas modalidades, el cartucho comprende una pluralidad de sondas, cada una específica para una región metilada diferente en una región amplificada de interés. En ciertas modalidades, el cartucho comprende una única sonda específica para una región metilada en una región amplificada de interés. En ciertas modalidades, el cartucho comprende una pluralidad de sondas, cada una específica para la misma región metilada en una región amplificada de interés.
Los cebadores y sondas ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, cebadores y/o sondas para determinar la metilación de una región promotora de un gen seleccionado del grupo que consiste en APC, ARF, CDKN2B, CDKN2A, BRCA1, VLH, hMLHI, MGMT.RASSF1A, ADAMTS1, BNC1, HIST1H3C, HOXB4, RASGRF2, TM6SF1, AKR1B1, HISTIH4F, PCDHGB6, NPBWR1, ALX1, y HOXA9. En ciertas modalidades, los cebadores y/o sondas se seleccionan para determinar la metilación de una región promotora de un gen que se selecciona del grupo que consiste en MGMT, RASSF1A, ADAMTS1, BNC1, HIST1H3C, HOXB4, RASGRF2, TM6SF1, y AKR1B1. En varias modalidades, los cebadores y/o sondas de PCR y/o enzimas se proporcionan como perlas, por ejemplo, como se describe en la Publicación de Patente de EE. UU. núm: 2006/0068399.
En varias modalidades, el cartucho está configurado de modo que la cámara de recepción de muestras, dicha(s) columna(s), la pluralidad de cámaras y el canal o cámara de temperatura controlada, estén selectivamente en comunicación de fluidos. En ciertas modalidades, la comunicación de fluidos selectiva se proporciona mediante canales y válvulas de microfluidos. En ciertas modalidades, la comunicación selectiva de fluido se proporciona al proporcionar la cámara de recepción de muestras, dicha(s) columna(s), dicha pluralidad de cámaras, el canal o cámara de calentamiento o un puerto en el canal o cámara de calentamiento, dispuestos alrededor de una válvula central y selectivamente en comunicación de fluidos con un canal en dicha válvula central.
En ciertas modalidades, el cartucho está configurado de manera que, cuando está en uso, el cartucho comprende: una primera cámara que contiene una muestra; una segunda cámara que contiene una solución de tiosulfato de guanidinioetanol (GTC-EtOH); una tercera cámara que contiene un reactivo bisulfito; una cuarta cámara que contiene un tampón; una quinta cámara que contiene una solución de enjuague; y una sexta cámara que contiene un reactivo de elución/desulfonación. En ciertas modalidades, el cartucho comprende una séptima cámara que contiene cebadores y/o sondas de PCR y/o enzimas de PCR. En ciertas modalidades, el cartucho comprende una octava cámara que contiene, además, cebadores y/o sondas de PCR y/o enzimas de PCR.
Las Figuras 1A, 1B y 2 ilustran un cartucho adecuado para la práctica de los métodos descritos en la presente descripción. Los cartuchos ilustrados se basan en el cartucho GENEXPERt ® (Cepheid, Inc., Sunnyvale, CA). Como se muestra en la Figura 2, panel A, el cartucho 200 comprende un cuerpo de cartucho 202 que contiene una pluralidad de cámaras de reactivo y/o tampón 208. Las cámaras están dispuestas alrededor de un cilindro de jeringa central 206 que está en comunicación de fluidos con un cuerpo de válvula 210 (panel B y Figura 1B) y que está sellado con una junta 204. El cuerpo de la válvula 210 puede comprender una tapa 212 y todo el cuerpo del cartucho puede apoyarse sobre una base de cartucho 226. Se puede operar un "émbolo" que no se muestra para extraer líquido dentro del cilindro de la jeringa 206 y rotación del cilindro de la jeringa 206 y el cuerpo de válvula asociado 212 proporciona una comunicación de fluidos selectiva entre las cámaras 208 una cavidad 214 que puede contener un material de matriz como se describe en la presente descripción y funcionar como una columna. En varias modalidades, el cartucho comprende, además, uno o más canales o cámaras de temperatura controlada 216 que pueden, en ciertas modalidades, funcionar como cámaras de termociclado. Los canales o cámaras de temperatura controlada están, además, selectivamente en comunicación de fluidos con la cavidad 214 y/o las cámaras 208. Como se muestra en la Figura 1A, en ciertas modalidades, el cartucho proporciona ventanas ópticas para proporcionar detección en tiempo real de, por ejemplo, productos de amplificación, identidad de base en operaciones de secuenciación, y similares.
En ciertas modalidades, el cartucho 200 está configurado para su inserción en un módulo de reacción 300, por ejemplo, como se muestra en la Figura 3A. Como se ilustra en la Figura 3B, el módulo está configurado para recibir el cartucho 200. En ciertas modalidades, el módulo de reacción proporciona placas de calentamiento 308 para calentar la cámara o canal de temperatura controlada. El módulo puede incluir opcionalmente, además, un ventilador 304 para proporcionar enfriamiento donde el canal o cámara de temperatura controlada es un canal o cámara de termociclado. Pueden proporcionarse circuitos electrónicos 302 para pasar información (por ejemplo, información óptica) a una computadora para su análisis. En ciertas modalidades, el módulo puede contener bloques ópticos 306 para proporcionar excitación y/o detección de uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o más) señales ópticas que representan, por ejemplo., varias dianas de ácidos nucleicos. En varias modalidades, un conector eléctrico 312 puede proporcionarse para interconectar el módulo con un sistema (por ejemplo controlador de sistema o con una unidad discreta de análisis/controladora. Como se ilustra, en la Figura 3B, la muestra puede introducirse en el cartucho mediante el uso de una pipeta 310.
En ciertas modalidades, el módulo contiene, además, un controlador que opera un émbolo en el cilindro de la jeringa y la rotación del cuerpo de la válvula.
En ciertas modalidades se proporciona, un sistema (por ejemplo, una unidad de procesamiento). En la Figura 3C se muestra una modalidad ilustrativa, pero no limitante. En ciertas modalidades, la unidad de procesamiento comprende un recinto configurado para contener uno o más módulos de procesamiento de muestras donde cada módulo de procesamiento está configurado para contener y operar un cartucho extraíble como se describe en la presente descripción. En ciertas modalidades, el sistema está configurado para operar los módulos de procesamiento de muestras para realizar el procesamiento de muestras para determinar la metilación de uno o más ácidos nucleicos diana y, opcionalmente, para determinar el nivel de una o más secuencias de ARN/ADN diana dentro de un cartucho de muestra extraíble correspondiente, en donde el procesamiento de una muestra dentro del correspondiente cartucho de muestra extraíble realiza un método como se describe en la presente descripción. En ciertas modalidades, el sistema está configurado para contener un módulo de procesamiento de muestras. En ciertas modalidades, el sistema está configurado para contener al menos dos módulos de procesamiento de muestras, o al menos 4 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 8 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 12 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 16 módulos de procesamiento de muestras, o al menos al menos 20 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 24 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 28 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 32 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 64 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 128 módulos de procesamiento de muestras. En ciertas modalidades, el sistema proporciona una interfaz del usuario que permite al usuario ingresar instrucciones operativas y/o monitorear el funcionamiento de los cartuchos para determinar la metilación del ADN.
Si bien los métodos descritos en la presente descripción se describen principalmente con referencia al cartucho GENEXPERT® de Cepheid Inc. (Sunnyvale, CA) (ver, por ejemplo, Figura 1A), se reconocerá que, en vista de las enseñanzas proporcionadas en la presente descripción, los métodos pueden implementarse en otros sistemas de cartucho/microfluidos. Dichos sistemas de cartucho/microfluidos pueden incluir, por ejemplo, sistemas microfluídicos implementados mediante el uso de litografía blanda, sistemas microfluídicos micro/nanofabricados implementados mediante el uso de litografía dura y similares.
Cartucho de preparación de muestras de alto volumen (HVSP)
En varias modalidades, se proporcionan cartuchos para la preparación de grandes volúmenes de muestra. En ciertas modalidades, los cartuchos de preparación de muestras comprenden cartuchos GENEXPERT® modificados para la preparación de muestras de gran volumen (por ejemplo, como se muestra en la Figura 20). En ciertas modalidades, por ejemplo, cuando el cartucho se basa en un cartucho GENEXPERT® comprende uno o más canales o cámaras que comprenden una matriz de afinidad que une el ADN, una pluralidad de cámaras dispuestas alrededor de un conjunto de válvula central y selectivamente en comunicación de fluidos con dicho conjunto de válvula central donde el conjunto de la válvula central está configurado para acomodar un émbolo que es capaz de extraer fluido dentro o fuera de una cámara en comunicación de fluidos con la válvula central en donde dicha pluralidad de cámaras comprende al menos dos cámaras diferentes, cada una configurada para recibir hasta aproximadamente 4 ml (o hasta aproximadamente 5 ml) de solución de muestra (en ciertas modalidades, la cámara 2 tiene un volumen máximo de aproximadamente 4 ml, mientras que la cámara 3 tiene un volumen máximo de aproximadamente 4,5 ml), una cámara que contiene PEG (por ejemplo, PEG200), una cámara que contiene una solución alcalina (por ejemplo, solución de KOH) y una cámara que contiene un tampón (por ejemplo, Tris). En ciertas modalidades, la pluralidad de cámaras comprende al menos tres cámaras diferentes, cada una configurada para recibir hasta aproximadamente 4 ml (o hasta aproximadamente 5 ml) de solución de muestra. En ciertas modalidades, la pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene una solución de lavado (por ejemplo, solución de lavado de GTC-etanol que es típicamente tiocianato de guanidinio 1,25 M, Tris 25 mM pH 7,0, etanol al 50 %). En ciertas modalidades, el cartucho comprende una cámara configurada para la extracción de una muestra procesada. En ciertas modalidades, las cámaras de muestra, cuando están en uso, contienen solución de muestra, GTC y alcohol (por ejemplo, isopropanol). En ciertas modalidades, las cámaras de muestra, cuando están en uso, contienen solución de muestra, GTC y alcohol en volúmenes sustancialmente iguales. En ciertas modalidades, el cartucho, cuando está en uso, comprende 4 ml de solución de muestra GTC e isopropanol dispuestos en cada una de dichas cámaras configuradas para recibir una muestra. En ciertas modalidades, el cartucho proporciona una recuperación de ADN o ARN que es sustancialmente lineal con respecto al volumen de muestra entre 0,5 ml y aproximadamente 4 ml de muestra.
En ciertas modalidades, el cartucho HVSP está configurado para realizar una conversión de ADN (por ejemplo, conversión de bisulfito) para proporcionar un análisis de metilación. En consecuencia, en ciertas modalidades, el cartucho HVSP está configurado para contener, o para recibir inmediatamente o poco antes de su uso, un reactivo de conversión (por ejemplo un reactivo bisulfito, DABSO, etc.). En ciertas modalidades, el cartucho HVSP puede configurarse para contener, además, reactivos y proporcionar una desulfonación del ADN convertido. Alternativamente, en ciertas modalidades, la conversión se realiza en el cartucho HSVP mientras que la desulfonación y el análisis de metilación (por ejemplo, PCR) se realiza en el segundo cartucho (por ejemplo, como se ilustra en los flujos de trabajo que se muestran en la Figura 20B).
Cartucho de preparación de muestras ADNcf.
En ciertas modalidades, se proporciona un cartucho de preparación de muestras que es particularmente adecuado para la preparación (y análisis opcional) de ácidos nucleicos a partir de plasma o suero. En la Figura 17 se muestra una modalidad ilustrativa, pero no limitante. Como se ilustra en ese lugar, en ciertas modalidades, el cartucho comprende un canal o cámara que comprende una matriz de afinidad que une el ADN, una pluralidad de cámaras dispuestas alrededor de un conjunto de válvula central y selectivamente en comunicación de fluidos con el conjunto de válvula central donde el conjunto de válvula central está configurado para acomodar un émbolo que es capaz de extraer fluido dentro o fuera de una cámara en comunicación de fluidos con la válvula central donde la pluralidad de cámaras comprende: una cámara configurada para recibir hasta aproximadamente 5 ml o hasta aproximadamente 4 ml de solución de muestra; una cámara que contiene PEG (por ejemplo, PEG200); una cámara que contiene GTC-EtOH; una cámara que contiene una solución alcalina (por ejemplo, KOH); y una cámara que contiene un tampón (por ejemplo, Tris). En ciertas modalidades, la pluralidad de cámaras comprende, además, una cámara que contiene un reactivo de conversión (por ejemplo, un reactivo bisulfito). En ciertas modalidades, la pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene una solución de lavado (por ejemplo, lavado con GTC-etanol (típicamente tiocianato de guanidinio 1,25 M, Tris 25 mM pH 7,0, etanol al 50 %)). En ciertas modalidades, la pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene perlas que comprenden uno o más cebadores y/o sondas de PCR. En ciertas modalidades, la cámara que contiene PEG contiene aproximadamente 1 ml de PEG. En ciertas modalidades, la cámara que contiene una solución alcalina contiene aproximadamente 500 pl de solución. En ciertas modalidades, la cámara que contiene GTC-EtOH contiene aproximadamente 2 ml de GTC-EtOH. En ciertas modalidades, la cámara que contiene un tampón contiene aproximadamente 2 mL de tampón.
Se reconocerá que esta configuración es ilustrativa y, mediante el uso de las enseñanzas proporcionadas en la presente descripción, estarán disponibles otras numerosas configuraciones de cartuchos de preparación para un experto en la técnica.
Uso de DABSO como una alternativa al bisulfito
Fue un descubrimiento sorprendente que DABSO puede usarse para realizar una conversión de ADN de una manera análoga al uso de bisulfitos para la conversión de ADN y detección de metilación. En consecuencia, en ciertas modalidades, se proporcionan métodos para usar DABSO para convertir residuos de citosina en un ADN en uracilo, mientras que se dejan residuos de 5-metilcitosina sustancialmente intactos. En ciertas modalidades, los métodos implican poner en contacto una muestra que comprende ADN con DABSO para convertir el ADN, y desulfonar el ADN convertido para producir un ADN en el que los residuos de citosina se convierten en uracilo, pero los residuos de 5-metilcitosina no se afectan sustancialmente. En ciertas modalidades, el DABSO se proporciona a una concentración que varía desde aproximadamente 2 M hasta aproximadamente 5 M. En ciertas modalidades, el DABSO se proporciona a una concentración de aproximadamente 2,5 M. En ciertas modalidades, el DABSO se disuelve en una solución acuosa alcalina (por ejemplo, una solución de KOH). En ciertas modalidades, el reactivo que comprende DABSO comprende DABSO disuelto en una solución que comprende KOH.
En ciertas modalidades, los métodos implican calentar la solución de DABSO/ADN hasta una temperatura que varía de aproximadamente 55 °C a aproximadamente 90 °C. En ciertas modalidades, el DABSO se hace reaccionar con el ADN durante un período de tiempo que varía desde aproximadamente 15 minutos hasta aproximadamente 90 minutos. Una vez convertido el ADN, se desulfona (por ejemplo, al poner en contacto el ADN convertido con un reactivo alcalino (por ejemplo, solución de KOH). En ciertas modalidades, la conversión y/o desulfonación se realiza en el ADN unido a una columna, mientras que en otras modalidades la conversión y/o desulfonación se realiza en el ADN en solución.
Se proporcionan, además, métodos para analizar la metilación del ADN, donde los métodos implican proporcionar una muestra de ADN, convertir el ADN en la muestra mediante el uso de un reactivo DABSO, por ejemplo, como se describió anteriormente, y realizar PCR específica de metilación y/o secuenciación de ácidos nucleicos y/o análisis de fusión de alta resolución (HRM) sobre el ácido nucleico convertido para determinar la metilación de dicho ácido nucleico. En ciertas modalidades, proporcionar una muestra de ADN comprende preparar una muestra como se describe en la presente descripción (por ejemplo, mediante el uso de soluciones de lisis y/o cartuchos de preparación como se describe en la presente descripción.
Estuches
Estuches para detección de metilación
En ciertas modalidades, se proporcionan estuches para realizar los métodos descritos en la presente descripción. En una modalidad ilustrativa, los estuches comprenden un recipiente que contiene un cartucho de reacción como se describe en la presente descripción, un recipiente que contiene un reactivo de procesamiento de muestras como se describe en la presente descripción, y un recipiente que contiene un reactivo de conversión (por ejemplo, un reactivo bisulfito) como se describe en la presente descripción. En ciertas modalidades, el reactivo bisulfito se proporciona en una cámara del cartucho. En ciertas modalidades, el reactivo bisulfito se proporciona en un recipiente separado del cartucho. En ciertas modalidades, el reactivo de procesamiento de muestras se proporciona en una cámara del cartucho. En ciertas modalidades, particularmente cuando el reactivo de procesamiento de muestras comprende tiocianato de guanidinio, el reactivo de procesamiento de muestras se proporciona en un recipiente separado del cartucho.
Además, los estuches incluyen opcionalmente etiquetas y/o materiales instructivos que proporcionan instrucciones (es decir, protocolos) para el uso de los cartuchos descritos en la presente descripción para determinar la metilación del ADN y, opcionalmente, la expresión del ARN.
En ciertas modalidades, se proporciona un estuche para la determinación de la metilación del ADN donde el estuche comprende un recipiente que contiene un cartucho para determinar el estado de metilación de un ácido nucleico como se describe en la presente descripción. En ciertas modalidades, el estuche comprende, además, una solución de lisis como se describe en la presente descripción (por ejemplo, una solución de lisis para suero o plasma, por ejemplo, como se describe en la Tabla 11, y/o una solución de lisis para muestras FFPE, por ejemplo, como se describe en la Tabla 12). En ciertas modalidades, el estuche comprende un recipiente que contiene proteinasa K. En ciertas modalidades, el estuche contiene un reactivo de conversión (por ejemplo, un reactivo bisulfito) en el cartucho o en un recipiente separado del cartucho. En ciertas modalidades, el recipiente separado puede contener un volumen medido previamente del reactivo de conversión adecuado para una "corrida" del cartucho. En ciertas modalidades, el reactivo de conversión comprende un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en metabisulfito de sodio, bisulfito de potasio, bisulfito de cesio, bisulfito de amonio y DABSO. En ciertas modalidades, el estuche comprende un recipiente que contiene un reactivo de procesamiento de muestras. En ciertas modalidades, el reactivo de procesamiento de muestras comprende tiocianato de guanidio y/o etanol.
En varias modalidades, el estuche puede contener adicionalmente un cartucho para la preparación de muestras como se describe en la presente descripción (por ejemplo, como se ilustra en la Figura 20).
En ciertas modalidades, el estuche contiene materiales de instrucción que enseñan el uso de un cartucho para la determinación de la metilación del ADN. Donde se incluye un cartucho de preparación de muestras en el estuche, el estuche puede contener, además, materiales instructivos que enseñan el uso y funcionamiento del cartucho de preparación de muestras.
Estuche para conversión de ADN con DABSO y detección de mutilación
En ciertas modalidades, se proporcionan estuches para el uso de DABSO como reactivo de conversión, por ejemplo, en la detección del estado de mutilación de un ADN. En ciertas modalidades, los estuches comprenden un recipiente que contiene un reactivo de conversión que comprende DABSO y un recipiente que contiene un reactivo de desulfonación. En ciertas modalidades, el estuche comprende una columna que comprende una matriz de afinidad (por ejemplo, un material de matriz de sílice). En ciertas modalidades, los estuches comprenden un recipiente que contiene un tampón de unión y/o un recipiente que contiene un tampón de elución. En ciertas modalidades, el estuche comprende un recipiente que contiene un tampón de lavado.
En ciertas modalidades, el estuche comprende, además, una solución de lisis como se describe en la presente descripción (por ejemplo, una solución de lisis para suero o plasma, por ejemplo, como se describe en la Tabla 11, y/o una solución de lisis para muestras FFPE, por ejemplo, como se describe en la Tabla 12). En ciertas modalidades, el estuche comprende un recipiente que contiene proteinasa K.
En varias modalidades, el estuche puede contener adicionalmente un cartucho para la preparación de muestras como se describe en la presente descripción (por ejemplo, como se ilustra en la Figura 20).
En ciertas modalidades, el estuche contiene materiales de instrucción que enseñan el uso del estuche para convertir un ácido nucleico para la determinación del estado de metilación del ácido nucleico.
Si bien los materiales de instrucción en los estuches descritos anteriormente comprenden típicamente materiales escritos o impresos, no se limitan a ellos. Esta invención contempla cualquier medio capaz de almacenar tales instrucciones y comunicarlas a un usuario final. Dichos medios incluyen, entre otros, medios de almacenamiento electrónicos (por ejemplo, discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips), medios ópticos (por ejemplo, CD ROM) y similares. Dichos medios pueden incluir direcciones de sitios de Internet que proporcionan dichos materiales instructivos.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar la invención reivindicada.
Ejemplo 1
Para validar el método, se usó ADN genómico humano (HGDNA) como muestra de partida para monitorear la preparación de la muestra, la conversión de bisulfito, la limpieza de la muestra y la qPCR específica de metilación en un cartucho Cepheid GENEXPERT®. Con el fin de medir la eficiencia de conversión de bisulfito, se cargó la mitad de la mezcla de ADN-bisulfito y se calentó en el tubo del cartucho de 50 pl durante la etapa de conversión de bisulfito. Por lo tanto, en condiciones óptimas de conversión, aproximadamente la mitad del HGDNA se convierte y la otra mitad permanece sin convertir.
Los cebadores y las sondas Taqman para la etapa qPCR se diseñaron para un gen no convertido (HMBS (gen de mantenimiento de la hidroximetilbilano sintasa)) y un gen convertido (ACTB (beta actina)), y luego se cuantificó la eficiencia de la conversión mediante la comparación de los valores de umbral de ciclo (Ct). Ambos ACTB y HMBS se usan comúnmente como genes de referencia de copia única o baja y, así, esperamos números de copias similares por ng de HGDNA.
En la Figura 5 más abajo se muestra una corrida GENEXPERT® representativo para 300 ng de HGDNA, con la curva ACTB qPCR en verde y la curva HMBS qPCR en azul. La reacción de qPCR se corrió durante 45 ciclos con un ciclo de 3 temperaturas de 96 °C durante 5 segundos, 60 °C durante 15 segundos y 72 °C durante 15 segundos. En un ajuste manual de umbral de 20 unidades de fluorescencia, nosotros observamos un Ct de 31,7 para el gen ACTB convertido y un Ct de 32,7 para el gen HMBS no convertido. Es importante destacar que este resultado demuestra que nosotros podemos lograr una eficiencia de conversión de bisulfito casi óptima del HGDNA en nuestro cartucho a concentraciones fisiológicas relevantes de ADN que se encuentran en cortes de tejido FFPE y muestras de plasma/suero. Puede lograrse una mayor especificidad para las secuencias completamente convertidas mediante una reacción de qPCR anidada o al calentar toda la muestra. Sin embargo, ninguna opción sería absolutamente necesaria para la qPCR específica de metilación en GENEXPERT® porque los conjuntos de cebadores y sondas están diseñados para amplificar solo las secuencias convertidas. Así, las secuencias de ADN no convertidas restantes actuarían como ADN portador, que notablemente se añade con frecuencia durante los métodos de conversión de bisulfito, aislamiento de ADN y PCR.
Ejemplo 2
Las Figuras 6A y 6B muestran la linealidad de ACTB convertido. En particular, la Figura 6A muestra los resultados de una qPCR anidada de 15 ciclos para ACTB mediante el uso de hgDNA. Como puede verse en el panel de la derecha, la señal (valor Ct) es sustancialmente lineal entre aproximadamente 25 000 copias y aproximadamente 100 copias. La Figura 6B muestra los resultados de una qPCR anidada de 20 ciclos para ACTB mediante el uso de hgDNA. Estos gráficos demuestran la sensibilidad del cartucho para hgDNA. Los abandonos comienzan a ocurrir alrededor de las 20-50 copias con una sensibilidad de aproximadamente 25 copias de ADN convertido.
Las Figuras 7A, 7B y 7C muestran los resultados de qPCR para seis dianas metiladas (AKR1B1, HOXB4, TM6SF1, RASGRF2, y RASSF1A). La Figura 7A muestra los resultados de la qPCR anidada de 20 ciclos para los controles (25 ng de HSDNA y 5000 células MBA-453 cuyo ADN no se convierte con bisulfito). La Figura 7B muestra los resultados de la qPCR anidada de 20 ciclos para las seis dianas metiladas mediante el uso de ADN de células MBA-453 convertidas con bisulfito. Se muestra una señal fuerte para todos las dianas. HIST1H3C no se detectó de forma confiable. La Figura 7C muestra los resultados de la qPCR anidada de 20 ciclos para las seis dianas metiladas mediante el uso de ADN de células MBA-453 convertidas con bisulfito y está en un portador que comprende 1 pg de SS y 10 ng de HS ADN. Los abandonos se observaron en aproximadamente 100 células y más abajo, sin embargo, con el portador, hubo significativamente menos abandonos.
Ejemplo 3
La Figura 8 ilustra los resultados de una determinación de la eficiencia de conversión. La eficiencia de conversión es aproximadamente 66 % (~ 1 Ct) de la diferencia entre HMBS no convertido y ACTB convertido. El Ct ideal con 100 % de unión/elución, 100 % de conversión y 100 % de elución de unión es aproximadamente 24-25. Los experimentos parecen mostrar 50 % de unión/elución, 50-66 % de conversión y 50 % de unión/elución para una reducción de 10 veces y un Ct de aproximadamente 27.
La Figura 9 ilustra el aumento de la especificidad por el ADN convertido producido por qPCR anidada. La PCR anidada parece aumentar la especificidad para el ADN convertido, aumentar la especificidad para el ADN metilado y reducir los problemas de contaminación.
La Figura 10 ilustra la especificidad del cartucho de metilación. No se muestra ninguna especificidad para el ADN no convertido (panel superior) o para el ADN no metilado (panel inferior) excepto para HIST1H3C.
Las Figuras 11A y 11B muestran algunos flujos de trabajo ilustrativos, pero no limitantes para el análisis de metilación mediante el uso de un cartucho (por ejemplo, un cartucho GENEXPERT®). La Figura 11A ilustra un flujo de trabajo para el análisis de la metilación del a Dn en una muestra de suero. Como se ilustra en este flujo de trabajo, el suero se añade a un vial de reactivo de lisis y se mezcla/agita. A continuación, la muestra se dispensa en un puerto de muestra del cartucho. El cartucho se coloca en el sistema para análisis.
La Figura 11A ilustra un flujo de trabajo para el análisis de la metilación del ADN en una sección de tejido (por ejemplo., sección congelada o incluida en parafina fijada en formalina (FFPE)). Como se muestra allí, en una modalidad, se proporciona una sección de tejido (por ejemplo, una sección de FFPE de 4 pm). Se añaden reactivos de lisis FFPE (ver, por ejemplo, los documentos núms. p Ct /Us 2013/061863 (WO/2014/052551 para reactivos de lisis ilustrativos) y la mezcla puede calentarse. Puede añadirse etanol y agitarse la mezcla. A continuación, la muestra se dispensa en un puerto de muestra del cartucho. El cartucho se coloca en el sistema para análisis.
La Figura 12 ilustra los resultados para un botón de células FFPE para ALU convertido y RASSF1A metilado.
Ejemplo 4
Detección de marcadores para la monitorización del cáncer de mama
Materiales y Métodos:
Se añadieron 1000 células MBA-453 o 25 ng de ADN de esperma humano (HS) a 2,5 ml de tampón de unión (tiocianato de guanidinio 2,25 M, Tris 22,5 mM pH 7,0, Tween20 al 0,5 %, etanol al 50 % y antiespumante SE-15 al 0,005 %). La solución de 2,5 ml de células o ADN se añadió a la cámara 2 del cartucho de metilación Cepheid (diseño en la Figura 13A). Las cámaras restantes en el cartucho de metilación se llenaron de la siguiente manera: Cámara 3 - 3,2 ml de tampón de lavado (tiocianato de guanidinio 1,25 M, Tris 25 mM pH 7,0, etanol al 50 %), Cámara 4 - 90 pL de bisulfito de amonio 7 M, Cámara 5 - 4 ml de Tris 50 mM pH 8,5, Cámara 8 -1 ml de enjuague PEG200, Cámara 9: perlas de PCR cuantitativa que incluyen EZR (Taq) y TSR (ensayo en formato múltiple de 6 dianas de cáncer de mama para RASSF1A, AKR1B1, HOXB4, HIST1H3C, RASGRF2, TM6SF1, ver Tabla 9, a más abajo), Cámara 10-500 pL de KOH 15 mM y Cámara 11 -perlas anidadas que incluyen EZR (Taq) y TSR (ensayo en formato múltiple de 6 dianas de cáncer de mama para RASSF1A, AKR1B1, HOXB4, HIST1H3C, RASGRF2, TM6SF1). Luego, el cartucho de metilación se cargó en un Cepheid GeneXpert y se completó la totalidad del ensayo de metilación en el GeneXpert - la primera preparación de la muestra de ADN, la conversión de bisulfito, la segunda preparación de muestra de ADN posterior a la conversión, la desulfonación y el ciclo de 20 reacciones de PCR cuantitativas anidadas.
En la Figura 13B se muestra un diagrama de flujo que ilustra el protocolo de metilación. Se observa que el PEG200 se llenó en la cámara de desechos 8 y, una vez que comienza el ensayo, el PEG200 se dispensa en la Cámara 1. El PEG200 es un líquido viscoso que no puede cargarse directamente en la cámara 1 más pequeña. Además, la cámara 1 actúa como una cámara de aire cuando el cartucho se carga por primera vez antes de convertirse en la cámara PEG200. Así, el ensayo comienza con la Cámara 1 = aire y la Cámara 8 = PEG200 y se cambia rápidamente a la Cámara 1 = PEG200 y la Cámara 8 = Desechos después de cargar el cartucho.
Los números se muestran en el "Volumen inicial." La columna de la Figura 13A simplemente se refiere a los volúmenes de líquido. En este caso, hay solo 2x perlas en la cámara 11- 1x perla TSR (cebador y sondas para las 6 dianas) y 1x perla EZR (Phoenix Taq). Estas perlas son para la reacción qPCR final. De manera similar, hay 3x perlas en la cámara 9: perla 1xTSR (cebadores para las 6 dianas), perla 1xTris (para inactivar KOH) y perla 1x EZR (Phoenix Taq). Estas perlas son para la primera reacción de PCR de 15-20 ciclos.
Se observa, además, que la Cámara 6 es una cámara de aire durante todo el ensayo y nunca se llena. La cámara 7 se usa como una especie de puerta de entrada al tubo de PCR en la parte posterior del cartucho. No se llena para iniciar el ensayo, pero se llena durante el ensayo en 3 ocasiones antes de cargar en el tubo -1 ) la mezcla de ADN-bisulfito que se calienta en el tubo para la conversión 2) la reacción PCR de 15-20 ciclos y 3) la reacción qPCR final.
Los cebadores que se muestran en la Tabla 9 que se proporciona muestran cinco secuencias para cada gen: dos cebadores de extensión y 2 cebadores de qPCR para cada amplificación anidada y una sonda. La primera reacción de PCR de 15-20 ciclos no fue específica para la metilación, sino solo las secuencias de ADN convertidas (es decir, no cruzan CpG y, en un par de casos, cuando lo hacen, nosotros usamos una R = purina o Y = pirimidina para atrapartanto metilados como no metilados). La segunda reacción de qPCR de 45 ciclos contiene cebadores y sondas que son específicos para 2-3 CpG metilados típicamente.
Resultados
El cartucho de metilación se corrió mediante el uso de 1000 células MBA-453 con y sin bisulfito (Figura 15A-15B) y 25 ng de HS ADN con bisulfito (Figura 15C) que no estaba metilado primariamente en cada promotor de gen con la excepción de HIST1H3C. Hubo poca o ninguna amplificación de cualquiera de las dianas en las reacciones de control de ADN HS sin bisulfito o sin metilar (Figura 15A, 15C). Con la adición de bisulfito, el cartucho de metilación recogió altos niveles de metilación en múltiples promotores de genes de 1000 células MBA-453, específicamente AKR1B1, RASSF1A, HOXB4, y RASGRF2.
Tabla 9. Cebadores anidados para RASSF1A, AKR1B1, HOXB4, HIST1H3C, RASGRF2, y TM6SF1. C* T* son bases opcionalmente funcionalizadas (por ejemplo, para alterar la sonda Tm).
Figure imgf000042_0001
Figure imgf000043_0001
Los cebadores que se muestran en la Tabla 9 son ilustrativos y no limitantes. Los expertos en la técnica dispondrán de numerosos otros cebadores y conjuntos de cebadores anidados. A manera de ejemplo, en la Tabla 10 se muestran cebadores ilustrativos para la detección de la metilación de ADAMTS1 y BNC1, genes asociados con el cáncer de páncreas y para la detección de la metilación del MGMT, gen asociado con glioma.
Tabla 10. Cebadores ilustrativos para la detección de la metilación de ADAMTS1 y BNC1, genes asociados con el cáncer de páncreas y para la detección de la metilación del gen MGMT asociado con el glioma.
Figure imgf000043_0002
Figure imgf000044_0001
Ejemplo 5
Preparación de muestras para muestras de plasma y FFPE
La Figura 17 ilustra una configuración de un cartucho que puede usarse para preparar muestras de ADN para PCR y/o detección de metilación. La muestra, que se obtiene de suero o plasma, o una muestra de FFPE puede simplemente introducirse en una cámara de muestra del cartucho (por ejemplo, cámara 3) y el funcionamiento del cartucho como se describe en la presente descripción proporciona una muestra lista para PCR y/o detección de metilación.
Preparación de las muestras
En una modalidad ilustrativa, pero no limitante, se prepara una muestra de suero o plasma (por ejemplo, para el análisis de ADNcf) al tratar el suero o plasma con proteinasa K. Luego, el suero/plasma tratado con proteinasa K se mezcla con una solución de lisis que comprende tiocianato de guanidinio (GTC), tampón (por ejemplo, Tris pH 7,0), un detergente (por ejemplo, Tween 20) y un antiespumante opcional (por ejemplo, antiespumante SE15). A la solución se añade un alcohol por ejemplo, isopropanol) que luego se introduce en el cartucho para procesar la muestra. En una modalidad, la solución de lisis se formula como se muestra en la Tabla 11. El suero/plasma tratado con proteinasa K puede mezclarse con solución de lisis y alcohol en una relación correspondiente a 1,3 ml de suero/plasma tratado con proteinasa K, 2,2 ml de solución de lisis y 1,5 ml de alcohol. En ciertas modalidades, la muestra de suero/plasma se trata con proteinasa K durante aproximadamente 15 minutos. La solución de lisis se añade fría y se mantiene/mezcla durante aproximadamente 10 minutos. Luego se añade isopropanol a la mezcla que luego se carga en el cartucho para su procesamiento.
Como se indicó anteriormente, para el suero/plasma las precipitaciones con alcohol (por ejemplo, isopropanol) se realizan típicamente a TA y, en particular, típicamente no se realizan con soluciones "saladas". En ciertas modalidades, pueden usarse tiempos de precipitación más prolongados a temperatura ambiente.
Tabla 11. Solución de lisis para suero o plasma
Figure imgf000044_0002
En otra modalidad ilustrativa, pero no limitante, se prepara una muestra incluida en parafina fijada con formalina (FFPE) al combinar la muestra FFPE con proteinasa Ky una solución de lisis que comprende un tampón (por ejemplo, HEPES), un quelante (por ejemplo, EDTA), NaCl, MgChy opcionalmente azida de sodio y/o un agente antiespumante. La solución se calienta (por ejemplo, a 70 °C hasta 90 °C) durante un período de tiempo que varía, por ejemplo, desde aproximadamente 10 minutos hasta aproximadamente 4 horas. Se añade un alcohol a la solución y luego la solución se introduce en el cartucho para procesar la muestra. En una modalidad, la solución de lisis se formula como se muestra en la Tabla 12. En una modalidad ilustrativa, pero no limitante, se añaden 1,2 ml de la solución de lisis que se muestra en la Tabla 12 a la sección o secciones de FFPE. Se añade proteinasa K y la mezcla se calienta, por ejemplo a 80 °C durante aproximadamente 15 minutos. En ciertas modalidades, el calentamiento se realiza a 56 ° C durante 2 horas seguido de 90 ° C durante 30 minutos. Luego se añaden 1,2 ml de etanol a la mezcla y la mezcla se carga en una cámara de muestra del cartucho para su procesamiento.
Tabla 12. Tampón de lisis para muestra incluida en parafina fijada con formalina (FFPE).
Figure imgf000045_0001
Funcionamiento del cartucho y rendimiento de extracción
Cuando se está preparando ADNcf, en determinadas modalidades, es posible incluir controles de extracción para permitir el monitoreo de la calidad de la preparación de ADN. Como se ilustra en la Figura 18, hay dos juegos de perlas diferentes. Un juego de perlas contiene un cebador HMBS endógeno y un juego de sondas para un SAC (control de ensayo de muestra) y un juego de cebadores y sondas BG exógenas para un SPC (control de preparación de muestras). El otro contiene un conjunto endógeno de Beta-Globina PP para SAC (así como BG SPC).
Fue descubierto, entre otros, que el uso de GTC en el cartucho puede ser menos importante para el suero que para las muestras de plasma. Sin estar ligado a una teoría particular, se cree que esto puede deberse al hecho de que el suero contiene menos proteína. En consecuencia, en determinadas modalidades, el cartucho puede contener menos GTC o puede omitir GTC.
Las Figuras 19A y 19B muestran una comparación de los resultados de la preparación de ADNcf realizada mediante el uso de un cartucho como se describe en la presente descripción en comparación con los resultados que se obtienen mediante el uso de un procedimiento convencional de "llenado de tubos". Como se ilustra en los resultados de qPCR que se muestran en la Figura 19A, las eficiencias de unión y elución que se obtienen mediante el uso del cartucho son extremadamente cercanas (dentro de un Ct) a las que se obtienen mediante el uso del protocolo de llenado de tubos. Como se ilustra en la Figura 19B, las titulaciones de las concentraciones de muestra muestran que la preparación del cartucho se encuentra conservadoramente dentro de 1 Ct de la preparación de llenado del tubo hasta una concentración de muestra tan baja como aproximadamente 10 pg. Se cree que la preparación del cartucho está aún más cerca del protocolo de llenado de tubos a concentraciones de muestra más altas.
Ejemplo 6
Prueba de un cartucho de preparación de muestras de gran volumen
En ciertas modalidades, se proporcionan cartuchos de preparación de muestras de alto volumen (HSVP) para la preparación de grandes volúmenes de muestra (por ejemplo, hasta aproximadamente 12 ml a 15 ml). Esto es particularmente útil cuando la muestra contiene ADN en una concentración baja (por ejemplo, ADNcf en suero o plasma). Uno de tales cartuchos se ilustra esquemáticamente en la Figura 20A. Como se muestra en el mismo, el cartucho proporciona tres cámaras (cámaras 2, 3 y 5) que pueden usarse para recibir una muestra. En la modalidad ilustrada, cada una de estas cámaras puede recibir aproximadamente 4 ml de muestra y, en ciertas modalidades, la muestra comprende 4 ml de plasma/suero combinado con 4 ml de GTC y 4 ml de alcohol (por ejemplo, isopropanol).
La muestra se introduce en estas cámaras y el cartucho se opera como se describe en la presente descripción para preparar la muestra para PCR y/o análisis de metilación. A modo de ilustración, en determinadas modalidades, el funcionamiento de este cartucho puede comprender la unión de ADN a una columna de afinidad (por ejemplo, para limpieza) y eluir el ADN. En ciertas modalidades en las que se va a realizar un análisis de metilación, el funcionamiento del cartucho puede comprender, además, combinar el ADN con un reactivo de conversión (por ejemplo, un bisulfito como se describe en la presente descripción) y calentar la mezcla para convertir el ADN. En ciertas modalidades, el cartucho de HSVP puede configurarse, además, para desulfonar el ADN convertido. En otras modalidades, el ADN puede desulfonarse en el segundo cartucho (por ejemplo, qPCR) como se ilustra esquemáticamente en la Figura 20B. El segundo cartucho puede, además, realizar el análisis de metilación (por ejemplo, un análisis de qPCR).
La Figura 21 muestra una comparación de los resultados de la preparación de muestras de ADN de plasma y suero entre un cartucho y dos protocolos de cartucho mediante el uso del conjunto de cebador y sonda HMBS o p-globina. Como se muestra allí, hubo un aumento lineal en la recuperación de ADN entre 0,5 mL y 4 mL de suero o plasma. Además, hubo poca o ninguna pérdida al usar un cartucho para la preparación y el análisis o al usar cartuchos separados para la preparación y el análisis/
Ejemplo 7
Optimización de la conversión de bisulfito
En ciertas modalidades, cuando se usa un cartucho para un análisis de metilación como se describe en la presente descripción, un problema potencial es la optimización de la eficiencia de elución mediante el uso del volumen más pequeño posible. Los volúmenes de elución pequeños son más fáciles de manejar mediante el uso de columnas de centrifugación. Este problema puede solucionarse mediante el uso de varias etapas de calentamiento para procesar volúmenes de muestra más grandes.
Una segunda preocupación técnica surge cuando se calienta una muestra más grande (por ejemplo, mínimo 100 j L) cuando se usa un tubo o cámara de calentamiento más pequeño (por ejemplo, 50 j L). En ciertos casos, las presurizaciones entre las etapas de calentamiento pueden dificultar la cuantificación reproducible del volumen aspirado y dispensado. En segundo lugar, la ausencia de presurización puede provocar cambios de volumen y burbujas, especialmente a temperaturas más altas. En tercer lugar, es posible recoger aire entre las muestras calentadas y no calentadas durante los cambios de puerto entre las etapas de calor.
Para investigar esta optimización de la conversión de bisulfito, se investigó en un tubo de 50 j L mediante el uso de etapas de calentamiento simple y doble. Este experimento se realizó de la siguiente manera:
Extraer 75-80 j L de bisulfito-ADN; calentar a 95 °C-10s, 65 °C-300s x8;
Extraer el resto 5-10 j L; presurizar; calentar 95 °C-480s, 65 °C-1800s x1.
Los resultados para 0,5 mL de suero se muestran en la Figura 22 donde el panel superior es 1x Calentar (convertido 33,0, no convertido 34,4) N=4, y el panel inferior es 2x Calentar (convertido 31,9, no convertido 36,1) N=4.
Hay una ganancia de aproximadamente 1 Ct en la señal ACTB convertida cuando se pasa de calentar 1x a calentar 2x. Esto sugiere que casi todo el ADN se convierte. Esto está respaldado por el hecho de que también hay una pérdida de aproximadamente 2 Ct en la señal HMBS no convertida. Un aumento de 1 Ct es lógico ya que nosotros pasamos de calentar 50/100 j L a 100/100 j L de muestra de ADN-bisulfito.
Ejemplo 8
Comparación de un cartucho de metilación de ADN con estuches comerciales basados en tubos
La Figura 23A muestra una comparación de las etapas del usuario requeridas al realizar un análisis de metilación mediante el uso de un cartucho como se describe en la presente descripción (izquierda) en comparación con las etapas requeridas cuando se usan estuches comerciales (QlAamp MinElute Virus Spin Kit (Qiagen, Inc.) y EZ DNA Methylation-Lightning™ Kit (Zymo Research, Inc.)) para realizar el mismo análisis. Como puede verse fácilmente, el análisis de metilación basado en cartuchos requiere muchas menos etapas del usuario con un tiempo de trabajo de aproximadamente 5 minutos en comparación con el tiempo de trabajo de 2-3 horas requerido con los estuches.
Para comparar los resultados que se obtienen por los diferentes métodos, se purificaron 200 j L de suero mediante el uso del estuche Qiagen. El ADN se convirtió mediante el uso del estuche Zymo, se purificó con una segunda columna de centrifugación y se eluyó con 10 jl. Se corrieron los 10 j l mediante el uso de cebadores y sondas ACTB convertidos no metilados (TSR). En comparación, se corrieron 200 j l de suero en el cartucho de metilación como se describe en la presente descripción. Los resultados se muestran en la Figura 23B. Como es evidente, el método del cartucho produjo resultados extremadamente comparables a los que se obtienen mediante el uso de los estuches comerciales. Sin embargo, esto se logró con mucho menos trabajo y tiempo.
Ejemplo 9
Uso de DABSO para la conversión de ADN
Inicialmente se intentó disolver 5 g de DABSO en 5 ml de H2O. Finalmente, se añadieron unos pocos ml de KOH 10 M y un ml de agua y se calentó para solubilizar el DABSO y elevar el pH entre aproximadamente pH 5 y pH 5,5 a una concentración final estimada de DABSO de ~2,5M.
La Figura 24 muestra gráficos de rellenos de tubo de 750 ng de ADN convertidos mediante el uso de DABSO o el reactivo de conversión Zymo. Los materiales se calentaron fuera de borda (1 |jg) en un termocicladory se purificaron con columnas de centrifugación y se corrieron como rellenos de tubos. Los 3 experimentos diferentes fueron:
1) 120 jL de DABSO/30 jL de ADN;
2) 120 jL de Zymo/30 jL de ADN; y
3) 70 jL de Zymo/30 jL de ADN (relación actualmente en el cartucho).
Como se muestra en la Figura 24, DABSO proporcionó buenas conversiones casi comparables a las que se obtienen mediante el uso del reactivo Zymo.
Ejemplo 10
Sensibilidad de detección de ADN metilado
Para evaluar la sensibilidad de detección de la metilación del ADN, se detectó el promotor del gen convertido ACTB en función del número de copias mediante el uso de un cartucho como se describe en la presente descripción. El objetivo era detectar menos de 25 copias de ADN no metilado convertido. Como se mostró anteriormente, se observaron precipitaciones en aproximadamente 10-50 copias (1 precipitación cada una). Se observó una sensibilidad similar para las dianas de ADN metilado en un fondo de suero.
La Figura 25, panel A, ilustra la detección de ADN metilado en una serie de diluciones (MGMT (gen de O-6-Metilguanina-ADN Metiltransferasa)). Como se muestra en el mismo, se detectó MGMT hasta un nivel de 78 pg.
La detección de marcadores de cáncer de mama metilados RASSF1A y AKR1B1 en células MBA-453 se muestra en la Figura 25, panel B. Como se muestra allí, los marcadores de cáncer de mama detectaron hasta 100 células.
La detección de marcadores de cáncer de páncreas metilados ACTB, BNC1, y ADAMTS1 en una serie de diluciones se muestra en la Figura 25, panel C. Como se muestra en la misma, los marcadores pancreáticos detectaron hasta 25 copias. La Tabla 13 muestra la tasa de aciertos de los marcadores de cáncer de páncreas BNC1 y ADAMTS1 en función de la concentración. Como se muestra en el mismo, estos marcadores pudieron detectar por debajo de 120 pg. Téngase en cuenta que una "tasa de aciertos" positiva es una amplificación en cualquiera de los genes para una réplica.
La Tabla 13 ilustra la tasa de aciertos para la detección de marcadores pancreáticos en función de la concentración.
Figure imgf000047_0001
Ejemplo 11
Ensayo en formato múltiple de complemento inverso para ambas cadenas
La Figura 26 ilustra los resultados de un ensayo en formato múltiple de complemento inverso para ambas cadenas de ADN. Después de la conversión de bisulfito, ambas cadenas pierden su complementariedad. Así, los conjuntos de cebadores y sondas deben diseñarse para una cadena u otra, y dar como resultado amplicones únicos. Además de brindar "más oportunidades", este enfoque podría ayudar potencialmente con la sensibilidad (en LOD, si solo una cadena u otra termina en el tubo, este enfoque aseguraría que se capte la señal).
El ensayo en formato múltiple permite la detección de diferentes CpG en el mismo sitio promotor. El ensayo en formato múltiple de complemento inverso proporciona más consultas sobre la diana y la posibilidad de captar metilación heterogámica.
Ejemplo 12
Detección de metilación y mutación del ADN en un solo cartucho
En ciertas modalidades, las reacciones en formato múltiple de PCR pueden contener cebadores y sondas que permiten la detección de mutaciones además de la metilación en el mismo cartucho. La Figura 27A ilustra la detección de BNC1 y ADAMTS1 metilados junto con la mutación KRAS G12D junto con el control BG (panel superior) y la detección de BNC1 y ADAMTS1 metilados junto con KRAS tipo silvestre junto con el control BG (Panel inferior).
La Figura 27B ilustra la detección simultánea de metilación en BNC1 y ADAMTS1 en células PANC-1 (panel superior) y células MIA-PaCa (panel inferior) junto con la mutación KRAS G12D.
Ejemplo 13
Optimización en formato múltiple del cáncer de páncreas
Se determinó que el análisis de metilación de ADAMTS1, BNC1, (y algunos otros genes) permite la detección y/o estadificación del cáncer de páncreas. En consecuencia, el ensayo en formato múltiple inicial para BNC1 y ADAMTS1 se optimizó para facilitar la incorporación de sondas para otros genes. Para optimizar este ensayo, se corrieron gradientes de temperatura en PCR externas e internas para cadenas directas/inversas convertidas con bisulfito. Las reacciones individuales (dir/inv para cada gen) se corrieron a temperaturas externas de 56 °C, 58 °C y 60 °C y temperaturas internas de 64 °C, 66 °C y 68 °C (ver, por ejemplo, Figura 28). En ciertas modalidades, los ensayos se desarrollaron como dos ensayos cuádruples para BNCl y ADAMTS1 y otros dos genes, uno de los ensayos cuádruples para el análisis de metilación de una cadena directa y el otro ensayo cuádruple para el análisis de metilación de una cadena inversa.
Las sondas se combinaron en dos conjuntos (ver, Figura 29) basado en las condiciones de reacción preferidas (condiciones salinas 40 mM (LS), 60 mM (MS), 80 mM (HS) KCl, 15 mM NH4SO4) y optimizados para especificidad. La condición de sal optimizada final para el ensayo en formato múltiple 1 fue 80 mM de KCl, 5 mM de MgCh, 20 mM de Tris pH 8,5 y 10 mM de NH4 y para el ensayo en formato múltiple 2 fue 62 mM de KCl, 4 mM de MgCh, 20 mM de Tris pH 8,5 y 10 mM de NH4.
Ejemplo 14
Detección de Metilación de MGMT
El gen de O(6)-metilguanina-ADN metiltransferasa (MGMT) codifica una enzima de reparación del ADN que puede anular los efectos de la quimioterapia alquilante como la temozolamida. Si el gen MGMt está activo, el daño se repara rápidamente. Se cree que los gliomas malignos pueden tener el gen de MGMT inactivado debido a la metilación de su región promotora. El gen metilado MGMT es un indicador predictivo de una mejor respuesta a la quimioterapia (ya que el tumor no tiene medios para reparar el daño del ADN inducido por el agente alquilante).
Se desarrollaron cebadores y sondas para la detección de la metilación de MGMT como se ilustra en la Figura 30 y se resume a continuación en la Tabla 14. En particular, la Figura 30 ilustra el molde convertido con CPG (según se determina a partir de la pirosecuenciación) que se muestra en gris. Como se ilustra después de la conversión de bisulfito, las cadenas directas e inversas ya no son complementarias, lo que permite un análisis por separado de cada cadena.
Tabla 14. Conjunto ilustrativo de cebador/sonda para la detección de la metilación de MGMTver, por ejemplo, Figura 30).
Figure imgf000048_0001
Para evaluar la sensibilidad de detección de una serie de dilución MGMT (5 ng a 78 pg MGMT se evaluó ADN en un fondo de 20 ng de ADN HS)) mediante el uso de ACTB como control. En un experimento ilustrativo, 78 pg de MGMT metilado el ADN estaba solo a unos 10 ciclos del Ct de solo ADN HS sin metilar.
Como se muestra en la Figura 31, los resultados que se producen mediante el uso de el cartucho de metilación descrito en la presente descripción para la detección de la metilación de MGMT se comparó con los resultados que se producen por pirosecuenciación para el ADN extraído (Figura 31, superior) y para una muestra de FFPE (Figura 31, inferior). La pirosecuenciación típicamente usa un límite entre 10-15 % para determinar la estratificación del paciente. Nosotros usamos un punto de corte arbitrario de 12,5 (entre ACTB y MGMT) para igualar los resultados de la pirosecuenciación lo más cerca posible. En consecuencia, en este ejemplo se estableció un límite en delta Ct=12,5 y se calculó la concordancia con> 15 % de metilación. El análisis del cartucho del ADN extraído mostró una sensibilidad de 90 % y una especificidad de 86 %, mientras que el análisis del cartucho de la muestra FFPE mostró una sensibilidad del 88 % y una especificidad del 95 %.
Se observa que la especificidad puede mejorarse de dos maneras: 1) la temperatura de hibridación puede aumentar ya que la temperatura de hibridación de 62 °C era bastante baja. Además, pueden usarse sondas de metilación que cubren 3 (o más) CpG.
Ejemplo 15
Detección de Metilación de BRCA1
BRCA1 es un gen cuidador responsable de reparar el ADN. Se cree que BRCA1 participa en la reparación por escisión de nucleótidos, unión de extremos homólogos, recombinantes y no homólogos. Mujeres con un gen BRCA1 anormal tienen 80 % de posibilidades de desarrollar cáncer de mama.
Sin estar ligado a una teoría en particular, se cree que la metilación de BRCA1 es un posible marcador predictivo de la respuesta a la quimioterapia en pacientes con cáncer de mama triple BC negativo. El estudio de pacientes con NSCLC tratados con cisplatino mostró que aquellos con expresión DE BRCA1 habían mejorado las tasas de supervivencia. Los niveles altos redujeron la eficacia de la quimioterapia al reparar el daño causado a las células cancerosas.
En vista de estas y otras observaciones, se desarrollaron cartuchos de observación y métodos para usar para la detección de la metilación de BRCA1. En particular, la condición de la PCR se optimizó de la siguiente manera: 1) La temperatura externa se evaluó entre 56-62 °C y nos decidimos por un protocolo de PCR de hibridación de 3 etapas a 56 °C; 2) La temperatura interna se evaluó entre 64 °C y 70 °C y nos decidimos por un protocolo de PCR de hibridación a 68 °C en dos etapas. Los resultados se muestran en la Figura 32.
Para BRCA1, se probó un ensayo de una diana con el gen de control ACTB. Se probaron ocho líneas celulares diferentes y se comparó el efecto de añadir NH4 (ver, Figura 33). Se esperaba que la metilación de BRCA1 se observara en la línea celular 3199.
Ejemplo 16
Detección de metilación de genes asociados con el cáncer de pulmón
Un ensayo de metilación de tres objetivos para genes cuya metilación está asociada con el cáncer de pulmón (SOX17, CD01, TAC1) se probó junto con el gen de control ACTB. Los datos que se muestran en la Figura 34 indican que, como se esperaba, las 3 dianas no aparecen en un fondo de plasma normal, sino que están presentes hasta cierto grado en tres líneas celulares diferentes de cáncer de pulmón.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un cartucho para determinar el estado de mutilación de un ácido nucleico, dicho cartucho comprende:
(i) una primera columna que comprende un primer material de matriz,
(ii) una cámara de recepción de muestras,
(iii) un canal o cámara de temperatura controlada,
(iv) una pluralidad de cámaras que contienen reactivos y/o tampones, y en donde cuando el cartucho está en uso, al menos una de dichas cámaras contiene un reactivo bisulfito,
y al menos una de dichas cámaras contiene un tampón de desulfonación/elución, en donde dicho cartucho opcionalmente comprende una segunda columna que comprende un segundo material de matriz,
en donde dicha cámara de recepción de muestras, dicha primera y segunda columna(s) opcional(es), dicha pluralidad de cámaras y dicho canal o cámara de calentamiento de temperatura controlada, están selectivamente en comunicación de fluidos mediante canales y válvulas microfluídicos.
2. El cartucho de la reivindicación 1, en donde dicho cartucho, cuando está en uso, comprende una cámara que contiene un reactivo que comprende tiocianato de guanidinio etanol (GTC-EtOH).
3. El cartucho de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicha segunda columna está ausente.
4. El cartucho de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho canal o cámara de temperatura controlada es un canal o cámara de termociclado.
5. El cartucho de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicho reactivo bisulfito comprende un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en bisulfito de amonio, metabisulfito de sodio, bisulfito de potasio, bisulfito de cesio y 1,4-diazoniabiciclo[2.2.2]octano-1,4-disulfinato (DABSO).
6. El cartucho de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicho cartucho comprende una, dos o más cámaras que contienen uno o más reactivos que se seleccionan del grupo que consiste en cebadores de PCR específicos de metilación, sondas de PCR específicas de metilación, enzima(s) de PCR y tampón de reacción de PCR.
7. El cartucho de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicho cartucho contiene al menos una cámara que contiene cebadores y sondas para la detección de la metilación de una cadena directa de un ADN convertido; y/o
dicho cartucho contiene al menos una cámara que contiene cebadores y sondas para la detección de la metilación de una cadena inversa de un ADN convertido.
8. El cartucho de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en donde dichos cebadores de PCR y/o dichas sondas y/o enzimas se proporcionan como perlas.
9. El cartucho de la reivindicación 1, en donde dicha cámara de recepción de muestras, dicha primera y segunda columna(s) opcional(es), dicha pluralidad de cámaras y dicho canal o cámara de temperatura controlada o un puerto en dicho canal o cámara de temperatura controlada, están dispuestos alrededor de una válvula central y selectivamente en comunicación de fluidos con un canal en dicha válvula central, en donde dicha válvula central está configurada para acomodar un émbolo que es capaz de extraer fluido hacia dentro o fuera de una cámara en comunicación de fluidos con dicha válvula central.
10. El cartucho de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dicho cartucho está configurado de manera que, cuando está en uso, dicho cartucho comprende:
una primera cámara que contiene una muestra, que opcionalmente comprende un reactivo de extracción/precipitación GTC-EtOH-Tween;
una segunda cámara que contiene una solución detiosulfato de guanidinio-etanol (GTC-EtOH);
una tercera cámara que contiene un reactivo bisulfito;
una cuarta cámara que contiene un tampón;
una quinta cámara que contiene una solución de enjuague; y
una sexta cámara que contiene un reactivo de elución/desulfonación.
11. El cartucho de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde:
el cartucho está configurado para que el reactivo bisulfito se añada al cartucho en o cerca del momento en que se coloca la muestra en el cartucho; y/o
el cartucho está configurado para la adición de dicho tampón GTC-ETOH-Tween en o cerca del momento en que se coloca la muestra en el cartucho.
12. El cartucho de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde:
el reactivo bisulfito se proporciona como un componente del cartucho; y/o
el tampón GTC-ETOH-Tween se proporciona como un componente del cartucho.
13. El cartucho de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde dicho cartucho comprende una séptima cámara que contiene cebadores y/o sondas de PCR y/o enzimas de PCR.
14. El cartucho de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde
dicho cartucho comprende una o más cámaras que contienen cebadores específicos para secuencias metiladas y/o no metiladas convertidas con bisulfito; y/o
dicho cartucho comprende una o más cámaras que contienen reactivos para reacciones de PCR TaqMan; y/o dicho cartucho comprende una o más cámaras que contienen una o más sondas fluorescentes que son marcadores para secuencias metiladas amplificadas y/o una o más sondas fluorescentes que son marcadores para secuencias no metiladas amplificadas.
15. El cartucho de la reivindicación 14, en donde:
(a) dichas sondas comprenden un colorante indicador fluorescente y un colorante inactivador, donde las sondas proporcionan una señal tras la escisión por la actividad nucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa Taq; y/o dicho cartucho comprende una pluralidad de sondas, cada una específica para una región metilada diferente en una región amplificada de interés; o
dicho cartucho comprende una pluralidad de sondas, cada una específica para la misma región metilada en una región amplificada de interés; o
(b) dicho cartucho comprende una única sonda específica para una región metilada en una región amplificada de interés y/o
dicho cartucho contiene cebadores y/o sondas para determinar la metilación de una región promotora de un gen que se selecciona del grupo que consiste en MGMT, RASSF1A, ADAMTS1, BNC1, HIST1H3C, HOXB4, RASGRF2, TM6SF1 y AKR1B1; y/o
(c) dicho cartucho contiene uno o más cebadores que se muestran en las Tablas 5, 9 o 10, y/o una o más sondas que se muestran en las Tablas 5, 9 o 10; y/o
(d) el cartucho está configurado para la determinación del nivel de expresión de ARN para una metiltransferasa.
ES16732159T 2015-06-15 2016-06-14 Integración de la purificación del ADN y la medición de su metilación y la medición conjunta de mutaciones y/o niveles de expresión de ARNm en un cartucho de reacción automático Active ES2842205T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562175916P 2015-06-15 2015-06-15
PCT/US2016/037422 WO2016205233A2 (en) 2015-06-15 2016-06-14 Integrated purification and measurement of dna methylation and co-measurement of mutations and/or mrna expression levels in an automated reaction cartridge

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2842205T3 true ES2842205T3 (es) 2021-07-13

Family

ID=56204035

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16732159T Active ES2842205T3 (es) 2015-06-15 2016-06-14 Integración de la purificación del ADN y la medición de su metilación y la medición conjunta de mutaciones y/o niveles de expresión de ARNm en un cartucho de reacción automático

Country Status (8)

Country Link
US (2) US11603555B2 (es)
EP (2) EP3839047A1 (es)
JP (2) JP7020922B2 (es)
CN (1) CN107922941A (es)
AU (2) AU2016277943B2 (es)
CA (1) CA2989573A1 (es)
ES (1) ES2842205T3 (es)
WO (1) WO2016205233A2 (es)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2886389A1 (en) 2012-09-28 2014-04-03 Cepheid Methods for dna and rna extraction from fixed paraffin-embedded tissue samples
EP3839047A1 (en) 2015-06-15 2021-06-23 Cepheid Integrated purification and measurement of dna methylation and co-measurement of mutations and/or mrna expression levels in an automated reaction cartridge
DE102015009187B3 (de) * 2015-07-16 2016-10-13 Dimo Dietrich Verfahren zur Bestimmung einer Mutation in genomischer DNA, Verwendung des Verfahrens und Kit zur Durchführung des Verfahrens
EP3325647B1 (en) * 2015-07-24 2020-02-19 Cepheid Compositions and methods for dna and rna extraction from tissue samples
CN110267744A (zh) * 2016-12-12 2019-09-20 塞弗德公司 在自动化反应盒中DNA甲基化的整合的纯化和测量以及突变和/或mRNA表达水平的共同测量
CN108277274A (zh) * 2017-01-03 2018-07-13 博尔诚（北京）科技有限公司 用于区分胰腺癌和慢性胰腺炎的组合物及其用途
US20200010907A1 (en) * 2017-03-17 2020-01-09 Mdxhealth Sa Mgmt epigenetic deep-sequencing assay
CN107164535A (zh) * 2017-07-07 2017-09-15 沈阳宁沪科技有限公司 一种无创高通量甲基化结肠癌诊断、研究和治疗方法
EP3652343A1 (en) * 2017-07-13 2020-05-20 Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Dual-probe digital droplet pcr strategy for specific detection of tissue-specific circulating dna molecules
US11207674B2 (en) 2017-08-09 2021-12-28 Biogx, Inc. Method of customizing a universal reagent cartridge with a lyophilized target-specific reagent
CN111050903B (zh) * 2017-08-25 2023-02-28 积水医疗株式会社 甲基化dna分离和/或检测用色谱用填充剂
CN107868813B (zh) * 2017-11-16 2021-07-27 上海覃谷生物技术有限公司 一种血浆dna边提取边转化的方法及应用
CA3094717A1 (en) 2018-04-02 2019-10-10 Grail, Inc. Methylation markers and targeted methylation probe panels
CN108300787A (zh) * 2018-04-17 2018-07-20 中国科学院北京基因组研究所 特异甲基化位点作为乳腺癌早期诊断标志物的应用
CN108531595A (zh) * 2018-04-25 2018-09-14 新疆医科大学附属肿瘤医院 检测待测dna甲基化的引物组合物、检测方法及应用
CN108456721B (zh) * 2018-05-16 2021-07-09 基因科技（上海）股份有限公司 同步检测基因突变和甲基化的方法及其应用
CN108676879A (zh) * 2018-05-24 2018-10-19 中国科学院北京基因组研究所 特异甲基化位点作为乳腺癌分子分型诊断标志物的应用
CN108753979B (zh) * 2018-07-09 2021-10-26 安徽达健医学科技有限公司 一种用于肝癌早期筛查的试剂盒及其使用方法
WO2020019268A1 (zh) * 2018-07-26 2020-01-30 北京艾克伦医疗科技有限公司 鉴定乳腺癌状态的方法和试剂盒
CN113286881A (zh) 2018-09-27 2021-08-20 格里尔公司 甲基化标记和标靶甲基化探针板
CN110964813B (zh) * 2018-09-29 2021-11-16 广州康立明生物科技股份有限公司 Hoxa7甲基化检测试剂在制备肺癌诊断试剂中的用途
CN111088351A (zh) * 2018-10-23 2020-05-01 博尔诚（北京）科技有限公司 用于检测肺癌的组合物及其用途
WO2020257404A1 (en) * 2019-06-20 2020-12-24 The Johns Hopkins University Dna markers for differentiation of biopsy samples
WO2020252721A1 (en) * 2019-06-20 2020-12-24 The Johns Hopkins University Dna methylation markers and their use in differentiation of suspected cancerous lymph node biopsy samples
CN111662980A (zh) * 2020-06-03 2020-09-15 广州市康立明生物科技有限责任公司 一种肺癌检测试剂及试剂盒
CN111676287B (zh) * 2020-06-03 2022-04-29 广州康立明生物科技股份有限公司 一种基因标志物组合及其应用
CN113930499B (zh) * 2020-06-29 2023-09-22 武汉艾米森生命科技有限公司 检测基因甲基化的试剂的应用以及结直肠癌诊断或辅助诊断试剂盒
CN114085894A (zh) * 2021-11-03 2022-02-25 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 核酸甲基化胞嘧啶转化方法
MX2024008473A (es) * 2022-01-06 2024-07-12 The Univ Of Chicago Metodos y composiciones para deteccion y analisis rapidos de metilacion de citosina de arn y adn.
DE102022204638A1 (de) 2022-05-12 2023-11-16 Robert Bosch Gesellschaft mit beschränkter Haftung Verfahren und mikrofluidische Vorrichtung zur Denaturierung einer Nukleinsäure
EP4299764A1 (en) * 2022-06-28 2024-01-03 Universal Diagnostics, S.A. Methods for detecting pancreatic cancer using dna methylation markers
WO2024111038A1 (ja) * 2022-11-22 2024-05-30 株式会社日立ハイテク 変異遺伝子検出方法

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1190838A (en) 1981-07-17 1985-07-23 Cavit Akin Homogeneous nucleic acid hybridization diagnostics by non-radiative energy transfer
US5449602A (en) 1988-01-13 1995-09-12 Amoco Corporation Template-directed photoligation
US5494810A (en) 1990-05-03 1996-02-27 Cornell Research Foundation, Inc. Thermostable ligase-mediated DNA amplifications system for the detection of genetic disease
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
EP1958955B1 (en) 1996-02-09 2013-09-04 Cornell Research Foundation, Inc. Spatially addressable oligonucleotide arrays and method of making the same
AU713667B2 (en) 1996-04-12 1999-12-09 Phri Properties, Inc. Detection probes, kits and assays
CA2255774C (en) 1996-05-29 2008-03-18 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
US6312892B1 (en) 1996-07-19 2001-11-06 Cornell Research Foundation, Inc. High fidelity detection of nucleic acid differences by ligase detection reaction
US5958349A (en) 1997-02-28 1999-09-28 Cepheid Reaction vessel for heat-exchanging chemical processes
US6251594B1 (en) * 1997-06-09 2001-06-26 Usc/Norris Comprehensive Cancer Ctr. Cancer diagnostic method based upon DNA methylation differences
WO1999033559A1 (en) 1997-12-24 1999-07-08 Cepheid Integrated fluid manipulation cartridge
US6027998A (en) 1997-12-17 2000-02-22 Advanced Micro Devices, Inc. Method for fully planarized conductive line for a stack gate
US6506594B1 (en) 1999-03-19 2003-01-14 Cornell Res Foundation Inc Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
US6942771B1 (en) * 1999-04-21 2005-09-13 Clinical Micro Sensors, Inc. Microfluidic systems in the electrochemical detection of target analytes
CA2373249C (en) * 1999-05-28 2011-08-02 Cepheid Apparatus and method for cell disruption
US6818185B1 (en) 1999-05-28 2004-11-16 Cepheid Cartridge for conducting a chemical reaction
US6403037B1 (en) 2000-02-04 2002-06-11 Cepheid Reaction vessel and temperature control system
CA2410950A1 (en) 2000-05-30 2001-12-06 Hans-Michael Wenz Methods for detecting target nucleic acids using coupled ligation and amplification
US6605451B1 (en) 2000-06-06 2003-08-12 Xtrana, Inc. Methods and devices for multiplexing amplification reactions
US20060134643A1 (en) * 2000-06-19 2006-06-22 Kurt Berlin Bisulfite conversion of DNA
DE10112515B4 (de) 2001-03-09 2004-02-12 Epigenomics Ag Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungsmustern mit hoher Sensitivität
JP2003144172A (ja) * 2001-11-16 2003-05-20 Nisshinbo Ind Inc メチル化検出用オリゴヌクレオチド固定化基板
AU2003236461B2 (en) * 2002-08-29 2009-05-28 Epigenomics Ag Improved method for bisulfite treatment
US7288373B2 (en) * 2003-05-02 2007-10-30 Human Genetic Signatures Pty Ltd. Treatment of methylated nucleic acid
EP1692264A2 (en) 2003-10-28 2006-08-23 The Johns Hopkins University Quantitative multiplex methylation-specific pcr
JP2008513022A (ja) 2004-09-15 2008-05-01 マイクロチップ バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド マイクロ流体デバイス
US20060068399A1 (en) 2004-09-24 2006-03-30 Cepheid Multiple bead reagent system for protein based assays with optimized matrices
EP2803734B1 (en) * 2005-04-01 2017-09-20 Epigenomics AG Improved bisulfite conversion of DNA
US20060286577A1 (en) * 2005-06-17 2006-12-21 Xiyu Jia Methods for detection of methylated DNA
US9568424B2 (en) * 2005-06-23 2017-02-14 Biocartis Nv Cartridge, system and method for automated medical diagnostics
JP5049274B2 (ja) 2005-06-30 2012-10-17 ビオカルティ ソシエテ アノニム 自動化医療診断のためのカートリッジ
WO2007068437A1 (en) * 2005-12-14 2007-06-21 Roche Diagnostics Gmbh New method for bisulfite treatment
JP5063616B2 (ja) * 2006-02-03 2012-10-31 インテジェニックス インコーポレイテッド マイクロ流体デバイス
US20090036665A1 (en) * 2007-07-11 2009-02-05 Gonzalo Domingo Disposable Sample Processing Unit
CN101802223A (zh) * 2007-08-15 2010-08-11 香港大学 用于高通量亚硫酸氢盐dna-测序的方法和组合物及其用途
WO2009108260A2 (en) 2008-01-22 2009-09-03 Microchip Biotechnologies, Inc. Universal sample preparation system and use in an integrated analysis system
FR2928659B1 (fr) * 2008-03-12 2012-01-13 Biomerieux Sa Procede pour le diagnostic ou pronostic in vitro du cancer du testicule
CN101285096A (zh) 2008-06-03 2008-10-15 中国人民解放军第二军医大学 一种快速检测dna甲基化的方法
US20120252015A1 (en) * 2011-02-18 2012-10-04 Bio-Rad Laboratories Methods and compositions for detecting genetic material
EP2218793A1 (en) * 2009-02-13 2010-08-18 Alphagenics International SA Detection of MGMT methylation in tumors
EP2462245B1 (en) * 2009-08-06 2016-10-05 Cornell University Device and methods for epigenetic analysis
WO2011106314A2 (en) * 2010-02-25 2011-09-01 Advanced Liquid Logic, Inc. Method of making nucleic acid libraries
GB201004147D0 (en) 2010-03-12 2010-04-28 Dna Electronics Ltd Method and apparatus for sensing methylation
CN101984069B (zh) 2010-09-19 2012-07-25 生工生物工程(上海)有限公司 一种快速检测dna甲基化的试剂盒及方法
US20150136604A1 (en) * 2011-10-21 2015-05-21 Integenx Inc. Sample preparation, processing and analysis systems
EP2841600B1 (en) 2012-04-27 2024-04-24 Cepheid Apparatus with heterogeneous processing modules
JP6543569B2 (ja) 2012-05-22 2019-07-10 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ 定量的多重メチル化特異的ＰＣＲ法−ｃＭｅｔｈＤＮＡ、試薬、及びその使用
WO2013192570A1 (en) * 2012-06-21 2013-12-27 Gigagen, Inc. System and methods for genetic analysis of mixed cell populations
JP6289473B2 (ja) * 2012-09-05 2018-03-07 セファイド 流体解析システムにおけるユニバーサルドッキングベイおよびデータドア
CA2886389A1 (en) 2012-09-28 2014-04-03 Cepheid Methods for dna and rna extraction from fixed paraffin-embedded tissue samples
US20140272967A1 (en) 2013-03-13 2014-09-18 Abbott Molecular Inc. Systems and methods for isolating nucleic acids
WO2014160117A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 Abbott Molecular Inc. Multiplex methylation-specific amplification systems and methods
US9670479B2 (en) * 2013-03-15 2017-06-06 F Cubed, LLC Sample preparation device and methods of use
GB201316347D0 (en) 2013-09-13 2013-10-30 Cancer Rec Tech Ltd Biological fluid filtration assembly
KR20150038944A (ko) 2013-10-01 2015-04-09 주식회사 바이오이즈 유전자의 메틸화 여부 및 비율의 분석방법
US20150099670A1 (en) * 2013-10-07 2015-04-09 Weiwei Li Method of preparing post-bisulfite conversion DNA library
ES2815684T3 (es) 2015-06-10 2021-03-30 Biocartis N V Detección mejorada de ADN metilado
EP3839047A1 (en) 2015-06-15 2021-06-23 Cepheid Integrated purification and measurement of dna methylation and co-measurement of mutations and/or mrna expression levels in an automated reaction cartridge
CN110267744A (zh) 2016-12-12 2019-09-20 塞弗德公司 在自动化反应盒中DNA甲基化的整合的纯化和测量以及突变和/或mRNA表达水平的共同测量

Also Published As

Publication number Publication date
JP7466580B2 (ja) 2024-04-12
CA2989573A1 (en) 2016-12-22
JP7020922B2 (ja) 2022-02-16
AU2016277943B2 (en) 2022-09-01
EP3307885A2 (en) 2018-04-18
US20240141415A1 (en) 2024-05-02
EP3839047A1 (en) 2021-06-23
AU2016277943A1 (en) 2018-02-01
WO2016205233A2 (en) 2016-12-22
JP2018524978A (ja) 2018-09-06
WO2016205233A3 (en) 2017-02-02
AU2022279465A1 (en) 2023-02-02
JP2022070885A (ja) 2022-05-13
US11603555B2 (en) 2023-03-14
EP3307885B1 (en) 2020-10-21
US20170137871A1 (en) 2017-05-18
CN107922941A (zh) 2018-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2842205T3 (es) Integración de la purificación del ADN y la medición de su metilación y la medición conjunta de mutaciones y/o niveles de expresión de ARNm en un cartucho de reacción automático
EP3551332B1 (en) Integrated purification and measurement of dna methylation and co-measurement of mutations and/or mrna expression levels in an automated reaction cartridge
ES2890776T3 (es) Métodos, composiciones y kits para la captura, la detección y la cuantificación del ARN pequeño
ES2769841T3 (es) Método de análisis de metilación
ES2538214T3 (es) Un método para el análisis de metilación de ácido nucleico
ES2769795T3 (es) Sistema y método de detección de RNAs alterados por cáncer de pulmón en sangre periférica
ES2950346T3 (es) Detección mejorada de repeticiones homopoliméricas cortas
JP5258760B2 (ja) メチル化核酸又は非メチル化核酸を増幅する方法
US8377657B1 (en) Primers for analyzing methylated sequences and methods of use thereof
US20130309667A1 (en) Primers for analyzing methylated sequences and methods of use thereof
RU2780660C2 (ru) ОБЪЕДИНЕННАЯ ОЧИСТКА И ИЗМЕРЕНИЕ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК С СОВМЕСТНЫМ ИЗМЕРЕНИЕМ МУТАЦИЙ И/ИЛИ УРОВНЕЙ ЭКСПРЕССИИ мРНК В АВТОМАТИЧЕСКОМ РЕАКЦИОННОМ КАРТРИДЖЕ
US9765397B2 (en) Method of detecting methylation
US20080096213A1 (en) Method for confirming conversion treatment and nucleic acid molecule used therefor
BR112019011670B1 (pt) Conjunto de cartuchos e método para determinação do estado de metilação de um ácido nucleico, sistema para determinação da metilação de um ácido nucleico em uma amostra biológica, método para detecção de um câncer ou da predisposição a um câncer em um indivíduo, e kit para determinação de metilação do dna
US20130310550A1 (en) Primers for analyzing methylated sequences and methods of use thereof