ES2950346T3

ES2950346T3 - Detección mejorada de repeticiones homopoliméricas cortas

Info

Publication number: ES2950346T3
Application number: ES16770028T
Authority: ES
Inventors: Bart Claes; Rudi Rossau
Original assignee: Biocartis NV
Current assignee: Biocartis NV
Priority date: 2015-09-22
Filing date: 2016-09-22
Publication date: 2023-10-09
Anticipated expiration: 2036-09-22
Also published as: JP2018528780A; CA2999403A1; KR102648647B1; RU2018113750A; RU2730622C2; WO2017050934A1; KR20180053743A; RU2018113750A3; CN108350506A; US11028431B2; EP3353320C0; EP4299763A2; EP3353320A1; JP6906504B2; US20180371537A1; US20210246499A1; EP3353320B1

Abstract

La presente solicitud se refiere a la detección de cambios en el número de nucleótidos en repeticiones cortas de ácidos nucleicos homopoliméricos, en particular en microsatélites homopoliméricos cortos, por ejemplo con el fin de diagnosticar la inestabilidad de microsatélites (MSI) y/o la deficiencia de reparación de errores de coincidencia (MMR-) en tumores. En consecuencia, se proporcionan métodos para detectar cambios en el número de nucleótidos presentes en secuencias cortas repetidas de nucleótidos homopoliméricos, así como kits y cartuchos para la detección automatizada de dichos cambios. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Detección mejorada de repeticiones homopoliméricas cortas

Campo técnico

La presente solicitud se refiere a la detección de cambios en el número de nucleótidos en repeticiones de ácidos nucleicos homopoliméricas cortas, en particular en microsatélites homopoliméricos cortos, por ejemplo, con el fin de diagnosticar la inestabilidad de microsatélites (MSI) y/o la alteración de la vía reparadora (MMR-) en tumores. Por consiguiente, se proporcionan métodos para detectar cambios en el número de nucleótidos presentes en secuencias de repetición de nucleótidos homopoliméricas cortas, así como kits y cartuchos para la detección automatizada de dichos cambios.

Antecedentes de la invención

La vía reparadora del ADN (MMR) es un sistema conservado evolutivamente de múltiples factores para reconocer y reparar inserciones o deleciones defectuosas (“ indels” ) de bases en el genoma, que pueden surgir durante la replicación o recombinación, o durante la reparación de algunas formas de daño al ADN. En línea con lo anterior, existe evidencia de que la MMR alterada se correlaciona con la inestabilidad genómica y, por tanto, también está implicada en la progresión del cáncer.

De hecho, la alteración de la MMR se ha descrito en varios tipos de cáncer, incluyendo leucemia, cáncer de ovario, páncreas o gástrico, y es una causa establecida de síndrome de sensibilidad al cáncer de Lynch que es responsable del 2-5 % de todos los tumores endometriales (EM) o colorrectales (CCR) (Jiricny, 2006). Es importante destacar que los tumores con alteración de la MMR muestran diferentes pronósticos y desenlaces terapéuticos después de los tratamientos convencionales contra el cáncer (N gy Schrag, 2010). Por ejemplo, los tumores con alteración en la MMR de pacientes con CRC no parecen responder a la quimioterapia basada en 5-fluorouracilo (Fischery col., 2007), que es la quimioterapia de primera elección para CRC. Además, los tumores con alteración en la MMR también tienden a ser resistentes al cisplatino y al carboplatino, que se usan frecuentemente en el tratamiento de cáncer de EM (Hewish y col., 2010). Finalmente, estos tumores también se observaron para desarrollar de manera relativamente rápida resistencia a las terapias dirigidas, posiblemente debido a su aumento de la mutabilidad y, por tanto, también a la adquisición más fácil de mutaciones secundarias que potencialmente pueden afectar a otras defensas contra el cáncer.

Debido al hecho de que se demostró que la alteración de la MMR afectaba a la respuesta de los pacientes a los tratamientos contra el cáncer, su detección eficaz puede tener potencialmente graves consecuencias sobre el tratamiento eficaz de los pacientes y sobre su supervivencia. Debido a la complejidad de las mutaciones que afectan a la ruta de MMR, en la práctica clínica es más común probar la alteración de la MMR mediante el cribado para determinar su consecuencia directa que son errores en la replicación del ADN, en lugar de realizar un cribado detallado para mutaciones seleccionadas en genes MMR tales como MLH1, MSH2, MSH6 o PMS2 (Peltomaki, 1997). Estos errores en la replicación del ADN se manifiestan mejor en cambios en la variación de longitud en secuencias de repetición en tándem cortas denominadas microsatélites, un fenómeno denominado inestabilidad de microsatélites o MSI.

Los microsatélites son conductos de motivos de ADN adyacentes repetidos normalmente de 5 a 50 veces (es decir, repetidos en tándem) de uno a cinco nucleótidos. Están ampliamente distribuidos en todo el genoma de mamíferos y se ubican más frecuentemente en sus partes no codificantes. Por este motivo, muchos microsatélites son biológicamente silenciosos, lo que les permite acumular mutaciones inofensivas a lo largo de generaciones, que pueden usarse para el análisis de la huella de ADN u otros propósitos de identificación. Sin embargo, la pérdida (deleción) o ganancia (inserción) clonal de una o más unidades de repetición de microsatélites en múltiples microsatélites en un tejido de un solo individuo, pero no en el tejido circundante, es un rasgo distintivo de la replicación defectuosa y sugiere fuertemente una MMR alterada y una propensión a desarrollar cáncer (P inoly col., 2005).

Actualmente, el estándar establecido del análisis de MSI implica una prueba basada en PCR en el ADN de los pacientes con cáncer para determinar la longitud de al menos 5 marcadores de microsatélites que incluyen 2 mono- u homopolímeros (BAT25, BAT26) de 25 y 26 nucleótidos de longitud, y de 3 repeticiones de dinucleótidos (D2S123, D5S346, D17S250) (Boland y col., 1998). El panel de estos 5 marcadores de MSI se propuso primero por el National Cancer Institute Research Workshop en Bethesda, Maryland, y, por tanto, ahora se conoce ampliamente como el panel de Bethesda. Una muestra sometida a prueba con el panel de Bethesda se designa como que tiene una alta frecuencia de MSI o un fenotipo “ MSI-H” si el 30 % o más de los marcadores (de modo que al menos 2 en el panel de 5 marcadores) se sometieron a prueba como inestables. Si un marcador de los cinco (o < 30 % de los marcadores tumorales) puntúa como positivo para MSI, una muestra se designa como baja en MSI o “ MSI-L” . Finalmente, si no se halla ningún marcador alterado, una muestra se considera estable al MSI o “ MSS” (Bolandy col., 1998).

A pesar de ser el estándar actual de prueba de MSI, el panel de Bethesda tiende a mostrar baja sensibilidad, especialmente para cánceres distintos del cáncer colorrectal en vista del cual se desarrolló inicialmente (Bolandy col., 1998). Por tanto, se han sometido a prueba ampliamente marcadores alternativos, incluyendo los mencionados en, por ejemplo, Murphy y col., 2006 y Garcia-Alfonso 2012, y el documento WO2013153130.

Otro inconveniente de los enfoques conocidos actualmente es su nivel de complicación, necesidad de instrumentos especializados que se extienden más allá de los termocicladores de laboratorio convencionales, así como su limitada viabilidad para la automatización. Las técnicas de detección actualmente existentes para MSI aplican uno de estos principios: (i) uso de cebadores marcados con fluorescencia para la detección de los marcadores del panel de Bethesda, seguido de electroforesis capilar; (ii) análisis de la curva de fusión de alta resolución de los 5 marcadores del panel de Bethesda usando un tinte de intercalación de ADNbc; (iii) detección espectrométrica de masa de alelos de una longitud diferente; y (iv) secuenciación de próxima generación de grandes regiones de ADN (por ejemplo, exoma), seguido de recuento del número de mutaciones.

Por ejemplo, (i) la estrategia inicial de cribado de Bethesda basada en PCR requiere una interpretación de un observador experto lo que dificulta la automatización eficaz y sencilla. A continuación, (ii) el análisis de la curva de fusión de alta resolución con tintes de intercalación de ADNbc también usando los marcadores del panel de Bethesda largos, aunque en principio adaptable a termocicladores de PCR convencionales, adolece de capacidades de multiplexación muy limitadas para el cribado de varios marcadores de MSI diferentes en una serie ya que la temperatura de fusión para cada amplicón marcador necesita ser lo suficientemente diferente como para no producir señales superpuestas. Además, a medida que esta estrategia se basa en la formación de heterodúplex entre alelos de longitud normal y mutantes, también es menos sensible en comparación con las otras alternativas. A continuación, (iii) el método basado en espectrometría de masas (Zhao y col., 2014 ) es en principio también susceptible de automatización pero, requiere instrumentación especializada y personal altamente cualificado para la interpretación de los datos. Por último, (iv) la detección del estado de MSI mediante secuenciación de próxima generación (NGS) y recuento del número de mutaciones observadas, sin duda, tiene la ventaja de observar una gran cantidad de posiciones en el genoma o exoma en lugar de sólo en los marcadores selectivos con alta sensibilidad para MSI. Sin embargo, aunque este método también es en principio, al menos parcialmente automatizable, actualmente es muy costoso, requiere un instrumento de NGS especializado, y sigue siendo lento y complicado debido a la generación de una gran cantidad de datos que aún necesitan ser analizados por un especialista.

Por tanto, las técnicas actualmente existentes para determinar el estado de MSI tienen determinados inconvenientes, ya sea relacionados con sus capacidades de detección limitadas, costes y tiempo de respuesta, o requieren un equipo especializado y una interpretación de expertos altamente entrenada de los resultados. La presente invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas resuelve los problemas enumerados anteriormente proporcionando un método altamente sensible, de multiplexación adecuada y totalmente automatizable para la detección de cambios en el número de nucleótidos en microsatélites homopoliméricos cortos que pueden usarse por cualquier instrumento de termociclado por PCR cuantitativa. Esta y otras ventajas de la presente invención se presentan a continuación.

Resumen de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones independientes adjuntas. Las realizaciones preferidas se definen en las reivindicaciones dependientes. En particular, la presente invención se refiere a un método para detectar cambios en el número de nucleótidos presentes en una secuencia de repetición de nucleótidos homopolimérica igual o menor que 15 pb de longitud, comprendiendo el método las etapas de:

- generar amplicones amplificando una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de repetición homopolimérica diana igual o menor que 15 pb de longitud y sus secuencias flanqueantes específicas;

- calentar los amplicones generados en presencia de al menos una sonda de oligonucleótido de baliza molecular generadora de señal que comprende una secuencia complementaria a la secuencia de repetición homopolimérica diana y capaz de hibridar con la secuencia de repetición homopolimérica diana y sus secuencias flanqueantes específicas, y detectar los cambios en la resistencia de la señal generada por dicha sonda en función de la temperatura para obtener al menos una curva de fusión; y

- deducir el número de nucleótidos presentes en la secuencia de repetición homopolimérica diana a partir de la al menos una curva de fusión;

el método se caracteriza porque dicha al menos una sonda de oligonucleótido de baliza molecular generadora de señal comprende una característica o modificación estructural que protege dicha sonda de la actividad 3'-5’ exonucleasa de la polimerasa; y porque la etapa de generar amplicones se realiza en una PCR que comprende una polimerasa que tiene actividad 3'-5’ exonucleasa.

En una realización preferida, el método de la presente invención usa sondas marcadas con fluorescencia para detectar variaciones de longitud en las regiones de repetición homopoliméricas cortas en un instrumento de termociclado por PCR cuantitativa convencional sin la necesidad de ningún equipo adicional para el análisis posterior a la PCR. Por tanto, en una realización particularmente ventajosa, el reactivo generador de señal es al menos una sonda de oligonucleótido marcada (es decir, generadora de señal), siendo preferiblemente una sonda de baliza molecular, que comprende una secuencia complementaria a la secuencia de repetición homopolimérica diana y capaz de hibridar con dicha secuencia de repetición homopolimérica diana y su secuencia flanqueante específica. Lo más preferiblemente, la secuencia capaz de hibridar con la secuencia de repetición homopolimérica diana comprende una secuencia idéntica o perfectamente complementaria a un mutante de dicha secuencia de repetición homopolimérica diana, comprendiendo dicho mutante una deleción de al menos un homonucleótido en dicha secuencia de repetición homopolimérica diana en comparación con su forma de tipo natural.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un kit, preferiblemente en forma de cartucho, para detectar cambios en el número de nucleótidos presentes en una secuencia de repetición de nucleótidos homopolimérica diana igual o más corta que 15 pb de longitud, comprendiendo dicho kit al menos una, preferiblemente una pluralidad de sondas de oligonucleótido que son balizas moleculares, comprendiendo cada una, una secuencia capaz de hibridar con una secuencia que comprende una secuencia de repetición homopolimérica específica diferente igual o menor que 15 pb de longitud; dicho kit también comprende preferiblemente una polimerasa de corrección de lectura. Ventajosamente, cada una de dichas sondas de baliza molecular comprende una secuencia capaz de hibridar con diferentes secuencias de repetición de nucleótidos homopoliméricas diana y siendo idéntica a o complementaria a al menos secuencias mutantes de deleción de homonucleótidos individuales de cada una de dichas diferentes secuencias de repetición homopoliméricas diana.

Finalmente, la presente invención también proporciona usos de los métodos, kits y/o cartuchos proporcionados en el presente documento para la detección de inestabilidad de microsatélites (MSI), en particular en una muestra de un paciente con cáncer.

Breve descripción de las figuras

Para una comprensión más completa de la naturaleza de la presente invención, se hace referencia a la siguiente descripción detallada tomada junto con los dibujos adjuntos, en los que:

Figura 1: muestra las curvas de fusión (panel A) y picos de fusión (panel B) que caracterizan la cinética de hibridación en función de la temperatura para la sonda de baliza molecular específica de TMEM65 que hibrida con tres secuencias diana que tienen diferentes números de homonucleótidos en la secuencia de repetición homopolimérica de TMEM65;

Figura 2: muestra picos de fusión que caracterizan el estado de estabilidad de microsatélites de TMEM65 en 10 muestras de tipo natural (WT) y de microsatélites estables (MSS) (curvas negras, longitud de repetición de TMEM65 de 11) y en 10 muestras de microsatélites inestables (alto en MSI [MSI-H]) (curvas de color gris, longitud de repetición de TMEM65 de 10);

Figura 3: muestra picos de fusión de la sonda de TMEM65 para dos muestras de MSS seleccionadas al azar MSS 1 y MSS 2;

Figura 4: muestra picos de fusión de la sonda de TMEM65 para tres muestras MSI-H seleccionadas al azar (MSI-H 1 -3), cada una mostrada frente a un pico de fusión de sonda de TMEM65 obtenido para la muestra MSS 1 estable al MSI.

Figura 5: muestra picos de fusión para sondas de baliza molecular específicas del marcador ABAT que comprenden (panel A) un tallo que es resistente a la actividad exonucleasa de la polimerasa Q5, o (panel B) un tallo que la polimerasa Q5 degrada.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a nuevos métodos, kits y cartuchos, así como a usos de los mismos, para detectar incluso cambios muy pequeños en el número de nucleótidos (por ejemplo, /1 nt) presentes en uno corto, es decir, al menos 10 nucleótidos más cortos que las secuencias de repetición de nucleótidos homopoliméricas del marcador del panel de Bethesda BAT25. En línea con esto, la presente invención proporciona los métodos, kits y cartuchos, así como usos de los mismos, para la detección de inestabilidad de marcadores de microsatélites homopoliméricos cortos (<15 pb, preferiblemente<12 pb), por ejemplo, tales como los descritos en el documento WO2013153130.

En particular, la presente invención se refiere a un método para detectar cambios en el número de nucleótidos presentes en una secuencia de repetición de nucleótidos homopolimérica igual o menor que 15 pb de longitud, preferiblemente 12 pb, tal como se define mediante las reivindicaciones adjuntas

El método proporcionado en el presente documento tiene la ventaja de ser completamente automatizable y adaptable a cualquier instrumento de termociclado de PCR cuantitativa convencional, lo que le permite ser realizado por personal de laboratorio normal sin necesidad de formación especializada. Además de lo anterior, el método es altamente sensible, de multiplexación adecuada, y puede proporcionar una estimación de las cantidades relativas de las secuencias de repetición de nucleótidos homopoliméricas detectadas y las variantes de las mismas.

Los métodos actualmente existentes para la detección de MSI tienen las siguientes desventajas:

(a) para determinar la longitud de repetición que requieren equipos especializados adicionales para realizar el análisis posterior a la PCR y/o este análisis normalmente debe interpretarse por un experto altamente entrenado; o

(b) en el caso de una curva de fusión de alta resolución con tintes de intercalación de ADNbc, la desventaja es una capacidad de multiplexación muy limitada con el fin de evitar las señales de fusión superpuestas de diferentes amplicones y, además, no proporciona capacidad para cuantificar las cantidades relativas de secuencias inestables (mutantes) con respecto a las estables (de tipo natural).

La presente solicitud supera estos inconvenientes realizando el análisis de la curva de fusión usando sondas marcadas con fluorescencia altamente sensibles a mutantes, en donde cada marcador puede detectarse en un canal fluorescente diferente. En un aspecto particularmente preferido para su realización de sensibilidad, la secuencia en la sonda capaz de hibridar con la secuencia de repetición homopolimérica diana comprende una secuencia idéntica o complementaria a una secuencia mutante de la secuencia de repetición homopolimérica diana, comprendiendo dicho mutante una deleción de al menos un homonucleótido en dicha secuencia de repetición homopolimérica diana en comparación con la forma de tipo natural (es decir, esperada).

A lo largo de estas líneas, en una realización preferida, se proporciona un método para detectar cambios en el número de nucleótidos presentes en una secuencia de repetición de nucleótidos homopolimérica igual o menor que 15 pb de longitud, comprendiendo el método las etapas de:

- generar amplicones amplificando una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de repetición homopolimérica diana y sus secuencias flanqueantes específicas;

- la detección de una señal generada por una sonda hibridando específicamente con la secuencia de repetición homopolimérica y sus secuencias flanqueantes; y

- deducir el número de nucleótidos presentes en la secuencia de repetición homopolimérica diana;

estando dicho método caracterizado porque la sonda comprende una secuencia idéntica o complementaria a una secuencia mutante de dicha secuencia de repetición homopolimérica diana, en donde dicha secuencia mutante comprende una deleción de al menos un homonucleótido en dicha secuencia de repetición homopolimérica diana en comparación con la forma de tipo natural esperada de la secuencia de repetición homopolimérica diana.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ ácido nucleico" y su equivalente "polinucleótido", tal como se usan en el presente documento, se refieren a un polímero de ribonucleósidos o desoxirribonucleósidos que comprenden enlaces fosfodiéster entre subunidades de nucleótidos. Los ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, ADN y ARN, por ejemplo, incluyendo ADN genómico, ADN mitocondrial o ADNme, ADNc, ARNm, ARNr, ARNt, hnARN, microARN, ARNlnc y diversas versiones modificadas de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden obtenerse más habitualmente de fuentes naturales como muestras biológicas obtenidas de diferentes tipos de organismos. Por otro lado, los ácidos nucleicos también pueden sintetizarse, recombinarse o producirse de otro modo en cualquiera de los métodos ideados por los seres humanos (por ejemplo, PCR).

Naturalmente, en una realización preferida, la amplificación se realiza preferiblemente mediante la reacción en cadena de la polimerasa o PCR usando un medio para realizar la PCR tal como un termociclador. Ventajosamente, para fines de automatización mejores, la PCR se realiza preferiblemente usando medios para realizar qPCR que proporciona una monitorización fácil de las señales generadas a partir del reactivo generador de señal.

Con el término “ PCR cuantitativa" o simplemente “ qPCR" se proporciona en el presente documento la definición de una técnica de laboratorio basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que se usa para amplificar y detectar o cuantificar simultáneamente una molécula de ADN seleccionada como diana. A diferencia de la PCR convencional donde el producto de la reacción se detecta en su extremo, es decir, después de que haya terminado el termociclado, la característica clave de la qPCR es que el producto de ADN se está detectando durante el termociclado a medida que la reacción progresa en “tiempo real” ; por tanto, el nombre alternativo de la qPCR es “ PCR en tiempo real". Actualmente existen muchos tipos diferentes de qPCR. Por ejemplo, cuando se inicia con una etapa de transcripción inversa (RT), la qPCR puede usarse para cuantificar el número de ARN mensajeros y entonces se denomina qPCR de transcriptasa inversa o una RT-qPCR. Tal como se usan en el presente documento, los términos “ PCR cuantitativa" o simplemente “ qPCR" se empleará con preferencia sobre el término "PCR en tiempo real" o “ RT-PCR" para evitar la confusión con PCR de transcripción inversa, también abreviada frecuentemente como RT-PCR. La mayoría de las qPCR usan uno de los dos métodos más habituales para detectar la amplificación del producto en tiempo real; (a) intercalación de tintes fluorescentes no específicos con cualquier ADN bicatenario, o (2) sondas de ADN específicas de secuencia que consisten en oligonucleótidos que se marcan con un indicador fluorescente que permite la detección sólo después de la hibridación de la sonda con su secuencia diana complementaria. Las señales fluorescentes generadas durante el termociclado se detectan mediante un sistema de detección óptica apropiado y se siguen desde el momento en que pasan el umbral de fondo hasta que la reacción alcanza la meseta. El número de copias de las secuencias diana puede estimarse usando una estrategia de cuantificación relativa o absoluta, normalmente analizando la forma de la curva de amplificación obtenida (estrategia de curva de calibración) o determinando cuándo la señal se eleva por encima de cierto valor umbral (a menudo denominado valor Ct, pero veces, también valor Cp o valor Cq). En la cuantificación relativa, los niveles de ácido nucleico diana estimados en una muestra dada usando el análisis de Ct o de curva de calibración se expresan en relación con los valores obtenidos para la misma diana en otra muestra de referencia, por ejemplo, una muestra de control no tratada. Por el contrario, en la cuantificación absoluta, la señal de qPCR se relaciona con el número de copias de entrada usando una curva de calibración o también puede calcularse según un método de PCR digital más reciente. Para el momento que es, la primera estrategia es aún más predominante y basa la estimación de la cantidad de ADN diana comparando los valores obtenidos con una curva de calibración elaborada previamente. Estas y otras estrategias de cuantificación por qPCR son ampliamente conocidas en la técnica y su cálculo puede diferir más o menos dependiendo de una aplicación dada y un sistema de qPCR.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “ medios para realizar PCR cuantitativa" se entenderá como una disposición mínima necesaria de reactivos y elementos para realizar una qPCR. Normalmente incluirán cualquier reactivo que permita el termociclado detectable de PCR en tiempo real de un molde de ácido nucleico recibido de una fuente de ácido nucleico. Tales reactivos incluyen, pero dependiendo del tipo de qPCR no se limitan a una polimerasa de calidad PCR, al menos un conjunto de cebadores, un tinte detectable o una sonda, dNTP, tampón de PCR, etc. Además, los “ medios para realizar PCR cuantitativa" normalmente también incluirá cualquier conjunto mínimo de partes conocido convencionalmente en la técnica, que habitualmente incluye, pero no se limita a lo siguiente: (1) un compartimento adecuado (denominado además “ un compartimento de qPCR de termociclado" donde puede tener lugar el termociclado detectable en tiempo real. Tales compartimentos pueden, por ejemplo, estar formados por una cámara adecuada para amplificar ácidos nucleicos, es decir, hechos de material apropiado y que proporcionan suficiente regulación de temperatura interna, y que también comprenden al menos una pared que permite la detección en tiempo real de señales generadas durante tal amplificación, por ejemplo, una pared transparente a la luz. Además, (2) medios para variar la temperatura en esta cámara u otro compartimento, tal como se conoce ampliamente a partir de diversas máquinas de termociclado existentes. A continuación, (3) medios para detectar las señales generadas durante el termociclado de qPCR, como un detector óptico acoplado a un ordenador, etc. En resumen, tal conjunto mínimo incluirá normalmente cualquier sistema o sistemas conocidos en la técnica capaz de iniciar y mantener la reacción de termociclado en el compartimiento de qPCR de termociclado, ajustar y regular la temperatura para garantizar condiciones estables de termociclado en la misma, etc.; además, también incluirá cualquier dispositivo o dispositivos de detección apropiados, medios para el procesamiento de datos (por ejemplo, un ordenador conectado alternativamente a una base de datos), y sistemas de salida que permitan leer y monitorizar el termociclado de la reacción de qPCR en tiempo real (normalmente una pantalla de ordenador que muestra el progreso de la reacción en una interfaz gráfica de usuario apropiada); así como cualquier paquete de software adecuado para hacer funcionar la maquinaria y/o mostrar y posiblemente también ayudar a la interpretación de los resultados obtenidos.

En principio, en posibles realizaciones, cualquier sonda de oligonucleótido específica de diana adecuada para realizar el análisis de la curva de fusión puede usarse en el método de la invención. Las sondas conocidas preferidas pueden comprender un par que consiste en un fluoróforo y un extintor, y también pueden formar ventajosamente estructuras secundarias tales como bucles o horquillas.

En una realización preferida, la al menos una sonda de oligonucleótido marcada es una sonda de oligonucleótido de baliza molecular. Las sondas de baliza molecular, o balizas moleculares, son moléculas con forma de horquilla con un fluoróforo extinguido internamente cuya fluorescencia se restaura cuando se unen a una secuencia de ácido nucleico diana. Por este motivo, las balizas moleculares no se degradan por la acción de la polimerasa y pueden emplearse en el estudio de su cinética de hibridación a su diana mediante la llamada de la curva de fusión. Una sonda de baliza molecular típica tiene aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, pero puede ser más larga. Normalmente, al menos los 15 nucleótidos intermedios son complementarios a su diana de ácido nucleico mientras los cinco nucleótidos en cada extremo terminal son complementarios entre sí, lo que permite que la baliza se ensamble en una estructura de bucle u horquilla. Una baliza molecular que no se hibrida con su diana puede dividirse en 4 partes estructurales: (1) el bucle, que es una región de 18-30 pb que es complementaria para e hibrida con la secuencia diana; (2) el tallo que está formado por los 5-7 nucleótidos terminales en ambos extremos del bucle unidos de manera complementaria entre sí; (3) el fluoróforo unido covalentemente en el extremo 5’ de la baliza molecular; y (4) el extintor unido covalentemente en el extremo 3’ de la baliza molecular. Tal estructura asegura que cuando la baliza no se hibrida con su diana y se cierra en la estructura de horquilla, el extintor extingue la emisión fluorescente del tinte de modo que no se genera señal. Pero cuando se produce la hibridación, se forma un dúplex entre la diana de ácido nucleico y el bucle de la baliza molecular que rompe la estructura de horquilla, elimina el extintor del tinte y, en última instancia, da como resultado la generación de la señal fluorescente.

En una realización preferida de la realización anterior, la sonda de oligonucleótido de baliza molecular comprende una secuencia idéntica o complementaria a un mutante de secuencia de repetición homopolimérica que comprende una deleción de al menos un homonucleótido en la secuencia de repetición homopolimérica diana. Tal diseño de balizas moleculares permite detectar específicamente con marcadores de MSI seleccionados de alta sensibilidad en donde se han producido errores de deslizamiento de la polimerasa, mientras que al mismo tiempo permanecen suficientemente sensibles a las formas de marcadores de tipo natural (es decir, esperadas) que tienen al menos una repetición más larga de las repeticiones. Debe remarcarse que con el término “secuencia de repetición de nucleótidos homopolimérica diana” se entiende la secuencia de repetición homopolimérica de tipo natural o de referencia tal como se espera en las condiciones en las que no está presente MSI. Por el contrario, por “secuencia de repetición de nucleótidos homopolimérica mutante” se entiende una secuencia de repetición de nucleótidos homopolimérica que comprende una inserción o una deleción de al menos un homonucleótido en la secuencia de repetición homopolimérica.

Debido a la especificidad así transmitida de una sonda de baliza molecular dada a un marcador de repetición homopolimérico y las variantes inestables (mutantes) de las mismas, también es posible diseñar un ensayo de multiplexación, en donde al menos dos sondas de baliza molecular se usan en un tubo o compartimento de reacción.

Por lo tanto, en una realización particularmente ventajosa, se proporciona un método en donde se usa al menos una segunda sonda de oligonucleótido de baliza molecular marcada de manera diferente que la primera sonda de oligonucleótido de baliza molecular, en donde dicha segunda sonda de oligonucleótido de baliza molecular comprende una secuencia capaz de hibridar con una segunda secuencia de repetición de nucleótidos homopolimérica diana que es diferente de la primera secuencia de repetición de nucleótidos homopolimérica diana.

Preferiblemente, se usan sondas de baliza molecular particularmente específicas. Por tanto, en una realización ventajosa se proporciona un método en donde la segunda secuencia de repetición de nucleótidos homopolimérica diana comprende una secuencia idéntica o complementaria a una secuencia mutante que comprende una deleción de al menos un homonucleótido en dicha segunda secuencia de repetición homopolimérica diana.

Durante la amplificación de regiones repetitivas homopoliméricas, se sabe que se produce el deslizamiento por polimerasa. Esto conduce a errores en el copiado del número original de nucleótidos repetidos, lo que provoca la acumulación de deleciones o inserciones artificiales en el producto de PCR amplificado. Por tanto, en otra realización preferida del método de la invención, la etapa de generar amplicones se realiza en una PCR que comprende una polimerasa de corrección de lectura, es decir, una polimerasa que tiene actividad 3'-5’ exonucleasa. Muchas de tales polimerasas de calidad de PCR se conocen y están disponibles comercialmente. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, polimerasas como Q5, Pfx, Pfu, Ex Taq, etc.

En un desarrollo adicional de la realización anterior, para proteger a las sondas de oligonucleótido de la amenaza potencial de que la actividad 3'-5’ exonucleasa de la polimerasa de corrección de lectura pueda plantearse, es ventajoso modificar estructuralmente las balizas de tal manera que no puedan digerirse. Por tanto, en una realización particularmente ventajosa del método de la invención, especialmente desde el punto de vista de la estabilidad del ensayo, la al menos una sonda de oligonucleótido marcada generadora de señal comprende una característica o modificación estructural que protege dicha sonda de la actividad 3'-5’ exonucleasa de la polimerasa, seleccionándose dicha característica o modificación estructural de:

- dT invertida en el extremo 3’ de la sonda;

- al menos un enlace fosforotioato situado antes de cualquiera de los tres últimos nucleótidos en el extremo 3’ de la sonda.

Se ha observado que, dependiendo de la polimerasa de corrección de lectura, algunas polimerasas de corrección de lectura no digieren determinadas balizas moleculares cuyo tallo está hecho por determinadas secuencias. Esta observación inesperada probablemente resulta del hecho de que los tallos de balizas moleculares dependiendo de sus secuencias tienen diferentes estructuras 3D. Por tanto, podría plantearse la hipótesis de que determinadas polimerasas de corrección de lectura son incapaces de atacar balizas moleculares cuya estructura de tallo es incompatible con el centro catalítico de la polimerasa de corrección de lectura. Independientemente del mecanismo, hemos observado que la provisión de algunos tipos de tallos de balizas moleculares puede hacerlo completamente inmune a la actividad 3'-5’ exonucleasa de determinadas polimerasas de corrección de lectura. En línea con lo anterior, en una realización alternativa, se proporciona un método en donde la sonda específica de secuencia es una sonda de oligonucleótido de baliza molecular y en donde la característica o modificación estructural protectora es un tallo resistente a la actividad 3'-5’ exonucleasa. Tales tallos pueden trasplantarse fácilmente a una baliza molecular de interés mediante cualquier técnica de clonación o recombinación de ácido nucleico conocida en la técnica.

Una de las principales ventajas del método de la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas es su sencilla automatización y adaptación, especialmente en sistemas de qPCR convencionales conocidos. Por tanto, en una realización particularmente preferida, las etapas del método se realizan en un sistema automatizado. Un sistema particularmente adecuado para tal automatización es una plataforma Biocartis Idylla, que proporciona además la automatización del procesamiento de muestras.

Ventajosamente, el método está precedido por cualquiera de las siguientes etapas:

- proporcionar una fuente de un ácido nucleico que comprende potencialmente la secuencia de repetición homopolimérica diana, siendo dicha fuente preferiblemente una muestra biológica;

- liberar y/o aislar el ácido nucleico que comprende potencialmente la secuencia de repetición homopolimérica diana de la fuente de un ácido nucleico;

- proporcionar dicho ácido nucleico liberado y/o purificado que comprende potencialmente la secuencia de repetición homopolimérica diana a la etapa de generar amplicones;

en donde al menos las etapas de:

también se realizan en un sistema automatizado.

Además, particularmente ventajoso y que requiere una manipulación y preparación técnica mínimas de la realización anterior, puede proporcionarse un método en donde al menos las etapas de:

- generar amplicones amplificando una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de repetición homopolimérica diana; y

- calentar los amplicones generados en presencia de una sonda de oligonucleótido generadora de señal y detectar los cambios en la resistencia de dicha señal en función de la temperatura para obtener al menos una curva de fusión;

se realizan en un cartucho que puede acoplarse con dicho sistema automatizado.

Tal como se usa en el presente documento, el término "cartucho" debe entenderse como un conjunto autocontenido de cámaras y/o canales, que se forma como un único objeto que puede transferirse o moverse como un accesorio dentro o fuera de un instrumento más grande adecuado para aceptar o conectar a tal cartucho. Algunas partes contenidas en el cartucho pueden estar firmemente conectadas, mientras que otras pueden conectarse y moverse de manera flexible con respecto a otros componentes del cartucho. Análogamente, tal como se usa en el presente documento, el término “ cartucho de fluido" se entenderá como un cartucho que incluye al menos una cámara o canal adecuado para tratar, procesar, descargar o analizar un fluido, preferiblemente un líquido. Un ejemplo de tal cartucho se proporciona en el documento WO2007004103. Ventajosamente, un cartucho de fluido puede ser un cartucho de microfluido. En el contexto de los cartuchos de fluido, los términos “ aguas abajo" y "aguas arriba" pueden definirse en relación con la dirección en la que fluyen fluidos en tal cartucho. Concretamente, una sección de una trayectoria de fluido en un cartucho desde el que fluye un fluido hacia una segunda sección en el mismo cartucho debe interpretarse como posicionado aguas arriba de este último. Análogamente, la sección a la que llega un fluido más adelante está posicionado aguas abajo con respecto a una sección por la que dicho fluido pasó antes.

En general, tal como se usa en el presente documento, los términos “ fluido" o a veces "microfluidos" se refiere a sistemas y disposiciones que tratan el comportamiento, control y manipulación de fluidos que están geométricamente restringidos a una escala pequeña, normalmente submilimétrica en al menos una o dos dimensiones (por ejemplo, anchura y altura o un canal). Tales fluidos de pequeño volumen se mueven, se mezclan, se separan o se procesan de otro modo a microescala que requiere un tamaño pequeño y bajo consumo de energía. Los sistemas de microfluido incluyen estructuras tales como sistemas microneumáticos (fuentes de presión, bombas de líquido, microválvulas, etc.) y estructuras de microfluido para la manipulación de volúmenes de micro, nano o picocolitros (canales de microfluido, etc.). Se describieron sistemas de fluido a modo de ejemplo en los documentos EP1896180, EP1904234 y EP2419705 y, en consecuencia, pueden aplicarse en determinadas realizaciones

En una realización particularmente deseada según las realizaciones enumeradas anteriormente, para simplificar y facilitar la interpretación de los resultados del método según la presente invención, el análisis en la curva de fusión también se realiza de manera automatizada mediante un software implementado por ordenador. Tal software puede ser instruido para reconocer la posición característica de los picos de fusión definidos (o puntos de inflexión) que caracterizan la hibridación de una sonda particular a una diana particular y se obtiene representando gráficamente la primera derivada negativa de una curva de fusión obtenida para dicho par de sonda y diana. Por tanto, en otra realización preferida, se proporciona un método en donde la etapa de deducir el número de nucleótidos presentes en la secuencia de repetición homopolimérica diana de la al menos una curva de fusión se realiza evaluando la posición o una posición relativa de al menos un pico de la primera derivada de dicha curva de fusión, y se realiza más preferiblemente de manera totalmente automatizada.

En un aspecto adicional, la presente invención también proporciona kits para realizar el método según la invención. En particular, la presente invención proporciona un kit para detectar cambios en el número de nucleótidos presentes en una secuencia de repetición de nucleótidos homopolimérica diana igual o más corta que 15 pb de longitud, comprendiendo dicho kit al menos una sonda de oligonucleótido de baliza molecular, preferiblemente una pluralidad de sondas de oligonucleótido de baliza molecular, comprendiendo cada baliza molecular una secuencia capaz de hibridar con una secuencia que comprende una secuencia de repetición homopolimérica diana diferente igual o menor de 15 pb de longitud, y preferiblemente dicho kit también comprende una polimerasa de corrección de lectura. Preferiblemente, cada una de dicha pluralidad de sondas de baliza molecular comprende una secuencia capaz de hibridar con una secuencia de repetición de nucleótidos homopolimérica diana particular (preferiblemente siendo diferente de las secuencias de repetición de nucleótidos homopoliméricas seleccionadas como diana por otras balizas moleculares) y que es idéntica o complementaria a una forma mutada de dicha secuencia de repetición diana particular de manera que dicha forma mutada pierde al menos un único homonucleótido (es decir, es una deleción) en dicha secuencia de repetición homopolimérica diana en comparación con la forma de tipo natural.

En una realización preferida, se proporciona un kit en forma de cartucho. Por tanto, ventajosamente, la presente invención proporciona un kit en donde dicha al menos una, preferentemente una pluralidad de sondas de oligonucleótido de baliza molecular, y preferiblemente también una polimerasa de corrección de lectura, se proporcionan en un cartucho que puede acoplarse con un sistema automatizado. Tal como se describió anteriormente, un ejemplo adecuado de un cartucho y un sistema automatizado que puede acoplarse con el mismo es la plataforma Biocartis Idylla. Detalles adicionales de esto y de manera similar aplicables a los presentes sistemas pueden hallarse en los documentos WO2007004103, EP1896180, EP1904234 y EP2419705. Tal como puede apreciarse a partir de los documentos citados en el presente documento, los cartuchos ventajosos no sólo comprenden medios para realizar la PCR sino también pueden diseñarse para aceptar directamente una fuente de ácido nucleico o una muestra, liberar ácidos nucleicos de dicha fuente de ácido nucleico, y proporcionar (por ejemplo, bombear) el ácido nucleico así liberado para el posterior ensayo basado en PCR.

Tal como se usa en el presente documento, el término "fuente de un ácido nucleico" debe entenderse como cualquier sustancia líquida o sólida, que comprende o se espera que comprenda un ácido nucleico. Una fuente de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, una disolución creada artificialmente que comprende un ácido nucleico sintético o recombinante tal como entre muchas otras una disolución que contiene un producto de ligamiento, un marcador de electroforesis (denominado “ marcador de peso molecular” ), una reserva de cebadores, etc. Sin embargo, más habitualmente, una fuente de ácido nucleico será una muestra biológica obtenida de un organismo o de células que forman parte o se derivan del mismo, preferiblemente una muestra clínica obtenida de un paciente.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ muestra biológica", o simplemente "muestra", pretende incluir una variedad de fuentes biológicas que contienen ácido nucleico y/o material celular, independientemente de si está recién obtenido de un organismo (es decir, muestra de tejido recién obtenido) o se conserva mediante cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo, una muestra de FFPE). Los ejemplos de muestras biológicas incluyen: cultivos de células tales como células de mamíferos pero también de microorganismos eucariotas, líquidos corporales, precipitados de líquido corporal, muestra de lavado, aspirados con aguja fina, muestras de biopsia, muestras de tejido, células cancerosas, otros tipos de células obtenidas de un paciente, células de un tejido o células cultivadas in vitro de un individuo que se está sometiendo a prueba y/o tratando para una enfermedad o infección, o muestras forenses. Los ejemplos no limitativos de muestras de líquido corporal incluyen sangre completa, médula ósea, líquido cefalorraquídeo (LCR), líquido peritoneal, líquido pleural, líquido linfático, suero, plasma, orina, quilo, heces, semen, esputo, aspirado de pezón, saliva, muestra de hisopado, lavado o líquido de lavado y/o muestras de cepillado.

Una vez que se proporciona una muestra biológica en los sistemas o durante la realización de los métodos, generalmente se pondrá en contacto con una composición para proporcionar un lisado en donde se libera ácido nucleico. Tal como se utiliza en el presente documento, por "poner en contacto" se entiende poner, exponer, incubar o mezclar la muestra y la composición. "Liberar" se refiere a liberar, obtener y/o invertir la reticulación. Para liberar ácido nucleico de una muestra, puede requerirse actividad proteasa y tamponamiento del pH de la composición. La liberación puede requerir la actividad de precipitación potencial de la composición de los componentes distintos del ácido nucleico presente en la muestra investigada y la eliminación/disolución del fijador. La liberación puede requerir condiciones tales como calentamiento o ultrasonidos enfocados de alta intensidad (HIFU). En una realización, se introduce una muestra biológica en un cartucho compatible con un sistema automatizado tal como un analizador de diagnóstico, en donde las etapas de procesamiento de muestras implican poner en contacto con diversas soluciones y liberar ácidos nucleicos.

Además, el término "medios para liberar o purificar ácido nucleico de la muestra biológica" debe entenderse como cualquier pluralidad de reactivos químicos y/o elementos físicos tal como se conocen en la técnica que se sabe que se usan para liberar ácidos nucleicos de células u otras estructuras en una muestra biológica, y, en el caso de la purificación, separar suficientemente dichos ácidos nucleicos de residuos de muestras no deseados en una forma aceptablemente pura (en donde el término “ aceptablemente” depende del propósito adicional de tales ácidos nucleicos purificados), normalmente en una disolución acuosa. Los reactivos químicos adecuados para tal propósito incluyen, por ejemplo, cualquiera detergente y/o tampón conocido en la técnica que comprenda detergentes, agentes caotrópicos, inhibidores de nucleasa, etc., que se usan en la destrucción y/o licuado de tejidos o células y, por tanto, liberan ácidos nucleicos contenidos en los mismos en la disolución. De manera similar, los elementos físicos conocidos en la técnica que van a usarse en diversos métodos de procesamiento de muestras con el propósito de la liberación/purificación de ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, soportes sólidos de sílice tales como resinas en columnas de centrifugación, membranas de sílice, perlas etc. disruptores mecánicos adicionales o máquinas que generan energía disruptiva como sonicadores, etc.

En línea con lo anterior, ventajosamente, la presente descripción también proporciona un cartucho para la detección automatizada de cambios en el número de nucleótidos presentes en una secuencia de repetición de nucleótidos homopolimérica igual o menor que 15 pb de longitud, comprendiendo el cartucho

- un compartimento de muestra para recibir una muestra biológica;

- un medio para liberar o purificar ácido nucleico de la muestra biológica recibida en el compartimento de muestra, siendo dichos medios capaces de entrar en comunicación de fluido con dicho compartimento de muestra; - un compartimento de PCR situado aguas abajo del compartimento de muestra y de los medios para liberar o purificar ácido nucleico, y configurado para recibir al menos una porción del ácido nucleico liberado o purificado o al menos una porción de la biblioteca de ácidos nucleicos preparada en el compartimento de biblioteca, siendo dicho compartimiento de PCR de termociclado adecuado para amplificar ácidos nucleicos y permitir la detección de señales generadas durante o después de tal amplificación

el cartucho caracterizado porque comprende además al menos una, preferiblemente una pluralidad de sondas de oligonucleótido de baliza molecular tal como se describió anteriormente, y una polimerasa de corrección de lectura, preferiblemente en el compartimento de PCR.

En una realización preferida, las sondas de oligonucleótido de baliza molecular, y/o la polimerasa de corrección de lectura pueden proporcionarse en dicho cartucho en un formato punteado, lo que contribuye a una mayor vida útil de tal cartucho según la invención.

Por último, también es un objeto de la invención proporcionar un uso de métodos, kits y cartuchos según la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas para la detección de la inestabilidad de microsatélites (MSI), preferiblemente en una muestra obtenida de un paciente diagnosticado con o que se espera que padezca un cáncer.

EJEMPLOS

1. Curva de fusión de baliza molecular para marcador de MSI en el TMEM65

La capacidad de una realización preferida del método presentado en el presente documento para detectar incluso cambios muy menores de 1 nt de longitud en una secuencia de repetición de nucleótidos homopolimérica se demostrará en el presente documento usando un marcador de TMEM65 humana, situado en Chr8:125325217, y que contiene una repetición homopolimérica de 11 adeninas (A). La secuencia de repetición homopolimérica de tipo natural (WT) (en negrita y subrayada) y su secuencia circundante específica de TMEM65 se proporciona a continuación:

TAAATAAAATTCACTAAATAAGATATAATGAGATTAGGAGTATGAATATGGGGTATTCAGACTT

ATTCCATTCAGATGAGAAGATGACATCTTTGGAGGGAAAAAAAAAAACCTTACCAAATAATATA

AATTGTATCTCATTAATCTTTCAAACATCACTTCAACTTCATCATTTATACCATAAACCTTCTT

GACAGTTC

Para detectar los cambios de nucleótidos en la secuencia de repetición de TMEM65, se diseñó una sonda de detección de baliza molecular que tenía la secuencia de CGCACGAGGGAAAAAAAAAACCTTACGTGCG y se marcó con FAM como una molécula de marcado fluorescente, mientras que se usó dabcilo como un extintor (la región de tallo de la sonda de baliza molecular se indica en cursiva, la región de hibridación de la sonda está en negrita en donde la secuencia de repetición es idéntica al marcador de TMEM65 mutado que comprende 10 repeticiones de adenina en lugar de 11 está en negrita y subrayada).

Para someter a prueba la capacidad de la sonda específica de TMEM65 para unirse y reconocer tanto la secuencia de marcador de TMEM65 w T como sus dos homólogos mutantes diferentes siendo una deleción o una inserción de un homonucleótido, se prepararon 3 dianas sintéticas de TMEM65 representando las 3 variantes diferentes de la repetición del homopolímero de TMEM65. Las secuencias de las tres de dichas variantes se proporcionan a continuación como cadenas de ADN que son complementarias a la sonda de baliza molecular específica de TMEM65 (que contiene repeticiones de poli-A) que se híbrida con dichas cadenas de variantes. Las cadenas de variantes de TMEM65 complementarias (que contienen repeticiones de poli-T) son las siguientes:

TMEM65_T10 (deleción de 1 pb):

AAATGATGAAGTTGAAGTGATGTTTGAAAGATTAATGAGATACAATTTATATTATTTGGTAAG

GTTTTTTTTTTCCCTCCAAAGATGTCATCTTCTCATCTGAATGGAATAAGTCTGAATAC

TMEM65_T11 (referencia):

AAATGATGAAGTTGAAGTGATGTTTGAAAGATTAATGAGATACAATTTATATTATTTGGTAAG

GTTTTTTTTTTTCCCTCCAAAGATGTCATCTTCTCATCTGAATGGAATAAGTCTGAATAC

TMEM65_T12 (inserción de 1 pb):

AAATGATGAAGTTGAAGTGATGTTTGAAAGATTAATGAGATACAATTTATATTATTTGGTAAG

GTTTTTTTTTTTTCCCTCCAAAGATGTCATCTTCTCATCTGAATGGAATAAGTCTGAATAC

La sonda de baliza molecular específica de TMEM65 se añadió a una concentración de 200 nM a 3 tubos de PCR independientes, conteniendo cada uno una de las 3 variantes descritas anteriormente a la concentración de 2500 nM en un tampón de reacción de PCR convencional. Después, se desnaturalizó la mezcla en un instrumento Bio-Rad CFX96 durante 2 minutos a 95 °C y después se enfrió hasta 45 °C durante 15 min para permitir el tiempo suficiente para que la sonda de baliza molecular se hibride con su diana. A continuación, se realizó un análisis de la curva de fusión calentando la mezcla hasta 75 °C en etapas de 0,3 °C (5 s por ciclo) y se midió la fluorescencia después de cada aumento de 0,3 °C.

Los resultados del análisis de la curva de fusión se muestran en la figura 1, en donde el panel superior A muestra las curvas de fusión (como fluorescencia a lo largo del tiempo) de la sonda específica de TMEM65 con respecto a las tres dianas, y en donde el panel inferior B muestra picos de fusión o primeras derivadas negativas de las curvas de fusión en A. Los valores de Tm para los tres picos de fusión fueron: 54,9 °C para TMEM65_T10, 51,3 °C para TMEM65_T11, y 47,7 °C para TMEM65_T12. Los valores de delta Tm de los picos de fusión fueron:

TMEM65_T10 - TMEM65_T11 = 3,6°C

TMEM65_T11 - TMEM65_T12 = 3,6°C

TMEM65_T10 - TMEM65_T12 = 7,2°C

Basándose en estos resultados, puede concluirse que la deleción o inserción de un único nucleótido en comparación con la secuencia de referencia (es decir, la repetición T10 o T12 frente a la repetición de referencia T11) da como resultado una diferencia de varios °C (grados Celsius) en la Tm del pico de fusión en comparación con la Tm del pico de fusión para la secuencia de referencia. Por tanto, la longitud de esta secuencia repetida en el gen TMEM65 puede determinarse mediante el análisis de los picos de fusión producidos por hibridación de la sonda de baliza molecular descrita en su región diana.

2. Evaluación de estado del marcador de MSI de TMEM65 en muestras de pacientes con cáncer

Se proporcionaron muestras de FFPE de pacientes con cáncer colorrectal en cartuchos de fluido Biocartis Idylla. Se cerraron y se cargaron los cartuchos en la plataforma Biocartis Idylla para análisis genéticos basados en PCR automatizados, después de lo cual se inició el procesamiento automatizado de muestras. En primer lugar, el ADN de los pacientes se liberó de las muestras de FFPE y luego se bombeó en los compartimentos de PCR de los cartuchos. A continuación, se realizó la amplificación por PCR asimétrica de la región que rodea la secuencia de repetición homopolimérica de TMEM65 en cada cartucho usando los siguientes cebadores directo:5'-CAGACTTATTCCATTCAGATGAGA-3' e inverso: 5'-GAAGTGATGTTTGAAAGATTAATGAGA-3'. La amplificación por PCR se realizó en presencia de la sonda de baliza molecular específica de TMEM65 descrita anteriormente.

Después de la PCR, los productos de PCR se desnaturalizaron en los cartuchos durante 2 minutos a 95 °C y después se enfriaron hasta 45 °C durante 15 min para permitir el tiempo suficiente para la hibridación de la sonda de baliza molecular específica de TMEM65 con sus dianas. A continuación, se realizó un análisis de la curva de fusión todavía en el sistema Idylla calentando la mezcla desde 40 °C hasta 60 °C en etapas de 0,3 °C (5 s por ciclo) y al mismo tiempo monitorizando las señales de fluorescencia después de cada 0,3 0C. Los picos de fusión se calcularon como los valores negativos de las primeras derivadas de las curvas de fusión obtenidas.

La figura 2 muestra los resultados obtenidos de 10 muestras de tipo natural (curvas negras, longitud de repetición de TMEM65 de 11) consideradas como microsatélites estables (MSS) y 10 muestras mutantes (curvas de color gris, longitud de repetición de TMEM65 de 10) consideradas como microsatélites inestables (alto en MSI [MSI-H]). Téngase en cuenta las alturas de pico consistentes del pico A11 de tipo natural (a ±49 0C) en las muestras de MSS, mientras que en las muestras de MSI-H tanto el pico A11 de tipo natural como el pico A10 mutante (a ±53 0C) tienen una altura variable. Esto refleja las proporciones variables de alelos de tipo natural y mutantes presentes en cada muestra.

Las figuras 3 y 4 muestran ejemplos representativos de muestras de FFPE de MSS y MSI-H, respectivamente. En la figura 4, en cada uno de los paneles A-C que representan tres muestras diferentes de MSI-H, MSS 1 se muestra como una referencia de tipo natural. La muestra MSI-H 1 contiene un menor contenido de alelo mutante que del alelo de tipo natural, ya que la altura del pico A10 mutante (a ±53 0C) es menor que la altura del pico A11 de tipo natural (a ±49 0C). La muestra MSI-H 2 contiene cantidades similares de alelo mutante y de tipo natural, ya que la altura del pico A10 mutante (a ±53 0C) es similar a la altura del pico A11 de tipo natural (a ±49 0C). La muestra MSI-H 3 contiene una mayor cantidad de alelo mutante que del alelo de tipo natural, ya que la altura del pico A10 mutante (a ±53 0C) es mayor que la altura del pico A11 de tipo natural (a ±49 0C).

Los resultados presentados en el presente documento demuestran que el procedimiento de uso de una sonda de baliza molecular, tal como se describe en este caso, permite la determinación del número de nucleótidos presentes en la secuencia de repetición homopolimérica de TMEM65 en ADN a partir de biopsias de tejido de FFPE de cáncer colorrectal. Adicionalmente, este método permite una estimación de las cantidades relativas de alelos de repetición de TMEM65 de tipo natural y mutantes presentes en el ADN de la biopsia de tumor.

3. Rendimiento de diferentes sondas de baliza molecular en presencia de una polimerasa de corrección de lectura

Para lograr una mayor sensibilidad del método descrito en el presente documento, es ventajoso usar en la mezcla de amplificación por PCR una polimerasa de corrección de lectura (es decir, una corrección de errores) que tiene actividad 3'-5’ exonucleasa. Sin embargo, para muchas balizas moleculares en la mezcla se observó que diferentes polimerasas de corrección de lectura sometidas a prueba pueden degradar diferentes balizas, lo que da como resultado una pérdida parcial o completa de señal y, por tanto, también interfiere con o evita la interpretación fiable de datos.

Un ejemplo de lo anterior se muestra en la figura 5. El panel superior A muestra picos de fusión obtenidos en el ADN de 2 muestras de FFPE clínicas con una polimerasa Q5 de corrección de lectura y una sonda de baliza molecular de una secuencia CGCAGGAAGCTAAAAAAAAAACCCTTCTGCG (que tiene como marcador Texas Red y como un extintor Iowa Black FQ) diseñado para detectar posibles pérdidas de homonucleótidos en un marcador de MSI ABAT. El pico más oscuro continuo corresponde a una muestra de MSS (estable) donde ABAT es de tipo natural y comprende 11 repeticiones de adenina. La línea con círculos muestra una curva doble obtenida en el ADN de una muestra de MSI-H que comprende un pico de deleción más alto en el lado derecho de la curva y un pico WT más pequeño en el lado izquierdo. El pico WT se observa habitualmente en muestras de tumor de MSI-H ya que hay casi siempre una contaminación de tejido tumoral siempre con ADN WT del estroma circundante del tumor.

Tales resultados estables podrían obtenerse de manera repetitiva con otras muestras cuando se usa la polimerasa Q5 de corrección de lectura y la baliza molecular específica de ABAT descrita anteriormente sin la necesidad de proteger adicionalmente dicha baliza con cualquier modificación química adicional. Se ha planteado la hipótesis de que esto resulta probablemente de la estructura 3D de dicho tallo de baliza que es incompatible para unirse y digerirse por el centro activo de exonucleasa de la polimerasa Q5.

Se obtuvo un perfil de fusión completamente diferente, mostrado en el lado izquierdo del panel inferior B de la figura 5, con la polimerasa Q5 para otra baliza molecular específica para ABAT y que tenía la secuencia de CCGTCCGAAGCTAAAAAAAAAACCCTTGGACGG (mismo marcador y extintor). Esta sonda pudo degradarse de manera eficiente y repetida por la actividad exonucleasa de la polimerasa Q5 durante la PCR. Dado que la baliza se degradó en el transcurso de la PCR, no pudo obtenerse señal durante el análisis de la curva de fusión posterior a la PCR (el gráfico es plano). El lado derecho del panel B muestra un perfil de qPCR para la misma sonda lo que demuestra que la baliza es funcional y genera señal durante la PCR. Dado que la señal ya no está presente en la fusión posterior a la PCR, esto demuestra que la señal generada durante la PCR fue provocada por la degradación de la baliza.

Se observó que en las PCR realizadas usando la polimerasa Q5, pero con otras sondas de baliza molecular específicas para diferentes marcadores de MSI, se observó la misma tendencia dependiendo de cuál de los tallos anteriormente descritos para las dos sondas específicas de ABAT estaba presente en la baliza dada.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar cambios en el número de nucleótidos presentes en una secuencia de repetición de nucleótidos homopolimérica igual o menor que 15 pb de longitud, comprendiendo el método las etapas de:

el método caracterizado porque dicha al menos una sonda de oligonucleótido de baliza molecular generadora de señal comprende una característica o modificación estructural que protege dicha sonda de la actividad 3'-5’ exonucleasa de la polimerasa y

porque la etapa de generar amplicones se realiza en una PCR que comprende una polimerasa que tiene actividad 3'-5’ exonucleasa.

2. El método según la reivindicación 1, en donde dicha sonda de oligonucleótido de baliza molecular generadora de señal comprende 4 partes estructurales:

(1) el bucle, que es una región de 18-30 nt que es complementaria para e hibrida con la secuencia diana;

(2) el tallo que está formado por los 5-7 nucleótidos terminales en ambos extremos del bucle unidos de manera complementaria entre sí;

(3) el fluoróforo unido covalentemente en el extremo 5’ de la baliza molecular; y (4) el extintor unido covalentemente al extremo 3’ de la baliza molecular.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en donde se usa al menos una segunda sonda de oligonucleótido de baliza molecular marcada de manera diferente que la primera sonda de oligonucleótido de baliza molecular, en donde dicha segunda sonda de oligonucleótido de baliza molecular comprende una secuencia capaz de hibridar con una segunda secuencia de repetición de nucleótidos homopolimérica diana que es diferente de la primera secuencia de repetición de nucleótidos homopolimérica diana,

y en donde la secuencia capaz de hibridar con la segunda secuencia de repetición de nucleótidos homopolimérica diana comprende una secuencia complementaria a dicha segunda secuencia de repetición homopolimérica diana y sus secuencias flanqueantes específicas.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha característica o modificación estructural protege la al menos una sonda de oligonucleótido de baliza molecular marcada generadora de señal de la actividad 3'-5’ exonucleasa de la polimerasa se selecciona de:

- dT invertida en el extremo 3’ de la sonda;

5. Método según la reivindicación 4, en donde dicha característica o modificación estructural es un tallo resistente a la actividad 3'-5’ exonucleasa.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las etapas de:

- calentar los amplicones generados en presencia de la al menos una sonda de oligonucleótido generadora de señal, y detectar los cambios en la resistencia de dicha señal en función de la temperatura para obtener al menos una curva de fusión; y

- deducir el número de nucleótidos presentes en la secuencia de repetición homopolimérica diana a partir de la al menos una curva de fusión

se realizan en un sistema automatizado.

7. Método según la reivindicación 6, dicho método precedido por cualquiera de las siguientes etapas de: - proporcionar una fuente de un ácido nucleico que comprende potencialmente la secuencia de repetición homopolimérica diana, siendo dicha fuente preferiblemente una muestra biológica; - liberar y/o aislar el ácido nucleico que comprende potencialmente la secuencia de repetición homopolimérica diana de la fuente de un ácido nucleico;

en donde al menos las etapas de:

también se realizan en un sistema automatizado.

8. Método según la reivindicación 7, en donde al menos las etapas de:

se realizan en un cartucho que puede acoplarse con dicho sistema automatizado.

9. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el deducir el número de nucleótidos presentes en la secuencia de repetición homopolimérica diana de la al menos una curva de fusión se realiza evaluando la posición o una posición relativa de al menos un pico de la primera derivada de dicha curva de fusión, y se realiza preferiblemente de manera automatizada.

10. Un kit para detectar cambios en el número de nucleótidos presentes en una secuencia de repetición de nucleótidos homopolimérica diana igual o menor que 15 pb de longitud, comprendiendo dicho kit una polimerasa que tiene actividad 3'-5’ exonucleasa y

al menos una, preferiblemente una pluralidad de sondas de oligonucleótido de baliza molecular, comprendiendo cada sonda de oligonucleótido de baliza molecular una secuencia capaz de hibridar con una secuencia de repetición homopolimérica diana diferente igual a o menor de 15 pb de longitud y sus secuencias flanqueantes, en donde cada una de las secuencias capaces de hibridar con las diferentes secuencias de repetición homopoliméricas diana comprende una secuencia complementaria a la secuencia de repetición homopolimérica diana y su secuencia flanqueante específica, y en donde cada baliza molecular comprende una característica o modificación estructural que protege dicha sonda de la actividad 3'-5’ exonucleasa de la polimerasa.

11. Kit según la reivindicación 10, en donde dicha al menos una, preferiblemente una pluralidad de sondas de oligonucleótido de baliza molecular, y preferiblemente también la polimerasa que tiene actividad 3'-5’ exonucleasa, se proporcionan en un cartucho que puede acoplarse con un sistema automatizado.

12. Uso de un método según las reivindicaciones 1-9 y/o kits según las reivindicaciones 10-11 para la detección de inestabilidad de microsatélites (MSI), preferiblemente en una muestra obtenida de un paciente diagnosticado con o que se espera que padezca un cáncer.