ES2925313T3 - Método para la detección de secuencias de ácido nucleico diana - Google Patents

Método para la detección de secuencias de ácido nucleico diana Download PDF

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Abstract

Se describen métodos y reactivos adecuados para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasa. En particular, la divulgación proporciona sondas y cebadores que son adecuados en procedimientos de amplificación de flujo dinámico. En algunos aspectos, la divulgación proporciona sondas y cebadores de oligonucleótidos largos, así como sondas y cebadores que forman triplex, que funcionan dentro de los estrechos intervalos de Tm utilizados con la amplificación de flujo dinámico. Sin embargo, también se proporcionan realizaciones en las que las sondas y los cebadores que se enseñan en el presente documento se pueden utilizar en PCR estándar. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método para la detección de secuencias de ácido nucleico diana
CAMPO
La presente divulgación se refiere a métodos que se pueden utilizar para realizar la amplificación de flujo dinámico ("DFA, por sus siglas en inglés"). En particular, describe un método para detectar una secuencia de ácido nucleico diana usando DFA.
ANTECEDENTES
Típicamente, la PCR en tiempo real se basa en el uso de moléculas fluorescentes que permiten la cuantificación o detección de un producto de PCR en tiempo real, mientras que también son aplicables otras químicas de detección/cuantificación, tal como la electroquímica.
Las moléculas fluorescentes pueden ser colorantes de unión a ADN tales como SYBR® Green o cebadores o sondas marcados con fluorescencia. Existen muchos colorantes fluorescentes y diseños de sondas disponibles para diferentes aplicaciones. El colorante de unión a ADN más usado para la PCR en tiempo real es SYBR® Green 1, que se une preferentemente al ADN bicatenario (ADNbc) frente al ADN monocatenario. La fluorescencia de SYBR Green I aumenta hasta 1.000 veces cuando se une a ADNbc. Por lo tanto, la señal de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADNbc presente.
El principal inconveniente de los colorantes de unión a ADN es su falta de especificidad, es decir, los colorantes de unión a ADN se unen a cualquier ADNbc. Como resultado, la presencia de cualquier producto no específico en una reacción de PCR en tiempo real o de punto extremo contribuirá a la fluorescencia general y afectará a la precisión de la cuantificación o detección. Además, los colorantes de unión a ADN no se pueden usar para la cuantificación o detección en reacciones multiplex porque las señales de fluorescencia de diferentes productos no se pueden distinguir sin la inclusión de un análisis de curva de fusión posterior a la PCR para distinguir la formación de diferentes productos.
Por el contrario, las químicas de detección basadas en cebadores y basadas en sondas aseguran que la señal se genera solo cuando se amplifica el producto de interés. Típicamente, el cebador o la sonda oligonucleotídica específica de la diana se marca con un fluoróforo indicador, pero en la mayoría de los casos, la fluorescencia se interrumpe cuando la diana específica aún no está amplificada o cuando no está presente en la muestra. Normalmente, esto se logra uniendo una molécula interruptora al cebador o la sonda, e ideando algún mecanismo por el cual el indicador y el interruptor se separen cuando el cebador o la sonda se una a su diana específica.
Las principales químicas de detección de cebador/sonda en uso hoy en día son las siguientes:
Sonda de hidrólisis (TaqMan)
Los ensayos de hidrólisis incluyen una sonda oligonucleotídica marcada con fluorescencia, específica de secuencia, además de los cebadores específicos de secuencia. Los ensayos de hidrólisis aprovechan la actividad de la exonucleasa 5' de determinadas polimerasas termoestables, tales como Taq o Tth. La sonda de hidrólisis está marcada con un indicador fluorescente en un extremo y un interruptor en el extremo opuesto, aunque son de uso común varias variaciones de este diseño particular. Cuando la sonda está intacta, la fluorescencia se interrumpe debido a la proximidad del fluoróforo al interruptor. Un par de indicador-interruptor fluorescente comúnmente usado es la fluoresceína (FAM), que emite fluorescencia verde, y el colorante Black Hole Quencher 1, aunque esta es solo una de las muchas combinaciones de colorante/interruptor en uso.
La reacción de amplificación incluye una etapa combinada de hibridación/extensión durante la cual la sonda se hibrida con la diana y la actividad de la exonucleasa 5' a 3' específica de ADNbc de Taq o Tth escinde el oligonucleótido, separando el fluoróforo del interruptor, lo que da como resultado una señal de fluorescencia que es proporcional a la cantidad de producto amplificado en la muestra. Se puede usar una sonda de hidrólisis diseñada correctamente en combinación con sondas adicionales de diseño similar para determinar las variaciones de secuencia dentro de la diana amplificada, es decir, el genotipo.
Balizas moleculares
Las balizas moleculares son oligonucleótidos marcados con colorante (25-40 nt) que forman una estructura de horquilla. Los extremos 5' y 3' tienen secuencias complementarias de 5-6 nucleótidos que forman el tallo, mientras que el bucle está diseñado para hibridar específicamente con una sección de 15-30 nucleótidos de la secuencia diana. Una molécula indicadora fluorescente se une a un extremo de la baliza molecular y un interruptor se une al otro extremo. Cuando la sonda no se une, se produce la formación de horquilla, lo que hace que el indicador y el interruptor se acerquen y se interrumpa la fluorescencia.
Si una secuencia diana está presente durante la etapa de hibridación de una reacción de amplificación, la porción de bucle de la baliza molecular se une a su secuencia diana, provocando la desnaturalización del tallo. El indicador y el interruptor se separan de este modo, la interrupción disminuye y la fluorescencia del indicador es detectable. Debido a que la sonda emite fluorescencia solo cuando está unida a la diana, la cantidad de fluorescencia detectada es proporcional a la cantidad de diana en la reacción. De nuevo, se puede usar una baliza molecular diseñada correctamente para distinguir las variaciones de secuencia subyacentes, es decir, los genotipos, dentro de la secuencia amplificada. Típicamente, esto se logra con el análisis de la curva de fusión después de la PCR.
Sondas de hibridación duales
Estos ensayos usan dos sondas oligonucleotídicas específicas de secuencia que se unen a secuencias adyacentes en la diana. Las sondas están marcadas con un par de colorantes que pueden participar en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET, por sus siglas en inglés). El colorante donante se une al extremo 3' de la primera sonda, mientras que el colorante aceptor se une al extremo 5' de la segunda sonda. Este orden puede invertirse, siempre que la unión de ambos oligonucleótidos a la diana lleve a los fluoróforos dentro del intervalo FRET (radio de Forster).
Durante la PCR en tiempo real, la excitación se realiza a una longitud de onda específica del colorante donante, y la reacción se controla a la longitud de onda de emisión del colorante aceptor. En la etapa de hibridación, las sondas se hibridan con sus secuencias diana en una disposición de cabeza a cola. Esto acerca los colorantes donante y aceptor, lo que permite que tenga lugar la FRET. La cantidad de fluorescencia del aceptor es proporcional a la cantidad de producto de PCR presente. Las sondas de hibridación permiten una diversidad de lecturas de detección y cuantificación genética.
Combinaciones de cebador/sonda
Estos detectores usan un cebador oligonucleotídico específico de secuencia y una sonda oligonucleotídica específica de secuencia. El cebador y la sonda están diseñados para unirse a secuencias adyacentes de la diana, normalmente con la sonda complementaria a la cadena formada por el cebador. La sonda y el cebador están marcados con un par de colorantes que pueden participar en la (FRET). Generalmente, el colorante donante se une cerca del extremo 3' del cebador, mientras que el colorante aceptor se une al extremo 3' de la sonda, que se hibrida con la cadena complementaria sintetizada por la extensión del cebador.
Al igual que con las sondas de hibridación duales, durante la amplificación del ADN, la excitación se realiza a una longitud de onda específica del colorante donante, y la reacción se controla a la longitud de onda de emisión del colorante aceptor. En la etapa de hibridación, la sonda y cebador se hibridan con sus secuencias diana en una disposición de cabeza a cola. Esto acerca los colorantes donante y aceptor, lo que permite que tenga lugar la FRET. La cantidad creciente de fluorescencia del aceptor es proporcional a la cantidad de producto de PCR presente.
El documento WO2013/113748 describe un método para determinar la presencia de un ácido nucleico diana usando cebadores y sondas y en donde las condiciones de ciclo durante la reacción de amplificación de ácido nucleico comprenden al menos dos conjuntos diferentes de parámetros de ciclo.
Amplificación de flujo dinámico
Una desventaja de las químicas de sonda convencionales mencionadas anteriormente es que no son compatibles con la tecnología de amplificación de flujo dinámico ("DFA"). Esto se debe en parte a la diferencia en las temperaturas de fusión requeridas de las sondas usadas en la PCR en comparación con la DFA. La PCR utiliza sondas que generalmente están en el intervalo de 20-30 pares de bases y generalmente poseen una Tm de al menos 20 grados C menos que la Tm de la secuencia de interés. Por el contrario, la DFA requiere sondas que estén dentro de los 20 grados C o menos de la Tm de la secuencia de interés. Debido a que la DFA normalmente opera fuera de los intervalos de temperatura de hibridación usados en la tecnología de sonda para PCR, las sondas que se ponen en práctica actualmente generalmente no son compatibles con la tecnología DFA.
Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de desarrollar químicas, reactivos y metodologías de sonda, que sean compatibles con la DFA. Específicamente, existe la necesidad insatisfecha en la técnica de desarrollar cebadores y sondas que puedan utilizarse en protocolos DFA.
En algunos aspectos, se utilizará en la descripción la expresión "reacción en cadena extrema" o "XCR". Los presentes inventores utilizan el término XCR como sinónimo de DFA. Por lo tanto, los dos términos se usan indistintamente.
Detección múltiplex
La necesidad de, como mínimo, la capacidad de detectar dos dianas amplificadas distintas dentro de una sola reacción es un aspecto fundamental de las pruebas de diagnóstico modernas. Aunque algunas pruebas pueden comercializarse con recipientes de reacción separados que contienen los controles de rendimiento de prueba necesarios, es rentable en términos de producción de muestras y uso de reactivos, incorporar los controles de reacción dentro de un solo recipiente de reacción. Idealmente, la utilización eficaz de DFA implicaría un medio para detectar una o más dianas amplificadas simultáneamente.
Por lo tanto, sería útil ampliar la tecnología de sonda para su uso tanto con cebadores de PCR como con cebadores de alta Tm y frecuentemente más largos comúnmente usados en la DFA.
También sería útil tener una tecnología de sonda para detectar simultáneamente más de una diana amplificada en un solo recipiente de reacción que sea compatible con la DFA.
SUMARIO DE LA DIVULGACIÓN
La invención se define por el conjunto de reivindicaciones adjuntas.
La presente divulgación que comprende la invención proporciona un sistema de ácido nucleico que comprende: un oligonucleótido en dirección 3' que tiene una secuencia que es complementaria a una primera secuencia diana de un oligonucleótido diana y que tiene una secuencia escindible; un oligonucleótido en dirección 5' que tiene una secuencia que es complementaria a una segunda secuencia diana del oligonucleótido diana, en donde un extremo 3' del oligonucleótido en dirección 5' incluye un sitio de unión de polimerasa de ácido nucleico inicial, en donde el oligonucleótido en dirección 3' y el oligonucleótido en dirección 5' se hibridan con el oligonucleótido diana, en donde el oligonucleótido en dirección 3' está configurado para que la polimerasa escinda mononucleótidos u oligonucleótidos pequeños tras llegar al extremo 5' del oligonucleótido en dirección 3'.
En una realización, el oligonucleótido en dirección 3' incluye una secuencia escindible que se escinde mediante escisión independiente de la polimerización por la polimerasa que se une con el sitio de unión de polimerasa de ácido nucleico inicial.
En una realización, el oligonucleótido en dirección 3' incluye un extremo 5' que tiene un indicador y un interruptor en dirección 3' del indicador.
En una realización, el oligonucleótido en dirección 5' es un cebador.
En una realización, el oligonucleótido en dirección 3' no es un cebador.
En una realización, el oligonucleótido en dirección 3' es una sonda.
En una realización, el sistema comprende un cebador que tiene una secuencia que es complementaria a una secuencia del oligonucleótido diana.
En una realización, el oligonucleótido en dirección 5' y el oligonucleótido en dirección 3' se hibridan con el oligonucleótido diana.
En una realización, un oligonucleótido complementario es complementario y se hibrida con el oligonucleótido diana, teniendo el oligonucleótido complementario el cebador inverso hibridado con el mismo.
En una realización, el oligonucleótido en dirección 3' y el oligonucleótido en dirección 5' se hibridan con el oligonucleótido diana a una distancia de nucleótido suficientemente cercana para que la polimerasa de ácido nucleico entre en contacto con un extremo 5' del oligonucleótido en dirección 3' cuando se une al sitio de unión de polimerasa de ácido nucleico inicial del oligonucleótido en dirección 5'.
En una realización, el oligonucleótido en dirección 5' y el oligonucleótido en dirección 3' se configuran de manera cooperativa para que el oligonucleótido en dirección 3' se escinda mediante escisión independiente de la polimerización por la polimerasa que se une con el sitio de unión de polimerasa de ácido nucleico inicial del oligonucleótido en dirección 5'.
En una realización, el oligonucleótido en dirección 3' y el oligonucleótido en dirección 5' se hibridan con el oligonucleótido diana a una distancia de nucleótidos lo suficientemente alejada para que la polimerasa de ácido nucleico no entre en contacto con un extremo 5' del oligonucleótido en dirección 3' para dejar la distancia de nucleótidos suficientemente alejada entre el oligonucleótido en dirección 5' y el oligonucleótido en dirección 3' cuando la polimerasa de ácido nucleico se une al sitio de unión de polimerasa de ácido nucleico inicial del oligonucleótido en dirección 5'.
En una realización, el extremo 5' del oligonucleótido en dirección 3' se escinde en mononucleótidos u oligonucleótidos pequeños mediante la polimerasa hasta que el oligonucleótido en dirección 3' es lo suficientemente pequeño para disociarse del oligonucleótido diana.
En una realización, el oligonucleótido en dirección 5' y el oligonucleótido en dirección 3' se configuran de manera cooperativa para que el oligonucleótido en dirección 3' se escinda mediante la escisión dependiente de la polimerización por la polimerasa después de la polimerización.
En una realización, el oligonucleótido en dirección 5' es un cebador y el oligonucleótido en dirección 3' es una sonda. En una realización, el oligonucleótido en dirección 3' incluye al menos un marcador que se escinde por la actividad de la nucleasa.
En una realización, el oligonucleótido en dirección 3' incluye un marcador en dirección 5' y un marcador en dirección 3'.
En una realización, el marcador en dirección 5' comprende un colorante fluorescente o un interruptor, y un marcador en dirección 3' comprende un colorante fluorescente y un interruptor, de tal manera que cuando el oligonucleótido en dirección 3' está en solución, la señal del colorante fluorescente se suprime por el interruptor.
En una realización, el marcador en dirección 5' comprende un colorante fluorescente o un interruptor, y un marcador en dirección 3' comprende un colorante fluorescente y un interruptor, de tal manera que cuando se produce la unión del oligonucleótido en dirección 5' y el oligonucleótido en dirección 3' al oligonucleótido diana, la polimerasa escinde el marcador fluorescente o el interruptor del oligonucleótido en dirección 3', liberándolo en la solución de manera que el colorante ya no esté sometido al interruptor y pueda emitir fluorescencia.
En una realización, el marcador en dirección 5' comprende un colorante fluorescente o un interruptor, y un marcador en dirección 3' comprende el otro de un colorante fluorescente o un interruptor, de manera que un oligo tenga el colorante y el otro tenga el interruptor, de tal manera que cuando el oligonucleótido en dirección 3' está en solución, la señal del colorante fluorescente se suprime por el interruptor.
En una realización, uno del oligonucleótido en dirección 5' o el oligonucleótido en dirección 3' incluye un complejo de batofenantrolina-RU II como marcador.
En una realización, uno del oligonucleótido en dirección 5' o el oligonucleótido en dirección 3' incluye un complejo de batofenantrolina-RU II como marcador, y el otro del oligonucleótido en dirección 5' o el oligonucleótido en dirección 3' incluye una molécula donante de energía.
En una realización, uno del oligonucleótido en dirección 5' o el oligonucleótido en dirección 3' incluye un complejo de batofenantrolina-RU II como marcador, y el otro del oligonucleótido en dirección 5' o el oligonucleótido en dirección 3' incluye un grupo cromóforo de lumazina como molécula donante de energía.
En una realización, uno del oligonucleótido en dirección 5' o el oligonucleótido en dirección 3' incluye un complejo de batofenantrolina-RU II como marcador, y el otro del oligonucleótido en dirección 5' o el oligonucleótido en dirección 3' incluye una molécula donante de energía, en donde uno de los marcadores se escinde del oligonucleótido en dirección 3', se detecta un cambio en la luminiscencia.
En una realización, el oligonucleótido en dirección 5' (cebador directo) y el cebador inverso están configurados para tener una Tm cercana a la Tm del oligonucleótido o amplicón diana.
En una realización, el oligonucleótido en dirección 5' (cebador directo) y el cebador inverso tienen al menos 50 pares de bases, o al menos 40 pares de bases, o al menos 30 pares de bases, o al menos 20 pares de bases, o al menos 10 pares de bases. En las realizaciones, el cebador oligonucleotídico en dirección 5' tiene 5-10 pares de bases, o 10­ 20 pares de bases, o 20-30 pares de bases, o 30-40 pares de bases, o 40-50 pares de bases, o 50-60 pares de bases, o 60-100 pares de bases, o 100-200 pares de bases, o 10 o más pares de bases, o 20 o más pares de bases, o 30 o más pares de bases, o 40 o más pares de bases, o 50 o más pares de bases.
En una realización, el oligonucleótido en dirección 3' (sonda) tiene al menos 50 pares de bases, o al menos 40 pares de bases, o al menos 30 pares de bases, o al menos 20 pares de bases, o al menos 10 pares de bases. En las realizaciones, la sonda oligonucleotídica en dirección 3' tiene 5-10 pares de bases, o 10-20 pares de bases, o 20-30 pares de bases, o 30-40 pares de bases, o 40-50 pares de bases, o 50-60 pares de bases, o 60-100 pares de bases, o 100-200 pares de bases, o 10 o más pares de bases, o 20 o más pares de bases, o 30 o más pares de bases, o 40 o más pares de bases, o 50 o más pares de bases.
En una realización, el oligonucleótido diana es más largo que una secuencia diana de PCR en tiempo real tradicional. En una realización, se enseña un método para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana, comprendiendo el método: proporcionar el sistema de ácido nucleico de una de las reivindicaciones; desnaturalizar el ADN que tiene la secuencia diana; hibridar el oligonucleótido en dirección 5' y los nucleótidos en dirección 3' con el oligonucleótido diana; hibridar un cebador con el oligonucleótido complementario del oligonucleótido diana; extender el oligonucleótido en dirección 5' mediante polimerización con una polimerasa hacia el oligonucleótido en dirección 3'; escindir nucleótidos o pequeños oligonucleótidos del oligonucleótido en dirección 3'; y completar la polimerización de los complementos del oligonucleótido diana y del oligonucleótido complementario. En una realización, la escisión es una escisión independiente de la polimerización. En una realización, la escisión es una escisión dependiente de la polimerización.
En una realización, se determina si el oligonucleótido diana o la secuencia diana está presente en una muestra. En una realización, se proporciona un sistema de ácido nucleico de multiplexación, que comprende: un oligonucleótido formador de tríplex (sonda TFO) que tiene: una secuencia polinucleotídica de hibridación que está diseñada para hibridarse con una secuencia diana de un oligonucleótido diana; y una región formadora de tríplex (TFR, por sus siglas en inglés) asociada con la secuencia polinucleotídica hibridada.
En una realización, la TFR incluye una secuencia configurada para el emparejamiento de bases tríplex.
En una realización, el cebador TFO forma un tríplex con el oligonucleótido diana y un tercer oligonucleótido.
En una realización, la secuencia polinucleotídica de hibridación está configurada como un nucleótido sonda que tiene un resto de sonda.
En una realización, la TFR está en el extremo 5' de la secuencia polinucleotídica de hibridación.
En una realización, la TFR está próxima al extremo 5' de la secuencia polinucleotídica de hibridación.
En una realización, la TFR está en el extremo 3' de la secuencia polinucleotídica de hibridación.
En una realización, la TFR está próxima al extremo 3' de la secuencia polinucleotídica de hibridación.
En una realización, la TFR está en una ubicación entre el extremo 5' y el extremo 3' de la secuencia polinucleotídica de hibridación.
En una realización, la secuencia polinucleotídica de hibridación se configura como una secuencia de cebador.
En una realización, la TRF incluye un resto marcador seleccionado del grupo que consiste en un resto fluorescente, un resto radiactivo, un resto de color, un resto indicador fluorescente, un resto interruptor de fluorescencia, uno de un par de restos de transferencia de energía por resonancia fluorescente (por ejemplo, resto donante o resto aceptor), y combinaciones de los mismos.
En una realización, la secuencia polinucleotídica de hibridación tiene una longitud de 50 bases o más.
En una realización, la secuencia polinucleotídica de hibridación varía de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 bases de longitud, o de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 bases de longitud, o de aproximadamente 200 a aproximadamente 500 bases de longitud, o aproximadamente 500 o más bases. Además, el polinucleótido de hibridación puede comprender cualquier intervalo incluido dentro de los mencionados anteriormente. Por ejemplo, la secuencia polinucleotídica de hibridación podría variar de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 bases de longitud, o de aproximadamente 150 a aproximadamente 300 bases de longitud, o de aproximadamente 200 a aproximadamente 250 bases de longitud, o de aproximadamente 250 a aproximadamente 500 bases de longitud, o más.
En una realización, la sonda TFO se hibrida con una TFR, la secuencia diana de un oligonucleótido diana.
En una realización, la sonda TFO se hibrida con el oligonucleótido diana mediante la secuencia polinucleotídica de hibridación que se hibrida con la secuencia diana de un oligonucleótido diana, en donde la TFR no se hibrida con el oligonucleótido diana.
En una realización, la sonda TFO se hibrida con un primer cebador extendido mediante la secuencia polinucleotídica de hibridación que se hibrida con la secuencia diana del primer cebador extendido, una región polimerizada extendida de la sonda TFO que se hibrida con el primer cebador, y en donde la TFR se hibrida con una porción complementaria de TRF del primer cebador extendido.
En una realización, se utiliza una caperuza de fosfato 3'. Sin embargo, otras realizaciones utilizan cualquier bloqueador conocido en la técnica, por ejemplo, C-3, C6, C18, etc.
En una realización, se utiliza un marcador unido a la secuencia polinucleotídica de hibridación.
En una realización, se usa una caperuza que inhibe la extensión desde el extremo 3'.
En una realización, se utiliza un marcador 3' o 5' o un colorante donante.
En una realización, la sonda TFO es una sonda fluorescente formadora de tríplex (TFFP, por sus siglas en inglés). En una realización, un ácido nucleico bicatenario que tiene una segunda TFR, en donde la TFR de la sonda TFO forma un tríplex con la segunda TFR de tal manera que la sonda TFO forma un tríplex con el ácido nucleico bicatenario. En una realización, un ácido nucleico bicatenario que tiene una segunda TFR y que tiene un colorante receptor, en donde la TFR de la sonda TFO forma un tríplex con la segunda TFR de tal manera que la sonda TFO forma un tríplex con el ácido nucleico bicatenario, y donde la sonda TFO tiene un colorante donante.
En una realización, un ácido nucleico bicatenario que tiene una segunda TFR y que tiene un colorante receptor, en donde la TFR de la sonda TFO forma un tríplex con la segunda TFR de tal manera que la sonda TFO forma un tríplex con el ácido nucleico bicatenario, y donde la sonda TFO tiene un colorante donante adyacente a la caperuza 3'. En una realización, un ácido nucleico bicatenario que tiene una segunda TFR y que tiene un primer marcador, en donde la TFR de la sonda TFO forma un tríplex con la segunda TFR de tal manera que la sonda TFO forma un tríplex con el ácido nucleico bicatenario, y donde la sonda TFO tiene un segundo marcador, en donde el primer marcador y el segundo marcador proporcionan una emisión detectable tras una estrecha asociación.
En una realización, la TFFP se hibrida con el ADN amplificado solo cuando la temperatura de reacción es igual o inferior a la temperatura de hibridación de los cebadores y, por lo tanto, la TFFP no participa en la reacción de polimerización. Sin embargo, en algunas realizaciones, la TFFP se puede unir a la plantilla en cualquier momento en que la polimerasa se haya extendido más allá de la TFR.
En una realización, la TFFP se une al ADN bicatenario amplificado, y se proyecta una luz sobre el mismo, el colorante donante en la TFFP resuena, a medida que el colorante donante resuena, transfiere energía a un colorante aceptor ubicado en el ADN bicatenario, lo que hace que el colorante aceptor emita fluorescencia a una longitud de onda particular, emitiendo luz de un color que corresponde a esa longitud de onda para indicar que la secuencia diana estaba presente y se había amplificado.
En una realización, la TFFP se une al ADN bicatenario amplificado, y se proyecta una luz sobre el mismo, el colorante donante en el ADN de doble cadena amplificado, a medida que el colorante donante resuena, transfiere energía a un colorante aceptor ubicado en la TFFP, lo que hace que el colorante aceptor emita fluorescencia a una longitud de onda particular, emitiendo luz de un color que corresponde a esa longitud de onda para indicar que la secuencia diana estaba presente y se había amplificado.
En una realización, una pluralidad de cebadores TFR con diferentes secuencias diana, los cebadores TFR, tienen etiquetas diferentes.
En una realización, una pluralidad de cebadores TFR con diferentes secuencias diana, los cebadores TFR tienen primeros marcadores diferentes, y una sonda TFO incluye un marcador correspondiente que provoca fluorescencia cuando se asocia con los primeros marcadores diferentes.
En una realización, una sonda TFO está diseñada para hibridarse a aproximadamente la misma temperatura o inferior que la Tm de los cebadores TFR. Sin embargo, en otras realizaciones, la sonda TFO puede hibridarse a las temperaturas que se encuentran normalmente durante la PCR de rutina.
En una realización, la secuencia diana incluye una secuencia TFR de origen natural.
En una realización, la TFR incluye una secuencia TFR de origen natural, y en donde una sonda TFO está configurada para hibridar con la secuencia diana y una TFR del oligonucleótido diana.
Se desvelan realizaciones que comprenden uno o más colorantes de unión a ADN no específicos que se unen con ADN tríplex hibridado.
Se desvelan realizaciones que comprenden uno o más colorantes de unión a cuádruplex.
Se desvelan realizaciones que comprenden una sonda TFO que incluye un colorante fluorescente y un interruptor. En algunas realizaciones, una sonda TFO incluye un colorante fluorescente y un interruptor en una configuración de horquilla.
En algunas realizaciones, la TFR crea cadenas de ADN formador de tríplex cuando el ADN diana incluye una secuencia que tiene complementariedad con la secuencia de la TFR.
En algunas realizaciones, el TFO crea cadenas de ADN formador de triplex a lo largo de la longitud cuando el ADN diana incluye una secuencia que tiene complementariedad con la secuencia de la TFR.
En algunas realizaciones, el TFO crea cadenas de ADN formador de tríplex unidas a un ADN diana cuando el ADN diana incluye una secuencia que tiene complementariedad con la secuencia de la TFR.
En algunas realizaciones, el ADN diana incluye una región formadora de tríplex.
En algunas realizaciones, la TFR se añade artificialmente al ácido nucleico de multiplexación al producto amplificado de un protocolo de amplificación con el ácido nucleico de multiplexación.
En algunas realizaciones, la TFR es una región formadora de tríplex de origen natural en la secuencia polinucleotídica de hibridación.
En el presente documento también se proporciona un método para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana, comprendiendo el método: proporcionar el sistema de ácido nucleico de una de las reivindicaciones que incluye un cebador TFR; hibridar un cebador TFR con el oligonucleótido diana, en donde el cebador TFR incluye una etiqueta que tiene una o más TFR incorporadas en el oligonucleótido; extender el cebador TFR mediante polimerización con una polimerasa; deshibridar el cebador TFR extendido del oligonucleótido diana; hibridar un cebador con el cebador TFR extendido; extender el cebador para formar un complemento del cebador TFR extendido. Además, en el presente documento se proporciona un método para detectar una secuencia diana amplificada: proporcionando un sistema de ácido nucleico como se ha expuesto anteriormente que incluye una sonda TFO; y determinando si la sonda TFO se une con una región TFR en ácidos nucleicos amplificados. En algunos aspectos, la sonda TFO incluye un marcador para facilitar la detección de la secuencia diana amplificada. En algún aspecto, la detección se produce después de la amplificación.
En el presente documento también se proporcionan kits que comprenden cualquiera de los oligonucleótidos, cebadores, sondas y agentes de reacción mencionados anteriormente. Un kit que tiene dos o más oligonucleótidos de una de las reivindicaciones.
Estas y otras características, aspectos y ventajas de las realizaciones de la presente divulgación, se entenderán mejor con respecto a la siguiente descripción, reivindicaciones y dibujos adjuntos, que se explican a continuación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 es una representación gráfica de un diseño para superponer las temperaturas de hibridación de cebador y las temperaturas de desnaturalización de plantilla.
La figura 2 es una ilustración de productos de amplificación convencionales por PCR en tiempo real.
La figura 3 es un gráfico que muestra la amplificación por PCR a alta temperatura de la misma plantilla usada en la figura 2.
La figura 4 es un gráfico que muestra la amplificación HTPCR del mismo material de plantilla usando diferentes concentraciones de material de partida.
La figura 5 es una realización general de la tecnología de sonda escindida de acuerdo con la divulgación.
La figura 6 representa una combinación general de cebador y sonda usada en la amplificación por PCR.
La figura 7 representa una realización de una combinación de cebador y sonda que puede usarse con DFA.
La figura 8 representa la tecnología de sonda escindida en una realización en donde se usan complejos de batofenantrolina-RU II como moléculas marcadoras.
La figura 9 representa una combinación de cebador y sonda de hibridación dual.
La figura 10 representa una combinación de cebador/sonda capaz de participar en la FRET.
La figura 11 ilustra cebadores directos (superior) e inversos (inferior) con colorante (cuadrados) espaciados aproximadamente 6-9 nucleótidos a lo largo de la longitud de los cebadores, pero con suficientes nucleótidos sin colorante en el extremo 3'. Cuando los cebadores se unen a su complemento, se libera la interrupción de la fluorescencia y, por lo tanto, se crea una señal detectable
La figura 12 ilustra el complejo de cebador directo-dímero interrumpido (superior), el complejo de cebador inverso dímero interrumpido (centro) y el complejo de cebador-dímero formado a partir de la unión de los cebadores directos e inversos (inferior), que es detectable a través de la señal FRET. Los cuadrados representan colorantes.
La figura 13 ilustra la señal de formación de plantilla de cebadores directos (superior) y la señal de formación de plantilla de cebadores inversos (centro) y la señal generada cuando tanto los cebadores directos como inversos producen la plantilla diana (inferior). Los cuadrados representan el colorante.
La figura 14 ilustra que los productos correctos con ambos cebadores marcados con colorante mostrarán la formación de señal fluorescente a partir de ambos colorantes distintos con la misma eficiencia de formación de reacción, ya que se unirán directamente entre sí en la formación del producto de amplificación y podrían controlarse en dos canales fluorescentes simultáneamente. Señal de los cebadores directos a la izquierda y señal de los cebadores inversos a la derecha.
La figura 15 que ilustra una ventaja de evaluación de datos de la estrategia de diseño de la presente divulgación es en donde se forma el producto amplificado y el producto amplificador genera ambas señales fluorescentes. Cualquier señal de cebador-dímero que dé como resultado la FRET, dado que se interrumpirán los cebadores similares, se puede restar de las señales formadas para permitir una normalización de referencia de las señales de amplificación. Señales de cebadores directos e inversos que forman una curva sigmoidea. La señal de cebador-dímero que se restará se ilustra mediante una línea en la parte inferior del gráfico.
La figura 16 ilustra que el cebador TFR participa en la amplificación de la secuencia diana, creando cadenas de ADN formador de tríplex a lo largo de la secuencia diana y unidas a ella.
La figura 17 ilustra una sonda oligonucleotídica formadora de tríplex con el extremo 3' de la sonda TFO protegido. La figura 18 representa una secuencia de ADN bicatenario que comprende una región formadora de tríplex. La secuencia de ADN bicatenario posee un colorante receptor. La TFR de la TFFP se une a la región formadora de tríplex del ADN bicatenario.
La figura 19 ilustra que los colorantes de unión, restringidos por la unión covalente a una ubicación particular en la sonda TFO, en este caso, el extremo de la sonda TFO, solo pueden unirse a estructuras de ADN hibridadas cuando la sonda TFO está unida y, por lo tanto, coloca la sonda TFO en la proximidad del colorante unido a la secuencia amplificada de interés. Por lo tanto, una señal fluorescente indica que se ha producido la amplificación.
La figura 20 representa que en la presente realización la sonda TFO utiliza una configuración de colorante e interruptor de horquilla.
La figura 21 ilustra que se pueden usar dos o más cebadores con la misma secuencia TFR junto con cebadores TFR que comprenden una secuencia complementaria a la secuencia TFR.
La figura 22 representa una realización en donde seis cebadores se dividen en tres conjuntos de dos cada uno. En la figura 23, el colorante donante se une cerca del extremo 3' del primer cebador, mientras que el colorante aceptor se une cerca del extremo 3' del segundo cebador.
Figura 24, estructura genérica que ilustra la unión de colorantes en solución a la izquierda y unidos a un nucleótido a la derecha.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En la descripción y las tablas a continuación, se usa una serie de términos, y para proporcionar una comprensión clara y coherente de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones, incluyendo el alcance que se les da a dichos términos, se proporcionan las siguientes definiciones.
Definiciones
El término "un" o "una" se refiere a uno o más de esa entidad; por ejemplo, "un cebador" se refiere a uno o más cebadores o al menos un cebador. Como tal, los términos "un" (o "uno/a"), "uno/a o más" y "al menos uno/a" se usan indistintamente en el presente documento. Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno de los elementos, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos.
Como se usa en el presente documento, el término "microorganismo" puede referirse a bacterias, arqueas, hongos, protozoos, parásitos y/o virus.
El "sujeto" al que se hace referencia en el presente documento puede ser cualquier organismo capaz de albergar un microorganismo, incluyendo, pero sin limitación, animales de experimentación (por ejemplo, ratones, ratas, conejos y similares) y seres humanos. En diversas realizaciones, el sujeto es un paciente humano que padece una enfermedad infecciosa. En otras realizaciones, el sujeto es el propio organismo, tal como el paciente humano.
Una "muestra biológica" descrita en el presente documento puede incluir cualquier material biológico extraído de un sujeto, incluyendo, pero sin limitación, expectoraciones (por ejemplo, esputo), sangre, células sanguíneas (por ejemplo, linfocitos), tejido, biopsias, células cultivadas, líquido pleural, peritoneal o cefalorraquídeo, sudor, heces y orina. En algunas realizaciones, una muestra biológica de un sujeto se trata, por ejemplo, para cultivar un microorganismo infeccioso y/o amplificar su material genético, antes de ensayarse de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término "fármaco" puede referirse a cualquier compuesto, agente, modalidad de tratamiento o combinación de los mismos. En algunos aspectos preferidos, el fármaco es un compuesto antibiótico.
Como se usa en el presente documento, la expresión "ácido(s) nucleico(s) diana" se refiere a ácidos nucleicos obtenidos de un microorganismo infeccioso, ser humano, mamíferos o plantas. En algunos aspectos, un ácido nucleico diana es un ácido nucleico de un organismo o un microorganismo que se ensaya de acuerdo con un método proporcionado en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, la expresión "ácido nucleico de referencia" se refiere a un ácido nucleico correspondiente a un ácido nucleico diana (por ejemplo, que representa la misma porción de ADN genómico), que difiere del ácido nucleico diana en una o más variaciones de secuencia. Por ejemplo, en algunos aspectos, un ácido nucleico de referencia tiene la secuencia de un microorganismo de tipo natural (por ejemplo, con respecto a la capacidad de respuesta a un fármaco de interés). En aspectos adicionales, un ácido nucleico de referencia tiene la secuencia de una célula humana de tipo natural, tal como una célula enferma, incluyendo, por ejemplo, una célula cancerosa humana.
Como se usa en el presente documento en relación con los ácidos nucleicos, la expresión "variación de secuencia" se refiere a una diferencia en la secuencia de un ácido nucleico con respecto a la secuencia de un ácido nucleico correspondiente (por ejemplo, una secuencia que representa el mismo gen u otra porción de ADN genómico). En algunas realizaciones, las variaciones de secuencia detectadas de acuerdo con diversos métodos proporcionados en el presente documento son "polimorfismos de nucleótido único" ("SNP, por sus siglas en inglés"), resultantes de una diferencia en la identidad de un solo nucleótido entre un ácido nucleico diana y un ácido nucleico de referencia. En realizaciones adicionales, las variaciones de secuencia detectadas de acuerdo con diversos métodos proporcionados en el presente documento incluyen "polimorfismos de múltiples nucleótidos". En algunas realizaciones, el ácido nucleico de referencia corresponde a un fenotipo no farmacorresistente y un fenotipo farmacorresistente se detecta de acuerdo con un método proporcionado en el presente mediante la identificación de variaciones de secuencia entre el ácido nucleico de referencia y un ácido nucleico diana de una muestra biológica de un sujeto infectado con los microorganismos una célula enferma, tal como una célula cancerosa farmacorresistente.
Como se usan en el presente documento, las expresiones "capacidad de respuesta" y "capacidad de respuesta al fármaco" pueden referirse a la resistencia, sensibilidad, susceptibilidad, tolerancia y/u otras características fenotípicas de un microorganismo o célula enferma, tal como una célula cancerosa, en relación con el efecto terapéutico de un fármaco, incluyendo la falta de respuesta. La capacidad respuesta al fármaco se puede evaluar directamente, de acuerdo con el efecto del fármaco sobre un microorganismo o una célula enferma objetivo, tal como una célula cancerosa (por ejemplo, una mortalidad bacteriana o una mortalidad celular), y/o indirectamente, de acuerdo con el efecto del fármaco en uno o más aspectos de una enfermedad infecciosa causada por el microorganismo (por ejemplo, prevención, mejora, alivio y/o eliminación de la enfermedad o uno o más síntomas de la enfermedad). En algunos aspectos preferidos, en el presente documento se proporcionan sistemas y métodos para detectar la resistencia a uno o más fármacos, en donde la resistencia se refiere a la resistencia hereditaria (genética).
La expresión "elemento de secuencia variable" se refiere a una región de un ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) compuesta por una cadena de nucleótidos adyacentes que incluye al menos una variación de secuencia que se sabe que está asociada con una característica fenotípica de interés, tal como la resistencia, la sensibilidad y/u otros aspectos de la capacidad de respuesta a los fármacos o la propensión a una enfermedad en particular, tal como el cáncer o una cardiopatía, o características fenotípicas más mundanas, tales como el color de los ojos o el cabello. Por ejemplo, una variación de secuencia asociada con la farmacorresistencia tendrá lugar a menudo en una región de un ácido nucleico que codifica un sitio de la proteína correspondiente que es un determinante estructural y/o funcional de la capacidad de respuesta al fármaco, tal como un sitio de unión al fármaco. Un elemento de secuencia variable que incluye la variación conocida (y los nucleótidos circundantes) probablemente codificará porciones de la proteína relacionadas estructural y/o funcionalmente (por ejemplo, un compartimento, pliegue u otra estructura que comprende el sitio de unión al fármaco), y las variaciones adicionales no caracterizadas dentro del elemento de secuencia variable probablemente se asociarán con el mismo fenotipo que las variaciones conocidas.
La expresión "ácido nucleico" y el término "oligonucleótido" se refieren a cebadores, sondas y fragmentos de oligómeros a detectar, y serán genéricos con respecto a polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), a polinucleótidos (que contienen D-ribosa ), y a cualquier otro tipo de polinucleótido que contenga un N-glucósido de una base púrica o pirimidínica, o base púrica o piridínica modificada. No se pretende hacer una distinción de longitud entre la expresión "ácido nucleico" y el término "oligonucleótido", y estos términos se usarán indistintamente. Estos términos se refieren únicamente a la estructura primaria de la molécula. Por lo tanto, estos términos incluyen ADN bicatenario y monocatenario, así como ARN bicatenario y monocatenario.
El oligonucleótido no procede de forma necesaria físicamente de ninguna secuencia natural o existente, sino que puede generarse de cualquier manera, incluyendo síntesis química, replicación del ADN, transcripción inversa o una combinación de las mismas. El término "oligonucleótido" se refiere a un polinucleótido de ADN o ARN genómico, ADNc, de origen semisintético o sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado con la totalidad o una porción del polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza; y/o (2) está unido a un polinucleótido distinto al que está enlazado en la naturaleza; y (3) no se encuentra en la naturaleza.
El término "cebador" puede referirse a más de un cebador y se refiere a un oligonucleótido, ya sea de origen natural, como en una digestión de restricción purificada, o producido sintéticamente, que es capaz de actuar como un punto de inicio de la síntesis a lo largo de un cadena complementaria cuando se pone en condiciones en las que se cataliza la síntesis de un producto de extensión de cebador que es complementario a una cadena de ácido nucleico. Dichas condiciones incluyen la presencia de cinco trifosfatos de desoxirribonucleósido diferentes y agentes inductores de la polimerización, tales como ADN polimerasa o transcriptasa inversa, a una temperatura adecuada. Preferentemente, el cebador es monocatenario para lograr una máxima eficacia en la amplificación.
Como se usa en el presente documento, el complemento de una secuencia de ácido nucleico se refiere a un oligonucleótido que, cuando se alinea con la secuencia de ácido nucleico de manera que el extremo 5' de una secuencia se empareje con el extremo 3' de la otra, está en "asociación antiparalela". Determinadas bases que no se encuentran comúnmente en los ácidos nucleicos naturales pueden incluirse en los ácidos nucleicos de la presente divulgación e incluyen, por ejemplo, inosina y 7-desasaguanina. La complementariedad no ha de ser perfecta; los dúplex estables pueden contener pares de bases mal emparejadas o bases no emparejadas. Los expertos en la materia de la tecnología de ácidos nucleicos pueden determinar empíricamente la estabilidad de los dúplex considerando una serie de variables incluyendo, por ejemplo, la longitud del oligonucleótido, la composición de las bases y la secuencia del oligonucleótido, la fuerza iónica y la incidencia de pares de bases mal emparejadas.
Como se usa en el presente documento, el término "alelo" es cualquiera de una o más formas alternativas de un gen que se relaciona con un rasgo o característica. En una célula u organismo diploide, los dos alelos de un gen dado ocupa los correspondientes locus en un par de cromosomas homólogos.
Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia de aminoácidos" incluye un oligopéptido, péptido, polipéptido o proteína y fragmentos de los mismos que se aíslan de, son nativos o se producen de forma natural en una planta, o se elaboran sintéticamente pero comprenden la secuencia de ácido nucleico del equivalente endógeno.
Como se usa en el presente documento, el término "eficiencia" se refiere a un sello distintivo de los ensayos de PCR en tiempo real. Una reacción ideal de qPCR (PCR cuantitativa) tiene una eficacia del 100 % con una pendiente de -3,32, lo que se correlaciona con una duplicación perfecta del producto de PCR durante cada ciclo. Sin embargo, se consideran generalmente aceptables pendientes entre -3,1 y -3,6 con eficiencias entre el 90 y el 110 % (Commission, C. A. (2009). Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing European Network of GMO Laboratories (ENGL), (octubre de 2008), 1-8). La eficiencia se establece mediante curvas patrón replicadas. La eficiencia de amplificación se determina a partir de la pendiente de la porción logarítmica lineal de la curva patrón y se calcula como E = (10(-1/pendiente)-1)*100. (Bustin, S. A., et al. (2009). The MIQE Guidelines: Minimum I nformation for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chemistry, 55(4), 1-12. doi:10.1373/clinchem. 2008.112797).
Como se usa en el presente documento, el término "linealidad" se refiere a un sello distintivo de los ensayos de PCR en tiempo real optimizados y se determina por el valor de R2 obtenido por análisis de regresión lineal, que debe ser >0,98 (Bustin et al., 2009).
Con respecto al uso de sustancialmente cualquier término plural y/o singular en el presente documento, los expertos en la materia pueden traducir del plural al singular y/o del singular al plural según sea apropiado al contexto y/o la aplicación. Las diversas permutaciones singular/plural se pueden exponer expresamente en el presente documento por razones de claridad.
Las expresiones "región diana", "secuencia diana" y "secuencia de ácido nucleico diana" se refieren a una región de un ácido nucleico que se va a detectar, cuantificar o genotipificar.
El término "sonda" se refiere a un oligonucleótido, típicamente marcado, que forma una estructura dúplex con una secuencia de un ácido nucleico diana debido al emparejamiento de bases complementarias. La sonda comprenderá una "región de hibridación", que consiste preferentemente en 30 o más nucleótidos y, en algunos casos, que consiste en 50 o más nucleótidos, correspondiente a una región de la secuencia diana. De forma ideal, la Tm de la sonda estará dentro de los 30 grados o menos de la Tm de la secuencia de interés. "Correspondiente" significa idéntico o complementario al ácido nucleico designado. La sonda, preferentemente, no contiene una secuencia complementaria a una o más secuencias usadas para cebar la PCR. Generalmente, el extremo 3' de la sonda estará "bloqueado" para impedir la incorporación de la sonda en un producto de extensión de cebador. El "bloqueo" se puede lograr usando bases no complementarias o añadiendo un resto químico tal como biotina, un grupo fosfato o un fluoróforo al hidroxilo 3' del nucleótido base, que puede servir, dependiendo del resto seleccionado, como doble finalidad al actuar también como un marcador para la posterior detección o captura del ácido nucleico unido al marcador. El bloqueo también se puede lograr eliminando el 3'-OH o usando un nucleótido que carece de 3'-OH, tal como didesoxinucleótido.
Como se usa en el presente documento, el término "marcador" se refiere a cualquier átomo o molécula que se puede usar para proporcionar una señal detectable (preferentemente cuantificable), y que se puede unir a un ácido nucleico o proteína. Los marcadores pueden proporcionar señales detectables por fluorescencia, fosforescencia, quimioluminiscencia, electroquímica, radiactividad, colorimetría, gravimetría, difracción o absorción de rayos X, magnetismo, actividad enzimática y similares.
Como se define en el presente documento, "actividad de nucleasa 5' ----> 3'" o "actividad de nucleasa 5' a 3'" se refiere a la actividad de una polimerasa de ácido nucleico específica de plantilla que incluye una actividad de exonucleasa 5' a 3' tradicionalmente asociada con alguna ADN polimerasa, mediante la cual los nucleótidos se eliminan del extremo 5' de un oligonucleótido de manera secuencial, (es decir, la ADN polimerasa I de E. co litiene esta actividad, mientras que el fragmento Klenow no la tiene), o una actividad de endonucleasa 5' a 3' en donde se produce la escisión de más de un enlace fosfodiéster (nucleótido) desde el extremo 5', o ambos.
Como se usa en el presente documento, el término "adyacente" se refiere al posicionamiento del cebador con respecto a la sonda en su cadena complementaria del ácido nucleico plantilla en el que los nucleótidos pueden lindar directamente entre sí. Como alternativa, para su uso en el proceso dependiente de la polimerización, como cuando el presente método se usa en PCR y DFA y métodos de detección como se enseña en el presente documento, la "adyacencia" puede estar en cualquier lugar dentro de la secuencia a amplificar, en cualquier lugar en dirección 3' del cebador de tal manera que la extensión del cebador posicionará la polimerasa de modo que se produzca la escisión de la sonda.
Una "reacción singleplex" significa una reacción en donde solo se ensaya un producto en un solo recipiente de reacción.
Una "reacción dúplex" significa una reacción en donde se ensayan dos productos en un único recipiente de reacción.
Una "reacción multiplex" significa una reacción en donde se ensayarán más de dos productos en un solo recipiente de reacción.
Las expresiones "oligonucleótido específico de secuencia" y "SSO" se refieren a sondas oligonucleotídicas en donde la región de hibridación es exactamente complementaria a la secuencia a detectar. Esto se conoce como "hibridación rigurosa". El uso de condiciones de hibridación rigurosa en las que la sonda se hibridará solo con esa secuencia diana exactamente complementaria permite la detección de la secuencia diana específica. Las condiciones de hibridación rigurosas se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook, et al., 1985, molecular cloning - A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor, N.Y., incorporado por referencia en el presente documento). Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán distintas en diferentes circunstancias.
La Tm es la temperatura (por ejemplo, a una fuerza iónica y pH definidos) a la que se han disociado el 50 % de los oligonucleótidos. Suavizar la rigurosidad de las condiciones de hibridación permitirá tolerar emparejamientos erróneos de secuencia; el grado de emparejamiento erróneo tolerado puede controlarse mediante el ajuste adecuado de las condiciones de hibridación.
En el presente documento, el término "subsecuencia" se refiere a una secuencia de nucleótidos contenida dentro de otra secuencia.
Como se usa en el presente documento, el término "marcador" se refiere a cualquier átomo o molécula que se puede unir a un ácido nucleico y que se puede usar para proporcionar una señal detectable o para interactuar con un segundo marcador para modificar la señal detectable proporcionada por el segundo marcador. Los marcadores pueden ser compuestos emisores de luz que generan una señal detectable por fluorescencia, quimioluminiscencia, fosforescencia o bioluminiscencia. Como alternativa, los marcadores pueden proporcionar señales detectables por radioactividad, electroquímica, colorimetría o por absorción de luz, produciendo fluorescencia, o pueden usarse para inmovilizar un producto en una matriz.
El término "fluoróforo" se refiere a un compuesto que es capaz de emitir fluorescencia, es decir, absorber luz a una frecuencia y emitir luz a otra frecuencia, generalmente más baja.
El término "bioluminiscencia" se refiere a una forma de quimioluminiscencia en la que el compuesto emisor de luz es uno que se encuentra en organismos vivos. Los ejemplos de compuestos bioluminiscentes incluyen luciferasa bacteriana y luciferasa de luciérnaga.
El término "interrupción" se refiere a una disminución de la fluorescencia de un primer compuesto provocada por un segundo compuesto, independientemente del mecanismo. La interrupción típicamente requiere que los compuestos estén muy cerca. Como se usa en el presente documento, se dice que el compuesto o la fluorescencia del compuesto se interrumpe, y se entiende que ambos usos se refieren al mismo fenómeno.
El término "intercalador" se refiere a un agente o resto capaz de realizar una inserción no covalente entre pares de bases apiladas en una doble hélice de ácido nucleico.
Como se usa en el presente documento aplicado a procesos de múltiples etapas, el término "homogéneo" se refiere a métodos para realizar las etapas del proceso, en donde se minimiza o se elimina la necesidad de manejo y manipulación de muestras entre etapas. Por ejemplo, un ensayo de amplificación/detección "homogéneo" se refiere a un ensayo acoplado de amplificación y detección en donde se minimiza o se elimina la necesidad de manejar y manipular muestras entre la amplificación y la detección.
La expresión "mezcla de reacción" se refiere a una solución que contiene los reactivos necesarios para realizar la reacción. Una "mezcla de reacción de amplificación", que se refiere a una solución que contiene los reactivos necesarios para realizar una reacción de amplificación, típicamente contiene cebadores oligonucleotídicos y una ADN polimerasa en un tampón adecuado. Las mezclas de reacción para reacciones específicas se conocen bien en la bibliografía.
Los expertos en la materia entenderán que, en general, los términos usados en el presente documento, y especialmente en las reivindicaciones adjuntas (por ejemplo, los cuerpos de las reivindicaciones adjuntas), se entienden generalmente como términos "abiertos" (por ejemplo, el término "incluyendo" debe interpretarse como "incluyendo, pero sin limitación", el término "que tiene" se debería interpretar como "que tiene al menos", el término "que incluye" se debería interpretar como "que incluye, pero sin limitación", etc.). Los expertos en la materia comprenderán además que si se pretende un número específico de una mención de reivindicación introducida, tal intención se mencionará explícitamente en la reivindicación y, en ausencia de dicha mención, dicha intención no estará presente. Por ejemplo, como ayuda para la comprensión, las siguientes reivindicaciones adjuntas pueden contener el uso de las expresiones introductorias "al menos uno/a" y "uno/a o más" para introducir menciones de reivindicaciones. Sin embargo, el uso de dichas expresiones no debe interpretarse en el sentido de que la introducción de una mención de reivindicación mediante los artículos indefinidos "un" o "una" limita cualquier reivindicación particular que contenga dicha mención de reivindicación introducida a las realizaciones que contengan solo tal mención, incluso cuando la misma afirmación incluye las expresiones introductorias "uno/a o más" o "al menos uno/a" y los artículos indefinidos tales como "un" o "una" (por ejemplo, "un" y/o "una" debe interpretarse como "al menos uno/a" o "uno/a o más"); lo mismo se aplica al uso de artículos definidos usados para introducir menciones de reivindicaciones. Además, incluso si se menciona explícitamente un número específico de una mención de reivindicación introducida, los expertos en la materia reconocerán que dicha mención debe interpretarse como al menos el número mencionado (por ejemplo, la simple mención de "dos menciones", sin otros modificadores, significa al menos dos menciones, o dos o más menciones).
Además, en aquellos casos en donde se usa una convención análoga a "al menos uno de A, B y C, B y C, etc.", en general, tal construcción se pretende en el sentido de que un experto en la materia técnica entendería la convención (por ejemplo, "un sistema que tiene al menos uno de A, B y C" incluiría, pero sin limitación, sistemas que tienen A solo, B solo, C solo, A y B juntos, A y C juntos, B y C juntos, y/o A, B y C juntos, etc.). En aquellos casos en donde se usa una convención análoga a "al menos uno de A, B o C, B y C, etc.", en general, tal construcción se pretende en el sentido de que un experto en la materia técnica entendería la convención (por ejemplo, "un sistema que tiene al menos uno de A, B o C" incluiría, pero sin limitación, sistemas que tienen A solo, B solo, C solo, A y B juntos, A y C juntos, B y C juntos, y/o A, B y C juntos, etc.). Los expertos en la técnica comprenderán además que prácticamente cualquier palabra y/o expresión disyuntiva que presente dos o más términos alternativos, ya sea en la descripción, las reivindicaciones o los dibujos, debe entenderse que contempla las posibilidades de incluir uno de los términos, cualquiera de los términos, o ambos términos. Por ejemplo, se entenderá que la expresión "A o B" incluye las posibilidades de "A" o "B" o "A y B".
Además, cuando las características o aspectos de la divulgación se describen en términos de grupos de Markush, los expertos en la materia reconocerán que la divulgación también se describe de esta manera en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush.
Como entenderá un experto en la materia, para todos y cada uno de los fines, tal como en términos de proporcionar una descripción escrita, todos los intervalos desvelados en el presente documento también abarcan todos y cada uno de los posibles subintervalos y combinaciones de subintervalos de los mismos. Cualquier intervalo enumerado puede reconocerse fácilmente como lo suficientemente descriptivo y permite que el mismo intervalo se divida en al menos mitades iguales, tercios, cuartos, quintos, décimos, etc. Como ejemplo no limitante, cada intervalo analizado en el presente documento puede dividirse fácilmente en un tercio inferior, tercio medio y tercio superior, etc. Como también entenderá un experto en la materia, todos los términos lingüísticos tales como "hasta", "al menos" y similares incluyen el número mencionado y se refieren a intervalos que pueden dividirse posteriormente en subintervalos como se ha analizado anteriormente. Finalmente, como entenderá un experto en la materia, un intervalo incluye cada miembro individual. Por lo tanto, por ejemplo, un grupo que tiene 1 -3 células se refiere a grupos que tienen 1,2 o 3 células. De manera similar, un grupo que tiene 1 -5 células se refiere a grupos que tienen 1,2, 3, 4 o 5 células y así sucesivamente.
Amplificación de flujo dinámico
Generalmente, la presente divulgación se refiere a ácidos nucleicos, así como a los dispositivos, sistemas y métodos para usar los mismos junto con un método de amplificación de ADN denominado en lo sucesivo en el presente documento "amplificación de flujo dinámico" o "DFA".
Generalmente, DFA se refiere a técnicas específicas de amplificación de ADN y ARN. DFA aprovecha el hecho de que la amplificación de ADN puede tener lugar dentro de un intervalo de temperatura bastante estrecho. Una vez que se determina la Tm de la secuencia de interés, la muestra de ADN puede calentarse a esa temperatura o de 1 a 5 grados C por encima de esa temperatura. Esto define el parámetro superior del ciclo de calentamiento y enfriamiento. La Tm de los cebadores o de las sondas, (cualquiera que posea la Tm más baja) define el parámetro más bajo del ciclo de calentamiento y enfriamiento, dentro de 1 a 5 grados C.
En la práctica de la DFA, generalmente se prefiere usar cebadores con una Tm lo más cercana posible a la Tm de la secuencia de interés para que la temperatura pueda tener un ciclo dentro de un intervalo estrecho. El resultado de este ciclo estrecho es una apertura y cierre dinámicos de un dúplex entre ácidos nucleicos complementarios que comprenden la secuencia de interés en oposición a la desnaturalización completa o casi completa de toda la cadena de ADN.
Los presentes cebadores existentes (por ejemplo, cebadores que se ensayaron) se dirigen al producto de ácido nucleico que contiene menos productos no específicos. Por lo tanto, los productos de ácidos nucleicos diana amplificados pueden ser en general más específicos y sensibles para las aplicaciones de detección de diana de genotipado y PCR cuantitativa como se describe en el presente documento.
El "diseño racional" de cebadores oligonucleotídicos puede incluir la selección mediante cálculo, experimentación o computación de cebadores que tienen la temperatura de fusión (Tm) deseada. El diseño racional puede incluir la selección de secuencias de cebador específicas con el CG apropiado para obtener la Tm deseada. Además, el diseño racional puede incluir modificaciones en los cebadores que incluyen modificaciones de internucleótidos, modificaciones de bases y modificaciones de nucleótidos.
Metodología de diseño de cebadores de DFA
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para seleccionar cebadores para DFA que flanquean un elemento de secuencia variable de interés en un ácido nucleico diana.
En algunas realizaciones, los cebadores se seleccionan para que tengan una Tm con el ácido nucleico diana (Tm de cebador:diana) que esté dentro de un intervalo estrecho de la Tm del ácido nucleico diana (Tm de diana:diana). El estrecho intervalo de temperatura específico usado para tal amplificación de los ácidos nucleicos diana depende del perfil de fusión del ácido nucleico diana y, por lo tanto, de la secuencia del ácido nucleico diana que se amplifica. Como tal, el estrecho intervalo de temperatura se puede usar como intervalo de temperatura diana para identificar y/o generar cebadores específicos que tengan valores de Tm suficientemente altos cuando se hibridan con el ácido nucleico diana.
Diseño de cebadores de DFA: Superposición de curvas de hibridación/desnaturalización
Por consiguiente, los valores de Tm de los cebadores pueden superponerse dentro del intervalo de temperatura de hibridación y/o desnaturalización del ácido nucleico diana (véase la figura 1). La figura 1 puede contrastarse con la figura 2 para ilustrar el diseño de los cebadores para que tengan la Tm dentro de un intervalo de la Tm del ácido nucleico diana. La figura 2 muestra que la amplificación convencional con cebadores y un ácido nucleico diana carecen de superposición de temperatura (como se muestra en la figura 1) y requieren variaciones extremas de temperatura durante la amplificación, correspondientes a los ciclos de desnaturalización, hibridación y extensión, para producir un producto amplificado. Estos intervalos de temperatura tan extremos permiten la formación de productos no deseados.
Diseño de cebadores de DFA: Diseño iterativo
En algunas realizaciones, se proporciona un proceso de diseño iterativo para seleccionar y/u optimizar cebadores para secuencias de ácido nucleico diana específicas a amplificar o detectar. Ventajosamente, el método iterativo permite la formación de un ácido nucleico diana específico usando un intervalo estrecho de condiciones térmicas en donde tanto el ácido nucleico diana como los cebadores oligonucleotídicos hibridados con el ácido nucleico diana están en un flujo dinámico de hibridación y desnaturalización. Tal flujo dinámico de hibridación y desnaturalización puede dar como resultado una amplificación específica del ácido nucleico diana con una disminución proporcional en la formación de productos de amplificación no específicos. Las implicaciones de dichos métodos iterativos para seleccionar y/u optimizar los cebadores permiten el uso de colorantes de bajo coste en lugar de sondas oligonucleotídicas personalizadas más costosas, tales como las que tienen marcadores fluorescentes, y pueden permitir el uso de PCR cuantitativa o desnaturalización de alta resolución en el análisis de la secuencia del ácido nucleico diana. Además, el método iterativo puede proporcionar cebadores que funcionen en ausencia de instrumentos controlados térmicamente exquisitos para la formación de productos de amplificación.
Es decir, los cebadores pueden funcionar dentro de un estrecho intervalo de temperatura para amplificar el ácido nucleico diana, lo que permite que la amplificación de ácido nucleico se use en una serie de usos mucho más amplia. Se han descrito varios métodos en la técnica para calcular la Tm teórica del ADN de secuencia conocida, incluyendo, por ejemplo, los métodos descritos por Rychlik y Rhoads, Nucleic Acids Res. 17:8543-8551 (1989); Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); y Breslauer et al., Proc Natl Acad. Sci. 83: 3746-3750 (1986).
Dicho proceso iterativo puede incluir la identificación de una secuencia de ácido nucleico diana inicial como el amplicón diana, en donde la secuencia de ácido nucleico diana puede asociarse con una actividad biológica particular, tal como una posible farmacorresistencia. A continuación, la secuencia de ácido nucleico diana se amplifica para producir un producto amplificado, y el valor de Tm del producto amplificado (por ejemplo, el amplicón) se determina usando un análisis de curva de fusión convencional. A continuación, el análisis de la curva de fusión se utiliza para determinar o calcular nuevos cebadores o conjuntos de cebadores para su uso en la amplificación del ácido nucleico diana.
A continuación, los cebadores determinados o calculados se diseñan con valores de Tm de cebador dentro del intervalo del pico de fusión generado por la fusión del producto amplificado. A continuación, los cebadores se preparan o se sintetizan para que tengan los valores de Tm de cebador diseñados.
Diseño de cebadores de DFA: Modificación química de oligonucleótidos
En algunas realizaciones, los cebadores pueden configurarse para que tengan una Tm que esté dentro de un intervalo estrecho de la Tm del ácido nucleico diana modificando químicamente los oligonucleótidos. Se pueden usar químicas de síntesis de oligonucleótidos bien conocidas para aumentar los valores de Tm de los cebadores para que correspondan al intervalo de temperatura de la Tm del ácido nucleico diana. Dichas químicas pueden usar bases modificadas (por ejemplo, Super G, A, T, C), LNA o PNA, u otras químicas estabilizadoras de oligonucleótidos. Además, se pueden desarrollar químicas estabilizadoras de hibridación de oligonucleótidos adicionales que se pueden usar para esta aplicación.
Por ejemplo, se han usado cebadores sintetizados tanto con química de enlace fosfodiéster convencional como con química de LNA para proporcionar valores de Tm de cebador cercanos a los valores de Tm de la secuencia de ácido nucleico diana. Sin embargo, es posible que determinados ácidos nucleicos diana puedan tener valores de Tm más bajos que los de los cebadores, y es posible que se deba incluir una química desestabilizadora de hibridación para disminuir los valores de Tm de cebador de modo que el valor de Tm de cebador esté dentro de un intervalo de los valores de Tm de la secuencia de ácido nucleico diana.
Diseño de cebadores de DFA: Análisis de la curva de fusión
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para refinar el diseño de los cebadores para minimizar el intervalo de temperatura para la amplificación específica de la secuencia de ácido nucleico diana. Como tal, el ácido nucleico diana se amplifica con condiciones de termociclado de reacción estándar para garantizar que se amplifique la secuencia de ácido nucleico diana. La amplificación se controla usando PCR en tiempo real con un colorante de unión a ADN bicatenario, tal como SYBR, LCGreen, LCGreen+, colorante Eva o similares.
El ácido nucleico diana amplificado se somete a un análisis de la curva de fusión para determinar el valor real de Tm de la secuencia de ácido nucleico diana. El pico de fusión, que se puede expresar como -dF/dT, se genera a partir de la fusión del ácido nucleico diana amplificado y puede tener un intervalo similar a una curva de distribución a lo largo de un intervalo de temperatura definido. En el extremo de baja temperatura, la plantilla de ácido nucleico diana amplificada se desnaturaliza parcialmente. A la temperatura más alta, se desnaturaliza toda la muestra de ácido nucleico diana amplificado. La temperatura necesaria para desnaturalizar el ácido nucleico diana durante el procedimiento de amplificación está dentro de esta distribución de temperatura.
Inicialmente, se recomienda la temperatura más alta para garantizar una desnaturalización más completa. Posteriormente, la temperatura más baja de la curva de distribución se puede usar como la Tm inicial para un conjunto de cebadores diseñados para su uso en la amplificación antes de que se realicen cambios iterativos en los cebadores.
La confirmación del estrecho intervalo de temperatura con el que se pueden usar los cebadores iniciales se puede realizar en experimentos en serie o en paralelo de temperaturas de hibridación cada vez mayores.
Como alternativa, los cebadores individuales se pueden añadir a la plantilla amplificada y se puede realizar un análisis de curva de fusión adicional en las curvas de fusión de cebador y plantilla combinadas.
En cualquier caso, la Tm de los cebadores se puede configurar para superponerse con un estrecho intervalo de temperatura que contiene la Tm de la secuencia de ácido nucleico diana. La temperatura de hibridación más alta de estos experimentos en donde la secuencia de ácido nucleico diana se amplifica de forma específica y eficiente puede considerarse la temperatura que define la temperatura de hibridación óptima para los cebadores existentes (por ejemplo, cebadores que se ensayaron). Estos mismos cebadores o cebadores ligeramente modificados se pueden volver a sintetizar con químicas estabilizadoras de hibridación adicionales. Modificaciones de los cebadores para cambiar la Tm en la dirección deseada de modo que la Tm del cebador se superponga con un estrecho intervalo de temperatura que contiene la Tm de la secuencia de ácido nucleico diana. Esto se puede lograr usando herramientas de diseño en línea, tales como la herramienta de diseño de LNA disponible en Integrated DNA Technologies. Dichas herramientas de diseño se pueden usar para estimar el número de modificaciones de LNA necesarias requeridas para aumentar la Tm del cebador para superponerse mejor con la curva de fusión de la secuencia de ácido nucleico diana.
En el caso de que los valores de Tm de cebador sean mayores que la temperatura de fusión más alta de la secuencia de ácido nucleico diana, puede ser necesario rediseñar los cebadores para que tengan una Tm más baja. Como alternativa, la cantidad de sales catiónicas divalentes y/o monovalentes u otros agentes desestabilizantes (por ejemplo, AgCI, DMSO, etc.) que se usan en el protocolo de amplificación (por ejemplo, PCR) puede reducirse para desestabilizar la hibridación de estos oligonucleótidos con respecto al modelo. En cualquier caso, en algunos casos puede ser necesaria una reducción de la Tm de cebador.
Diseño de cebadores de DFA: Modificación del contenido de GC
En algunas realizaciones, la Tm de cebador se puede modificar alterando el contenido de GC de la secuencia de cebador. Al cambiar el contenido de GC, la Tm de cebador se puede cambiar selectivamente. Normalmente, aumentar el contenido de GC puede aumentar la Tm, y disminuir el contenido de GC puede disminuir la Tm. Sin embargo, hay casos en los que se desea un alto contenido de GC que aumentará demasiado la Tm. En tales casos, se pueden usar desestabilizadores para permitir la inclusión de cebadores con alto contenido de GC o para el uso de secuencias de ácido nucleico diana con alto contenido de GC. Los desestabilizadores pueden disminuir selectivamente la temperatura del procedimiento de amplificación. Los ejemplos de desestabilizadores incluyen DMSO, AgCI y otros.
Intervalos del termociclado de DFA
En algunas realizaciones, los cebadores se pueden preparar para que los protocolos de enriquecimiento o amplificación de ácido nucleico diana se puedan realizar con diferencias de temperatura minimizadas durante el termociclado. Esto permite que el termociclado se realice dentro de un estrecho intervalo de temperatura para promover la formación de un producto específico.
Un intervalo del termociclado puede estar dentro de aproximadamente 15 °C de la Tm del ácido nucleico diana, o dentro de 10 °C de la Tm del ácido nucleico diana, o dentro de 5 °C de la Tm del ácido nucleico diana, o dentro de 2,5 °C de la Tm del ácido nucleico diana, o dentro de 1 °C de la Tm del ácido nucleico diana o ser incluso sustancialmente la misma Tm que la Tm del ácido nucleico diana.
En algunas realizaciones, las condiciones del termociclado para la amplificación del ácido nucleico diana abarcan el intervalo del pico de Tm /- aproximadamente de 1 °C a 15 °C de la secuencia de ácido nucleico diana
En algunas realizaciones, las condiciones del termociclado para la amplificación del ácido nucleico diana abarcan el intervalo del pico de Tm /- aproximadamente de 1 °C a 10 °C de la secuencia de ácido nucleico diana.
O, en algunas realizaciones, las condiciones del termociclado para la amplificación del ácido nucleico diana abarcan el intervalo del pico de Tm /- aproximadamente de 1 °C a 5 °C de la secuencia de ácido nucleico diana.
En algunas realizaciones, las condiciones del termociclado para la amplificación del ácido nucleico diana abarcan el intervalo del pico de Tm /- aproximadamente de 5 °C a 15 °C de la secuencia de ácido nucleico diana.
En algunas realizaciones, las condiciones del termociclado para la amplificación del ácido nucleico diana abarcan el intervalo del pico de Tm /- aproximadamente de 5 °C a 10 °C de la secuencia de ácido nucleico diana.
En algunas realizaciones, las condiciones del termociclado para la amplificación del ácido nucleico diana abarcan el intervalo del pico de Tm /- aproximadamente 5 °C de la secuencia de ácido nucleico diana.
En algunas realizaciones, las condiciones del termociclado para la amplificación del ácido nucleico diana abarcan el intervalo del pico de Tm /- aproximadamente 2,5 °C de la secuencia de ácido nucleico diana.
Dichos intervalos de temperatura estrechos hacen posible amplificar ácidos nucleicos diana específicos sin termociclado entre temperaturas correspondientes a las etapas normales de amplificación por PCR (desnaturalización, hibridación y extensión).
Además, hace posible realizar amplificaciones y enriquecimientos en instrumentos comerciales de temperatura controlada que pueden ajustarse a temperaturas seleccionadas o variarse dentro de intervalos de temperatura estrechos, tales como un horno, un bloque calefactor o similares.
La figura 3 ilustra el gráfico de una amplificación por PCR de intervalo de temperatura estrecho con la misma secuencia de ácido nucleico diana que se muestra en la figura 2, que muestra una formación de productos más específicos y se forman menos productos no deseados.
En algunas realizaciones, las temperaturas del termociclado se pueden seleccionar en un intervalo de temperatura estrecho para limitar sustancialmente la amplificación con respecto a la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana. Como tal, las condiciones de termociclado se pueden modificar para amplificar la secuencia de ácido nucleico diana modificando la temperatura de hibridación para que sea sustancialmente la misma que la base de temperatura más baja del pico de fusión para el amplicón. Además, las condiciones de termociclado se pueden modificar para amplificar la secuencia de ácido nucleico diana modificando la temperatura de hibridación para que sea sustancialmente la misma que la base de temperatura más alta para el pico de fusión del amplicón.
En algunas realizaciones, la Tm de cebador se puede seleccionar de modo que la amplificación del ácido nucleico diana se pueda realizar a una temperatura que varía entre aproximadamente 75 °C y aproximadamente 90 °C. Tal intervalo de temperatura, o un intervalo estrecho de 5 °C a 10 °C en el mismo, se puede usar para la amplificación de secuencias de ácido nucleico diana de ADN y/o ARN para reducir la formación de productos no específicos durante el proceso de amplificación (por ejemplo, PCR).
En algunas realizaciones, la Tm de cebador se puede seleccionar para que la amplificación se realice en condiciones de amplificación isotérmicas en el intervalo de Tm de la secuencia de ácido nucleico diana para garantizar la formación adecuada de productos.
En algunas realizaciones, la presente divulgación incluye un método para diseñar un conjunto de cebadores que tiene una Tm con un ácido nucleico diana que está dentro de un intervalo estrecho de la Tm de la secuencia de ácido nucleico diana. Como tal, el conjunto de cebadores se puede diseñar de modo que la Tm de cebador se solape con la curva de distribución de la Tm de la secuencia de ácido nucleico diana. Por ejemplo, el conjunto de cebadores se puede usar en ensayos de PCR en tiempo real para que la Tm de cebador se superponga a la curva de distribución de la Tm para la secuencia de ácido nucleico diana, de modo que se pueda usar un intervalo de temperatura estrecho para amplificar la secuencia de ácido nucleico diana.
Modificación del pH de la DFA
En algunas realizaciones, las condiciones del protocolo para amplificar la secuencia de ácido nucleico diana se pueden modificar a un pH apropiado para aumentar la especificidad de amplificación selectiva del ácido nucleico diana sobre otros ácidos nucleicos. Como tal, el uso de un pH apropiado puede aumentar la capacidad de amplificar selectivamente la secuencia de ácido nucleico diana. Esto puede incluir el uso de un tampón de amplificación que puede permitir la activación de ADN polimerasas termoestables inactivadas químicamente. Además, ajustar el pH con tampones de amplificación seleccionados puede permitir que el protocolo de amplificación se realice a temperaturas reducidas, tales como los intervalos de temperatura que se han enumerado en el presente documento.
En algunas realizaciones, el pH del tampón de amplificación se puede ajustar para permitir la conversión de una enzima inactivada químicamente al estado activado. Como tal, una enzima puede activarse en una condición ligeramente ácida; sin embargo, se pueden usar valores de pH básicos para algunas enzimas. Para las enzimas activadas por ácido, los tampones de PCR a base de Tris estándar pueden tener una dependencia significativa de la temperatura (por ejemplo, reducción en 0,028 unidades de pH por grado C). La activación completa de la enzima (por ejemplo, ADN polimerasa termoestable inactivada químicamente) desde el estado inactivado puede requerir que el pH sea inferior a 7, más preferentemente inferior a aproximadamente 6,75 y lo más preferentemente inferior a 6,5.
En algunas realizaciones, el protocolo de amplificación incluye el uso de tampones de pH más bajos para que la amplificación se pueda realizar a temperaturas de activación más bajas. Por ejemplo, por cada 10 °C por debajo de 95 °C, la temperatura de activación de la enzima puede reducirse en 0,3 unidades de pH. Sin embargo, los límites de este enfoque dependen completamente de la química del colorante usada para la detección en tiempo real de la plantilla amplificada (por ejemplo, la detección a base de fluoresceína ha reducido significativamente la fluorescencia por debajo de un pH de 7,3).
Modulación de la DFA del tamaño del amplicón
En algunas realizaciones, el diseño de los cebadores y/o las condiciones de amplificación se pueden modular para modular el tamaño de la secuencia de ácido nucleico diana que se amplifica. Esto puede incluir modular el diseño de los cebadores y/o las condiciones de amplificación para que el tamaño del amplicón sea significativamente mayor que el de los cebadores combinados solamente. Esto puede incluir que el amplicón sea 1 -3 nucleótidos más largo que los cebadores, o 2 veces más grande que los cebadores, o 5 veces más grande que los cebadores, y más preferentemente 10 veces más grande que los cebadores.
Matrices de DFA
En algunas realizaciones, los cebadores diseñados como se describen en el presente documento se pueden emplear en una serie de procedimientos de amplificación con diferentes concentraciones de material de partida. Es decir, el material de partida se puede repartir en una matriz a concentraciones variables, y los cebadores se pueden usar con el mismo para el protocolo de amplificación de temperatura estrecha como se describe en el presente documento.
El uso de los cebadores y el protocolo de amplificación de temperatura estrecha con una matriz de concentraciones variables de material de partida se puede usar para la cuantificación de la cantidad de ácido nucleico diana en el material de partida.
La figura 4 es un gráfico que muestra el uso de los cebadores y el protocolo con una matriz de concentraciones variables de material de partida para que se pueda cuantificar la cantidad de material diana.
Enriquecimiento de la amplificación de ácido nucleico diana
En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en el presente documento incluyen una etapa de amplificación o enriquecimiento del ácido nucleico diana. Tal método puede incluir un procedimiento sustancialmente similar a los métodos bien conocidos de amplificación del genoma completo y amplificación del transcriptoma completo.
Esto puede incluir la amplificación de un genoma con una etapa de generación de biblioteca del genoma, que puede ir seguida de una etapa de amplificación de la biblioteca. Además, la etapa de generación de biblioteca puede utilizar los cebadores específicos o mezclas de los cebadores específicos descritos en el presente documento con una ADN polimerasa o transcriptasa inversa. Las mezclas de cebadores específicos se pueden diseñar con los cebadores para eliminar la capacidad de autohibridarse y/o hibridarse con otros cebadores en una mezcla, pero permitir que los cebadores ceben de manera eficiente y frecuente la secuencia de ácido nucleico diana, en donde los cebadores se pueden diseñar como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para determinar simultáneamente un perfil de expresión genética para un miembro individual de una especie en relación con un genoma estándar completo para la especie. Los métodos pueden comprender distribuir una muestra líquida de material genómico en una matriz de cámaras de reacción de un sustrato. La matriz puede comprender un conjunto de cebadores y una sonda para cada secuencia de ácido nucleico diana a lo largo de todo el genoma estándar. La muestra líquida puede comprender sustancialmente todo el material genético del miembro. Cada una de las cámaras de reacción puede comprender el conjunto de cebadores y la sonda para al menos una de las secuencias de ácido nucleico diana y una polimerasa. Los métodos pueden comprender además amplificar la muestra líquida en la matriz, detectar una señal emitida por al menos una de las sondas e identificar el perfil de expresión genética en respuesta a la señal.
Dado que el aislamiento de cantidades adecuadas de microorganismos, tales como MTb, a partir de muestras de esputo puede ser un desafío importante, pueden usarse las técnicas de amplificación del genoma descritas en el presente documento en lugar de los protocolos tradicionales de cultivo y purificación. Aunque muchas técnicas de diagnóstico molecular permiten la detección de cantidades muy pequeñas de material genético inicial (por ejemplo, tan solo una copia de una secuencia de ácido nucleico diana), a menudo resulta difícil garantizar que una muestra particular contenga realmente la copia única deseada de la secuencia de ácido nucleico diana.
Para permitir que las muestras muy raras o valiosas se ensayen con precisión en los procedimientos de diagnóstico molecular, se ha empleado una técnica conocida como amplificación del genoma completo para enriquecer el material de partida para su uso en los procedimientos de diagnóstico molecular posterior. El método descrito aquí aplica el método de amplificación del genoma completo al problema del cribado de MTb en muestras de esputo que a menudo contienen dichas cantidades bajas de organismos vivos. Por otra parte, los procedimientos estándar pueden usar aislamientos de MTb que deben cultivarse hasta durante 2 meses para garantizar que se puedan obtener cantidades suficientes de material genético de la muestra para aplicaciones de diagnóstico molecular.
Usando técnicas de amplificación del genoma completo desarrolladas para el enriquecimiento in vitro de muestras de ADN y/o ARN raras y valiosas, se ha desarrollado un método de enriquecimiento de material genético novedosos para enriquecer muestras que contienen ADN de un microorganismo, tal como ADN de MTb. Esta técnica permite eludir los métodos de cultivo convencionales que se han usado hasta ahora para aumentar las concentraciones de microorganismos, que a menudo se requieren para el diagnóstico molecular posterior. Tal técnica de amplificación del genoma completo usa pequeñas cantidades de ADN genómico de muestras de microorganismos lisadas directamente. Las muestras que contienen microorganismos vivos que se han aislado mediante el método de Petroff se pueden lisar directamente con un producto disponible comercialmente, y las pequeñas cantidades resultantes de ADN de microorganismo se pueden someter a las técnicas de amplificación del genoma completo para proporcionar un amplicón para su uso en aplicaciones de diagnóstico molecular posterior.
Aunque el procedimiento para emplear la técnica de amplificación del genoma completo se describe con respecto a MTb, se reconoce que tal técnica puede aplicarse a cualquier microorganismo. Usando un método convencional de preparación de organismos vivos, el método de Petroff, el MTb aislado se fracciona de la muestra de esputo dejando pequeñas cantidades del organismo en una suspensión de agua. Siguiendo el protocolo del fabricante de la solución de lisis de micobacterias, MycoBuffer, (RAOGene; Milford, Pa.), se aíslan pequeñas cantidades de ADN de MTb en el material residual del producto MycoBuffer.
El uso de esta muestra de ADN directamente lisada y combinarla con ingredientes de reacción similares a los que se usan en los procedimientos de amplificación del genoma completo permite la apertura y el cierre dinámicos de un nucleótido que se ha denominado "respiración" o "flujo", de ácidos nucleicos complementarios. Este flujo permite el acceso por y la unión mediante cebadores y sondas específicos únicamente, ya que los cebadores o las sondas solo pueden interrogar aquellas regiones en flujo. Esto, a su vez, hace que la amplificación sea totalmente específica y, posteriormente, se elimine sustancialmente la formación de productos no específicos (NSP, por sus siglas en inglés).
La técnica de DFA se ha validado frente a una diversidad de plantillas de ADN, y se ha determinado que la DFA funciona en una amplia gama de plantillas de contenido de G+C del 30-66 %, en donde la técnica de DFA se desempeñó de manera comparable en sensibilidad a la PCR y sin la formación de productos no específicos (NSP). La DFA se ha adaptado a las siguientes técnicas de detección: PCR en tiempo real (colorante de unión a ADNbc), gel electroforético, quimioluminiscencia, colorimetría y ELISA.
Sondas y cebadores de DFA
Una característica distintiva de las sondas y cebadores de DFA es la posesión de temperaturas de fusión (Tm) cercanas a la Tm de la secuencia diana. Para satisfacer este parámetro operativo, los cebadores y las sondas generalmente deben tener una Tm más alta que las usadas en la amplificación por PCR. Como consecuencia, los diseños de sondas comunes que se usan para PCR generalmente no pueden funcionar con la DFA, particularmente si se desea una lectura en tiempo real. Por lo tanto, la siguiente memoria descriptiva describe diseños de cebadores y sondas, así como las combinaciones de sondas y cebadores que se pueden usar con la DFA.
En una o más realizaciones, la tecnología descrita implica modificaciones de la tecnología de sonda y cebador existentes para funcionar con la DFA.
En otras realizaciones, la tecnología descrita minimiza el número de sondas y cebadores requeridos para la operación de DFA. Los oligonucleótidos se pueden configurar y usar para limitar el número de oligonucleótidos diferentes presentes durante las reacciones.
Se analizan en la bibliografía muchos diseños de sonda específicos y combinaciones de marcadores de sonda y se conocen por los expertos en la materia. Estos incluyen, pero sin limitación, las tecnologías expuestas en las siguientes patentes: U.S. 5.491.063; U.S. 5.538.848; U.S. 5.571.673; U.S. 5.573.906 y 5.804.375, cada una de las cuales se incorpora por referencia específica en su totalidad.
i. Tecnología de sonda escindida por DFA: Consideraciones
Por razones de ejemplo, una realización de la divulgación se basa en la tecnología de sonda escindida, ilustrada generalmente en la figura 5 y expuesta de la siguiente manera. La tecnología de sonda escindida se refiere a cualquiera de varias estrategias que pueden emplearse para distinguir el oligonucleótido marcado no escindido de los fragmentos escindidos del mismo. De esta manera, la tecnología de sonda escindida permite la identificación de aquellas muestras de ácido nucleico que contienen secuencias complementarias a los oligonucleótidos en dirección 5' y en dirección 3'.
La presente realización de tecnología de sonda escindida por DFA es una modificación de la tecnología de sonda escindida existente. A modo de antecedentes, la tecnología de sonda escindida se describe a continuación. La tecnología de sonda escindida se basa en una actividad de nucleasa de 5' a 3' mediante la cual la polimerasa de ácido nucleico puede escindir un mononucleótido o pequeños oligonucleótidos de un oligonucleótido (por ejemplo, un oligonucleótido en dirección 3') hibridado con su oligonucleótido diana. Para que la escisión se produzca de forma eficiente, un oligonucleótido en dirección 5' también debe hibridarse con el mismo oligonucleótido diana.
El extremo 3' de este oligonucleótido en dirección 5' proporciona el sitio de unión inicial para la polimerasa de ácido nucleico. Tan pronto como la polimerasa unida encuentra el extremo 5' del oligonucleótido en dirección 3', la polimerasa puede escindir mononucleótidos o pequeños oligonucleótidos del mismo.
Los dos oligonucleótidos se pueden diseñar de tal manera que se hibriden en estrecha proximidad en el ácido nucleico diana complementario, de modo que la unión de la polimerasa de ácido nucleico al extremo 3' del oligonucleótido en dirección 5' automáticamente lo ponga en contacto con el extremo 5' del oligonucleótido en dirección 3' en un proceso conocido como "escisión independiente de la polimerización".
Como alternativa, si los dos oligonucleótidos se hibridan con regiones espaciadas más distantes de la diana de ácido nucleico plantilla, la polimerización debe tener lugar antes de que la polimerasa de ácido nucleico encuentre el extremo 5' del oligonucleótido en dirección 3'. A medida que continúa la polimerización, la polimerasa escinde progresivamente los mononucleótidos o los oligonucleótidos pequeños del extremo 5' del oligonucleótido en dirección 3'. Esta escisión continúa hasta que el resto del oligonucleótido en dirección 3' se ha desestabilizado hasta el punto de que se disocia de la molécula plantilla en un proceso que se denomina "escisión dependiente de la polimerización".
En la práctica, el oligonucleótido en dirección 5' comprende el cebador y el oligonucleótido en dirección 3' comprende la sonda.
La sonda contiene al menos un marcador que se escinde por la actividad de la nucleasa. En algunas realizaciones, la sonda comprende un marcador en dirección 5' y un marcador en dirección 3'. El marcador en dirección 5' comprende un colorante fluorescente o interruptor, y el marcador en dirección 3' comprende un colorante fluorescente o interruptor, de tal manera que cuando la sonda está en solución, la señal del colorante fluorescente se suprime por el interruptor. Por lo tanto, cuando el marcador en dirección 5' comprende un colorante fluorescente, el marcador en dirección 3' comprende un interruptor, y viceversa.
Cuando se produce la unión de la sonda y el cebador al oligonucleótido diana, la polimerasa escinde el marcador fluorescente o el interruptor, o ambos, liberándolos en la solución de modo que el colorante ya no esté sometido al interruptor y pueda emitir fluorescencia.
Al diseñar la combinación de cebador y sonda para utilizar polimerasa de tecnología de sonda en el caso de la DFA, se deben tener en cuenta los siguientes factores.
En primer lugar, debido a que una de las características centrales de la DFA es la estrecha proximidad entre la Tm de los cebadores y la Tm de la secuencia de interés, los cebadores frecuentemente deben ser más largos que los cebadores usados en la PCR. En las realizaciones, los cebadores tienen frecuentemente 50 pares de bases, más o menos.
En segundo lugar, debido a que las sondas también deben hibridarse a temperaturas aproximadamente iguales o ligeramente más altas que los cebadores, con frecuencia son más largas que las sondas usadas en la PCR. En las realizaciones, las sondas también deben tener 50 pares de bases o más.
En tercer lugar, para alojar sondas y cebadores de esta longitud, la secuencia diana debe ser más larga que la de la PCR. Estas longitudes pueden variar un poco dependiendo del contenido de GC de las sondas y cebadores respectivos.
La figura 6 representa una combinación general de cebador y sonda usada en la amplificación por PCR. La secuencia de interés tiene generalmente una longitud de 100 a 200 pares de bases. Los cebadores generalmente tienen una longitud de 15 a 20 pares de bases y las sondas generalmente tienen una longitud de 20 a 25 pares de bases. Las sondas y los cebadores generalmente tienen una temperatura de fusión que está dentro de los 30 grados C o más que la temperatura de fusión de la secuencia de interés.
La mayor longitud de la sonda crea un problema al usar la química de la sonda escindida existente con la DFA por la siguiente razón. El enfriamiento generalmente sigue la siguiente fórmula: F = 1/r3.
Por lo tanto, en el caso de las químicas de sonda escindida existentes, el interruptor generalmente está lo suficientemente cerca radialmente del fluoróforo que, cuando las sondas están en solución, tiene lugar la interrupción eficaz. En el caso de las sondas de DFA, el interruptor generalmente no está lo suficientemente cerca radialmente del fluoróforo para interrumpirlo cuando las sondas están en solución.
Por lo tanto, en el caso de las químicas de sonda escindida tradicionales, es imposible distinguir entre sondas escindidas y sondas aún en solución.
En el presente documento, una solución a este problema se denomina "sondas híbridas de horquilla/escindidas" o simplemente "sondas híbridas".
ii. Tecnología de sonda escindida por DFA: Sondas híbridas de horquilla/escindidas
Específicamente, estas sondas híbridas de horquilla/escindidas son similares a las sondas de horquilla tradicionales en que la cadena de oligonucleótidos que comprende la sonda contiene al menos un par de secuencias complementarias. Cuando la sonda está en solución, las secuencias complementarias se hibridan intramolecularmente entre sí, lo que hace que la sonda adopte una forma similar a una horquilla y, por lo tanto, lleva el interruptor a una proximidad radial suficiente al fluoróforo para interrumpir la señal del fluoróforo.
Lo siguiente comprende secuencias de ejemplo para una sonda oligonucleotídica de DFA que formará una horquilla: Estructura 1 Bases plegables 1 a 72 de mfold Ejemplo 1 (SEQ ID NO: 1)
Figure imgf000021_0001
Estructura 1 Bases plegables 1 a 67 de mfold Ejemplo 2 (SEQ ID NO: 2)
Figure imgf000021_0002
Estructura 1 Bases plegables 1 a 83 de mfold Ejemplo 3 (SEQ ID NO: 3)
Figure imgf000022_0001
Estructura 2 Bases plegables 1 a 83 de mfoldM Ejemplo 3 (SEQ ID NO: 4)
Figure imgf000022_0002
Estructura 1 Bases plegables 1 a 67 de mfold Ejemplo 4 (SEQ ID NO: 5)
Figure imgf000022_0003
Estructura 1 Bases plegables 1 a 38 de LTSOW_SNP2CT_xm1 (SEQ ID NO: 6)
Figure imgf000023_0001
Estructura 7 Bases plegables 1 a 36 de LTSOW_TEflT_XM1 75-90 (SEQ ID NO: 7)
dG = -0,79 di I -30,80 dS = -96,76 Tm=45,2°C
10
C---------- --- -......i A ATCCCC
Ríi CCC \
L . 777777
TCC TCC GGTA' AGTGGA
30 20
Estructura 1 Bases plegables 1 a 30 de LTSOW_RNAseP_XM1 (SEQ ID NO: 8)
dG := -2,25 d H - -22,40 dS = -64,97 T* == 71,6 °C
10 20
TCAATGGCTGAGGTGAGGTAC I G
CCG \
30
Estructura 1 Bases plegables 1 a 42 de LTSOW_CC3_XM1 (SEQ ID NO: 9)
Figure imgf000023_0002
Estructura 1 Bases plegables 1 a 45 de LTSOW_CYPD2D_XM1 (SEQ ID NO: 10)
Figure imgf000023_0003
mfold versión 3.5
M. Zuker, Rensselaer Polytechnic Institute
Sin embargo, las sondas híbridas difieren de las sondas de horquilla tradicionales de la siguiente manera. A diferencia de las sondas de horquilla tradicionales, el híbrido comprende secuencias en sus extremos que son complementarias a las secuencias opuestas en la cadena de ADN con la que se hibrida la sonda. Esto hace que la sonda se hibride completamente con la secuencia diana, de la misma manera o de manera similar a una sonda escindida. Por lo tanto, como una sonda escindida, la sonda híbrida se escinde a medida que la polimerasa extiende la secuencia. Esto difiere de las sondas de horquilla tradicionales en que los extremos de las sondas de horquilla tradicionales, están diseñados deliberadamente para no complementar su secuencia diana opuesta. Esto se hace para permitir que la polimerasa se mueva debajo de la sonda.
Los siguientes son ejemplos de diseños de sonda híbrida/de horquilla y sus secuencias de ADN complementarias.
Ej. 1.
GCACZlTAAGTTGATAATTAGTGAGTTGGGTG.ATACATACACAAGGGT - Cebador (SEQ ID NO: 62) CGTGTATTCAACTATTAATCACTCAACCCACTATGTATGTGTTCCCA - Diana (SEQ ID NO: 63)
GGTTGAAGAAGTTGAGGAAGAGGTTGAAGAAGTGCTGAG - Cebador (SEQ ID NO: 64 ) CCAACTTCTTCAACTC:CTTCICCAACTTCTTCACGACTC ~ Diana (SEQ i d n o : 65 )
5 ' FAM-AGAAATCTCGTGCCCAAACCTGGTGATGGATCC-3' BHQ1 “ Sonda (SEQ ID NO: 66) TCTTTAGAGCACGGGTTTGGACCACTACCTAGG - Diana (SEQ ID NO: 67 )
Colorante S'-AGAAATCTCGTGCCCAAACCTGGTGATGAATCC--Interruptor 3' - Sonda (SEQ ID NO: 68) TCT'ITAGAGCACGGGTTIGGACCACTACTTAGG “ Diana (SEQ ID NO: 69 )
Ej. 2.
ATGTAAGGAAGTCCAAATGTTCACCTGAAGACAACTGTGGT - Cebador (SEQ ID NO: 70) TACATTCCTTCAGGTTTACAAGTGGACTTCTGTTGACACCA - Diana (SEQ ID NO: 71)
GCCTCTGGCAACAGTAAAGCAGGGGCAT - Cebador (SEQ ID NO: 72.) CGGAGACCGTTGTCATTTCGTCCCCGTA - Diana (SEQ ID NO: 73}
5 ' FAM--TGGCAATCCCAGGTTCTCTTTTCTACCTGTTTGCTCAA-3' BHQ1 - Sonda (SEQ ID NO: 74 ) ACCGTTAGGGTCCAAGAGAAAAGATGGACAAACGAGTT - Diana (SEQ ID NO: 75)
Colorante 5'-TGGCAATCCCAGGTTTTCTTTTCTACCTGTTTGTCAA-Interruptor 3' - Sonda (SEQ ID NO: 76) ACCGTTAGGGTCCAAAAGAAAAGATGGACAAACAGTT -- Diana (SEQ ID NO: 77)
La figura 7 representa una realización de una combinación de cebador y sonda que puede usarse con DFA. Representa un método para obtener una temperatura de fusión para las sondas y los cebadores que está cercana a las temperaturas de fusión para la secuencia de interés. En la presente realización, las sondas y los cebadores tienen generalmente 50 pares de bases de longitud o más. Para alojar cebadores y sondas de esta longitud, la secuencia de interés tiene generalmente una longitud de 250 a 300 pares de bases. Esto da una diferencia en la temperatura de fusión entre los cebadores, las sondas y la secuencia de interés de 20 grados C o menos.
En otra realización, la temperatura de fusión de los cebadores y las sondas puede aumentarse sin aumentar significativamente la longitud del oligonucleótido mediante agentes de acoplamiento covalente que se unen al ADN monocatenario o bicatenario, aumentando así la Tm. Una clase de agentes conocidos como ligandos del surco menor se unen y estabilizan el ADN helicoidal y se han aprovechado como sondas dentro del intervalo de temperatura limitado. Al aumentar la Tm, los cebadores y las sondas más cortos pueden funcionar dentro del intervalo de temperatura de la DFA. Para los intervalos de temperatura de la PCR, un ejemplo de este enfoque es el uso de agentes de unión al surco menor. Muchas otras clases de agentes, incluyendo los que se unen tanto a ADN monocatenario como bicatenario, se contemplan como en el siguiente ejemplo.
(SEQ II) NO: 11)
GKKX'TCTGAGGGGCCATA
— CCGAGACTCCCCGGTATCGATCGTAGCTAG...5'
Como se ha mostrado anteriormente, el cebador o la sonda tiene un resto unido covalentemente (marcado como "*") que se une al ADN adyacente y aumenta la Tm del cebador/sonda. El resto estabilizador puede unirse a ADNmc o ADNbc.
En una realización adicional, las modificaciones de la cadena principal o de base del oligonucleótido que aumentan la Tm también se pueden utilizar para mover la TM del cebador/sonda al intervalo de DFA sin aumentar la longitud del oligonucleótido.
Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, LNA, PNA, enlaces de ditiofosfato, modificación de azúcar 2', tal como 2'-O-metilo, 2'-fluoro, modificaciones de base, tales como 5-halopiridinas, 5-metilpirimidinas, bases que forman enlaces de hidrógeno adicionales, otras modificaciones de bases de purina, tales como super G, 2-aminopurina y similares.
iii. Tecnología de sonda de DFA: Sondas FRET
En otra realización de la tecnología de sonda escindida, representada en la figura 8, se usan complejos de batofenantrolina-RU II como moléculas marcadoras. Estos complejos pueden formar parte de un par interactivo de moléculas marcadoras que permiten la transferencia de energía desde moléculas donantes de energía adecuadas al complejo de Ru. Debido a que la eficiencia de la transferencia de energía depende en gran medida de la distancia entre las moléculas donantes y aceptoras, dichos sistemas de transferencia de energía son útiles para estudiar las interacciones de las moléculas.
Una clase adecuada de moléculas aceptoras para su uso como complejos de Ru es el grupo de moléculas de cromóforo de lumazina. Usando tal combinación, las transferencias de energía pueden detectarse entre el complejo de Ru-batofenantrolina y los cromóforos de lumazina en donde el complejo de Ru está ubicado a una distancia adecuada del cromóforo de lumazina. Cuando se usa junto con la tecnología de escisión por polimerasa, en donde uno de los dos marcadores se escinde de la sonda, se puede detectar un cambio en la luminiscencia que es útil para determinar si se ha logrado la amplificación de la secuencia diana.
La figura 9 representa una combinación de cebador y sonda de hibridación dual. La presente realización comprende dos sondas oligonucleotídicas específicas de secuencia además de dos cebadores específicos de secuencia. Las sondas comprenden pares de colorantes que pueden participar en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia. (FRET), con un colorante donante unido a una sonda y un colorante aceptor unido a la otra sonda, estando el colorante donante y el colorante aceptor ubicados de tal manera que cuando las sondas se unen a la secuencia diana, están lo suficientemente próximas entre sí para participar en FRET. Tanto las sondas como los cebadores cumplen los requisitos de temperatura para XCR.
La figura 10 representa una combinación de cebador/sonda capaz de participar en la FRET. Un cebador oligonucleotídico específico de secuencia y una sonda oligonucleotídica específica de secuencia están diseñados para unirse a secuencias adyacentes de la diana, normalmente con la sonda complementaria a la cadena formada por el cebador, de modo que la sonda se hibrida con la cadena complementaria sintetizada a partir del cebador marcado extendido.
Los siguientes son ejemplos de diseños de secuencias para combinaciones de cebador/sonda capaces de participar en la FRET. El siguiente ejemplo es en el Ébola.
Secuencia de ADN bicatenario del Ébola (SEQ ID NO: 12 y 61)
3 781 ACATTTCGGCAAAGGATTTGAGAAACATTATGTATGATCAiCTTGCCTGGTTTTGGAACTG TGTAAAGCCGTTTCCTAAACTCTTTGTAATACATACTAGTGAACGGACCAAAACCTTGAC
3 841 CTTTCCACCAATTAGTACAAG^ATTItsTiyUirTGGOAAAAGATAvfCAACTCAXrGGAGA GAAAGGTGGTTAATCATGTTCACTAAACATTTAAGCCTTTTCTATCGTTGAGTAACGTGT
3901 TCATTCATGCTGAGTTCCAGGCCAGCCTGGCTGAAGGAGACTCTCCTCAATGTGCCCTAA
AGTAAGTACGACTCA&GGTCCGGTCGGACCGACTTCCTCIGAGAGGAGTTACACGGGATT
Cebador directo (SEQ ID NO: 13):
EbolâFxcr
ATCACTTGC’C’TGGTTTTGGAACTGCTTT {'-Q 670Í CCACC
Cebador inverso (SEQ ID NO: 14):
E b o la G R x c r
CCTTCAGCCAGGCTGGCCT( - C & 161 0)GGñACT
Sonda (SEQ ID NO: 15):
Figure imgf000025_0001
El diseño de ensayos que contenían sondas y cebadores de estas longitudes produjo resultados inesperados porque generalmente se pensaba que las sondas y los cebadores de estas longitudes no podían diseñarse para poseer Tm dentro de los estrechos intervalos de la Tm de la secuencia diana requerida para la DFA. Sin embargo, se ha encontrado que se pueden diseñar fácilmente sondas y cebadores con intervalos de Tm adecuados para la DFA. EJEMPLOS
Ejemplo 1: Prueba de control
Las siguientes sondas y cebadores se crearon para usarse junto con la DFA para amplificar una secuencia diana de control.
Secuencia diana (SEQ ID NO: 16):
CC ATTGCCATATTTGGTTATCAGG f ATCTGTTA GAGGGGC'f AAAGCTAACCC a CCAA TT CCr GTGCC AGAGS AAT AAAATICCC ATCGCAATT CCTCT GTG AG C ACTGAAATAG GÜCGGTGCA TGAACAAT AGCCGGTAGGTATGTCAGAAAACCTCCA ATGCCAAACAT TACTC CTTGAC T CAATGTTT GCTGTGCCC ACG ATGCGCTTATTAG ACCCAT GGCC AT C AAAAGTGACCCGAGCACCATCGT ¡ FGTTGGATTGAAAAGAAGTGC- [GTAGTACGTÍ A TTACCGATG
Secuencia de cebador directo (SEQ ID NO: 17):
ATTGCC ATCCATA' i TTGGTTAI CAG GTA" rCTCGTTA GAGGGGCTAAAGCTAACCCAC CATTCC
Secuencia de cebador inverso (SEQ ID NO: 18):
GG TAATAACGT ACTACAT C AGC ACTTCTTTT CAATCC AACG AT GGTGCT GG GT CACT
Secuencia de sonda (SEQ ID NO: 19):
BHQ1 - ACCT CC AAT GCC'AAACATTACT CCTTÍ j ACT CAATG 1(T -FAM)TCC TGTGCCCACGA TGCGCTT ATTAG ACCCAT CGCC-Phos Tm de la secuencia diana: 88,00 °C
Tm del cebador directo: 80,04 °C
Tm del cebador inverso: 80,07 °C
Tm de la sonda: 84,07 °C
Ejemplo 2: Prueba Mat A de la gripe
El siguiente diseño de ensayo de sonda y cebador se creó para usarse junto con la DFA para ensayar mat A de la gripe:
Secuencia diana (SEQ ID NO: 20):
GAGTGAGCüAGGACTGCAGCüTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTNAATGGGAATG
GGGA'I CCAATAACATGGACAGAGCAGTTAAACTGTATAGGAAGCTTAAGGGATAAC
GTTCCATGGGGCCAAAGAAATAGCACTCAGTTATWTGCTGGTGCACTTGCCAGTTG
NGTATGTGCAACNTGTGAACAGATTGCTGACTCCCAGCATAGGTCTCATAGGCAATG
GTNACAACAACCAATCCATTAATAAGACATGAGAACAGAATGGTTCTGGCCAGCAC
TACAGCTAAG GCTATGGAGCAAATGGC
Secuencia de cebador directo (SEQ ID NO: 21):
GTGAGCGA GGACTGCAGCGTAG ACGCTTT G'PCCAAAATGCC
Secuencia de cebador inverso (SEQ ID NO: 22):
GCCATTI'GCTCCATAGCCTTAGCTGTAGTGCTGGCCAGAACCATTCTGTTCTCATGTC TTA TTA A T
Secuencia de sonda (SEQ ID NO: 23):
B H Q 1 -AGCACT CAGTT ATT CTGCT GGTGC AC(T -FA M ) FGCCAG TíG C A TG G G C C TC A TA TA C A A C AGGA FGGGGGCT -Phos
Tm de la secuencia diana: 89,4 °C
Tm del cebador directo: 79,9 °C
Tm del cebador inverso: 80,1 °C
Tm de la sonda: 85 °C
Ejemplo 3: Prueba del gen Nuc de S. Aurues
El siguiente diseño de ensayo de sonda y cebador se creó para usarse junto con la DFA para ensayar Nuc de S. Aurues:
Secuencia diana (SEQ ID NO: 24):
AGC AAGTGC ATT PAC G AAAAAAAT GGT AG AAAATGC AAAG AAAA ÍTG AAG' f C G AG' f
TTGACAAAGGCCAAAGAACTGATAAATATGGACGTGGCTTAGCGTATATTTATGCTG
ATGGAAAAATGGTAAACGAAGCTTTAGTTCGTCAAGGCTTGGCTAAAGTTGCTTATG
TTTATAAACCTAACAATACACATGAACAACTTTTAAGAAAAAGTGAAGCACAAGCG
AAAAAAGAGAAATTAAATATTTGGAGCG
Secuencia de cebador directo (SEQ ID NO: 25):
AGCAAG i GCATTT ACGAAAAAAATGGTAG AAAATGCAAAG AAAA riGAAG i CGAGT
Secuencia de cebador inverso (SEQ ID NO: 26):
CGCTCCAAATATTTAATFTCTCTrTTTTTGCTTGTGCTTCACITTTTCTTAAAAGITGT TC A TG TG TA TTG TTA G G T
Secuencia de sonda (SEQ ID NO: 27):
Figure imgf000028_0001
(T)=FAM-T
Secuencia de sonda (SEQ ID NO: 28):
Figure imgf000028_0002
Tm de la secuencia diana: 83 °C
Tm del cebador directo: 76,76 °C
Tm del cebador inverso: 76,76 °C
Tm de la sonda: 82 °C
Ejemplo 4: Química de detección XCR de cebador/cebador
La observación de la química de detección de sonda existente, tal como las sondas HybBeacon y HyGlow, muestra que el plegamiento nativo de las sondas en estructuras secundarias estrechas y la hidrofobicidad relativa que lo acompaña de los colorantes fluorescentes permite que estos restos fluorescentes se acerquen mucho, si no contacto real entre sí. Se cree que esto tiene lugar a partir de una configuración general favorecida entrópicamente para los oligonucleótidos plegados y sus colorantes unidos.
La XCR ha demostrado su capacidad para amplificar plantillas de ADN o ARN a casi 10 veces la velocidad de las tecnologías de PCR tradicionales. Una limitación sustancial para realizar amplificaciones a esas velocidades es la necesidad de incorporar una detección basada en sondas durante el protocolo de amplificación. La fuente principal del tiempo adicional requerido es la necesidad de la hibridación de la sonda y, en el caso de las sondas XCR de nucleasa 5', el tiempo adicional requerido para que la sonda se escinda para liberar la interrupción del colorante de su interruptor.
Lo siguiente describe un método para detectar la fluorescencia en amplificación en tiempo real que aprovecha las tecnologías HybBeacon y HyGlow, en donde la interrupción de la fluorescencia se libera mediante la unión del oligonucleótido a su plantilla de complemento.
De acuerdo con este diseño, en lugar de que el oligonucleótido fluorescente sea una sonda, las moléculas fluorescentes son los cebadores usados para producir la amplificación.
La ventaja principal es que no se requiere tiempo adicional para permitir que la sonda fluorescente se una, ya que los cebadores están hibridados y "estirados" de forma inherente en la plantilla, liberando así la interrupción de la fluorescencia tras el inicio del complejo de cebado. Véase la figura 11, que ilustra cebadores directos e inversos con colorante separados aproximadamente 6-9 nucleótidos a lo largo de los cebadores, pero con suficientes nucleótidos sin colorante en el extremo 3'. Cuando los cebadores se unen a su complemento, se libera la interrupción de la fluorescencia y, por lo tanto, se crea una señal detectable.
Los cebadores fluorescentes sirven para varios propósitos en este diseño. En primer lugar, se generan dos señales fluorescentes, una para el cebador directo que se une a la plantilla apropiada y otra para el cebador inverso que se une a la plantilla de cadena opuesta.
En caso de que un cebador forme un producto de extensión, cebador-dímero, con otro cebador similar, entonces los colorantes en el cebador deben estar lo suficientemente cerca para evitar la liberación de la interrupción y, por lo tanto, permanecer interrumpidos y no producir señal fluorescente de dichos complejos de cebador-dímero.
En caso de que los dos cebadores marcados de manera diferente formen un complejo de cebador-dímero, su interrupción no se relajará, sino que se formará un complejo de FRET, y la señal que indica la formación del complejo de cebador-dímero será controlable por excitación en la longitud de onda de mayor energía con emisión en la longitud de onda de energía inferior (una señal FRET estándar). Véase la figura 12, que ilustra el complejo de cebador directodímero interrumpido, el complejo de cebador inverso-dímero interrumpido y el complejo de cebador-dímero formado a partir de la unión de los cebadores directos e inversos, que es detectable a través de la señal FRET.
En determinadas circunstancias, cuando se fabrica un producto no específico dependiente de la plantilla, puede ser posible que un cebador único inicie la preparación de una plantilla. Estos productos producirán señales de un solo colorante fluorescente. Véase la figura 13, que ilustra la señal de formación de plantilla de cebadores directos y la señal de formación de plantilla de cebadores inversos y la señal generada cuando tanto los cebadores directos como inversos producen la plantilla diana.
Por otro lado, los productos correctos con ambos cebadores marcados con colorantes mostrarán la formación de señales fluorescentes a partir de ambos colorantes distintos con la misma eficiencia de formación de reacción, ya que se unirán directamente entre sí en la formación del producto de amplificación y podrían controlarse en dos canales fluorescentes simultáneamente. Véase la figura 14.
Otra ventaja de evaluación de datos de esta estrategia de diseño es que se forma el producto amplificado y ambas señales fluorescentes son generadas por el producto amplificador. Cualquier señal de cebador-dímero que dé como resultado la FRET, dado que se interrumpirán los cebadores similares, se puede restar de las señales formadas para permitir una normalización de referencia de las señales de amplificación. Véase la figura 15.
En general, la ventaja de esta técnica es que no limitará la velocidad de XCR durante la amplificación al no tener que esperar más a que la sonda hibride o a que la sonda se escinda.
Además de la XCR, este diseño también es adecuado para ensayos de PCR; sin embargo, la razón por la que tal química no se ha implementado y no ha sido obvia es que la PCR experimenta una formación sustancial de productos no específicos, y el uso de cebadores únicamente, como en el caso de colorantes de unión de ADN bicatenario como SYBR Green 1, se ha ignorado en gran medida como adecuado para la metodología de pruebas de diagnóstico. Lo siguiente ilustra una configuración de secuencia adecuada para este método.
Cebador directo de ejemplo con colorantes FAM resaltados (SEQ ID NO: 29):
AGGGCGGTGCA¡¡GAACAA|AGCCGG¡¡AGGTATG§CAGAAAACCT'CCAA 80,7°C Tm Posición del cebador inverso de ejemplo de colorantes RED resaltados (SEQ ID NO: 30):
Figure imgf000029_0001
Secuencia diana de ejemplo (SEQ ID NO: 31):
AAGAGGGAAGAGGGGGAGGGCGGTGCATGAACAATAGCCGGTAGGTATGTCAGAA AACCTCCAATGCCAAACATTACTCCTTGACTCAATGTTTCCTGTGCCCACGATGCGC TTATTAGACCCATGGCCATCAAAAGTGACCCGAGCACCATCGTTTGTTGGATTGAAA AGAAGTGCTGT 88,9°C Tm
Ejemplo 5: Diseño de sonda de la región formadora de tríplex
En otra realización, la presente divulgación proporciona una tecnología de sonda multiplex que es adecuada para su uso con la DFA.
La presente realización minimiza el número requerido de oligos (por ejemplo, cebadores y sondas) al eliminar la necesidad de que las sondas participen en la porción de amplificación de la reacción.
La tecnología de sonda más actual utiliza oligonucleótidos individuales o múltiples para sondear la secuencia amplificada. Las sondas oligonucleotídicas se unen a la secuencia de interés en el curso de la amplificación del ADN. Por el contrario, la divulgación actual utiliza regiones formadoras de tríplex (TFR) añadidas a cebadores específicos de secuencia. A continuación, la presente divulgación usa una sonda oligonucleotídica formadora de triplex diseñada para interactuar con cada producto específico en la TFR para producir un color único de fluorescencia basado en el producto particular formado. Esto reduce el número de oligonucleótidos presentes en la reacción.
La sonda formadora de tríplex no participa en la reacción de amplificación y, por lo tanto, no ralentiza la reacción de la forma en que la tecnología de sonda existente tiende a hacerlo.
Cuando dos oligonucleótidos diferentes que no se superponen se hibridan con diferentes regiones de la misma secuencia de ácido nucleico complementaria lineal, y el extremo 3' de un oligonucleótido apunta hacia el extremo 5' del otro, el primero puede denominarse oligonucleótido "en dirección 5'" y este último oligonucleótido "en dirección 3'". La práctica de la presente divulgación empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y técnicas de ADN recombinante como se explica completamente en la bibliografía, así como los métodos desvelados en las Pat. de EE.UU. N.° US 7.838.235, incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad.
En una realización, se utiliza una química de detección basada en una sonda oligonucleotídica formadora de tríplex para productos de amplificación de ácidos nucleicos. De acuerdo con este método, se sintetiza un cebador formador de tríplex de acuerdo con el siguiente método.
Se añade una región formadora de tríplex (TFR) de secuencia artificial al oligonucleótido diseñado para crear el cebador formador de tríplex.
Como se usa en el presente documento, una región formadora de tríplex, o TFR, se refiere a secuencias de ADN particulares que se prestan a Hoogsteen, o al apareamiento de bases tríplex, ya que una tercera cadena de ADN se une a la TFR bicatenaria para formar una longitud tricatenaria de ADN, conocida como tríplex.
Los siguientes son ejemplos ilustrativos de secuencias que forman regiones formadoras de tríplex:
5' - GTGTGGGAAGAGGGGGAXGAGGGGGAGGAGC - 3' (SEQ ID NO: 32)
3' - CACACCCCTTCTCCCTXCTCCCCTCCGTCG - 5' (SEQ ID NO: 33)
5' - GTGTGGGAAGAGGGGGAXGAGGGGGAGGAGC - 3' (SEQ ID NO: 34)
3' - CACACCCCTTCTCCCTXCTCCCCTCCGTCG - 5' (SEQ ID NO: 35)
En una realización, la TFR está ubicada en el extremo 5' del cebador diseñado.
En una realización alternativa, la TFR está ubicada próxima al extremo 5' del cebador diseñado.
En otra realización, la TFR está ubicada en cualquier ubicación interna del cebador diseñado.
En otra realización, la TFR está ubicada en el extremo 3' del cebador diseñado.
En otra realización, la TFR está ubicada próxima al extremo 3' del cebador diseñado.
El cebador formador de tríplex puede ser un segmento de ADN o ARN que es complementario a una secuencia de ADN dada y que se necesita para iniciar la replicación por la ADN polimerasa.
El oligonucleótido formador de tríplex puede comprender una sonda oligonucleotídica formadora de tríplex (sonda TFO). La sonda TFO puede formar un complejo con una región formadora de tríplex de secuencia apropiada de la secuencia de ácido nucleico bicatenario y, por lo tanto, cuando la sonda TFO se marca de alguna manera, como con un fluoróforo, la sonda TFO se puede usar para identificar cualquier secuencia de ácido nucleico.
En una realización, el cebador que comprende una región formadora de tríplex (cebador TFR) también puede poseer un colorante fluorescente.
Como se representa en la figura 16, el cebador TFR participa en la amplificación de la secuencia diana, creando cadenas de ADN formador de tríplex a lo largo de la secuencia diana y unidas a ella.
La etapa 1 representa las cadenas individuales del ADN desnaturalizado de la secuencia diana, unidas al cebador oligonucleotídico. El cebador oligonucleotídico comprende una secuencia final de etiqueta que no coincide con la secuencia diana. La secuencia final de etiqueta comprende una o más secuencias formadoras de tríplex.
La etapa 2 representa la fase de extensión del proceso de amplificación. Durante esta fase, el cebador se extiende hacia su extremo 3' para crear una diana para el siguiente ciclo.
La etapa 3 representa el cebador extendido desnaturalizado de la diana.
La etapa 4 representa un cebador sin etiqueta hibridado con el cebador TFR extendido.
La etapa 5 representa la fase de extensión del cebador sin etiqueta para crear una secuencia de ADN bicatenaria con una región formadora de tríplex.
A continuación, el siguiente método de detección se puede emplear para determinar si la sonda TFO se ha unido con la región formadora de tríplex bicatenaria del ADN amplificado, lo que indica que el ADN posee la secuencia de interés.
Como se representa en la figura 16, se crea una sonda oligonucleotídica formadora de tríplex de la siguiente manera. Un TFO monocatenario está diseñado para unirse a la región formadora de tríplex en la secuencia diana que se creó durante el proceso de amplificación. Un colorante capaz de participar en la transferencia de energía de fluorescencia (FRET) se une a la sonda TFO tríplex. En este caso, el colorante es el colorante donante. Los siguientes son dos ejemplos de un ADN monocatenario que forma un tríplex con un ADN bicatenario con TFR:
5' - GGAGGGGGAGAAGGGAGAAGGG - 3' (SEQ ID NO: 36)
3' - CCTCCCCCTCTTCCCTCTTCCC - 5' (SEQ ID NO: 37)
5' - GGTGGGGGTGTTGGGTGTTGGG - 3' TFO (SEQ ID NO: 38)
3'- GGGTTGTGGGTTGTGGGGGTGG - 5' TFO (SEQ ID NO: 39)
5' - GTGTGGGAAGAGGGGGAXGAGGGGGAGGAGC - 3' (SEQ ID NO: 40)
3' - CACACCCCTTCTCCCTXCTCCCCTCCGTCG - 5' (SEQ ID NO: 41)
Como se representa en la figura 17, el extremo 3' de la sonda TFO está protegido con un fosfato para evitar que la sonda TFO participe en el proceso de amplificación. La sonda TFO también puede estar protegida por un colorante fluorescente, un enlazador no extensible o cualquier otro átomo o molécula adecuada conocida por los expertos en la materia para evitar la extensión de oligonucleótidos durante las reacciones de amplificación. El colorante donante puede unirse al extremo 3' de la sonda o cerca del mismo. El colorante donante también puede unirse al extremo 5' de la sonda TFO o cerca del mismo. El colorante donante también se puede unir en cualquier lugar entre el extremo 5' y el extremo 3' de la sonda TFO. Cuando se une un colorante a la sonda TFO, comprende una sonda fluorescente formadora de tríplex (TFFP).
La figura 18 representa una secuencia de ADN bicatenario que comprende una región formadora de tríplex. La secuencia de ADN bicatenario posee un colorante receptor. La TFR de la TFFP se une a la región formadora de tríplex del ADN bicatenario.
En una realización, la TFFP se hibrida con el ADN amplificado solo cuando la temperatura de la reacción es igual o inferior a la temperatura de hibridación de los cebadores. Por lo tanto, la sonda fluorescente formadora de tríplex no participa en la reacción. Cuando la TFFP se une a la secuencia amplificada y se proyecta una luz sobre el producto, el colorante donante en la TFFP resuena. A medida que el colorante donante resuena, transfiere energía a un colorante receptor ubicado en el ADN bicatenario, lo que hace que el colorante receptor emita fluorescencia a una longitud de onda particular, emitiendo luz de un color que corresponde a esa longitud de onda. Esto indica que la secuencia de interés estaba presente en la muestra de prueba y se había amplificado.
En una realización alternativa, el colorante receptor se une a la TFFP y el colorante donante se une al producto de ADN bicatenario amplificado. En la presente realización, el colorante aceptor emite fluorescencia cuando se ha amplificado la secuencia de interés.
En otra realización, se puede usar una pluralidad de cebadores, estando cada cebador diseñado para unirse a y amplificar específicamente una secuencia de interés diferente. Cada cebador tiene un colorante aceptor diferente unido al mismo, de modo que cada colorante aceptor emite fluorescencia a una longitud de onda diferente. La sonda fluorescente formadora de tríplex se unirá a la región formadora de tríplex del producto amplificado. Un colorante donante adherido a la sonda formadora de tríplex hará que el colorante aceptor en el producto amplificado emita fluorescencia de un determinado color, dependiendo del producto que se haya amplificado. De esta manera, se puede ensayar una pluralidad de secuencias diferentes a la vez. La presente realización permitiría analizar una pluralidad de diferentes secuencias potenciales de interés en un recipiente de reacción. La prueba de una pluralidad de diferentes secuencias potenciales de interés en un recipiente de reacción se conoce como multiplexación.
En una realización alternativa de una combinación de sondas multiplex, el colorante aceptor puede unirse a la TFFP y el colorante donante puede unirse al producto de ADN bicatenario amplificado. En la presente realización, cada cebador tendrá un colorante donante de diferente color, de modo que el colorante aceptor, unido a la sonda TFO, emitirá fluorescencia con un color diferente, dependiendo de qué cebador haya amplificado la secuencia de interés. En otra realización, la sonda TFO está diseñada para hibridarse aproximadamente a la misma temperatura, o a una temperatura ligeramente superior o inferior a la Tm de los cebadores. Esta realización permite la lectura de los resultados de la amplificación en tiempo real.
Ejemplo 6: Diseño de sonda de la región formadora de triplex con TFR de origen natural
Otra realización aprovecha las regiones formadoras de tríplex (TFR) de origen natural que están ubicadas dentro o adyacentes a la propia secuencia de interés. Los siguientes son ejemplos de secuencias TFR de origen natural en ADN bicatenario.
5' TTTTTTCCCGTCC 3' (SEQ ID NO: 42)
3' AAAAAGGGCAGG 5' (SEQ ID NO: 43)
5' GGCGAGGGGGGAGCGGG 3' (SEQ ID NO: 44)
3' CCGCTCCCCCCTCGCCC 5' (SEQ ID NO: 45)
5' GGAGGTGGGGGAG 3' (SEQ ID NO: 46)
3' CCTCCACCCCCTC 5' (SEQ ID NO: 47)
5' GGAGGTGGGGGAG 3' (SEQ ID NO: 48)
3' CCTCCACCCCCCTC 5' (SEQ ID NO: 49)
5' GGAGAAGGTGAGGAAGAAGAAGAGGAAGAA 3' (SEQ ID NO: 78)
En la presente realización, los cebadores están diseñados para unirse con las regiones formadoras de tríplex de origen natural, así como con la secuencia de interés.
De esta manera, la región formadora de tríplex del ADN se amplifica a niveles detectables a medida que se amplifica la secuencia de interés. El cebador tiene un colorante receptor adherido al mismo. La sonda formadora de tríplex se crea con una secuencia complementaria a la secuencia de origen natural de interés.
En otra realización de un método de multiplexación, cada conjunto de cebadores diseñados para ensayar una secuencia particular de interés comprende su propia secuencia única de pares de bases de TFR además de su propio colorante de color único. En una realización, el colorante será un colorante donante. A continuación, se diseña una pluralidad de sondas TFO, cada conjunto de las cuales comprende una TFR para coincidir con una TFR particular de uno de los productos amplificados. Cada conjunto de sondas también comprende su propio color de colorante aceptor único. El producto que se amplifica determina qué sonda se unirá con el mismo. Qué sonda se une al producto amplificado y, por lo tanto, qué secuencia de interés existe en la muestra, se determina por el color de la fluorescencia de la sonda cuando se somete a FRET con el colorante de la sonda TFO.
En otra realización, el método de detección puede comprender el uso de colorantes de unión a ADN especiales que se unen preferentemente a estructuras de ADN tríplex. En una realización, el colorante comprende Tiazol Naranja. En otra realización, el colorante comprende colorante Cianina 40. Además de los colorantes expuestos en el presente documento, puede usarse cualquier otro colorante que se una preferentemente a estructuras de ADN tríplex conocido por los expertos en la materia. Estos colorantes de unión a tríplex pueden usarse en combinación con TFR marcadas con colorante, ya sea en los cebadores o dentro del propio producto, para producir una señal basada en FRET que también podría indicar la presencia de secuencias diana formadas específicamente.
Un método alternativo implica el acoplamiento de sondas TFO a colorantes de unión a ADN. Estos incluirían, sin limitación: Sybr Green 1; Sybr Gold; Eva Green; LightCycler Green I; LightCycler Green II; Toto/Yoyo/Toyo; y otros colorantes de unión a ADN que se unen a estructuras de ADN hibridadas conocidas por los expertos en la materia. Como se representa en la figura 19, los colorantes de unión, restringidos por la unión covalente a una ubicación particular en la sonda TFO, en este caso, el extremo de la sonda TFO, solo pueden unirse a estructuras de ADN hibridadas cuando la sonda TFO está unida y, por lo tanto, coloca la sonda TFO en la proximidad del colorante unido a la secuencia amplificada de interés. Por lo tanto, una señal fluorescente indica que se ha producido la amplificación. En otra realización más, se pueden usar Cy2 u otros colorantes de unión a cuádruplex conocidos por los expertos en la materia.
En otra realización, la sonda TFO puede sintetizarse con un colorante fluorescente y un interruptor ubicado en cualquier lugar a lo largo de su longitud. Como se representa en la figura 20, la presente realización utiliza una configuración de colorante de horquilla e interruptor. Tras la unión de la sonda TFO a la secuencia de interés, se elimina la estructura de horquilla de la sonda, con el resultado de que el interruptor se vuelve lo suficientemente distante del colorante, que ya no puede suprimir la fluorescencia del colorante. Esto da como resultado que se emita una fluorescencia de un determinado color si se ha amplificado la secuencia de interés. El cambio de la señal fluorescente específica es irrelevante siempre que se distinga de cualquier otro producto en la mezcla de reacción. El número total de reacciones que se pueden detectar solo depende de la plataforma del instrumento en el que se realizan las reacciones.
En otra realización, representada en la figura 21, pueden usarse dos o más cebadores con la misma secuencia TFR junto con cebadores TFR que comprenden una secuencia complementaria a la secuencia TFR. La figura 21, representa tres cebadores TFR, cada uno con un colorante de color diferente. En la etapa 2, el cebador que comprende el colorante rojo se unió a la secuencia de interés y se amplificó. En la etapa 3, el cebador TFR se ha unido a la TFR en presencia de un colorante de unión que se une preferentemente a un tríplex. Tal colorante de unión puede comprender Naranja Tiazol, Cían 40, o cualquier otro colorante de unión a tríplex conocido por los expertos en la materia. El colorante de unión participa en la FRET con el fluoróforo adjunto, lo que indica que se ha amplificado la secuencia complementaria al cebador que comprende el colorante rojo.
En una realización alternativa, los productos pueden distinguirse por el color, la temperatura de fusión o una combinación de color y temperatura de fusión de los productos tríplex. La figura 22 representa una realización en donde seis cebadores se dividen en tres conjuntos de dos cada uno. Cada conjunto de dos cebadores comprende la misma secuencia de TFR y cada uno de los tres conjuntos comprende tres secuencias TFR diferentes, de manera que cada uno de los tres conjuntos de cebadores se distingue de los otros dos en virtud de tener temperaturas de fusión diferentes. Los dos cebadores que comparten TFR dentro de cada conjunto tienen cada uno un colorante de color diferente. El método también comprende el uso de tres conjuntos de sondas que comprenden una secuencia que se une a la TFR de uno de los pares de cebadores. A continuación, los productos serán distinguibles basándose en sus combinaciones únicas de temperatura de fusión y color. Estos diversos métodos para distinguir el producto permitirían el uso de la formación de ADN tríplex en la detección del producto amplificado como detección cuantitativa, genotípica o simplemente de la diana.
La siguiente es una realización alternativa de tecnología de cebador y sonda diseñada para aprovechar las características únicas de la DFA. En la presente realización, cada cebador de un par de cebadores está marcado con un colorante que puede participar en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). Como se representa en la figura 23, el colorante donante se une cerca del extremo 3' del primer cebador, mientras que el colorante aceptor se une cerca del extremo 3' del segundo cebador. En la etapa de hibridación, los cebadores se hibridan con sus secuencias diana en una disposición casi de cola a cola que acerca los colorantes lo suficiente como para que se produzca la FRET. La cantidad de fluorescencia del aceptor es proporcional a la cantidad de producto de DFA presente.
Los kits de ensayo de la presente divulgación para amplificar y/o detectar una secuencia diana de una muestra de ADN pueden incluir: i) los cebadores y sondas que describen en el presente documento, y ii) tampón, dNTP, y enzimas. Dichos reactivos están presentes en cantidades suficientes para realizar una pluralidad de ensayos.
Ejemplo 7: Diseños adicionales de sonda de la región formadora de tríplex
Los oligonucleótidos formadores de tríplex proporcionan un método único para la detección de productos de amplificación de PCR, XCR, RAMP, HDA, NEAR o cualquier otra tecnología de amplificación que dé como resultado grandes cantidades de ADN bicatenario amplificado.
Se ha descrito la introducción de TFR artificiales unidas en algún lugar a lo largo de un cebador. Más interesante, sin embargo, es la aparición natural de regiones formadoras de tríplex (TFR), que es sorprendentemente abundante. Por ejemplo, Streptococcus agalactiae con un genoma de 2 millones de pares de bases, tiene hasta 29 TFR de 16 pares de bases o más. Tal abundancia relativamente alta de dichas TFR hace plausible utilizar tales TFR (tramos de homopurina u homopirimidina) como marcadores de diagnóstico potenciales para la amplificación del ácido nucleico deseado.
Uno de tales ejemplos de un diseño básico de un oligonucleótido formador de tríplex para su uso en la detección de ADN amplificado se diagrama a continuación, en donde un conjunto de cebadores adecuados para su uso en la DFA produce un producto de amplificación que es diagnóstico para la diana de elección y la secuencia entre los cebadores contiene una región formadora de tríplex (TFR) que puede detectarse adecuadamente con oligonucleótidos formadores de tríplex (TFO).
El TFO se uniría al ADN bicatenario amplificado en cualquier punto durante la reacción en donde se haya producido la extensión bicatenaria cadena a través de la porción de TFR del producto.
Ventajosamente, dichos eventos de unión se pueden controlar en muchas etapas diferentes de la amplificación y, por lo tanto, como otras químicas de hibridación, no obligarán a que la lectura en tiempo real tenga lugar a la temperatura más baja de la reacción en donde el ADN monocatenario no extendido se expone para la unión de la sonda.
Una ventaja distintiva de poder usar temperaturas más altas para las lecturas fluorescentes es que las reacciones pueden acelerarse hasta la velocidad máxima con la ventaja correspondiente de no fomentar la formación de productos no específicos manteniendo durante períodos prolongados temperaturas de reacción relativamente bajas.
TFO para su uso en la detección de adenovirus amplificados:
XCR DIRECTO de adenovirus: CGTGAGCTCGTCTTCCAGGAGCCTGAT (SEQ ID NO: 50)
XCR INVERSO de adenovirus: GTCTCCCGGTGCGTCGCCGT (SEQ ID NO: 51)
9001 CTGGGGATTGCGGGCCGAGACCGTGACXTCGTCTTCCAGGAGCCGGATGAGCTCGGGGAT
GACCCGTAACGCCCGGCTCTGGCACTCGAGCAGAAGGTCCTCGGACTACTCGAGCCGCTA
9061 GGTGGCGCGC ACCTCGCGCTCGAAATCCCCGGGGGCCTCCTCTTCT i'CCTCTTCTTCCAT
3! 1’~11Í1|1111111|1Í|1Í1111111~Q
CCACCGCGCGTGGAGCGCGAGCTTTAGGGGCCCCCGGAGGAGAAGAAGGAGAAGAAGGTA
9121 GACGACCTCTTCTTCTATTTCTTCCTCTGGGGGCGGTGGTGGTGGCGGGGCCCGACGACG
CTGCTGGAGAAGAAGATAAAGAAGGAGACCCCCGCCACCACCACCGCCCCGGGCTGCTGC
9181 a c g g c g a c g c a c c g g g a g a c g g t c g a c g a a g c g c t c g a t c a t c t c c c c g c g g c g g c g a c g
Figure imgf000034_0001
La sonda TFO que se une dentro del nucleótido de adenovirus más largo de SEQ ID NO: 52 se designa SEQ ID NO: 53 y contiene las etiquetas 3' F y 5' Q.
Además, se sabe que se pueden usar ligandos del surco menor para hacer TFO más cortos y para estabilizar su unión. Los TFO también se pueden usar para genotipificar variaciones de secuencia, como se muestra a continuación. TFO de horquilla:
XCR DIRECTO de adenovirus: CGTGAGCTCGTCTTCCAGGAGCCTGAT (SEQ ID NO: 50)
XCR INVERSO de adenovirus: GTCTCCCGGTGCGTCGCCGT (SEQ ID NO: 51)
TFOhorquilla: TTTIIAGGÁQGAG^GCíÁGAAGAAGÁAGCíI'ÁAAA.
(SEQ ID NO: 54)
Figure imgf000034_0002
9001 CTGGGCATTGCGGGCCGAGAGGGTG&^7Cr,?rTTCCAGGA<X:G?GA?GAGCTCGGCGAT
GACCCGTAACGCCCGGCTCTGGCACTCGAGCAGAAGGTCCTCGGACTACTCGAGCCGCTA
Figure imgf000035_0003
9121 GACGACCTCTTCTTCTATTTCTTCCTCTGGGGGCGGTGGTGGTGGCGGGGCCCGACGACG
CTGCTGGAGAAGAAGATAAAGAAGGAGACCCCCGCCACCACCACCGCCCCGGGCTGCTGC
9181 ACGGCGACGCACCGGGAGACGGTCGACGAAGCGCTCGATCATCTCCCCGCGGCGGCGACG
Figure imgf000035_0001
(SEQ ID NO: 52)
La sonda TFO de horquilla que se une dentro del nucleótido de adenovirus más largo de SEQ ID NO: 52 se denomina SEQ ID NO: 54 y contiene las bases terminales complementarias que pueden formar la estructura de horquilla cuando la sonda no está unida a la diana.
TFO de ligandos del surco menor:
XCR DIRECTO de adenovirus: CGTGAGCTCGTCTTCCAGGAGCCTGAT (SEQ ID NO: 50)
XCR INVERSO de adenovirus: GTCTCCCGGTGCGTCGCCGT (SEQ ID NO: 51)
Figure imgf000035_0002
La sonda TFO de ligandos del surco menor (mgb, por sus siglas en inglés) que se une dentro del nucleótido de adenovirus más largo de SEQ ID NO: 52 se designa SeQ ID NO: 55.
TFO de ligandos MGB dobles:
Estos TFO pueden ser particularmente útiles cuando las TFR son cortas y existe la necesidad de una estabilidad adicional para permitir que el TFO se una durante las condiciones del termociclado de DFA.
XCR DIR de adenovirus: CGTGAGCTCGTCTTCCAGGAGCCTGAT (SEQ ID NO: 50)
XCR INV de adenovirus: GTCTCCCGGTGCGTCGCCGT (SEQ ID NO: 51)
TFOmgb::
Figure imgf000036_0001
56;
'300.1 CTGGGCATTü CGGGCCG.A.G.A.CCGTGáGCTCG?CTTCC!iGGAGCCTG-ATGAGC?CGGCGAT
GACCCGTAACGCCCGGCTCTGGCACTCGAGCAGAAGGTCCTCGGACTACTCGAGCCGCTA
9061 GGTGGCGCGCACCTCGCGC7CGAAATCCCCGGGGGCCTCCTCT7C7TCCTCTTCTTCCAT
3 ’ - o - mg b ■ - ' Q io - F eC.ACCGCGCGTCA3AGCGCGA.GCTTTAGGGGCCCCCGCGAlClAGAA.GlAAGGAGA.AGA.AGG7.A
9121 GACGACCTCTTCTTCTATTTCTTCCTCTGGGGGCGGTGGTGGTGGCGGGGCCCGACGACG
CTGCTGGAGAAGAAGATAAAGAAGGAGACCCCCGCCACCACCACCGCCCCGGGCTGCTGC
9181 ACGGCGACGCACCGGGAGACGGTCGACGAAGCGCTCGATCATCTCCCCGCGGCGGCGACG
Figure imgf000036_0002
(SEQ ID NO: 52)
La sonda TFO de ligandos del surco menor (mgb, por sus siglas en inglés) doble que se une dentro del nucleótido de adenovirus más largo de SEQ ID NO: 52 se designa SEQ ID NO: 56.
Genotipado con TFO:
La presente divulgación proporciona métodos para utilizar TFO para realizar el genotipado.
XCR DIR de adenovirus: CGTGAGCTCGTCTTCCAGGAGCCTGAT (SEQ ID NO: 50)
XCR INV de adenovirus: GTCTCCCGGTGCGTCGCCGT (SEQ ID NO: 51)
T FO genotipo 1: Q - - l l Í i i l l l l l l l ® 1111111111 --f (Se q i d n o : 57 )
T F O g e n o tip o 2:
Figure imgf000036_0003
Amplicón de genotipo 1:
En las realizaciones, en donde la señal se puede generar solo con emparejamientos perfectas con el TFO o con el TFO formador de horquilla, podría usarse para el análisis de la curva de fusión.
9001 CTCA3GC.ATTGCGGGCCG.AG.ACCGTG39GCTCGTCTTCCAGGAGCCTGATG.AGCTCGGCG.A.T
GACCCGTAACGCCCGGCTCTGGCACTCGAGCAGAAGGTCCTCGGACTACTCGAGCCGCTA
9061 g g t g g c g c g c a c :c:t c g c g c t c g a a a t c c c c g g g g
C C A C C G C G C G T G G A G C G C G A G C T T T
Figure imgf000036_0005
9121 GACGACCTCTTCTTCTATTTCTTCCTCTGGGGGCGGTGGTGGTGGCGGGGCCCGACGACG
CTGCTGGAGAAGAAGATAAAGAAGGAGACCCCCGCCACCACCACCGCCCCGGGCTGCTGC
9181 ACGGCGACGCACCGGGAGACGGTCGACGAAGCGCTCGATCATCTCCCCGCGGCGGCGACG
Figure imgf000036_0004
(SEQ ID NO: 52)
Amplicón de genotipo 2:
En las realizaciones, en donde la señal se puede generar solo con emparejamientos perfectas con el TFO o con el TFO formador de horquilla, podría usarse para el análisis de la curva de fusión.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un método para detectar una secuencia de ácido nucleico diana, que comprende:
a) proporcionar un sistema de ácido nucleico, que comprende:
a. una sonda oligonucleotídica en dirección 3', que comprende al menos 50 pares de bases, que tiene una secuencia que es complementaria a una primera secuencia de un oligonucleótido diana y que tiene una secuencia escindible; y
b. un cebador oligonucleotídico en dirección 5', que comprende al menos 50 pares de bases, que tiene una secuencia que es complementaria a una segunda secuencia del oligonucleótido diana y que tiene un sitio de unión de polimerasa de ácido nucleico inicial;
b) desnaturalizar el ADN que tiene la secuencia diana;
c) hibridar el cebador oligonucleotídico en dirección 5' y la sonda oligonucleotídica en dirección 3' con el oligonucleótido diana;
d) unir una polimerasa al sitio de unión de polimerasa de ácido nucleico inicial;
e) realizar un termociclado con un intervalo de temperatura dentro de 15 °C de la Tm de la secuencia de ácido nucleico diana para extender el cebador oligonucleotídico en dirección 5' a través de polimerización con la polimerasa hacia la sonda oligonucleotídica en dirección 3';
f) escindir nucleótidos o pequeños oligonucleótidos de la sonda oligonucleotídica en dirección 3'; y
g) detectar una señal resultante de dicha escisión;
en donde la sonda oligonucleotídica en dirección 3' está configurada para que una polimerasa escinda mononucleótidos u oligonucleótidos pequeños en su extremo 5', y
en donde la Tm de la sonda oligonucleotídica en dirección 3' y el cebador oligonucleotídico en dirección 5' está dentro de aproximadamente 15 °C de la Tm del ácido nucleico diana.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la sonda oligonucleotídica en dirección 3' incluye una secuencia escindible que se escinde mediante escisión independiente de la polimerización por una polimerasa que se une con el sitio de unión de polimerasa de ácido nucleico inicial.
3. El método de la reivindicación 1, en donde la sonda oligonucleotídica en dirección 3' incluye al menos un marcador que se escinde por la actividad de la nucleasa.
4. El método de la reivindicación 1, en donde la sonda oligonucleotídica en dirección 3' incluye un extremo 5' que tiene un indicador y un interruptor en dirección 3' del indicador.
5. El método de la reivindicación 1, en donde el cebador oligonucleotídico en dirección 5' y la sonda oligonucleotídica en dirección 3' se hibridan con el oligonucleótido diana.
6. El método de la reivindicación 1, en donde la sonda oligonucleotídica en dirección 3' y el cebador oligonucleotídico en dirección 5' se hibridan con el oligonucleótido diana a una distancia de nucleótidos suficientemente cercana para que una polimerasa de ácido nucleico entre en contacto con el extremo 5' de la sonda oligonucleotídica en dirección 3' cuando se une al sitio de unión de polimerasa de ácido nucleico inicial del cebador oligonucleotídico en dirección 5'.
7. El método de la reivindicación 1, en donde el cebador oligonucleotídico en dirección 5' y la sonda oligonucleotídica en dirección 3' se configuran de manera cooperativa para que la sonda oligonucleotídica en dirección 3' se escinda mediante escisión independiente de la polimerización por una polimerasa que se une con el sitio de unión de polimerasa de ácido nucleico inicial del cebador oligonucleotídico en dirección 5'.
8. El método de la reivindicación 1, en donde la sonda oligonucleotídica en dirección 3' y el cebador oligonucleotídico en dirección 5' hibridan con el oligonucleótido diana a una distancia de nucleótidos suficientemente lejana para que una polimerasa de ácido nucleico no entre en contacto con un extremo 5' de la sonda oligonucleotídica en dirección 3' cuando la polimerasa de ácido nucleico se une al sitio de unión de polimerasa de ácido nucleico inicial del cebador oligonucleotídico en dirección 5'.
9. El método de la reivindicación 1, en donde el cebador oligonucleotídico en dirección 5' y la sonda oligonucleotídica en dirección 3' se configuran de manera cooperativa para que la sonda oligonucleotídica en dirección 3' se escinda por escisión dependiente de la polimerización por una polimerasa después de la polimerización.
10. El método de la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido en dirección 3' incluye un marcador en dirección 5' y un marcador en dirección 3'.
11. El método de la reivindicación 1, en donde la sonda oligonucleotídica en dirección 3' comprende un colorante fluorescente y un interruptor ubicado de manera intercambiable en el extremo 5' o 3' de dicha sonda, de tal manera que cuando la sonda está en solución, la señal del colorante fluorescente se suprime por el interruptor.
12. El método de la reivindicación 1, en donde la sonda oligonucleotídica en dirección 3' comprende un colorante fluorescente y un interruptor ubicado de manera intercambiable en el extremo 5' o 3' de dicha sonda, de tal manera que cuando se produce la unión del cebador oligonucleotídico en dirección 5' y la sonda oligonucleotídica en dirección 3' al oligonucleótido diana, junto con la unión de una polimerasa al sitio de unión de polimerasa de ácido nucleico inicial, la polimerasa escindirá el marcador fluorescente o el interruptor de la sonda oligonucleotídica en dirección 3'.
13. El método de la reivindicación 1, en donde uno del cebador oligonucleotídico en dirección 5' o la sonda oligonucleotídica en dirección 3' incluye un complejo de batofenantrolina-RU II como marcador, y el otro del cebador oligonucleotídico en dirección 5' o la sonda oligonucleotídica en dirección 3' incluye una molécula donante de energía.
14. El método de la reivindicación 1, en donde la sonda oligonucleotídica en dirección 3' es una sonda híbrida de horquilla/escindida.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el termociclado se realiza con un intervalo de temperatura dentro de 10 °C de la Tm de la secuencia de ácido nucleico diana.
16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el termociclado se realiza con un intervalo de temperatura dentro de 5 °C de la Tm de la secuencia de ácido nucleico diana.
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