DE69735313T2

DE69735313T2 - Fluoreszenz-Donor-Akzeptor Paar

Info

Publication number: DE69735313T2
Application number: DE69735313T
Authority: DE
Inventors: Carl T. Salt Lake City Wittwer
Original assignee: University of Utah Research Foundation Inc
Current assignee: University of Utah Research Foundation Inc
Priority date: 1996-06-04
Filing date: 1997-06-04
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2017-06-05
Also published as: US6232079B1; PT1179600E; US20090311673A1; DE69733282D1; US7160998B2; DK0912766T4; CA2658290C; CA2591550A1; JP4540754B2; EP1033411A3; DK1179600T3; US6569627B2; ES2326050T3; NZ333136A; US8343754B2; NZ502323A; US7670832B2; US20120258524A1; ES2326050T5; EP1033411A2

Description

Die Erfindung betrifft allgemein das Monitoring von Fluoreszenz-signalen, die bei einer Hybridisierung in Verbindung mit einer Polymerase-Kettenreaktion entstehen. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere das Monitoring einer Hybridisierung mittels Fluoreszenz während und/oder unmittelbar nach der PCR und die Verwendung dieser Informationen zur Produktbestimmung, zum Nachweis einer Sequenzänderung und zur Quantifizierung.
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist für die Molekularbiologie von grundlegender Bedeutung und stellt die erste praktische molekulare Methode für die klinische Laborarbeit dar. Trotz ihrer Nützlichkeit und Beliebtheit ist das derzeitige Verständnis der PCR nicht weit fortgeschritten. Geeignete Bedingungen für eine erfolgreiche Amplifikation müssen durch Ausprobieren herausgefunden werden und eine Optimierung erfolgt empirisch. Sogar Fachleute müssen eine leistungsstarke Methode verwenden, ohne die Theorie für ihren Ablauf zu verstehen oder vorhersagen zu können.
Die PCR erfolgt dadurch, dass eine Probe verschiedene Temperaturzyklen durchläuft, wodurch die DNA denaturiert (aufgetrennt) wird, sich spezifische Primer anlagern (Annealing oder Assoziation) und eine Replikation erfolgt (Extension oder Verlängerung). Ein PCR-Zyklus dauert üblicherweise 2 bis 8 min, so dass eine 30 Zyklen lange Amplifikation 1 bis 4 Stunden benötigt. Das Ansprechen der Proben auf die Temperatur ist bei den meisten PCR-Geräten im Vergleich zu der für die Denaturierung, das Annealing und die Extension benötigte Zeit sehr langsam. Die physikalischen (Denaturierung und Annealing) und enzymatischen (Extension) Reaktionen bei der PCR laufen sehr schnell ab. Die Amplifikationszeiten bei der PCR können von einigen Stunden auf weniger als 15 min gesenkt werden. Schnelle Cyclingtechniken werden durch das schnelle Ansprechen auf die Temperatur und eine Temperaturhomogenität ermöglicht, die in Probenbehältern mit hohem Verhältnis von Oberfläche/Volumen möglich sind, beispielsweise Kapillarröhrchen, Für weitere Informationen siehe auch: C.T.
Wittwer, G.B. Reed und K.M. Ririe, Rapid cycle DNA amplification, in K.B. Mulllis, F. Ferre und R.A. Gibbs, The polymerase chain reaction, Birkhauser, Boston, 174-181 (1994). Eine bessere Temperaturhomogenität ermöglicht, dass Zeit- und Temperaturerfordernisse der PCR besser definiert und verstanden werden können. Eine bessere Temperaturhomogenität erhöht auch die Genauigkeit jeder analytischen Methode, die zum Monitoring der PCR bei der Amplifikation verwendet wird.
Die Fluorimetrie ist eine empfindliche und vielseitige Methode mit vielen Anwendungsmöglichkeiten in der Molekularbiologie. Viele Jahre lang wurde Ethidiumbromid verwendet, um die Größenverteilung von durch Gelelektrophorese aufgetrennten Nukleinsäuren sichtbar zu machen. Das Gel wird gewöhnlich mit Ultraviolettlicht durchleuchtet und die rote Fluoreszenz der doppelsträngigen Nukleinsäure beobachtet. Im Einzelnen wird Ethidiumbromid gewöhnlich verwendet, um die PCR-Produkte nach Beendigung der Amplifikation zu analysieren. Die EP 0 640 828 A1 von Higuchi & Watson offenbart zudem die Verwendung von Ethidiumbromid bei der Amplifikation zum Monitoring der Menge an doppelsträngiger DNA, indem die Fluoreszenz bei jedem Zyklus gemessen wird. Es wurde festgestellt, dass die Fluoreszenz umgekehrt zur Temperatur ansteigt und abfällt und bei der Annealing/Extensionstemperatur (50 °C) am stärksten und bei der Denaturierungstemperatur (94 °C) am schwächsten war. Die bei jedem Zyklus aufgenommene maximale Fluoreszenz diente als Maß für die DNA-Menge. Die Anmeldung von Higuchi & Watson lehrt keine Verwendung von Fluoreszenz zum Monitoring von Hybridisierungen und sie schlägt auch keine Fluoreszenzerfassung über verschiedene Temperaturen vor, um das Ausmaß der Hybridisierung zu verfolgen. Außerdem machen Higuchi & Watson keine Angaben oder Vorschläge, wie man die Temperaturabhängigkeit der Hybridisierung von PCR-Produkten ausnützen könnte, um PCR-Produkte zu identifizieren oder zu quantifizieren.
In der Anmeldung von Higuchi & Watson wird jedoch die Verwendung anderer Fluorophore, einschließlich zweifachmarkierter Sondensysteme, erwähnt, die Fluoreszenz erzeugen, wenn sie durch die 5'-Exonukleaseaktivität bestimmter DNA-Polymerasen hydrolysiert werden, wie in dem U.S. Patent-Nr. 5,210,015 von Gelfand et al. offenbart ist. Die bei diesen Sonden beob achtete Fluoreszenz hängt in erster Linie von der Hydrolyse der Sonden zwischen den beiden Fluorophoren ab. Die Menge an PCR-Produkt wird durch Erfassung der Fluoreszenz einmal pro Zyklus abgeschätzt. Obwohl eine Hybridisierung der Sonden für das Auftreten einer Hydrolyse notwendig zu sein scheint, kommt das Fluoreszenzsignal in erster Linie durch die Hydrolyse der Sonden zustande und nicht durch die Hybridisierung, wobei eine Oligonucleotidsonde mit Fluoreszenzfarbstoffen an gegenüberliegenden Enden ein zum Nachweis des PCR-Produkts und der Nukleinsäurehybridisierung nützliches, gequenchtes Sondensystem liefert, K.J. Livak et al., 4 PCR Meth. Appl. 357-362 (1995). Es findet sich kein Vorschlag, die Temperaturabhängigkeit der Sondenhybridisierung mittels Fluoreszenz zu verfolgen, um Änderungen in der Sequenz der PCR-Produkte zu identifizieren.
Die spezifische Hybridisierung einer Nukleinsäure an einen komplementären Strang zu Identifizierungszwecken wurde in vielen verschiedenen Formaten genutzt. Beispielsweise kann genomische DNA nach dem Verdau mit Restriktionsenzymen, nach Größe aufgetrennt und durch Southern Blotting mit Sonden hybridisiert werden. Als weiteres Beispiel können einzelne Basenmutationen durch "Dot Blots" mit allelspezifischen Oligonucleotiden nachgewiesen werden. Um die notwendige Trennschärfe zu erreichen, wird eine Hybridisierung üblicherweise über Minuten bis Stunden bei einer einzelnen Temperatur durchgeführt. Abwechselnd kann das Ausmaß der Hybridisierung während der Temperaturwechsel dynamisch mit Fluoreszenzmethoden verfolgt werden. Beispielsweise wurden Fluoreszenzschmelzkurven zum Monitoring der Hybridisierung verwendet. L.E. Morrison & L.M. Stols, Sensitive fluorescence-based thermodynamic and kinetic measurements of DNA hybridization in solution, 32 Biochemistry 3095-3104, 1993. Die Geschwindigkeit des Temperaturscans beträgt gewöhnlich 10 °C/Stunde oder weniger, zum Teil wegen der großen thermischen Masse der Fluorimeterküvette.
Die augenblicklichen Verfahren zum Monitoring der Hybridisierung brauchen viel Zeit. Falls das Monitoring einer Hybridisierung innerhalb von Sekunden anstatt von Stunden erfolgen könnte, könnte das Monitoring der Hybridisierung während der PCR-Amplifikation und sogar bei einer PCR mit schnellem Thermocycling erfolgen. Die zahlreichen Anwendungsmöglichkeiten für ein Monitoring der Hybridisierung während der PCR, wie sie hier um fassend offenbart sind, beinhalten Produktidentifizierung und -quantifizierung, Nachweis von Sequenzänderungen und automatische Kontrolle der Parameter für das Thermocycling durch Fluoreszenz-Feedback.
EP 0805190 A2 offenbart Energietransferfarbstoffe, die mittels Linker angehängt sind. WO 93/09128 offenbart Fluoreszenzenergietransferpaare, die aus Fluorescein und Rhodamin oder Texas Rot und DABITC und Texas Rot bestehen. WO 96/00901 offenbart eine Anzahl an Lanthanid-Chelaten, die zu einer intensiven Lumineszenz fähig sind. Die Chelate umfassen einen Lanthanid-Chelator, der kovalent an einen Cumarin-artigen oder Chinolon-artigen Sensibilisator gebunden ist.
Wie oben beschrieben, werden die Temperaturzyklen im Stand der Technik langsam und empirisch durchgeführt. Wenn eine Analyse der PCR-Produkte durch Hybridisierung notwendig ist, werden zusätzliche zeitintensive Schritte nötig. Es wäre daher ein großer Fortschritt auf diesem Gebiet, Verfahren zum Monitoring der Hybridisierung während einer PCR bereitstellen zu können und die Reaktion ohne Probenmanipulation zu analysieren, während sie stattfindet, d.h. während oder unmittelbar nach dem Thermocycling. Durch ein Monitoring der Hybridisierung während der PCR können die grundlegenden Prinzipien, die den Ablauf einer PCR ermöglichen, verfolgt und zur Analyse und Optimierung der Reaktion bei der Amplifikation verwendet werden.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein neuartiges Resonanzenergietransferpaar zum Monitoring der Primer- und/oder Sondenhydridisierung zur Verfügung zu stellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein System zur homogenen Erfassung von PCR-Produkten durch Resonanzenergietransfer zwischen zwei markierten Sonden, die intern an die PCR-Primer hybridisieren, zur Verfügung zu stellen.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein System zur homogenen Erfassung von PCR-Produkten durch Resonanzenergietransfer zwi schen einem markierten Primer und einer markierten Sonden, die intern an die PCR-Primer hybridisiert, zur Verfügung zu stellen.
Es ist des weiteren eine Aufgabe der Erfindung, ein System zum Nachweis von Sequenzänderungen intern für PCR-Primer durch Resonanzenergietransfer und Sondenschmelzkurven zur Verfügung zu stellen.
Diese und andere Aufgaben und Vorteile der Erfindung ergeben sich deutlicher aus der folgenden Beschreibung und den Ansprüchen oder lassen sich bei der Ausführung der Erfindung feststellen.
Die vorliegende Erfindung verringert gegenüber den Methoden des Standes der Technik insbesondere die Gesamtzeit, die für die PCR-Amplifikation und die Analyse benötigt wird, wobei sie gleichzeitig die Möglichkeit bietet, die Qualität der Reaktion durch Optimierung der Amplifikationsbedingungen erheblich zu steigern.
Die Erfindung stellt ein wie in Anspruch 1 definiertes Fluoreszenzenergietransferpaar (FRET-Paar) zur Erzeugung eines Fluoreszenzsignals unter vorbestimmten Bedingungen zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht Verfahren und Anwendungsmöglichkeiten zum kontinuierlichen Fluoreszenzmonitoring einer DNA-Amplifikation. Die benötigte Apparatur kombiniert optische Komponenten mit Elementen für ein schnelles Thermocycling zum kontinuierlichen Monitoring der DNA-Amplifikation mit Hilfe einer Vielzahl verschiedener Fluoreszenzmethoden. In einer veranschaulichenden Ausführungsform wird die Fluoreszenz kontinuierlich von einer einzelnen Probe oder abwechselnd von mehreren Proben auf einem rotierenden Karussell erfasst, wobei alle Proben gleichzeitig einem schnellen Thermocycling unterzogen werden.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde eine Fluoreszenz während einer DNA-Amplifikation mittels Resonanzenergietransfer von Fluoreszein auf Cy5^TM oder Cy5.5^TM mit Hybridisierungssonden überwacht. Die einmal pro Zyklus erfassten Fluoreszentdaten erlauben eine Quantifizierung der Ausgangszahl der Templatekopien.
Das FRET-Paar gemäß der Erfindung kann in einem Verfahren zur Erfassung einer Zielnukleinsäuresequenz einer biologischen Probe verwendet werden, das folgende Schritte umfasst:

(a) Zugeben einer wirksamen Menge eines Paars von Oligonucleotidsonden, die an die Zielnukleinsäuresequenz hybridisieren, zu einer biologischen Probe, wobei eine der Sonden mit einem Akzeptorfluorophor markiert ist und die andere Sonde mit einem Donorfluorophor eines Fluoreszenzenergietransferpaares markiert ist, wobei ein Emissionsspektrum des Donorfluorophors und ein Absorptionsspektrum des Akzeptorfluorophors weniger als 25 % überlappen, das Akzeptorfluorophor einen Peak-Extinktionskoeffizienten von mehr als 100 000 M^–1cm^–1 aufweist und die Donor- und Akzeptorfluorophore bei Hybridisierung der beiden Sonden innerhalb von 25 Nucleotiden voneinander vorliegen,
(b) Beleuchten der biologischen Probe mit Licht einer ausgewählten, vom Donorfluorophor absorbierten Wellenlänge und
(c) Erfassen der Emission der biologischen Probe.

Ein beispielhaftes Resonanzenergietransferpaar umfasst Fluorescein als den Donor und Cy5 oder Cy5.5 als den Akzeptor.
Es wird ein Fluoreszenzresonanzenergietransferpaar offenbart, wobei das Paar ein Donorfluorophor mit einem Emissionsspektrum und ein Akzeptorfluorophor mit einem Absorptionsspektrum und mit einem Extinktionskoeffizienten von mehr als 100 000 M^–1 cm^–1 umfasst, wobei das Emissionsspektrum des Donorfluorophors und das Absorptionsspektrum des Akzeptorfluorophors weniger als 25 % überlappen. Ein beispielhaft beschriebenes Fluoreszenzresonanzenergietransferpaar ist eines, bei dem das Donorfluorophor Fluorescein ist und das Akzeptorfluorophor Cy5 oder Cy5.5 ist.
Kurze Beschreibung der verschiedenen Zeichnungsansichten
1A & B zeigen Graphen, die ein Gleichgewichts-PCR-Paradigma (A) und ein kinetisches PCR-Paradigma (B) darstellen.
2 veranschaulicht nützliche Abschnitte von Temperatur gegen Zeit zum Fluoreszenzmonitoring der Hybridisierung.
3 stellt ein Diagramm von Temperatur gegen Zeit dar, das beispielhaft für schnelle Temperaturwechsel bei einer PCR ist.
4 zeigt die Ergebnisse vier verschiedener Temperatur-/Zeit-Profile (A-D) und ihre entsprechenden Amplifikationsprodukte nach dreißig Zyklen (Nebenbild).
5A, B & C veranschaulichen den Mechanismus der Fluoreszenzerzeugung für drei verschiedene Verfahren zum Fluoreszenzmonitoring einer PCR: (A) Farbstoff für doppelsträngige DNA, (B) Hydrolysedonde und (C) Hybridisierungssonden.
6 zeigt die chemische Struktur des einwertigen N-Hydroxysuccinimidester von Cy5^TM.
7 zeigt die chemische Struktur des einwertigen N-Hydroxysuccinimidester von Cy5.5^TM.
8 zeigt das Emissionsspektrum von Fluorescein (durgezogenen Linie) und das Anregungsspektrum von Cy5 (unterbrochene Linie).
9 zeigt den bei jedem Zyklus während einer PCR zwischen benachbarten Fluorescein- und Cy5-markierten Hybridisierungssonden auftretenden Resonanzenergietransfer.
10 zeigt den Effekt des Variierens des Verhältnisses der Cy5-Sonde zur Fluoresceinsonde auf das während einer PCR erzeugte Resonanzenergietransfersignal.
11 zeigt den Effekt des Variierens der Sondenkonzentration bei einem gegebenen Sondenverhältnis auf das während einer PCR erzeugte Resonanzenergietransfersignal.
12 zeigt den Effekt eines Abstands zwischen den markierten Oligonucleotiden auf das während einer PCR erzeugte Resonanzenergietransfersignal.
13 zeigt den Zeitverlauf einer benachbarten Sondenhybridisierung durch Fluoreszenzenergietransfer unmittelbar nach 30 Zyklen der Amplifikation mit Taq-DNA-Polymerase (exo⁺; durchgezogenen Linie) und das Stoffel-Fragment der Taq-DNA-Polymerase (exo^–; gestrichelte Linie) eines Temperaturwechsels und den Typ der Polymerase bei einer Fluoreszenzentwicklung während einer PCR mit benachbarten Hybridisierungssonden; die Temperatur ist mit einer dicken Linie dargestellt.
14 ist eine Auftragung des Fluoreszenzverhältnisses gegen die Zyklenzahl für eine Amplifikation mit Taq-DNA-Polymerase (exo⁺; durchgezogenen Linie), Stoffel-Fragment der Taq-DNA-Polymerase (exo^–; unterbrochene Linie) und KlenTaq-DNA-Polymerase (exo^–; gestrichelte Linie); das Cycling im oberen Feld liegt zwischen 94 °C und 60 °C mit einem Halt bei 60 °C während 20 Sekunden; das Cycling im mittleren Feld liegt zwischen 94 °C und 60 °C mit einem Halt bei 60 °C während 120 Sekunden und das Cycling im unteren Feld liegt zwischen 94 °C und 60 °C mit einem langsamen Anstieg von 60 °C auf 75 °C.
15 ist eine Auftragung der Fluoreszenz gegen die Zyklenzahl für mehrere verschiedene anfängliche Kopierreaktionen von Templaten, die mit Sybr^TM Green I verfolgt wurden: 0, (Δ); 1, (∎); 10, (–); 10², (–); 10³, (+): 10⁴, (•); 10⁵, (♢) 10⁶, (×); 10⁷,
; 10⁸, (☐); 10⁹, (♦).
16 ist eine Auftragung des Fluoreszenzverhältnisses gegen die Zyklenzahl für mehrere verschiedene anfängliche Kopierreaktionen von Templaten, die mit einer zweifach markierten Hydrolysesonde verfolgt wur den: 0, (–); 1,
; 10, (o); 10², (*); 10³, (•): 10⁴, (☐); 10⁵, (+); 10⁶, (∎); 10⁷, (♢); 10⁸, (x); 10⁹, (♦).
17 ist eine Auftragung des Fluoreszenzverhältnisses gegen die Zyklenzahl für mehrere verschiedene anfängliche Kopierreaktionen von Templaten, die mit benachbarten Hybridisierungssonden verfolgt wurden: 0, (–); 1,
; 10, (o); 10², (*); 10³, (•): 10⁴, (☐); 10⁵, (+); 10⁶, (∎); 10⁷, (♢); 10⁸, (x); 10⁹, (♦).
18 ist eine Auftragung des Fluoreszenzverhältnisses gegen die Zyklenzahl, das den Unterschied zweier Hybridisierungssondenentwürfe aufzeigt, die mittels Resonanzenergietransfer verfolgt wurden: (♢) zwei Hybridisierungssonden, die mit Fluorescein bzw. Cy5 markiert sind, und (♦) ein mit Cy5 markierter Primer und eine mit Fluorescein markierte Sonde.
19A-C stellen einen Vergleich von drei Methoden eines Fluoreszenzmonitoring für PCR dar, einschließlich des doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffs SYBR Green I (A), einer zweifach markierten Fluorescein/Rhodamin-Hydrolysesonde (B), und einer Fluorescein-markierten Hybridisierungssonde mit einem Cy5-markierten Primer (C); 19D zeigt den Variationskoeffizienten für die drei in den 19A-C dargestellten Monitoringmethoden.
20 zeigt eine typische logarithmische Auftragung der Fluoreszenz gegen die Zyklenzahl einer Standardamplifikation, die mit SYBR Green I verfolgt wurde.
21 zeigt die Anpassung einer exponentiellen Kurve an Zyklen 20-27 der aus 20 stammenden Daten.
22 zeigt eine exponentielle Anpassung an eine zu bestimmende, unbekannte anfänglichen Kopienzahl aus den Amplifikationsdaten.
23 zeigt eine typische Auftragung der Fluoreszenz gegen die Zyklenzahl für fünf Standards, bei denen in jedem Zyklus ein Monitoring mit benachbarten Hybridisierungssonden erfolgte, wobei die anfänglichen Kopien zahlen wie folgt dargestellt sind: 10³, (•); 10⁴, (♢); 10⁵, (
; 10⁶, (☐); 10⁷, (♦).
24 zeigt eine Kurvenanpassung an die Standarddaten von 23.
25 zeigt eine typische Auftragung der Fluoreszenz gegen die Zyklenzahl für fünf Standards, bei denen in jedem Zyklus ein Monitoring mit einer Hydrolysesonde erfolgte, wobei die anfänglichen Kopienzahlen wie folgt dargestellt sind: 1,5 (•); 15, (♢); 150,
; 1500, (☐); 15.000, (♦).
26 zeigt eine Kurvenanpassung an die Standarddaten von 25.
27 zeigt eine typische logarithmische Auftragung der Fluoreszenz gegen die Zyklenzahl von drei Standardamplifikationen, die mit SYBR Green 1 verfolgt wurden, wobei: (∎); (•);
.
28 zeigt verschiedene Kurvenanpassungen an die Standarddaten der 27.
29A & B zeigen Auftragungen von (A) Zeit gegen Fluoreszenz und (B) Zeit gegen Temperatur, welche die inverse Beziehung zwischen Temperatur und Fluoreszenz verdeutlicht.
30 stellt ein Diagramm dar, das auch als 3D-Plot dargestellte 2D-Plots von Temperatur gegen Zeit, Fluoreszenz gegen Zeit und Fluoreszenz gegen Temperatur für die Amplifikation eines 180 Basenpaarfragments des Hepatitis B-Genoms in Gegenwart von SYBR Green I zeigt.
31 zeigt eine Projektion der Fluoreszenz gegen die Temperatur für die Amplifikation eines 536 Basenpaarfragments des humanen beta-Globingens in Gegenwart von SYBR Green I.
32A & B stellen eine Auftragung dar, die (A) eine lineare Änderung des Fluoreszenzverhältnisses mit der Temperatur für Hydrolysesonden und (B) eine radikale Änderung mit der Temperatur für Hybridisierungssonden zeigt.
33 zeigt eine Auftragung des Fluoreszenzverhältnisses gegen die Temperatur einer Amplifikation mit einer exo^– Polymerase in der Gegenwart von benachbarten Hybridisierungssonden.
34 zeigt eine Auftragung des Fluoreszenzverhältnisses gegen die Temperatur einer Amplifikation mit einer exo⁺ Polymerase in der Gegenwart von benachbarten Hybridisierungssonden.
35 zeigt eine dreidimensionale Auftragung der Temperatur, Zeit und Fluoreszenz während einer Amplifikation mit einer exo^– Polymerase in der Gegenwart von benachbarten Hybridisierungssonden.
36 zeigt eine dreidimensionale Auftragung der Temperatur, Zeit und Fluoreszenz während einer Amplifikation mit einer exo⁺ Polymerase in der Gegenwart von benachbarten Hybridisierungssonden.
37A & B zeigen (A) Schmelzkurven und (B) Schmelzpeaks für PCR-Produkte einer Person, die heterozygot ist für die Faktor-V-Leiden-Mutation (durchgezogene Linie), homozygot ist für die Faktor-V-Leiden-Mutation (gepunktete Linie), homozygot ist für Wildtyp (unterbrochene Linie) und ohne DNA-Steuerung (abwechselnd Punkt und Strich).
38 zeigt eine Auftragung des Fluoreszenzverhältnisses gegen die Temperatur eines kontinuierlichen Monitoring während 40 Zyklen von PCR-Produkten einer Probe, die homozygot ist für die Faktor-V-Leiden-Mutation (durchgezogene Linie), heterozygot ist für die Faktor-V-Leiden-Mutation (gepunktete Linie) und homozygot ist für Wildtyp (abwechselnd Punkt und Strich).
39 zeigt Schmelzpeaks eines homozygoten Mutanten des Methylentatrahydrofolatgens (durchgezogene Linie), eines homozygoten Wildtyps (unterbrochene Linie), eines heterozygoten Mutanten (gepunktete Linie) und ohne DNA-Steuerung (abwechselnd Punkt und Strich).
40 zeigt die Form der Reannealingkurven von amplifizierten β -Globin-PCR-Produkten bei verschiedenen Anfangsmengen an Templat.
41 zeigt die Bestimmung einer Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung zur Bestimmung der anfänglichen Templatkonzentration.
42 zeigt ein Blockdiagramm zur Steuerung des Thermocyclings mit den Fluoreszenzdaten.
43A & B zeigen (A) eine Auftragung Temperatur gegen Zeit, die nach 20 Zyklen erhalten wurde, und (B) eine Auftragung Fluoreszenz gegen Zeit, die nach 25 Zyklen erhalten wurde, wobei das Thermocycling mit den Fluoreszenzdaten gesteuert wurde.
Ausführliche Beschreibung
Bevor die vorliegenden Methoden zum Monitoring der Hybridisierung während einer PCR offenbart und beschrieben werden, sollte deutlich gemacht werden, dass diese Erfindung nicht auf die hierin offenbarten speziellen Ausgestaltungen, Verfahrensschritte und Materialien beschränkt ist, da solche Ausgestaltungen, Verfahrensschritte und Materialien ziemlich variieren können. Es wird auch darauf hingewiesen, dass die hierin verwendete Terminologie lediglich zum Zweck der Beschreibung spezieller Ausführungsformen verwendet wird und damit keine Einschränkung beabsichtigt ist, da der Umfang der vorliegenden Erfindung lediglich durch die anhängenden Ansprüche und deren Äquivalente beschränkt wird.
Es muss darauf hingewiesen werden, dass die Singularformen "ein", "eine", "einer", "der", "die" und "das", wie sie in dieser Beschreibung verwendet werden, entsprechende Pluralformen einschließen, insofern der Kontext dies nicht deutlich anderweitig vorschreibt.
In der Beschreibung und den Ansprüchen der vorliegenden Erfindung wird entsprechend den nachfolgenden Definitionen die folgende Terminologie verwendet.
"Nukleinsäure", "DNA" und ähnliche Bezeichnungen, wie sie hier verwendet werden, schließen auch Nukleinsäureanaloga, d.h. Analoga mit einem anderen als einem Phosphodiestergrundgerüst, ein. Beispielsweise kommen die aus dem Stand der Technik bekannten so genannten "Peptidnukleinsäuren", die Peptidbindungen anstelle von Phosphodiesterbindungen im Grundgerüst aufweisen, im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Betracht.
"Kontinuierliches Monitoring" und ähnliche Begriffe, wie sie hier verwendet werden, bezeichnen ein mehrmaliges Monitoring während eines PCR-Zyklus, vorzugsweise bei Temperaturwechseln, und besonders bevorzugt den Erhalt wenigstens eines Wertepunktes bei jedem Temperaturwechsel.
Der Begriff "Cycle-by-cycle"-Monitoring, wie hier verwendet wird, bedeutet ein einmaliges Monitoring der PCR-Reaktion pro Zyklus, vorzugsweise während der Annealing-Phase der PCR.
Wie hierin verwendet, bezeichnen "Fluoreszenzresonanzenergietransferbeziehung" und ähnliche Ausdrücke eine benachbarte Hybridisierung von einem Oligonucleotid, das mit einem Donorfluorophor markiert ist, und eines anderen Oligonucleotids, das mit einem Akzeptorfluorophor markiert ist, zu einer Zielnucleinsäure, derart, dass das Donorfluorophor eine Resonanzenergie auf das Akzeptorfluorophor übertragen kann, derart, dass das Akzeptorfluorophor eine messbare Fluoreszenzemission erzeugt. Wenn das Donorfluorophor und das Akzeptorfluorophor mit einem zu großen Abstand voneinander getrennt vorliegen, kann das Donorfluorophor keine Resonanzenergie auf das Akzeptorfluorophor übertragen, so dass das Akzeptorfluorophor keine messbare Fluoreszenz emittiert, und können somit das Donorfluorophor und das Akzeptorfluorophor nicht in einer Resonanzenergietransferbeziehung stehen. Wenn die beiden markierten Oligonucleotide beide Sonden sind und nicht als ein PCR-Primer ("Sonde-Sonde") fungieren, dann lie gen das Donor- und Akzeptorfluorophor vorzugsweise innerhalb von ungefähr 0-25 Nucleotiden, weiter bevorzugt innerhalb von ungefähr 0-5 Nucleotiden und am meisten bevorzugt innerhalb von ungefähr 0-2 Nucleotiden. Ein besonders bevorzugter Abstand ist 1 Nucleotid. Wenn eines der markierten Oligonucleotide auch als ein PCR-Primer ("Sonde-Primer") fungiert, dann liegen das Donor- und Akzeptorfluorophor vorzugsweise innerhalb von ungefähr 0-15 Nucleotiden und weiter bevorzugt innerhalb von ungefähr 4-6 Nucleotiden.
Der Begriff "wirksame Menge", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine Menge, die ausreicht, um eine ausgewählte Wirkung hervorzurufen. Eine wirksame Menge an PCR-Primern ist beispielsweise eine zur Amplifikation eines Nukleinsäurefragments durch PCR ausreichende Menge, vorausgesetzt, dass eine DNA-Polymerase, ein Puffer, ein Templat und andere Bedingungen, einschließlich Temperaturbedingungen, wie sie nach dem Stand der Technik zur Durchführung der PCR notwendig sind, vorliegen.
Eine PCR erfordert wiederholtes Denaturieren von Templat und Annealing von Primern. Diese Hybridisierungsvorgänge sind temperaturabhängig. Die Temperaturzyklen der PCR, die die Amplifikation treiben, denaturieren abwechselnd bei hoher Temperatur das sich akkumulierende Produkt und bewirken bei einer niedrigeren Temperatur das Annealing von Primern an das Produkt. Die Übergangstemperaturen von Produktdenaturierung und Primer-Annealing hängen in erster Linie vom GC-Gehalt und von der Länge ab. Wenn eine Sonde konstruiert wird, um innen an das PCR-Produkt zu hybridisieren, hängt die Schmelztemperatur der Sonde auch vom GC-Gehalt, der Länge und dem Grad der Komplementarität mit dem Target ab. Mit PCR-kompatiblen Fluoreszenzsonden lässt sich die Hybridisierung während der Amplifikation verfolgen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung, die vorzugsweise in Verbindung mit schnellen Thermocycling eingesetzt wird, ist ein kinetisches Paradigma für die PCR zweckdienlich. Anstatt sich PCR als drei Reaktionen (Denaturierung, Annealing, Extension) vorzustellen, die bei drei verschiedenen Temperaturen über drei Zeiträume ablaufen (1A), ist ein kinetisches Paradigma für die PCR nützlicher (1B). Mit einem kinetischen Para digma besteht die Kurve von Temperatur gegen Zeit aus kontinuierlichen Wechseln zwischen sich überlagernden Reaktionen. Denaturierung und Annealing erfolgen so schnell, dass keine Haltedauer bei einer bestimmten Temperatur notwendig ist. Die Extension erfolgt mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten über einen Bereich von Temperaturen. Eine vollständige Analyse würde die Kenntnis aller relevanten Geschwindigkeitskonstanten über alle Temperaturen erfordern. Wenn die Geschwindigkeitskonstanten aller Reaktionen bekannt wären, könnte eine "physikochemische Beschreibung der PCR" entwickelt werden. Die Bestimmung dieser Geschwindigkeiten würde eine genaue Kontrolle der Probentemperatur erfordern und wird durch ein Monitoring der Reaktion bei den Temperaturwechseln stark vereinfacht.
2 veranschaulicht nützliche Abschnitte von Temperatur gegen Zeit zum Fluoreszenzmonitoring der Hybridisierung. Die Produktschmelzkurven werden während eines langsamen Temperaturanstiegs bis zur Denaturierung erhalten. Durch ein schnelles Absenken der Temperatur nach der Denaturierung auf eine konstante Temperatur können gegebenenfalls Produkt-, Sonden- oder Primerannealing verfolgt werden. Die Sondenschmelzkurven werden durch langsames Aufheizen durch die Temperaturen um den Sonden-T_m hindurch erhalten. Die in 2 dargestellte Ausführungsform liefert die gesamte Analyse während des Thermocycling in sofortiger Echtzeitdarstellung. Die Fluoreszenzsonden bilden Teil der Amplifikationslösung zum kontinuierlichen Monitoring von Primer-, Sonden- oder Produkthybridisierung während des Thermocycling.
Die hier enthaltenen Fluoreszenzhybridisierungsmethoden basieren auf schnellem Thermocycling, wobei dessen Vorteile in Geschwindigkeit und Spezifität liegen.
Das Temperaturprofil einer Probe bei einer PCR mit schnellem Thermocycling ist in 3 gezeigt. Denaturierung und Annealing zeigen sich im Gegensatz zu den breiten Plateaus des herkömmlichen Thermocycling der PCR in diesen Figuren als Temperaturspitzen ("Spikes"), z.B. 1A. Schnelles Thermocycling steht dem herkömmlichen Thermocycling in 4 gegenüber, wo gezeigt ist, dass 30 Amplifikationszyklen in 15 Minuten abgeschlossen sein können und die entsprechenden PCR-Produkte viel weniger Nebenprodukte enthalten. Daher werden beim schnellen Thermocycling die zur Amplifikation benötigten Zeiten um ungefähr das 10-fache gesenkt und die Spezifität verbessert.
Beispiel 1
4 zeigt die Ergebnisse vier verschiedener Temperatur/Zeit-Profile (A-D) und ihre entsprechenden Amplifikationsprodukte nach dreißig Zyklen (A-D). Die Profile A und B in 4 wurden mit einer im Stand der Technik gebräuchlichen Heizblockvorrichtung mit einem im Stand der Technik gebräuchlichen Mikrofugenröhrchen erhalten. Wie in 4 zu sehen ist, erfolgen die Wechsel zwischen den Temperaturen langsam, und in den Profilen A und B zeigen sich viele unspezifische Banden. Profil B zeigt eine Verbesserung bei der Eliminierung einiger der unspezifischen Banden (im Gegensatz zu Profil A), indem die Zeit, für die jede Probe bei jeder Temperatur bleibt, begrenzt wird, was anzeigt, dass kürzere Zeiten bessere Ergebnisse liefern.
Profile C und D wurden mit einem schellen Thermocycler erhalten. Wie in 4 zu sehen ist, ist die Amplifikation spezifisch und obwohl die Ausbeute bei Elongationszeiten von 60 Sekunden maximale ist (C), ist sie bei Elongationszeiten von 10 Sekunden noch völlig ausreichend (D).
Die optimalen Zeiten und Temperaturen für die Amplifikation eines 536 bp-Fragments von beta-Globin aus humaner genomischer DNA wurden ebenfalls bestimmt. Die Amplifikationsausbeuten und die Produktspezifität waren optimal, wenn die Denaturierung (93 °C) und das Annealing (55 °C) weniger als 1 Sekunde dauerten. Es gab keinen Vorteil bei längeren Denaturierungs- oder Annealingzeiten. Die Ausbeute stieg bei längeren Elongationszeiten bei 77 °C an, aber es wurde kaum eine Veränderung bei Elongationszeiten von länger als 10-20 Sekunden festgestellt. Diese unerwarteten Ergebnisse zeigen, dass die Bedingungen, die zur Optimierung der physikalischen und enzymatischen Erfordernisse der Reaktion benötigt werden, bei den früher verfügbaren Vorrichtungen zur DNA-Amplifikation nicht maximal sind.
Weitere Informationen lassen sich erhalten aus: C.T. Wittwer et al., Rapid Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis delta F(508) Locus, 39 Clinical Chemistry, 804 (1993) und C.T. Wittwer et al., Rapid DNA Amplification, THE POLYMERASE CHAIN REACTION, 174 (1994). Die zur Fluoreszenzerfassung und zum schnellen Thermocycling verwendete Apparatur ist in der Serien-Nr. 08/537,612, siehe oben, vollständig offenbart.
Wie oben angegeben, kann die Polymerase-Kettenreaktion schnell durchgeführt werden. Neben der Möglichkeit einer schnellen Wärmeübertragung erlaubt die Verwendung optisch reiner Kapillarröhrchen ein kontinuierliches Fluoreszenzmonitoring der DNA-Amplifikation gemäß der vorliegenden Erfindung.
Fluoreszenzsonden können zum Nachweis und zum Monitoring einer DNA-Amplifikation verwendet werden. Geeignete Sonden beinhalten für doppelsträngige DNA spezifische Farbstoffe und sequenzspezifische Sonden. In 5 werden drei unterschiedliche Fluoreszenztechniken zur Verfolgung einer DNA-Amplifikation verglichen. In den 5A und 5B ist die Fluoreszenz abhängig von der Hybridisierung eines PCR-Produkts, das mittels eines doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffs detektiert wird. In den 5C und 5D ist die Fluoreszenz abhängig von der Hydrolyse einer 5'-Exonuclease-Quenchsonde, was, wie bereits oben diskutiert, im Stand der Technik gut bekannt ist. Die 5E und 5F sind Diagramme eines Hybridisierungsschemas auf Basis eines Resonanzenergietransfers zwischen Fluorophoren auf zwei benachbarten Sonden. Das Verfahren aus 5A ist nicht sequenzspezifisch, obwohl eine Produktspezifität mittels Schmelzkurven erfasst werden kann, was ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist. Sowohl die 5C als auch 5E sind sequenzspezifisch. Das Hybridisierungsverfahren erlaubt jedoch auch Analysen mittels Schmelzkurven, ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Beim Monitoring einer Fluoreszenz aus Reaktionen, bei denen Hydrolysesonden beteiligt sind, wie in 5C, und aus Reaktionen, bei denen Hybridisierungssonden beteiligt sind, wie in 5E, ist es vorteilhaft, die von sowohl dem Donorfluorophor als auch dem Akzeptorfluorophor emittierte Fluoreszenz zu messen. In der Praxis stammt die Hauptmenge der durch Hydrolysesonden emittierten Fluoreszenz von dem Donorfluorophor, und die Hauptmenge der von Hybridisierungssonden emittierten Fluoreszenz stammt von dem Akzeptorfluorophor.
Auswahl des doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffs.
Der Fachmann ist mit der Verwendung von Ethidiumbromid bei Fluoreszenzmethoden vertraut. Wenn während der Amplifikation ein doppelstrangspezifischer Fluoreszenzfarbstoff vorhanden ist, nimmt die Fluoreszenz im Allgemeinen zu, wenn mehr doppelsträngiges Produkt gebildet wird, siehe R. Higuchi et al., Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences, 10 Bio/Technology, 413-417 (1992). Ein PCR-Fluoreszenzassay für Hepatitis C-RNA mit einem interkalierenden Farbstoff YO-PRO-1 ist im Stand der Technik ebenfalls bekannt. Siehe T. Ishiguro et al., Homogeneous quantitative assay of hepatitis C virus RNA by polymerase chain reaction in the presence of a fluorescent intercalater, 229 Anal. Biochem., 207-213 (1995). SYBR^TM Green I, das dem Fachmann allgemein bekannt ist und von Molecular Probes, Eugene, Oregon, erhältlich ist, kann als doppelstrangspezifischer Farbstoff als Vrgleichsbeispiel verwendet werden. Die Molekülstruktur dieses Farbstoffs ist ein Geschäftsgeheimnis, aber der Hersteller empfiehlt es als einen empfindlicheren doppelstrangspezifischen Farbstoff zum DNA-Nachweis auf Gelen. SYBR^TM Green I ist jedoch hitzelabil und daher nicht zum Fluoreszenzmonitoring von PCR gemäß den herkömmlichen Verfahren geeignet, bei denen die Temperatur der Reaktionsmischung für längere Zeit auf Schmelztemperatur gehalten wird. Aufgrund der Hitzelabilität war es überraschend zu entdecken, dass SYBR^TM Green I zum Monitoring von PCR-Reaktionen verwendet werden kann, wenn die Schmelztemperaturen nicht für längere Zeit beibehalten werden, d.h. wenn die PCR mit schnellem Thermocycling gemäß dem oben beschriebenen kinetischen Paradigma durchgeführt wird.
Beispiel 2
Verschiedene doppelstrangspezifische DNA-Farbstoffe wurden durch Monitoring der Amplifikation eines 110 bp-Fragments ausgehend vom PCO3/PCO4-Primerpaar des humanen beta-Glonbingens mit 10.000 Templatkopien verglichen. Die Primer wurden mit der standardmäßigen Phosphoramiditchemie, wie sie im Stand der Technik bekannt ist, nämlich unter Verwendung des Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus (Piscataway, New Jersey), synthetisiert. Die humanen beta-Globinprimer PCO3/PCO4 (110 Basenpaare) sind bei C.T. Wittwer et al., Automated polymerase chain reaction in capillary tubes with hot air, 17 Nucl. Acids. Res., 4353-4357 (1989), beschrieben, worauf hier vollinhaltlich Bezug genommen wird. Die DNA-Amplifikation wurde in 50 mM Tris, pH-Wert 8,5 (25 °C), 3 mM MgCl₂, 500 μg/ml Rinderserumalbumin, 0,5 μM von jedem Primery, 0,2 mM von jedem Desoxynukleosidtriphosphat und 0,2 U Taq-Polymerase pro 5 μl Probe durchgeführt, soweit in den folgenden Beispielen nicht anders angegeben. Das gereinigte Amplifikationsprodukt wurde als DNA-Templat verwendet und durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung erhalten, siehe D.M. Wallace, Large- and small-scale phenol extractions and precipitation of nucleic acids, 152 Methods in Enzymology, 33-48 (1987), gefolgt vom Abtrennen der Primer durch wiederholtes Waschen durch einen Centricon 30 Mikroconcentrator (Amicon, Danvers, Massachusetts). Die Templatkonzentrationen wurden durch Extinktion bei 260 nm bestimmt. Die A(260):A(280)-Verhältnisse der Template waren größer als 1,7.
SYBR^TM Green I (Molecular Probes, Eugene, Oregon) wurde in einer Verdünnung von 1:10.000, Ethidiumbromid mit 5 µg/ml und Acridinorange mit 3 µg/ml verwendet. Diese Konzentrationen wurden als optimale Konzentrationen zur Maximierung des bei der Amplifikation für jeden Farbstoff beobachteten Fluoreszenzsignals bestimmt. Die Anregung erfolgte über einen 450-490 nm Interterenzfilter mit einer Xenonlichtbogenquelle, außer bei Ethidiumbromid, bei dem die Anregung bei 520-550 nm erfolgte. Für SYBR^TM Green I erfolgte das Monitoring der Emission bei 520-550 nm. Die Ethidiumbromidfluoreszenz wurde durch einen 580-620 nm Bandfilter beobachtet. Das Signal von Acridinorange wurde als Verhältnis von grüner (520-550 nm) zu roter (> 610 nm) Fluoreszenz angenommen. Die Fluoreszenz der Probe vor der Amplifikation wurde mit der Fluoreszenz nach 35 Zyklen (94 °C Max., 60 °C für 20 s) bei 60 °C verglichen. Der Fluoreszenzanstieg betrug das 5,3-fache für SYBR^TM Green I, das 1,7-fache für Ethidiumbromid und das 1,2-fache für Acridinorange. Bei getrennten Experimenten war die Fluoreszenz von SYBR^TM Green I für mehr als 30 min bei 70 °C stabil. Es wird auch bequem mit sichtbarem Licht angeregt und soll weniger mutagen sein als Ethidiumbromid. In allen Fällen stammte die Background-Fluoreszenz in erster Linie von den Primern.
SYBR^TM Green I ist ein bevorzugter doppelstrangspezifischer Farbstoff für das erfindungsgemäße Fluoreszenzmonitoring von PCR, in erster Linie wegen seiner der überragenden Empfindlichkeit, die von einer größeren Trennschärfe zwischen doppelsträngiger und einzelsträngiger Nukleinsäure herrührt. SYBR^TM Green I kann bei jeder Amplifikation verwendet werden und ist nicht teuer. Außerdem lässt sich die Produktspezifität durch Analyse der Schmelzkurven erhalten, wie nun gleich beschrieben wird.
Auswahl eines Resonanzenergietransferfarbstoffes für Hybridisierungssonden.
Ein Fluoreszenzresonanzenergietransfer kann zwischen 2 Fluorophoren stattfinden, wenn sie in einer physikalischen Nähe zueinander vorliegen und das Emissionsspektrum von einem Fluorophor mit dem Anregungsspektrum des anderen überlappt. Eine einleitende Übersicht der Theorie eines Fluoreszenzresonanzenergietransfers ist in vielen kürzlich veröffentlichten Übersichtsartikeln zu finden. Die Rate des Resonanzenergietransfers beträgt: (8,785E-5)(t–1)(k2)(n–4)(qD)R–6)(JDA)wobei:

t: = Lebensdauer des angeregten Zustands des Donors bei Abwesenheit des Akzeptors;
k²: = ein Orientierungsfaktor zwischen dem Donor und Akzeptor;
n: = Brechungsindex des sichtbaren Lichts in dem dazwischenliegenden Medium;
q_D: = Quanteneffizienz des Donors in Abwesenheit des Akzeptors;
R: = Abstand zwischen dem Donor und Akzeptor (in Angström);
J_DA: = das Integral von (F_D)(e_A)(W⁴) in Bezug auf W bei allen überlappenden Wellenlängen mit:
F_D: = Peak-normalisiertes Fluoreszenzspektrum des Donors,
e_A: = molarer Absorptionskoeffizient des Akzeptors (M^–1 cm^–1), und
W: = Wellenlänge (nm).

Für irgendeinen gegebenen Donor und Akzeptor kann ein Abstand berechnet werden, bei dem 50 % des Resonanzenergietransfers auftreten, und dieser wird als R₀ abgekürzt. Da die Rate des Resonanzenergietransfers mit der sechsten Potenz vom Abstand zwischen Donor und Akzeptor abhängt, verändert sich der Resonanzenergietransfer schnell, wenn R sich gegenüber R₀ verändert. Bei 2 R₀ tritt ein sehr geringer Resonanzenergietransfer auf, und bei 0,5. R₀ ist die Effizienz des Transfers nahezu vollständig, solange nicht andere Formen einer Nichtanregung überwiegen (d.h. Quenchen durch Kollision). Für viele unterschiedliche Donor- und Akzeptorpaare wurden R₀-Werte zusammengetragen, und diese variieren zwischen 22 und 72 Angström.
Bei einer doppelhelikalen DNA sind 10 Basen um ungefähr 34 Angström getrennt. Bei einem Markieren der Basen einer DNA mit Donor- und Akzeptorfluorophoren wurde der Resonanzenergietransfer als ein spektroskopisches Lineal zur Beobachtung der helikalen Geometrie der DNA verwendet und die Struktur einer Vier-Wege-DNA-Verknüpfung analysiert. Der Resonanzenergietransfer kann auch als ein Monitor der Hybridisierung verwendet werden. Wenn ein markiertes Oligonucleotid an einen markierten Templatstrang hybridisiert wird, kann R von einem viel größeren Wert als R₀ auf deutlich unterhalb R₀ gebracht werden, was den Resonanzenergietransfer dramatisch erhöht. Alternativ dazu können zwei markierte Sonden an denselben Templatstrang für eine ähnliche Änderung des Fluoreszenzenergietransfers hybridisiert werden.
Die praktische Verwendung des Resonanzenergietransfers zum Monitoring einer Hybridisierung ist abhängig von der erforderlichen Empfindlichkeit und von der verfügbaren Zeit. Bei der Verwendung einer kompetitiven Hybridisierungstechnik mit 1 nM markierten Sonden wurde eine PCR-ampli fizierte DNA nach 15 min bei 40 °C erfasst. Es ist eine schnellere Signalerzeugung wünschenswert. Wenn lediglich Sekunden für eine Hybridisierung erforderlich wären, könnten PCR-Produkte bequem bei jedem Zyklus der Amplifikation quantifiziert werden. Darüber hinaus könnte das Ausmaß der Sondenhybridisierung innerhalb eines Temperaturzyklus überwacht werden.
Die Hybridisierung ist ein Prozess zweiter Ordnung (siehe B. Young & M. Anderson, Quantitative analysis of solution hybridization, In: Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, 47-71 (Hrsg. B. Hames, S. Higgins, 1985)). Wenn die Konzentration der Sonde viel größer als die Konzentration des Targets ist, ist die Hybridisierungsrate umgekehrt proportional zur Konzentration der Sonde. Wenn zum Beispiel die Sondenkonzentration verdoppelt wird, wird die Hybridisierungszeit halbiert. Es wären hohe Sondenkonzentrationen notwendig für ein Cycle-by-Cycle-Monitoring während einer PCR, da eine Hybridisierung stattfinden muss, bevor die Hybridisierungsstelle durch eine Polymeraseverlängerung abgedeckt wird.
Die hohen Sondenkonzentrationen, die für ein Hybridisierungsmonitoring während einer PCR erforderlich sind, erfordern ein Resonanzenergietransferpaar mit einmaligen Eigenschaften. Man betrachte die Anregung eines Paars aus Donor (D) und Akzeptor (A) mit Licht. Die Anzahl an direkt angeregten Fluorophoren von D und A werden proportional zu dem Extinktionskoeffizienten (e) eines jeden Fluorophors bei der Anregungswellenlänge sein, oder:
Anzahl an direkt angeregten D-Molekülen = (K)(e_D)
Anzahl an direkt angeregten A-Molekülen = (K)(e_A)
wobei K eine Proportionalitätskonstante ist. Eine Deexcitation des Donors wird durch Fluoreszenz, Resonanzenergietransfer und andere Prozesse, die als thermisches Quenchen zusammengefasst werden können, stattfinden. Wenn p_F = Wahrscheinlichkeit des Resonanzenergietransfers und p_TD Wahrscheinlichkeit eines thermischen Quenchens des Donors, dann beträgt die Wahrscheinlichkeit der Donorfluoreszenz gleich: 1-pF-PTD und die Anzahl an fluoreszierenden Donormolekülen beträgt: (K)(eD)(1-pF-PTD).
Wenn die Wahrscheinlichkeit der Erfassung einer Donoremission in dem Donoremissionsfenster (zum Beispiel ein Fenster eines Bandpassfilters) gleich p_DD ist, dann beträgt die Anzahl der beobachteten Donoremissionen gleich: (PDD)(K)(eD)(1-pF-pTD)
Die Anzahl an angeregten Akzeptorfluorophoren ist nun die Summe von denen, die direkt angeregt werden, und denen, die durch Resonanzenergietransfer angeregt werden: (K)(eA) + (K)(eD)(pF)
Wenn p_TA = die Wahrscheinlichkeit eines thermischen Quenchens des Akzeptors, dann beträgt die Wahrscheinlichkeit einer Akzeptorfluoreszenz: 1-pTA und die Anzahl an fluoreszierenden Akzeptormolekülen beträgt: [(K)(eA) + (K)(eD)(pF)][1-(pTA)]
Wenn die Wahrscheinlichkeit der Erfassung einer Akzeptoremission in dem Akzeptoremissionsfenster p_AA ist, dann beträgt die Anzahl an beobachteten Akzeptoremissionen gleich: (PAA)[(K)(eA) + (K)(eD)(pF)][1-(pTA)].
Wenn schließlich die Wahrscheinlichkeit der Beobachtung einer Donoremission im Akzeptoremissionsfenster gleich p_DA ist, dann beträgt die Anzahl an beobachteten Emissionen (sowohl D als auch A) in dem Akzeptoremissionsfenster: (pAA)[(K)(eA) + (K)(eD)(pF)][1-(PTA)) + (pDA)(K)(eD)(1-pF-PTD)
Da Fluoreszenzmessungen relativ sind und K in allen Termen vorhanden ist, ist, wenn wir K entfernen und umstellen, die beobachtete Intensität bei dem Donorfenster proportional zu (Donoranregung) – (Energietransfer):

1) (eD)(pDD(1-pTD) – (eD)(pDD)(pF) und die beobachtete Intensität bei dem Akzeptorfenster ist proportional zu (Akzeptoranregung) + (Energietransfer) + (Donoremission im Akzeptorfenster):
2) (eA)(pAA)(1-pTA) + (eD)(pDD)(pF)(1-pTA) + (eD)(PDA)(1-pTD-pF)

Wenn der Resonanzenergietransfer zunimmt, nimmt das Donorsignal ab und nimmt das Akzeptorsignal zu. Die prozentuale Signaländerung ist abhängig von der Hintergrundlichtintensität in jedem Fenster. Bei hohen Konzentrationen an Sonden ist diese Hintergrundlichtintensität hoch. Wenn während einer PCR es notwendig ist, die variierenden Targetkonzentrationen (Produktkonzentrationen) zu überwachen, ist es nicht möglich, die Donorkonzentration an die Targetkonzentration anzupassen. Der Überschuss an Donormolekülen trägt zur Hintergrundlichtintensität in sowohl dem Donorfenster als auch dem Akzeptorfenster bei und überdeckt teilweise das Energietransferphänomen. Das Hintergrundlicht in dem Akzeptorfenster stammt nicht nur von einer Donoremission in dem Akzeptorfenster, sondern auch von einer direkten Anregung des Akzeptors. Dieser Hintergrund kann mit einem geringen e_A und einem geringen p_DA minimiert werden.
Das Fluorescein/Rhodamin-Fluoreszenzenergietransferpaar, das üblicherweise für eine Nucleinsäureerfassung verwendet wird, besitzt eine hohe Hintergrundfluoreszenz. Sowohl eine direkte Akzeptoranregung (e_A, ca. 10 % e_MAX) als auch eine Emission des Donors bei Wellenlängen, die zur Erfassung der Akzeptoremission verwendet werden (p_DA, ca. 20 % der Peakemission), sind hoch. Dieses Paar kann zur Überwachung der Hybridisierung verwendet werden, wenn die Sondenkonzentration nahe der Zielkonzentration ist und genügend Zeit für eine vollständige Hybridisierung eingeräumt wird. Es ist kein brauchbares Paar an Fluorophoren für ein kontinuierliches Monitoring einer PCR, da hohe Sondenkonzentrationen erforderlich sind und die Templatkonzentration bei der PCR sich kontinuierlich ändert.
Das Monitoring einer Produktkonzentration während einer PCR durch Hybridisierung war bis jetzt nicht möglich, da kein akzeptables Resonanzenergietransferpaar gefunden wurde. Es gab einige wenige Versuche zur Verwendung eines Resonanzenergietransfers für eine direkte (nichtkompetitive) Erfassung der Hybridisierung. Zum Beispiel wird in dem US-Patent Nr. 5,565,322 angegeben, dass "die beobachtete Energietransfereffizienz in Bezug auf eine Reemission durch den Akzeptor relativ gering war". Bei Sondenkonzentrationen, die hoch genug sind, dass eine signifikante Hybridisierung in Sekunden stattfindet, ist die Hintergrundfluoreszenz zu hoch.
Fluorescein ist wahrscheinlich das am häufigsten verwendete Fluorophor. Sein Extinktionskoeffizient und seine Quanteneffizienz sind hoch, und es wird in großem Ausmaß in der Mikroskopie, bei Immunoassays und bei der Durchflusscytometrie verwendet. Es ist der Donor in einem üblicherweise verwendeten Resonanzenergietransferpaar mit Rhodamin. Cy5 ist ein beliebtes Rot-emittierendes Fluorophor mit einem sehr hohen Extinktionskoeffizienten. Die Struktur des N-Hydroxysuccinimidesters von Cy5 ist in 6 aufgezeigt und die Struktur des verwandten Farbstoffs, Cy5.5, ist in 7 aufgezeigt. Diese Farbstoffe sind Indodicarbocyaninfarbstoffe, die üblicherweise bei der Durchflusscytometrie und bei automatisierten Fluoreszenzsequenzen verwendet werden, und sind erhältlich von Amersham (Pittsburg, PA). Sowohl Fluorescein als auch Cy5 sind im Handel als Amidite für eine direkte, automatisierte Einbringung in Oligonucleotide erhältlich. Jedoch wurde Cy5 nie als ein Resonanzenergietransferpaar mit Fluorescein berichtet. Intuitiv überlappen die Fluoresceinemission und die Cy5-Absorption nicht genügend hinsichtlich eines Resonanzenergietransfers. Das Emissionsspektrum von Fluorescein und das Absorptionsspektrum von Cy5, gebunden an Oligonucleotide, werden in 8 aufgezeigt. Wenn die Bereiche unter den Kurven normalisiert werden, beträgt die Überlappung der technischen Spektren 19 %. Die Cy5.5-Anregung ist um ungefähr 25 nm in Richtung Rot verschoben, wodurch die Überlappung mit der Fluoresceinemission auf ungefähr 15 % verringert wird. Ein Arbeiten im roten/infraroten Bereich der Spektren ist vorteilhaft, wenn optische Komponenten für die instrumentelle Ausrüstung gewählt werden. Es können Laserdioden für die Beleuchtung verwendet werden, Photodiodendetektoren besitzen eine ausgezeichnete Empfindlichkeit und die meisten Materialien haben eine minimale Autofluoreszenz in dem entsprechenden spektralen Bereich.
Trotz der geringen spektralen Überlappen wurde herausgefunden, dass Fluorescein und entweder Cy5 oder Cy5.5 ein ausgezeichnetes Resonanz energietransferpaar für ein Hybridisierungsmonitoring während einer PCR darstellen.
Beispiel 3
Es wurde entsprechend dem Verfahren aus Beispiel 2 ein beta-Globin-Fragment mit 110 Basenpaaren aus 50 ng an humaner genomischer DNA amplifiziert, wobei die internen Sonden CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA-Fluorescein (SeQ ID NO:3) und Cy5-GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAA G-p (SEQ ID NO:18) bei jeweils 0,2 µM und 0,8 U an KlenTaq1-Polymerase (eine 5'-Exonuclease-abgereicherte Variante der Taq-Polymerase – US-Patent Nr. 5,436,149) in einer 10-µl-Reaktion verwendet wurden. Die Sonden hybridisierten intern an die Primer desselben Strangs und waren unmittelbar benachbart ohne irgendwelche dazwischenliegende Basen.
Sonden und Primer wurden mittels der Standardphosphoramiditchemie, wie sie im Stand der Technik bekannt ist, synthetisiert, wobei ein Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus (Piscataway, New Jersey) verwendet wurde. Die 3'-Fluorescein-markierte Sonde wurde auf einer Fluorescein-markierten CPG-Kassette (Glen Research, Sterling, VA) mit dem abschließenden Trityl-ON unter Unterstützung mittels einer C18-Umkehrphasen-HPLC-Reinigung synthetisiert. Der späte Elutionspeak wurde gesammelt und die Tritylgruppe wurde auf einem PolyPack (Glen Research) entfernt. Das Fluorescein-markierte Oligo wurde mit 50 % Acetonitril eluiert und erneut mittels C18-Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die 5'-Cy5-markierte Sonde wurde synthetisiert mittels eines chemischen Phosphorylierungsmittels am 3'-Ende (Glen Research) und durch Zugabe eines Cy5-Amidits (Pharmacia) zu dem 5'-Ende während einer Trityl-OFF-Synthese. Fehlsequenzen wurden mittels C18-Umkehrphasen-HPLC entfernt. Die Sondenreinheit wurde mittels Polyacrylamid-Elektrophorese und der Absorption des Farbstoffs und des Oligo überprüft.
Eine HPLC wurde durchgeführt auf einer 4 × 250 mm Hypersil ODS-Säule (Hewlett Packard) mit 0,1 M Triethanolamin:Acetat als mobile Phase und einem Acetonitrilgradienten bei 1 ml/min. Das Eluat wurde hinsichtlich sowohl der Absorption (A₂₆₀) als auch der Fluoreszenz (490 nm Anregung, 520 nm Emission für Fluorescein und 650 nm Exzitation, 670 nm Emission für Cy5) überwacht. Die tritylierten und Fluorescein-markierten Oligonucleotide wurden mit 10-30 % Acetonitrilgradient eluiert, und die Cy5-markierten Oligonucleotide eluierten über einem 10-40 % Acetonitrilgradienten.
Das Temperatur-Cycling betrug 94 °C während 0 s mit einer programmierten Annäherungsrate von 20 °C/s, 60 °C während 20 s mit einer Annäherungsrate von 20 °C/s und 75 °C während 0 s mit einer Annäherungsrate von 1 °C/s in einem Kapillarfluoreszenz-Rapid-Temperaturcycler. Während des Temperaturcycling wurde die Fluorescein- und Cy5-Fluoreszenz für jeden Zyklus am Ende des Annealing/Extensions-Segments erhalten. Der Resonanzenergietransfer wurde sowohl als eine Abnahme bei der Fluoresceinfluoreszenz als auch eine Zunahme bei der Cy5-Fluoreszenz beginnend bei ungefähr dem Zyklus 26 der Amplifikation beobachtet (9). Im Allgemeinen ist eine Beobachtung des Fluoreszenzverhältnisses der Cy5- zur Fluorescein-Fluoreszenz bevorzugt.
Die unerwartet guten Ergebnisse mit dem Fluorescein/Cy5-Paar können zumindest teilweise rationalisiert werden. Das überlappende Integral J_DA ist nicht nur von der spektralen Überlappung abhängig, sondern auch von dem Extinktionskoeffizienten des Akzeptors (Cy5 besitzt einen Extinktionskoeffizienten von 250.000 M^–1 cm^–1 bei 650 nm) und von der vierten Potenz der Wellenlänge. Diese beiden Faktoren werden auch bei der gegebenen geringen spektralen Überlappung ein hohes J_DA für Cy5 begünstigen. Kürzlich erwiesen sich Phycoerythrin und Cy7 als eine wirksame Tandemsonde für die Immunofluoreszenz, trotz einer geringen spektralen Überlappung. In einem späteren Beispiel wird die Brauchbarkeit von Fluorescein und Cy5.5 als Markierungen auf Hybridisierungssonden demonstriert. Der Fluoreszenzresonanzenergietransfer kann zum Monitoring einer Nucleinsäurehybridisierung auch dann verwendet werden, wenn die interagierenden Farbstoffe eine geringe spektrale Überlappung aufweisen. Die Verwendung von Fluorescein mit Cy5, Cy5.5 und anderen Rot- oder Infrarot-emitiierenden Farbstoffen als Resonanzenergietransferpaare für ein Monitoring der Hybridisierung wurde bisher nicht erkannt. Fluorescein besitzt einen langen "Emissionsschwanz", der bis auf 600 nm, 700 nm ausläuft und der zur Anregung dieser Farbstoffe des fernen roten und infraroten Bereichs verwendet werden kann. Die Rate des Energietransfers ist abhängig von dem Überlappungsintegral, wird jedoch auch von der sechsten Potenz des Abstandes zwischen den Fluorophoren beeinflusst. Wenn die Sonden so entworfen werden, dass die Resonanzenergietransferfarbstoffe in unmittelbarer Nähe zueinander liegen, ist die Transferrate hoch. Zumindest bei den Fluorescein/Cy5-, Fluorescein/Cy5.5- und vergleichbaren Paaren scheint der Resonanzenergietransfer vorherrschend gegenüber einem Kollisionsquenchen und anderen Formen des Energieverlusts zu sein, wenn die Fluorophore nahe beieinander liegen, wie in dem obigen Beispiel, wo die Fluorophore an benachbarten Sonden ohne dazwischenliegende Basen angeordnet sind.
Die potentielle Brauchbarkeit eines Resonanzenergietransferpaares für Hybridisierungssonden kann beurteilt werden durch Beobachten der Änderung des Verhältnisses der Lichtintensität im Donor- und Akzeptorfenster bei minimalem und maximalem Resonanzenergietransfer. Ein Weg zum Erhalt eines minimalen und maximalen Tranfers ist das Anbringen von beiden Fluorophoren an demselben Oligonucleotid und ein Messen des Fluoreszenzverhältnisses vor und nach einer Digestion mit Phosphodiesterase.
Beispiel 4
Die zweifach markierte Fluorescein/Cy5-Sonde Cy5-CTGCCG-F-TACT GCCCTGTGGG GCAAGGp (SEQ ID NO:19) wurde mittels der Standardphosphoramiditchemie synthetisiert, wobei p ein endständiges 3'-Phosphat (chemisches Phosphorylierungsreagens Glen Research) ist, F ein als ein Amidit eingeführter Fluoresceinrest mit einer 2-Aminobutyl-1,3-propandiol-Hauptkette ist, um den natürlichen 3-Kohlenstoff-Internucleotidphosphodiesterabstand beizubehalten (ClonTech, Palo Alto, CA), und Cy5 als das Amidit (Pharmacia) zugegeben wird. Das Verhältnis der Cy5- zur Fluorescein-Fluoreszenz in 0,1 M Tris, pH 8,0, wurde vor und nach einer erschöpfenden Hydrolyse mit Phosphodiesterase (Sigma, St. Louis, MO) erhalten. Die Änderung des Fluoreszenzverhältnisses war 220-mal das nach der Hydrolyse. Eine zweifach markierte Fluorescein/Rhodamin-Sonde F- ATGCCCT*CCC CCATGCCATC CTGCGTp (SEQ ID NO:20) wurde von Perkin Elmer (Foster City, CA) gekauft, wobei F gleich Fluorescein und * ein an einem modifizierten T-Rest mittels eines Amino-Linkerarms angebrachtes Rhodamin ist. Die Änderung des Fluoreszenzverhältnisses (Rhodamin zu Fluorescein) war 22-mal das nach einer Hydrolyse mit Phosphodiesterase.
Das potentielle Signal des Fluorescein/Cy5-Paares war 10-mal das von dem Fluorescein/Rhodamin-Paar.
Beispiel 5
Der Effekt des Verhältnisses, der Konzentration und des Abstands von Fluorescein- und Cy5-markierten benachbarten Hybridisierungssonden während einer PCR wurde untersucht. Es wurde die Amplifikation des beta-Globin-Locus und des Sondenpaars aus Beispiel 3 verwendet und die maximale Änderung des Fluoreszenzverhältnisses von Cy5 zu Fluorescein beobachtet. Das maximale Signal trat auf, wenn das Verhältnis von Cy5- zu Fluoresceinmarkierten Sonden 2:1 betrug (10). Bei diesem 2:1-Verhältnis trat das beste Signal bei einer Fluoresceinsondenkonzentration von 0,2 µM und einer Konzentration der Cy5-markierten Sonde von 0,4 µM auf (11). Es wurde auch die optimale Anzahl an zwischenliegenden Basen zwischen benachbarten Hybridisierungssonden während einer PCR bestimmt. Es wurden gemäß Beispiel 3 mehrere Sonden derselben Länge, jedoch hinsichtlich ihrer Hybridisierungsposition geringfügig verschoben, synthetisiert, so dass, wenn diese an ein beta-Globin-Target hybridisiert wurden, 0, 1, 2, 3, 4 oder 6 Basen zwischen den Sonden verblieben. Das höchste Signal während einer PCR trat mit einer zwischenliegenden Base auf (12). Obwohl ein gewisser Resonanzenergietransfer bei einem Abstand von 15 und sogar 25 Basen erfasst wurde, fand ein deutlich besserer Transfer bei 0-5 Basen statt.
Heller et al. (US-Patent Nr. 4,996,143) fanden heraus, dass eine Energietransfereffizienz abnahm, wenn die Anzahl an Nucleotiden zwischen Fluorophoren von 4 auf 0 Einheiten abnahm. Im Gegensatz dazu zeigte sich der beste Energietransfer bei dem Fluoresein/Cy5-Paar bei 0 bis 2 zwischenliegenden Nucleotiden.
Hybridisierungssondenverfahren.
Wenn zwei Sonden synthetisiert wurden, welche benachbart auf einem Target hybridisieren, und jede mit einem Fluorophor eines Resonanzenergietransferpaares markiert wird, nimmt der Resonanzenergietransfer zu, wenn eine Hybridisierung stattfindet (5E und 5F). Das Fluorescein/Rhodamin-Paar wird am üblichsten für eine Nucleinsäureerfassung verwendet.
Ein Aspekt dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines sequenzspezifischen homogenen Hybridisierungsverfahrens zur Erfassung von PCR-Produkten. Es ist nicht offensichtlich, wie dies zu erreichen ist. Die Verwendung von Hybridisierungssonden während einer Amplifikation ist nicht nahe liegend. Es scheint nicht, dass sowohl eine Sondenhybridisierung als auch eine Polymeraseextension stattfinden kann. Zum Erhalt einer sequenzspezifischen Fluoreszenz müssen die Sonden hybridisiert werden, jedoch können die Sonden nicht hybridisiert werden, wenn die Polymerase zur Vollendung einer Primerextension bereitgestellt wird und exponentiell DNA amplifiziert.
Eine Lösung dieses Problems ist die Verwendung einer zweifach markierten einzelnen Sonde und die Verwendung der 5'-Exonuclease-Aktivität von üblichen wärmestabilen DNA-Polymerasen zur Spaltung der Sonde während einer Extension, wodurch zwei Fluorphore getrennt werden. In diesem Fall erscheint das Fluoreszenzsignal aus der Trennung des Resonanzenergietransferpaares nach einer Sondenhydrolyse (5C und 5D) anstatt einer Annäherung der Fluorophore durch benachbarte Hybridisierung (5E und 5F). Zweifach markierte Sonden sind jedoch schwierig herzustellen, erfordern eine manuelle Zugabe von zumindest einem Fluorophor zu dem Oligo und erfordern üblicherweise eine extensive Reinigung. Die Sonden sind teuer, und es sind zwei zweifach markierte Sonden notwendig für eine kompetitive Quantifizierung eines Targets oder für eine Mutationserfassung. Bedenken bestehen des Weiteren darin, dass die beobachtete Fluoreszenz von der sich ansammelnden Menge an hyrolysierter Sonde abhängt, nicht direkt von der Menge an vorhandenem Produkt bei einem be liebigen gegebenen Zyklus. Dies führt zu einer kontinuierlichen Zunahme der Fluoreszenz, auch nachdem das PCR-Plateau erreicht worden ist. Letztendlich und am bedeutendsten findet eine Sondenhydrolyse nicht immer während einer Polymeraseextension statt, ein Effekt, der nicht vollständig verstanden wird. Zum Beispiel zeigte die zweifach markierte Fluoreszenz/Cy5-Sonde aus Beispiel 4 eine sehr geringe Hydrolyse während einer PCR, wenn sie von zwei Primern flankiert wurde. In der Tat wurden verschiedene zweifach markierte Fluoreszenz/Cy5-Sonden hergestellt, einschließlich solcher mit endständigen Markierungen, und alle zeigten eine geringe Hydrolyse und Signalerzeugung während einer Amplifikation.
Eine homogene Erfassung von PCR-Produkten mit benachbarten Hybridisierungssonden würde viele der Probleme des 5'-Exonucleasesystems lösen. Die Synthese von benachbarten Hybridisierungssonden ist relativ einfach, da Amidite für sowohl Fluoreszenz als auch Cy5 verfügbar sind für ein direktes Einbringen während einer automatisierten Synthese und ein Zweifachmarkieren von einer Sonde nicht erforderlich ist. Da ihre Fluoreszenz von einer Hybridisierung, nicht einer Hydrolyse, resultiert, könnte die Temperaturabhängigkeit der Sondenfluoreszenz für eine Mutationserfassung und -quantifizierung verwendet werden. Bisher wurde jedoch eine Verwendung von benachbarten Hybridisierungssonden für eine homogene Erfassung von PCR-Produkten nicht berichtet. Überraschenderweise kann sowohl eine Hybridisierung für eine Signalerzeugung als auch eine Amplifikation durch Polymeraseextension durch den von den Sonden blockierten Bereich stattfinden.
Beispiel 6
Aus einer genomischen DNA mit benachbarten Fluorescein- und Cy-5-markierten Sonden wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, ein beta-Globin-Fragment mit 110 bp amplifiziert. In 10-µl-Reaktionen wurden entweder 0,4 U (Taq) oder 0,8 U (Stoffel-Fragment, Perkin Elmer oder KlenTaq1) an Enzym verwendet. Soweit nicht anderweitig angegeben, betrug das Temperaturcycling 94 °C während 0 s mit einer programmierten Annäherungsrate von 20 °C/s, 60 °C während 20 s mit einer Annäherungsrate von 20 °C/s und 75 °C während 0 s mit einer Annäherungsrate von 1 °C/s. 13 zeigt die Entwicklung der Fluoreszenz bei zwei benachbarten Hybridisierungssonden, unmittelbar nachdem das Templat während 30 Zyklen amplifiziert wurde. Nach einer kurzen Denaturierung bei 94 °C wurde die Temperatur auf 60 °C verringert und die Fluoreszenz erhöhte sich während ungefähr 20 s. Die Größenordnung des Signals ist größer bei einer Exonuclease-abgereicherten Polymerase (Stoffel-Fragment) als bei einer nativen Taq-Polymerase, welche eine 5'-Exonuclease-Aktivität einschließt. Nach ungefähr 20 s fiel die Fluoreszenz, wenn die Polymerase die Sonden ersetzt und/oder hydrolysiert. Die relative Abnahme der Fluoreszenz ist geringfügig schneller, wenn die Polymerase eine 5'-Exonuclease-Aktivität (Taq-DNA-Polymerase) aufweist, als wenn ihr diese Aktivität fehlt (Stoffel-Fragment).
In 14 (oberes Feld) wechselt die Temperatur zwischen 94 °C und 60 °C, wobei während 20 s auf 60 °C gehalten wird. Die Fluoreszenz wird am Ende der 20 s erhalten, wenn die Fluoreszenz maximal ist. Mit Taq (exo⁺) findet eine gute Amplifikation statt, jedoch nicht mit dem Stoffel-Fragment (exo^–), was sowohl mittels Fluoreszenzentwicklung als auch Agarosegelen (Gele sind nicht aufgezeigt) verifiziert wurde. Wenn jedoch die Zeit bei 60 °C von 20 s auf 120 s erhöht wird (14, mittleres Feld), amplifiziert die exo^–-Polymerase gut. Die geringere Rate einer Sondenverdrängung mit einer exo^–-Polymerase benötigt anscheinend mehr Zeit bei 60 °C für eine wirksame Amplifikation als die exo⁺-Polymerase. Die von der exo^–-Polymerase erforderliche Zeit kann verringert werden durch ein langsames Erhöhen der Temperatur von 60 °C auf 75 °C (14, unteres Feld). Die Polymerase fällt ab, wenn sie die Sonde erreicht. Bei den Sondenschmelztemperaturen schmelzen die Sonden jedoch von dem Templat ab und die Polymerase fährt unbeeinträchtigt mit der Vollendung der Polymerisation des Strangs fort. Die Polymerisation wird vollendet, solange die Temperatur nicht zu schnell nach einem Sondenschmelzen erhöht wird. 14 (unteres Feld) zeigt eine exo⁺-Polymerase (Taq) und zwei exo^–-Polymerasen (Stoffel-Fragment und KlenTaq1).
Wenn eine Exonuclease-Aktivität vorhanden ist, wird bei jedem Zyklus ein gewisser Teil der Sonde hydrolysiert, was ersichtlich ist anhand der Abnahme der Fluoreszenz bei extensiver Amplifikation. Dies ist in den 13 und 14 (mittleres und unteres Feld) zu beobachten, es findet jedoch nicht bei exo^–-Polymerasen statt. Da die Fluoreszenz bei einer extensiven Amplifikation stabil ist, sind exo^–-Polymerasen wie KlenTaq1 bevorzugt.
Der Erfolg der Verwendung benachbarter Hybridisierungssonden zum Monitoring von PCR ist von einigen Faktoren abhängig. Der Resonanzenergietransfer ist maximiert, wenn 0 bis 2 zwischenliegende Basen zwischen benachbarten Hybridisierungssonden vorhanden sind. Um die Fraktion an Strängen zu erhöhen, die an die Sonden hybridisieren, bevor sich der Primer durch den Bereich der Sondenhybridisierung erstreckt, sollten die Sondenschmelztemperaturen größer als die Primerschmelztemperaturen (vorzugsweise >5 °C) sein.
Cycle-by-cycle-Fluoreszenz.
Eine übliche Endpunktanalyse der DNA-Amplifikation durch Gelelektrophorese identifiziert die Produktgröße und schätzt die Reinheit ab. Da jedoch die Amplifikation zunächst stochastisch, dann exponentiell und schließlich stagnierend erfolgt, ist der Nutzen der Endpunktanalyse zur Quantifizierung begrenzt. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung beinhaltet ein Cycle-by-cycle-Monitoring zur Quantifizierung der anfänglichen Kopienzahl des Templats mit Hybridisierungssonden. Wie für einen Fachmann ersichtlich ist, ist ein einmaliges Monitoring mehrerer Proben pro Zyklus (Once-per-cycle Monitoring) während der DNA-Amplifikation ein leistungsstarkes quantitatives Werkzeug. Ein Cycle-by-cycle-Monitoring wird erreicht, indem man die Fluoreszenz bei der Extension oder der kombinierten Annealing/Extensionsphase eines jeden Zyklus erfasst und die Fluoreszenz mit der Produktkonzentration in Beziehung setzt.
Beispiel 7
Das Cycle-by-cycle-Monitoring der PCR wurde mit drei verschiedenen Fluoreszenzmethoden durchgeführt. Das Fluoreszenzmonitoring erfolgte durch (i) den doppelstrangspezifischen Farbstoff SYBR^TM Green I, (ii) ein Absenken des Fluorescein-Quenchings durch Rhodamin nach Exonukleasespaltung einer zweifach markierten Hydrolysesonde (Vergleichsbeispiele) und (iii) Resonanzenergietransfer von Fluorescein auf Cy5 durch benachbarte Hybridisierungssonden. Die Amplifikationsreagenzien und -bedingungen entsprachen denen von Beispiel 2. Die humanen beta-Globinprimer RS42/KM29 (536 Basenpaare) und PCO3/PCO4 (110 Basenpaare) sind bei C.T. Wittwer et al., Automated polymerase chain reaction in capillary tubes with hot air, 17 Nucl. Acids. Res. 4353-4357 (1989) beschrieben, worauf hier nun vollinhaltlich Bezug genommen wird. Das Thermocycling für beta-Globin erfolgte bei 95 °C Maximum, 61 °C Minimum, 15 s bei 72 °C und einer Durchschnittsgeschwindigkeit zwischen den Temperaturen von 5,2 °C/s. Die beta-Actinprimer und die Fluorescein/Rhodamin-Zweifachsonde wurden von Perkin Elmer (Nr. N808-0230) erhalten. Das Thermocycling für beta-Actin erfolgte bei 94 °C Maximum, 60 °C für 15 s mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit zwischen den Temperaturen von 6,2 °C/s. Die einfach markierten Sonden 5'-CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA-Fluorescein-3' (SEQ ID NO: 3) und 5'-Cy5-AAGTCTGCCG TTACTGCCCT GTGGGGCAAGp (SEQ ID NO: 4) wurden analog zu Beispiel 3 synthetisiert. Diese benachbarten Sonden hybridisieren auf dem gleichen DNA-Strang innen an das PCO3/PCO4-beta-Globin-Primerpaar und sind durch ein Basenpaar getrennt. Das Thermocycling erfolgte bei 94 °C Maximum, 59 °C für 20 s, mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit zwischen den Temperaturen von 7,0 °C/s. Die Hybridisierungssonden (beta-Actin und beta-Globin) wurden jeweils mit 0,2 µM eingesetzt.
Wenn mehrere Proben einmal pro Zyklus mit SYBR^TM Green I einem Monitoring unterzogen werden, lässt sich ein Bereich von 10⁷-10⁸ an anfänglicher Templatkonzentration unterscheiden, wie in 15 dargestellt. Diese Amplifikation stammt von einem 536 bp-Fragment des beta-Globingens mit SYBR^TM Green I als doppelstrangspezifischem Farbstoff. Wenn die Daten als Prozent maximale Fluoreszenz jeder Probe normiert wurden, waren hundert anfängliche Kopien eindeutig von zehn Kopien getrennt. Der Unterschied zwischen einer und zehn Kopien war jedoch nur marginal und es ließ sich kein Unterschied zwischen null und durchschnittlich einer Kopie pro Probe feststellen.
Im Gegensatz dazu weisen sequenzspezifische Sonden einen ähnlichen Bereich auf, scheinen jedoch sogar eine einzelne anfängliche Templatkopie von negativen Kontrollen zu unterscheiden. Eine Signalerzeugung mit 5'-Exonuclease-Sonden (beta-Actin-Fragment, 16) ist abhängig von nicht nur einer DNA-Synthese, sondern erfordert eine Hybridisierung und Hydrolyse zwischen den Fluorophoren der zweifach markierten Sonde. Diese Hydrolyse verringert ein Quenchen und das Fluoreszenzverhältnis der Fluorescein- zu Rhodamin-Emission nimmt zu. Wohingegen die Fluoreszenz von doppelsträngigen Farbstoffen bei übermäßigem Cycling sich einpendelt (15), steigt das Signal von Exonuclease-Sonden mit jedem Zyklus weiter an (16). Sogar obwohl noch kein Nettoprodukt synthetisiert wurde, findet fortlaufend eine Sondenhybridisierung und -hydrolyse statt. Wenn die Templatkopienzahl unterhalb 10³ abfällt, nimmt die Signalintensität ab, jedoch können niedrige Kopienzahlen noch quantifiziert werden, da das negative Kontrollsignal stabil ist.
In 17 wird eine Amplifikation unter Verwendung benachbarter Hybridisierungssonden überwacht und wird ausgedrückt als ein Verhältnis einer Cy5- zu Fluorescein-Fluoreszenz. Die Änderung des Fluoreszenzverhältnisses ist in großem Maße bedingt durch eine Erhöhung der Cy5-Fluoreszenz aus einem Resonanzenergietransfer (9). Im Gegensatz zu zweifach markierten Hydrolysesonden nimmt das Fluoreszenzsignal von Hybridisierungssonden bei hohen Zyklenzahlen ab, wenn die Polymerase eine Exonuclease-Aktivität enthält (siehe auch 14).
Es wird nun die Durchführbarkeit der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von zwei verschiedenen Verfahren zur Resonanzenergietransfererfassung einer Hybridisierung während einer PCR demonstriert. Das erste Verfahren verwendet zwei benachbarte Hybridisierungssonden, eine ist 3'-markiert mit Fluorescein und die andere 5'-markiert mit Cy5. Wenn sich während der PCR Produkt ansammelt, hybridisieren die Sonden während des Annealing-Segments eines jeden Zyklus nahe beeinander. Das zweite Verfahren verwendet einen Primer, der mit Cy5 markiert ist, und eine einzelne Hybridisierungssonde. Der markierte Primer wird während einer Amplifikation in das PCR-Produkt eingebracht, und es ist lediglich eine einzelne Hybridisierungssonde notwendig.
Beispiel 8
Es wurde ein Cycle-by-Cycle-Monitoring einer PCR durchgeführt mittels Resonanzenergietransfer zwischen einem Cy5-markierten Primer und einer Fluorescein-markierten Hybridisierungssonde. Dies wurde verglichen mit einem Monitoring mit benachbarten Cy5/Fluorescein-Hybridisierungssonden. Der Cy5-markierte Primer war CAACTTCATC CACGT*TCACC (SEQ ID NO:21), wobei T* eine modifizierte T-Base mit daran gebundenem Cy5 ist, und die entsprechende Sonde war GTCTGCCGTT ACTGCCCTGT GGGGCAA-Fluorescein (SEQ ID NO:22). Die benachbarten Hybridisierungssonden waren CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT CC-Fluorescein (SEQ ID NO:23) und Cy5-GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAAp (SEQ ID NO:24). Die Hybridisierungssonden wurden gemäß Beispiel 3 synthetisiert und mit 0,2 µM verwendet. Der Cy5-markierte Primer wurde in zwei Schritten synthetisiert. Es wurde eine automatisierte Synthese verwendet, um einen Amino-Modifikator C6dT (Glen Research) bei der gewünschten T-Position einzubringen. Dann wurde der einwertige N-Hydroxysuccinimidester von Cy5 (6) gemäß den Instruktionen des Herstellers (Amersham) manuell mit dem Aminolinker konjugiert. Die HPLC-Reinigung war wie in Beispiel 3 beschrieben.
Der Cy5-markierte Primer (0,5 µM) wurde anstelle von PCO4 verwendet, um das beta-Globin-Fragment mit 110 Basenpaaren aus humaner genomischer DNA wie in Beispiel 3 zu amplifizieren, mit der Ausnahme, dass pro 10 µl 0,4 U an Taq-Polymerase verwendet wurden. Die benachbarten Hybridisierungssonden überwachten auch eine Amplifikation desselben beta-Globin-Fragments. Ein Temperaturcycling wurde durchgeführt bei 94 °C während 0 s und 60 °C während 20 s. Die Fluoreszenz wurde einmal bei jedem Zyklus am Ende des Annealing/Extensions-Segments überwacht. In beiden Verfahren steigt der Fluoreszenzenergietransfer zu Cy5 mit der Hybridisierung an und wird aufgetragen als ein Verhältnis der Cy5- zu Fluorescein-Fluoreszenz (18).
In zusätzlichen Experimenten wurde die Anzahl an Basen variiert, welche die Cy5-Markierung und die Fluorescein-Markierung trennen. Der beste Fluoreszenzresonanzenergietransfer wurde mit ungefähr 4-6 Basen zwischen den Fluorophoren erhalten, obwohl ein Signal erfassbar war bis zu mindestens 15 Basen.
Im Gegensatz zu Hydrolysesonden ist das Fluoreszenzsignal von Hybridisierungssonden nicht kumulativ und tritt bei jeder Annealingphase neu auf. Die Fluoreszenz ist ein direktes Maß für die Produktkonzentration, da die Hybridisierung eine Reaktion pseudo-erster Ordnung ist. Weil die Konzentration der Sonde viel höher als die des Produkts ist, ist der an die Sonde hybridisierte Anteil des Produkts von der Produktkonzentration unabhängig. Diese Eigenschaften zeigen an, dass die Verwendung einer einzelnen Hybridisierungssonde zusammen mit einem markierten Primer zu einem besseren Monitoring der Produktakkumulation zu Quantifizierungszwecken führt. Die inhärente Varianz der verschiedenen Fluoreszenzmethoden bei einem Cycle-by-Cycle-Monitoring ist für eine Quantifizierung ebenfalls wichtig.
Beispiel 9
Die DNA-Amplifikation erfolgte gemäß Beispiel 2 für jedes der drei verschiedenen Verfahren zum Fluoreszenzmonitoring. SYBR^TM Green I wurde in einer Verdünnung von 1:10.000 bei der Amplifikation eines 205 bp langen humanen beta-Globinfragments von den Primern KM29 und PCO4 verwendet. Die Hydrolysesonde und -bedingungen entsprechen den in Beispiel 7 beschriebenen. Die Hybridisierungssonde, TCTGCCGTTA CTGCCCTGTG GGGCAAG-Fluorescein (SEQ ID NO: 5) wurde mit KM29 und dem wie in Beispiel 8 synthetisierten Cy5-markierten Primer CAACTTCATCCACGTT*CACC (SEQ ID NO: 6), wobei T* eine Cy5-markierte T-Base war, verwendet. Alle Amplifikationen wurden in zehnfacher Ausführung mit 15.000 Templatkopien (50 ng humane genomische DNA/10 µl) durchgeführt. Die Temperaturzyklen waren 31 s lang (94 °C Maximum, 60 °C für 20 s, Durchschnittgeschwindigkeit zwischen den Temperaturen 6,2 °C/s). Die Fluoreszenz wurde für jede Probe zwischen Sekunden 15 und 20 der Annealing/Extensionssphase erfasst.
19A ermöglicht einen Vergleich der drei Methoden zum Fluoreszenzmonitoring einer PCR. Die Fluoreszenzsonden sind der dsDNA-Farbstoff SYBR^TM Green I (19A), eine zweifach markierte Fluorescein/Rhodamin-Hydrolysesonde (19B) (Vergleichsbeispiele) und eine Fluorescein-markierte Hybridisierungssonde mit einem Cy5-markierten Primer (19C). Alle Sonden wiesen fast die gleiche Empfindlichkeit auf, wobei nachweisbare Fluoreszenz etwa um den Zyklus 20 herum auftrat. Bei längerer Amplifikation nahm das Signal bei der Hydrolysesonde kontinuierlich zu, war bei SYBR^TM Green I auf einem Niveau und nahm bei der Hybridisierungssonde leicht ab. Die Genauigkeit der drei Methoden zum Fluoreszenzmonitoring wird in 19D verglichen. Die mittleren +/– -Standardabweichungen sind für jeden Punkt aufgetragen. Die Daten sind als Variationskoeffizient (Standardabweichung/Mittelwert) des Fluoreszenzverhältnisses oberhalb der Grundlinie aufgetragen (genommen als Mittelwert der Zyklen 11-15).
Obwohl die Änderung im Fluoreszenzverhältnis bei der Hydrolysesonde größer ist als die bei der Hybridisierungssonde (19B und 19C), ist der Variationskoeffizient der Fluoreszenz bei den Hydrolysesonden größer (19D). Das heißt, dass die Fluoreszenz, die bei dem Verfahren mit Hybridisierungsonden resultiert, genauer ist als bei Verwendung einer Hydrolysesonde, auch wenn die absoluten Signalstärken niedriger sind. Dies stellt einen unerwarteten Vorteil der Hybridisierungssonden gegenüber den üblicheren zweifach markierten Hydrolysesonden dar.
Quantifizierung der anfänglichen Kopienzahl des Templats.
Die quantitative PCR ist sowohl in der biomedizinischen Forschung als auch in der klinischen Laborarbeit zu einer wichtigen Methode geworden. Das Quantifizierungsverfahren beinhaltet oft die Aufnahme einer Eichkurve von Proben, die eine bekannte Kopienzahl der Targetsequenz enthalten, ein. Die Kopienzahl einer unbekannten Probe wird durch Extrapolation zwischen den bekannten Werten ermittelt. Wenn das Cycle-by-cycle-Monitoring einer vollständige Amplifikationskurve mit Fluoreszenz, Radioaktivität oder einem anderen Verfahren erfolgt, das ein zur vorhandenen DNA-Menge proportionales Signal liefert, stehen viele Datenpunkte für eine Analyse zur Verfügung und es ist nicht klar, welcher Wert einen Standard oder eine Unbekannte darstellen soll. Der Stand der Technik wählt einen "Schwellenwert" für das Signal und verwendet dann die Zyklenzahl, bei der der Standard oder die Unbekannte den Schwellenwert schneidet, als repräsentativen Wert (siehe Higuchi & Watson, EPA 0 640 282 A1). Dieser Ansatz verwendet eine sehr kleine Menge der in einer Amplifikationskurve verfügbaren Daten. Außerdem ist die Zuordnung des Schwellenwerts sehr subjektiv und unterliegt einer bewußten oder unbewußten Verzerrung. Mehr verfügbare Daten könnten objektiv durch Anwendung von Methoden zur Anpassung nichtlinearer Kurven auf die Daten in einer Amplifikationskurve verwendet werden. Vorzugsweise könnte man Gleichungen finden, die die Form der Amplifikationskurven durch Modellieren der Faktoren des zugrundeliegenden Verfahrens beschreiben.
Eine Vielzahl verschiedener Gleichungen könnte zur Anpassung der bei einer Amplifikation erzeugten Daten verwendet werden. DNA-Amplifikationen weisen üblicherweise einen log-linearen Abschnitt auf und die Daten in diesem Abschnitt können an eine Gleichung angepasst werden, die einen exponentiellen Anstieg beschreiben, wie er bei einer DNA-Amplifikation erwartet wird. Der log-lineare Teil einer DNA-Amplifikation kann durch die Gleichung: y = A·[DNA]·(1 + E)n beschrieben werden, wobei A ein Skalierungsfaktor ist, der Signaleinheiten in DNA-Einheiten umrechnet; [DNA] die Anfangskonzentration der DNA in der Reaktion ist; E die Effizienz der Reaktion; und n die Zyklenzahl ist.
Ein Quantifizierungsverfahren sollte beinhalten: (1) Anpassen der bekannten Standards an die Gleichung und Fließen-Lassen der Parameter A und E, und (2) Anpassen der unbekannten Proben an die Gleichung mit den Werten für A und E aus den Standards und fließen lassen von [DNA]. Diese Methode verwendet viel mehr Daten und nützt den Teil der Daten, den loglinearen Teil, der wahrscheinlich am informativsten ist. Die 20, 21 und 22 zeigen ein Beispiel für diesen Ansatz. Zehnfach-Verdünnungen eines gereinigten PCR-Produkts wurden als Eichkurve amplifiziert und es wurde ein "unbekannter" humaner genomischer DNA-Standard verwendet. 20 zeigt, dass der log-lineare Teil leicht entweder durch den Benutzer oder die Software identifiziert werden kann. 21 zeigt eine Anpassung der Gleichung y = A·[DNA]·(1 + E)ⁿ an den 10⁴-Kopien-Standard. 22 verwendet Durchschnittswerte von verschiedenen Standards für A und E und passt [DNA] an. Der angepasste Wert von 16.700 liegt sehr nahe am theoretischen Wert eines Gens mit einer einzigen Kopie in der genomischen DNA (15.000 Kopien).
Die Verwendung aller Daten für eine Amplifikationskurve sollte das Ausmaß des Hintergrundrauschens und den Plateau-Wert beinhalten. Während das Plateau bei hoher Kopienzahl nicht informativ ist, ist es bei niedriger Kopienzahl häufig zur anfänglichen Kopienzahl proportional. Das Ausmaß des Hintergrundrauschens sollte zur Bestimmung des ersten Punkts nützlich sein, der einen deutlichen Anstieg des Signals zeigt. Zu diesem Zeitpunkt sind alle Faktoren, die an der Form einer DNA-Amplifikationskurve beteiligt sind, unbekannt, so dass ein Ansatz dahingeht, die Form der Kurve zu beschreiben. 23 zeigt Amplifikationskurven bei Verwendung von Fluoreszenzhybridisierungssonden zum Nachweis eines Bereichs von DNA-Templatkonzentrationen von fünf Größenordnungen. Jede Kurve ist an die Gleichung: Y = ((as·x + ab) – (ds·x + db))/(1 + (x/c)^b) + (ds·x + db)angepasst, wobei "as" der Background der Böschungslinie ist, "ab" der y-Abschnitt der Backgroundlinie ist, "ds" die Steigung der Plateaulinie ist, "db" der y-Abschnitt der Böschungslinie ist, "c" die Zyklenzahl ist, bei der die Reaktion auf halbem Wege zwischen Background und Plateau (A₅₀) ist und "b" die Steigung des log-linearen Teils der Amplifikation ist.
Diese Gleichung ergibt gute Anpassungen an diese Amplifikationsdaten und 24 zeigt, dass der A₅₀-Wert über sieben Größenordnungen gut mit dem log der anfänglichen Kopienzahl korreliert. 25 zeigt die gleiche Anpassung der Gleichung an die Daten von Amplifikationen, bei denen eine Hydrolysesonde zum Nachweis des DNA-Templates über einen Bereich von 5 Größenordnungen verwendet wurde. Diese Gleichung ergibt gute Anpassungen an diese Amplifikationsdaten und die 26 zeigt, dass der A_50- Wert gut mit dem log der anfänglichen Kopienzahl korreliert. Dies zeigt die Flexibilität des Ansatzes einer vollständigen Kurvenanpassung, da die Gleichung gute Anpassungen sowohl an die scharten Plateaus der Kurven für die Amplifikation mit Hybridisierungssonden als auch an die stetig ansteigenden "Plateaus" der Kurven für die Hydrolysesonden ergab.
Vollständige Kurvenanpassungen sind nicht auf diese Gleichung beschränkt. 27 zeigt eine Amplifikation von drei Konzentrationen DNA-Templat, die an die Gleichung: Y = (((as·x + ab) – (dmax·x/dd + x))/(1 + (x/c)^b)) + (dmax·x/dd + x)angepasst ist, die den ersten 6-Parameter-Gleichungen ähnelt, außer dass das Plateau durch eine hyperbolische Kurve und nicht durch eine Gerade definiert ist. 28 zeigt, dass der A₅₀-Wert für diese Gleichung gut mit der anfänglichen Kopienzahl korreliert.
Während der A₅₀-Wert bei diesen Beispielen verwendet wurde, sollte eine Ebene zwischen dem Background und dem Plateau gewählt werden, wenn eine bestimmte Methode im Amplifikationsprofil stärker niedriger oder höher ist. Beispielsweise wird eine Reihe von Amplifikationseichkurven für die beste Korrelation zwischen der anfänglichen Kopienzahl und dem A₅₀ dem A₄₀, dem A₃₀, dem A₂₀ und dem A₁₀ ausgewertet. Die Amplifikationsstärke, die am besten mit der bekannten anfänglichen Kopienzahl korreliert, wird bestimmt. Dies ist für verschiedene Nachweissysteme unterschiedlich. 19 zeigt den Variationskoeffizienten für verschiedene Nachweissysteme. Die Amplifikationsstärke, die die beste Vorhersage liefert, ist vermutlich die Stärke mit dem niedrigsten Variationskoeffizienten.
Wenn man die DNA-Amplifikationsreaktion selbst besser versteht, könnten andere Gleichungen mit Parametern verwendet werden, die physikalische Prozesse wiedergeben. Das Plateau der DNA-Amplifikationskurve hat bei verschiedenen Reaktionen verschiedene Ursachen. Es ist häufig darauf zurückzuführen, dass die Primer nicht in der Lage sind, mit dem Reannealing der Produkte in den letzten Zyklen zu konkurrieren. Dieser Effekt könnte mit einem Parameter erfasst werden, der vom Quadrat der Produktkonzentration in der Reaktion abhängt (da die Reannealinggeschwindigkeit proportional zum Quadrat der Produktkonzentration ist). Eine andere Ursache für das Plateau kann die Verarmung an Primern sein. Primer-limitierte Reaktionen weisen eine charakteristische Form auf, sie zeigen ein sehr scharfes, klar zu erkennendes Plateau. Anpassungen von Primer-limitierten Reaktionen beinhalten Parameter, die diese scharfe Obergrenze definieren. Enzym-limitierte Reaktionen weisen ein sehr abgerundetes Plateau auf, das entsprechend angepasst werden kann. Man kann sich Gewichtungsfaktoren ausdenken, die die bekannten Variationskoeffizienten für ein gegebenes System wiedergeben, so dass die verlässlicheren Datenpunkte schwerer gewichtet werden. Indem man mehr Punkte in einem Amplifikationsprofil anpasst, kann man genauere und zuverlässigere Schätzungen der anfänglichen Kopienzahl erhalten. Ein oder mehrere Parameter dieser Anpassungen können verwendet werden, um die anfängliche Kopienzahl unbekannter Proben zu schätzen.
Kontinuierliches Fluoreszenzmonitoring von PCR.
Das Merkmal des kontinuierlichen Monitorings, das heißt des mehrmaligen Monitorings in jedem PCR-Zyklus, soll nachfolgend erörtert werden. Obwohl ein Fluoreszenzmonitoring bei einer PCR auch einmal pro Zyklus bei einer konstanten Temperatur erfolgen kann, bietet die vorliegende Erfindung den wichtigen Vorteil, dass sie ein kontinuierliches Monitoring über einen ganzen PCR-Zyklus vorsieht. Die Temperatur ist von Bedeutung, da sich die Fluoreszenz ändert, wenn sich die Temperatur ändert. Die 29A & B zeigen die inverse Beziehung zwischen Temperatur und Fluoreszenz für SYBR^TM Green I (Vergleichsbeispiel). Dies ist ein beim Thermocycling verwirrender Effekt, der gewöhnlich eliminiert wird, indem man die Fluoreszenz einmal pro Zyklus bei konstanter Extensionstemperatur betrachtet. Erfindungsgemäß ist jedoch ein Fluoreszenzmonitoring bei Temperaturwechseln sehr informativ. Vor der vorliegenden Erfindung wurde nicht bei jedem Zyklus ein kontinuierliches Fluoreszenzmonitoring durchgeführt, sondern ein einmaliges Fluoreszenzmonitoring pro Zyklus. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Zeit, Temperatur und Fluoreszenz jede s, alle 200 ms, alle 100 ms oder sogar mit noch größerer Häufigkeit erfasst. Die entsprechenden Daten können feine Details der Produktdenaturierung, des Reannealing und der Extension, und des Sonden-Annealing und -Aufschmelzens bei einem schnellen Thermocycling aufdecken, die mit den vorher verfügbaren Verfahren nicht verfügbar waren.
Beispiel 10
Ein 180 bp-Fragment des Gens für das Hepatitis B-Oberflächenantigen wurde ausgehend von 10⁶ Kopien des gereinigten PCR-Produkts mit den Primern 5'-CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT-3' (SEQ ID NO: 1) und 5'-AGAAGATGAG GCATAGCAGC-3' (SEQ ID NO: 2) (Genbank-Sequenz HVHEPB) amplifiziert. Man folgte den Amplifikationsbedingungen von Beispiel 2 mit der Ausnahme, dass die Reaktion eine 1:20.000-Verdünnung an SYBR^TM Green I und 2 mM MgCl₂ enthielt. Jeder Temperaturzyklus dauerte 27 s (92 °C Maximum, 59 °C Minimum, 5 s bei 70 °C, Durchschnittsgeschwindigkeit zwischen den Temperaturen 3,0 °C/s). Zeit, Temperatur und 2 Fluoreszenzkanäle wurden alle 200 ms erfasst und kontinuierlich als Diagramme von Fluoreszenz gegen Zyklenzahl und Fluoreszenz gegen Temperatur dargestellt. 30 zeigt eine 3D-Kurve für Temperatur, Zeit und Fluoreszenz für die Zyklen 10 bis 34. Diese 3D-Kurve ist in 30 auch in Form von 2D-Plots von Temperatur gegen Zeit, Fluoreszenz gegen Zeit und Fluoreszenz gegen Temperatur projiziert. Die Projektion von Temperatur gegen Zeit in 30 wiederholt jeden Zyklus und liefert im Wesentlichen die gleichen Informationen, wie sie in 3 angegeben sind. Weil die Fluoreszenz sich umgekehrt zur Temperatur ändert, ist die in 30 gezeigte Projektion von Fluoreszenz gegen Zeit in frühen Zyklen ein maßstabsgetreues Spiegelbild des Diagramms von Temperatur gegen Zeit (siehe 29). Wenn Produkt akkumuliert, nimmt die Fluoreszenz bei allen Temperaturen bei doppelsträngigem Produkt zu. Bei den Denaturierungstemperaturen fällt die Fluoreszenz jedoch auf die Basislinie zurück, da nur einzelsträngige DNA vorhanden ist. Die in 30 gezeigte Projektion von Fluoreszenz gegen Temperatur der Doppelstrang-Farbstoffe eliminiert die Zeitachse und zeigt die Temperaturabhängigkeit des Strangstatus bei der DNA-Amplifikation.
Vergleichsbeispiel 11
Ein 536 bp-Fragment des humanen beta-Globingens wurde ausgehend von 25 ng genomischer DNA und einer 1:10.000-Verdünnung von SYBR^TM Green I in einem Volumen von 5 µl amplifiziert. Jeder Temperaturzyklus dauerte 28 s (95 °C Maximum, 61 °C Minimum, 15 s bei 72 °C mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit zwischen den Temperaturen von 5,2 °C/s). Andere Bedingungen entsprechen den in 30 beschriebenen. Die Zyklen 15-40 sind dargestellt. Die Temperaturabhängigkeit des Strangstatus des Produkts bei der PCR zeigt sich aus den Diagrammen von Fluoreszenz gegen Temperatur, wie in 31 gezeigt. Die dargestellten frühen Zyklen erscheinen identisch und zeigen einen nichtlinearen Anstieg der Fluoreszenz bei niedrigeren Temperaturen. Bei fortschreitender Amplifikation erscheinen die Temperaturzyklen als aufsteigende Schleifen zwischen Annealing- und Denaturierungstemperatur. Wenn die Probe erhitzt wird, ist die Fluoreszenz bis zur Denaturierung hoch. Wenn die Probe abkühlt, nimmt die Fluoreszenz zu, was ein Reannealing des Produkts widerspiegelt. Wenn die Temperatur bei der Extension konstant ist, korreliert die zunehmende Fluoreszenz mit weiterer DNA-Synthese.
Wie sich aus dem Verständnis dieser Offenbarung ergibt, kann ein kontinuierliches Monitoring innerhalb eines Zyklus einen Einblick in die Mechanismen der DNA-Amplifikation bieten, den es zuvor im Stand der Technik nicht gab. Mit der vorliegenden Erfindung sind viele Aspekte der DNA-Amplifikation erkennbar, die vorher schlecht zu verstehen waren. Eine Amplifikation mit schnellem Thermocycling soll das Produkt beispielsweise in weniger als einer Sekunde denaturieren, während der Stand der Technik zehn Sekunden bis eine Minute für die Denaturierung braucht. Die Beobachtung des Aufschmelzens des Produkts durch Echtzeit-Fluoreszenzmonitoring mit Doppelstrangfarbstoffen gemäß der vorliegenden Erfindung (30 und 31) zeigt, dass die Anwendung kürzerer Denaturierungszeiten effektiv ist. Als anderes Beispiel ist zu nennen, dass für den bekannten "Plateau-Effekt" viele Gründe vorgeschlagen wurden, aber nur wenige Daten zur Verfügung stehen, um zwischen diesen Alternativen zu unterscheiden. Wie in 31 gezeigt erfolgt das Reannealing des Produkts sehr schnell. Tatsächlich reassoziiert bei späteren Amplifikationszyklen beim Abkühlen in jedem Zyklus der größte Teil des Produkts, bevor die Annealingtemperatur der Primer erreicht wird. In einer Apparatur zum raschen Thermocycling erfolgt dies mit Abkühlgeschwindigkeiten von 5-10 °C/s. Das Reannealing des Produkts mit langsameren, im Stand der Technik gebräuchlichen Thermocyclern ist höher und dieser unerwünschte Effekt größer. Reannealing des Produkts scheint ein Hauptgrund und vielleicht der einzige Grund für den "Plateau-Effekt" zu sein.
Nachfolgend wird ein kontinuierliches Monitoring sequenzspezifischer Sonden betrachtet. Wie sich aus dieser Offenbarung ergibt, kann ein kontinuierliches Monitoring innerhalb eines Zyklus die Art der Sondenfluoreszenz identifizieren.
Beispiel 12
Analog zu Beispiel 7 wurde alle 200 ms ein kontinuierliches Monitoring der Amplifikation mit einer zweifach markierten Hydrolysesonde (beta-Actin) und benachbarten Hybridisierungssonden (beta-Globin) durchgeführt. In 32A sind die Zyklen 20-45 einer Reaktion gezeigt, die mit der Hydrolysesonde verfolgt wurde. Die Hydrolysesonden zeigen eine lineare Änderung des Fluoreszenzverhältnisses mit der Temperatur und eine parallele Zunahme bei der Fluoreszenz, wenn mehr Sonde hydrolysiert wird. Im Gegensatz dazu ändert sich das Fluoreszenzverhältnis von Hybridisierungssonden drastisch mit der Temperatur (32B, Zyklen 20-40). Während der Annealing/Extensionsphase hybridisieren die Sonden an einzelsträngiges Produkt und das Fluoreszenzverhältnis (Cy5/Fluorescein) nimmt zu. Beim Aufheizen auf Temperaturen zum Denaturieren des Produkts dissoziieren die Sonden bei etwa 70 °C, wodurch das Fluoreszenzverhältnis auf Backgroundniveau zurückgeht.
Beispiel 13
Aus 50 ng einer genomischen DNA in einem Volumen von 10 µl wurde ein beta-Globin-Fragment mit 110 Basenpaaren amplifiziert. Es wurden die Amplifizierungsbedingungen und benachbarten Hybridisierungssonden aus Beispiel 3 verwendet mit entweder 0,4 U an Taq-Polymerase oder 0,8 U an KlenTaq1. Die Fluoreszenz wurde alle 100 ms überwacht. Die Auftragungen Fluoreszenz gegen Temperatur unter Verwendung von KlenTaq1 (33) und Taq (34) zeigen ein Schmelzen der Sonden bei ungefähr 70 °C. Das maximale Signal mit KlenTaq1 ist größer als das mit Taq aufgrund der Exonuclease-Aktivität der Letzteren. Bei späteren Zyklen mit Taq beginnt sich die Fluoreszenz bei jedem Zyklus zu verringern, wenn die Konzentration an intakten Sonden abnimmt. Eine dreidimensionale Auftragung der Temperatur, Zeit und Fluoreszenz ist in 35 (KlenTaq1) und 36 (Taq) aufgezeigt.
Die Kombination aus (1) kontinuierlichem Fluoreszenzmonitoring innerhalb jedes Temperaturzyklus und (2) Analyse der Temperatur- und Zeitabhängigkeit der Hybridisierung bietet Vorteile, die ansonsten nicht zu erhalten sind. 2 zeigt, dass durch kontinuierliches Monitoring über einen Zyklus hinweg Informationen extrahiert werden können, die vorher nicht erhältlich waren. Ein kontinuierliches Fluoreszenzmonitoring während der Phase des Zyklus, in der das Produkt aufgeschmolzen wird, liefert nützliche Informationen über Reinheit, Identität und Menge der bei dem Zyklus vorhandenen DNA.
Wenn eine PCR-Reaktion von der Extensionstemperatur auf die Denaturierungstemperatur aufgeheizt wird, wird jede DNA in der Probe in Einzelstränge aufgeschmolzen. Diese Denaturierung kann als Abfall der Fluoreszenz von SYBR^TM Green I beobachtet werden. Für kleine PCR-Produkte erfolgt der Vorgang des Aufschmelzens innerhalb eines engen Temperaturbereichs und der Mittelpunkt dieses Schmelzbereichs wird als Tm bezeichnet. Ähnlich der Größenauftrennung durch Gelelektrophorese misst eine Schmelzpeak-Analyse eine grundlegende Eigenschaft der DNA und kann verwendet werden, um amplifizierte Produkts zu identifizieren. Anders als bei der Gelelektrophorese kann die Analyse der Schmelzkurven Produkte mit gleicher Länge aber unterschiedlichem GC/AT-Verhältnis unterscheiden. Zudem hätten zwei Produkte mit gleicher Länge und gleichem GC-Gehalt aber unterschiedlicher GC-Verteilung (beispielsweise gleichverteilt gegen über einem GC-Clamp an einem Ende) sehr unterschiedliche Schmelzkurven.
Die Temperatur, bei der PCR-Produkte schmelzen, variiert über einen großen Bereich. Die Verwendung von im Stand der Technik bekannten empirischen Formeln zum Effekt des GC-Gehalts auf die Schmelztemperatur (Tm) der DNA sagt voraus, dass eine Duplex mit 0% GC um 41 °C tiefer als eine Duplex mit 100% GC schmelzen würde. Bei gleichem GC-Gehalt würde ein 40 bp-Primerdimer 12 °C unter einem 1000 bp-Produkt schmelzen. Der Tm-Bereich für mögliche PCR-Produkte umfasst daher mindestens 50 °C. Dieser breite Bereich ermöglicht eine Unterscheidung der meisten PCR-Produkte aufgrund ihrer Schmelzkurven. Daher bietet eine Kombination aus Fluoreszenzmonitoring von PCR und Schmelzkurvenanalyse gleichzeitig Amplifikation, Nachweis und Unterscheidung von PCR-Produkten.
Beispiel 14
Die Faktor V Leiden Mutation ist eine einzelne Basenänderung (G zu A), die bei dem Aminosäurerest 506 (R5060Q) einen Glutaminrest mit einem Argininrest substituiert. Für weitere Informationen siehe R.M. Bertina et al., Mutation in Blood Coagulation Factor V Associated with Resistance to Activated Protein C, 369 Nature 64-67 (1994) und J. Voorberg et al., Association of Idiopathic Venous Thromboembolism with a Single Point-Mutation at Arg⁵⁰⁶ of Factor V, 343 Lancet 1535-36 (1994), welche beide hiermit durch Verweis mit aufgenommen werden. Wie hierin verwendet, bedeutet "Faktor V Leiden Mutation Locus" die Nucleotidposition in dem Faktor V Gen, bei der eine Guaninbase im Wildtyp ersetzt wird durch eine Adeninbase im Faktor V Leiden Mutant. SEC ID NO:9 zeigt einen Abschnitt des Faktor V Gens vom Wildtyp und SEQ ID NO:10 zeigt den entsprechenden Abschnitt des Faktor V Leiden Gens, wobei das relevante Nucleotid in jedem Fall an Position 31 liegt. Die vollständige Nucleotidsequenz des Faktor V Gens wird beschrieben bei R.J. Jenny et al., Complete cDNA and Derived Amino Acid Sequence of Human Factor V, 84 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 4846-50 (1987), welche hiermit durch Verweis mit aufgenommen wird, und die Sequenzen können auch bei Genbank Locus HUMF10 erhalten werden. Die Aminosäureänderung im Mutant Faktor V Protein macht diesen Gerinnungsfaktor beständig gegenüber einer Verschlechterung und erhöht die Neigung zur Gerinnung und Thrombose. Da diese Mutation die häufigste Ursache für vererbbare Thrombophilie ist, ist sie das Ziel eines üblichen Labortests, der in klinischen molekulargenetischen Laboratorien durchgeführt wird.
Das Standardverfahren der Analyse der Faktor V Leiden Mutation ist eine Amplifizierung des Gensegments mittels PCR, ein Verdauen des resultierenden amplifizierten Produkts mit einer Restriktionsendonuclease, welche die Wildtypsequenz, aber nicht den Mutanten schneidet, und ein Unterscheiden des verdauten Wildtyps und des nicht verdauten Mutantenprodukts mittels Gelelektrophorese. R.M. Bertina et al., siehe oben. Dies ist ein im Stand der Technik für die Analyse von definierten Mutationen bekanntes Verfahren. Ein derartiger Test benötigt üblicherweise ungefähr 4 Stunden, einschließlich einer PCR-Amplifikation (2 Stunden), einer Enzymverdauung (1 Stunde) und einer Elektrophorese (1 Stunde). Die Schritte nach einer Amplifikation umfassen ein Öffnen des Probenröhrchens, Zugeben des Enzyms und Übertragen der verdauten Probe auf die Elektrophoreseapparatur. Das Verarbeiten nach der Amplifikation erhöht das Risiko einer Kontamination des Endprodukts, und eine manuelle Handhabung erfordert eine gewisse Sorgfalt zur Verhinderung eines Fehlbeschriftens der Proben. Ein Verfahren, das hinsichtlich Punktmutationen gleichzeitig amplifiziert und analysiert, würde diese Problempunkte eliminieren.
Ein Verfahren zur vollständigen Amplifizierung und Analyse der Faktor V Leiden Mutation innerhalb von 30 min in demselben Instrument umfasst ein asymmetrisches Amplifizieren eines Abschnitts einer humanen genomischen DNA-Probe, welche den Mutationslocus enthält, gefolgt von einem Erhalten und Analysieren einer Schmelzkurve für die amplifizierte DNA. Genomische DNA wird gemäß den im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt, z. B. J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl., 1989), welche hiermit durch Verweis mit aufgenommen wird. Die Schmelzkurve wird vorzugsweise mittels der oben beschriebenen Resonanzenergietransfermethodik erhalten, wobei eine fluorogene Hybridisierungssonde verwendet wird. Ein solcher Assay unterscheidet auf einfache Weise zwischen homozygotem Wildtyp, homozygotem Mutanten und heterozygoten Genotypen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Oligonucleotidsonde 3'-markiert mit Fluorescein und so entworfen, dass sie an der amplifizierten DNA nahe einem Cy5-markierten Primer für einen Resonanzenergietransfer hybridisiert. Dieses Verfahren kann auf beliebige definierte Mutationen angewendet werden.
Das Sondenoligonucleotid hat eine Länge von vorzugsweise ungefähr 15-40 Nucleotidresten. Es ist denkbar, dass die Sonde so wenig wie ungefähr 10 Nucleotidreste enthält, jedoch umfassen solche kurzen Oligonucleotide mögliche Nachteile wie eine geringe Spezifität, eine geringe Schmelztemperatur und einen erhöhten Hintergrund. Es könnten auch Oligonucleotide mit mehr als 40 Rückständen verwendet werden, jedoch wären sie unnötigerweise teuer. Somit sind die Grenzen der Größe des Sondenoligonucleotids nur durch die Funktionalität festgelegt. Das Sondenoligonucleotid sollte die Mutation umspannen, jedoch entspricht die Mutation vorzugsweise nicht entweder dem 5'- oder dem 3'-terminalen Nucleotidrest der Sonde. Da die vorliegende Erfindung auf Schmelzkurven basiert und das Fehlen einer Basenpaarung an den Enden bekannterweise einen geringeren Effekt auf die Schmelzeigenschaften ausübt als an den inneren Stellen, sollte die Sonde so gestaltet sein, dass die Mutation an der inneren Position stattfindet.
Die Oligonucleotidprimer für eine Amplifikation des ausgewählten Mutationslocus haben vorzugsweise eine Länge von ungefähr 15 bis 30 Resten. Primer, die kürzer als der bevorzugte Bereich sind, könnten verwendet werden, sind jedoch nicht so spezifisch wie gewünscht. Gleichermaßen könnten auch Primer verwendet werden, die länger als der bevorzugte Bereich sind, jedoch wären diese unnötigerweise teuer. Somit sind die Grenzen hinsichtlich der Größe der PCR-Primer lediglich durch ihre Funktionalität festgelegt.
Der Abstand zwischen dem Resonanzenergietransferpaar ist ebenfalls bedeutend für ein ausreichendes Funktionieren der Erfindung. Der optimale Abstand zwischen dem Resonanzenergietransferpaar beträgt ungefähr 5 Nucleotide. Ein Abstand von ungefähr 2 bis 8 Nucleotiden ist bevorzugt, obwohl auch ein Abstand von bis zu ungefähr 10-15 Nucleotiden funktioniert.
Dass das Resonanzenergietransferpaar an benachbarten Nucleotiden liegt, ist nicht notwendigerweise günstig, da der Abstand zwischen dem Resonanzenergietransferpaar durch die Position an der DNA-Helix bewirkt wird.
In diesem Beispiel wurde eine PCR-Amplifikation in einer 10-µl-Reaktionsmischung durchgeführt, die 50 mM an Tris, pH 8,3, 3 mM an MgCl₂, 500 µg/ml an Rinderserumalbumin, 200 µM an jedem dNTP, 0,5 µM an Cy5-markiertem Primer (SEQ ID NO:11), 0,2 µM an nicht markiertem gegenüberliegendem Primer (SEQ ID NO:12), 0,1 µM an Fluorescein-markierter Sonde (SEQ ID NO:13), 0,4 U an Taq-Polymerase und 50 ng an humaner genomischer DNA umfasst. Es wurden vier verschiedene Proben an DNA getestet: humane genomische DNA von einem individuellen Homozygoten für die Faktor V Leiden Mutation; humane genomische DNA von einem heterozygoten Individuum; humane genomische DNA von einem individuellen Homozygoten für den Wildtyp Faktor V Allele; und eine negative Kontrolle ohne DNA. Die Orientierung des Cy5-markierten Primers, der Fluorescein-markierten Sonde und der Mutationsstelle (identifiziert durch einen Stern) werden nachfolgend aufgezeigt:
Die Sequenz des nicht markierten gegenüberliegenden Primers war TGTTATCACACTGGTGCTAA (SEQ ID NO:12) und das amplifizierte Produkt hatte eine Länge von 186 Basenpaaren. Der Cy5-markierte Primer wurde wie in Beispiel 8 erhalten. Die Cyclingbedingungen waren 94 °C während 0 s (Steigung = 20), 50 °C während 10 s (Steigung = 20) und 72 °C während 0 s (Steigung = 1) während 50 Zyklen, gefolgt von einem Kühlen auf 45 °C und einem kontinuierlichen Fluoreszenzmonitoring bei einer Steigung von 0,2 °C/s auf 94 °C für die Schmelzkurve. Die qualitativ hochwertigsten Schmelzkurven wurden am Ende einer Amplifikation mit einer geringen Temperaturübergangsrate (0,2 °C/s 37) erhalten, obwohl ein Monitoring während eines jeden Zyklus bei 1 °C/s zwischen 50 °C und 94 °C auch eine deutliche Genotypidentifikation bereitstellte (38). Die Schmelzkurven sind am einfachsten zu visualisieren durch ein Auftragen der negativen Ableitung der Fluoreszenz nach der Temperatur gegen die Temperatur (-dF/dT gegen T). Eine derartige Auftragung ermöglicht eine einfache visuelle Identifikation aller möglichen Genotypen aus den Fluoreszenzrohdaten.
Je näher sich die Cy5-Markierung am 3'-Ende des Primers befindet, desto größer ist das Resonanzenergietransfersignal. Jedoch muss das 3'-Ende eine freie 3'-Hydroxylgruppe für eine Polymeraseextension aufweisen, und ein zu nahes Anordnen des Cy5 an dem 3'-Ende (entweder an der 3'- oder vorletzten Base) kann ein Anbinden der Polymerase und eine Extension verhindern. Die 3'-Fluoresceinsonde sollte so nahe wie möglich am Primer hybridisieren (eine geringere Überlappung von 1-3 Basen kann toleriert werden) und die Mutationsstelle sollte nahe der Mitte der Sonde liegen. Eine 5-Basentrennung zwischen den hybridisierten Fluorophoren und einer Mutation an der Base 8 einer 23-mer-Sonde ergab eine Schmelzkurvenverschiebung von 8 °C zwischen Mutant- und Wildtyp-Sequenzen (37).
Die Detektion einer Mutation durch ein Sondenschmelzen kann auch mit zwei markierten Sonden anstelle von einer markierten Sonde und einem markierten Primer durchgeführt werden. In dieser Ausführungsform ist eine Sonde 5'-markiert mit Cy5 und die andere Sonde ist 3'-markiert mit Fluorescein. Da beide dieser Fluoreszenzsonden direkt aus den Amiditen synthetisiert werden können, ist kein manueller Syntheseschritt notwendig, wie dies im Primer/Sonden-System erforderlich ist. Die Fluorescein-markierte Sonde sollte derart gestaltet sein, dass der Mutationslocus nahe dem Zentrum der Fluorescein-markierten Sonde liegt. Die Länge der Cy5-markierten Sonde sollte so gestaltet sein, dass sie bei einer höheren Temperatur (>5 °C) als die Fluorescein-markierte Sonde, welche den Mutationslocus umspannt, schmilzt. Da der Hintergrund von Fluorescein problematischer ist als der von Cy5, sollte die Konzentration der Cy5-markierten Sonde 2- bis 5-mal die der Fluorescein-markierten Sonde sein. Die beiden Sonden sollten am selben Strang der genomischen DNA hybridisieren und das Resonanzenergietransferpaar sollte durch ungefähr 0 bis 5 Nucleotidreste getrennt sein. Alternativ dazu kann die Sonde, die die Mutationsstelle umspannt, mit Cy5 markiert sein und kann die andere Sonde mit Fluorescein markiert sein.
Es ist offensichtlich, dass die hierin offenbarten speziellen Sonden und Primer zur Erfassung der Faktor V Leiden Mutation lediglich beispielhaft sind und dass ein Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet in der Lage sein wird, andere Sonden und Primer zur Erfassung von Mutationen ohne unzumutbare Experimente zu entwerfen, indem er den hierin dargelegten Prinzipien und Richtlinien folgt. Es sollte auch darauf hingewiesen werden, dass dieselben Prinzipien auf eine Erfassung in cDNA angewendet werden können, obwohl die Erfindung in Bezug auf eine Erfassung einer einbasigen Mutation in genomischer DNA beschrieben wurde. Die Herstellung der cDNA erfordert zusätzliche Prozessschritte und zusätzliche Zeit, was nach dem Stand der Technik bekannt ist, so dass es bevorzugt ist, genomische DNA aufgrund der Vorteile hinsichtlich der Geschwindigkeit und geringerer Kosten zu verwenden. Darüber hinaus kann dieselbe Technik zur Erfassung von Einfügungen und Löschungen verwendet werden, indem die Hybridisierungssonde so gestaltet wird, dass ihre Schmelztemperatur sich ändert, wenn die Mutation oder der Polymorphismus vorhanden ist. Die Erfindung kann verwendet werden zur Erfassung einer beliebigen bekannten Mutation, bei der eine Sonde entworfen werden kann, die sich bei einer Hybridisierung an den Mutanten gegenüber einer Hybridisierung an den Wildtyp hinsichtlich der Schmelztemperatur unterscheidet.
Obwohl Fluorescein und Cy5 als Resonanzenergietransfermarkierungen in dem obigen Beispiel verwendet wurden, können mit Fluorescein auch andere Akzeptoren wie Cy5.5 verwendet werden.
Beispiel 15
Der Faktor V Locus aus Beispiel 21 wurde wie zuvor amplifiziert, mit der Ausnahme, dass der Primer mit Cy5.5 anstelle von Cy5 markiert wurde. Die Cy5.5-Emission wurde durch einen dichromatischen Langpassfilter mit 683 nm und einen Bandpass-Interferenzfilter mit 683-703 nm beobachtet. Das Verhältnis Cy5.5 zu Fluorescein erhöhte sich über den Hintergrund bei ungefähr 30 Zyklen und das Verhältnis verdoppelte sich ungefähr bei 50 Zyklen einer asymmetrischen Amplifikation. Bei einer Amplifikation mit einer Wildtyp-DNA betrug der Sonden-Tm 65-66 °C, was mittels der Schmelzpeaks beurteilt wurde.
Es wird nun ein weiteres Beispiel zur Erfassung von einbasigen Mutationen gegeben.
Beispiel 16
Es gibt eine übliche Punktmutation in dem Methylentetrahydrofolatreduktase-(MTHFR)-Gen (G₆₇₇T), welche einen Alaninrest zu einem Valinrest umwandelt und zu einem thermolabilen Enzym führt. Diese Mutation kann die MTHFR-Aktivität verringern und führt zu erhöhten Homocysteinplasmaniveaus, was als ein unabhängiger Risikofaktor für frühe Gefäßerkrankungen und Thrombosen angesehen wird, was im Stand der Technik gut bekannt ist. Einer der Primer wurde markiert mit Cy5 (TGAAGGAGAAGGTGTCT*GCGGGA) (SEQ ID NO:25), wobei T* einen modifizierten T-Rest darstellt, der mit Cy5 verbunden ist (siehe Beispiel 9 für die Synthese und Reinigung). Die Sondensequenz war Fluorescein-CCTCGGCTAAATAGTAGTGCGTCGA (SEQ ID NO:26) und der andere Primer war AGGACGGTGCGGTGAGAGTG (SEQ ID NO:27). Aus 50 ng an humaner genomischer DNA wurde ein Fragment des MTHFR-Gens mit 198 Basenpaaren amplifiziert in 50 mM an Tris, pH 8,3, 2 mM an MgCl₂, 500 µg/ml an Rinderserumalbumin, 0,2 mM an jedem dNTP, 0,5 µM des Cy5-markierten Primers, 0,1 µM des gegenüberliegenden Primers, 0,1 µM der Fluorescein-markierten Probe und 0,4 U an Taq-DNA-Polymerase pro 10 µl. Jeder Zyklus besaß eine Länge von 30 s und bestand aus einer Denaturierung bei 94 °C, gefolgt von einem kombinierten Annealing/Extensions-Schritt bei 60 °C während 20 s. Die Temperaturübergangsrate zwischen den Schritten betrug 20 °C/s. Nach 60 Zyklen wurde wie folgt eine Schmelzkurve erhalten: Erwärmen von 50-65 °C bei 0,5 °C/s, 65-75 °C bei 0,1 °C/s und 75-94 °C bei 0,5 °C/s. Nach einer Subtraktion der Grundlinie und einer Umwandlung zu Schmelzpeaks wurden alle möglichen Genotypen einfach unterschieden (39).
Die Unterscheidungsleistung von Hybridisierungssonden wird auch mit großem Vorteil in multiplexer oder kompetitiver PCR eingesetzt. Zum Beispiel wird ein künstliches Templat mit einer einzelnen inneren Basenänderung entworfen und es wird eine Hybridisierungssonde entworfen, um die Basenänderung abzudecken, wie in Beispielen 21 und 23. Eine relative Amplifikation des Kompetitors und des natürlichen Templats werden bestimmt durch Aufnehmen und Integrieren der Schmelzpeaks wie in Beispiel 16. Alternativ dazu wird, wenn Sonden mit multipler Erfassung verwendet werden, die sequentiell für verschiedene Targets bei verschiedenen Temperaturen abschmelzen, eine relative Quantifizierung durch dieselbe Analyse erreicht. Im Allgemeinen kann eine beliebige zuvor für doppelstrangspezifische DNA-Farbstoffe beschriebene Technik mit Hybridisierungssonden sequenzspezifisch gemacht werden.
Absolute Produktkonzentration durch Reassoziationskinetik des Produkts.
Bestimmungen der Produktkonzentration werden mit der vorliegenden Erfindung ebenfalls vorteilhaft durchgeführt. Ein kontinuierliches Monitoring der Bildung doppelsträngiger DNA ermöglicht bei jedem Amplifikationszyklus eine DNA-Quantifizierung durch eine Reassoziationskinetik. Die Probentemperatur wird schnell von der Denaturierungstemperatur abgesenkt und bei einer niedrigeren Temperatur konstant gehalten, die noch hoch genug ist, um ein Primer-Annealing zu verhindern (2). Die Geschwindigkeit der Reassoziation des Produkts folgt einer Kinetik zweiter Ordnung (siehe B. Young & M. Anderson, Quantitative analysis of solution hybridization, In: Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, 47-71, B. Hames & S. Higgins, Hrsg., (1985), welche nun hiermit durch Verweis mitaufgenommen wird). Für jedes gegebene PCR-Produkt und jede gegebene Temperatur kann eine Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung gemessen werden. Wenn die Geschwindigkeitskonstante bekannt ist, kann jede unbekannte DNA-Konzentration aus den experimentellen Reassoziationsdaten bestimmt werden. Das Abkühlen erfolgt nie unmittelbar und ein gewisses Reannealing tritt immer auf, bevor eine konstante Temperatur erreicht wird. Ein schnelles Abkühlen maximiert die Menge der Daten, die für eine Bestimmung der Geschwindigkeitskonstante und der DNA-Konzentration zur Verfügung stehen. Die Methode erfordert ein reines PCR-Produkt, dies kann aber durch Schmelzkurven, die bei der vorliegenden Erfindung ebenfalls während des Thermocyclings erhalten werden, sichergestellt werden. Dieses erfindungsgemäße Verfahren zur Quantifizierung ist in vorteilhafter Weise unabhängig von jeder Schwankung der Signalintensität zwischen den Proben.
Beispiel 17
Ein 536 bp-Fragment des beta-Globingens wurde aus humaner genomischer DNA amplifiziert (Beispiel 7) und gereinigt (siehe Beispiel 2). Verschiedene Mengen der gereinigten DNA wurden mit einer 1:30.000-Verdünnung von SYBR^TM Green I in 5 µl 50 mM Tris, pH-Wert 8,3 und 3 mM MgCl₂ vermischt. Die Proben wurden bei 94 °C denaturiert und anschließend schnell auf 85 °C abgekühlt. Das Fluoreszenzmonitoring bei 520-550 nm erfolgte zeitlich bei 85 °C. Wenn verschiedene DNA-Konzentrationen getestet wurden, war die Form der Reassoziationskurve für die DNA-Konzentration charakteristisch (siehe 40). Für jedes gegebene PCR-Produkt und jede gegebene Temperatur kann eine Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung bestimmt werden. 50 zeigt die Bestimmung einer Geschwindigkeits-konstanten zweiter Ordnung für die Reassoziation für 100 ng des 536 bp-Fragments in 5 µl bei 85 °C. Die Kurve wurde durch nichtlineare Regression nach der Methode der Abweichung der kleinsten Quadrate mit F_max, F_min, t₀ und k als Fließparametern angepasst, wobei die in 41 gezeigte Geschwindigkeitsgleichung zweiter Ordnung verwendet wurde. Analyseprogramme für diese Art von Kurvenanpassung sind im Stand der Technik allgemein bekannt (beispielsweise die benutzerdefinierte Kurvenanpassung von Delta Graph, DeltaPoint, Inc., Monteray, CA). Wenn die Geschwindigkeitskonstante bekannt ist, kann eine unbekannte DNA-Konzentration aus den experimentellen Reassoziationsdaten bestimmt werden.
Mit der definierten Geschwindigkeitskonstanten (k) werden die DNA-Konzentrationen in unbekannten Proben bestimmt. Die Kurven Fluoreszenz gegen Zeit unbekannter Proben werden durch nichtlineare Regression nach der Methode der Abweichung der kleinsten Quadrate, vorzugsweise bei Thermocycling in Echtzeit (beispielsweise mit dem nichtlinearen Levenberg-Marquardt-Verfahren, das in der LabView-Programmierumgebung, National Instruments, Austin, TX, beschrieben ist) angepasst. Bei dieser Anpassung sind F_max, F_min, t₀ und [DNA] die Fließparameter und k ist konstant.
Da einige Fluoreszenzfarbstoffe konzentrationsabhängig das Reannealing beeinflussen, wird die Annahme einer Kinetik zweiter Ordnung für die Reassoziation des Produkts durch Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten bei verschiedenen Konzentrationen einer Standard-DNA überprüft. Die Beziehung ist definiert und bei Bedarf wird eine alternative Formel zur Anpassung inkorporiert.
Die Verwendung von Sondenannealingraten zur Bestimmung von Produktkonzentrationen liegt ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Die Rate des Fluoreszenzresonanzenergietransfers wird nach einem schnellen Abfall auf eine Sondenannealingtemperatur, die größer ist als die Primerannealingtemperatur, über den Lauf der Zeit verfolgt (2). Für den Fall einer Amplifikation mit einem markierten Primer und einer markierten Sonde ist die Annealingrate (und Fluoreszenzerzeugung) von zweiter Ordnung. Wenn zwei markierte Sonden verwendet werden, ist die Rate der Fluoreszenzentwicklung dritter Ordnung. Diese beiden Anordnungen werden in 18 aufgezeigt. Wenn die Konzentration der Sonde(n) viel größer ist (sind) als die Produktkonzentration, sind Gleichungen von pseudo-erster Ordnung und pseudo-zweiter Ordnung angemessen für eine Beschreibung der Möglichkeiten. Die geeigneten Ratengleichungen für diese unterschiedlichen Bedingungen sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe Young, B. und Anderson, M., siehe oben). Für den Zweck dieser Erfindung ist es angemessen, dass der Stand der Technik geeignete Ratengleichungen vorschlägt, die experimentell getestet und, falls notwendig, korrigiert werden.
Wenn Sondenannealingraten zur Bestimmung von Produktkonzentrationen verwendet werden, umfassen mögliche beeinflussende Effekte ein Produktreannealing (mit einer Sondenersetzung durch eine Zweigmigration) und ein Primerannealing und eine Extension durch die Sonde. Letzteres wird minimiert, wenn die Tm der Sonde höher sind als die Tm des Primers und eine Sondenannealingtemperatur gewählt wird, um ein Primerannealing zu minimieren. 13 zeigt auf, dass, sogar wenn eine Extension stattfindet, die Fluoreszenz mit der Zeit während ungefähr 20 s ansteigt. Während dieses Zeitraums ist der Fluoreszenzanstieg von der Produktkonzentration abhängig.
Die Annealinggeschwindigkeiten für die Sonden benutzt, um die Produktkonzentration zu bestimmen, ähnlich dem oben beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der Produktkonzentration durch Produktreassoziation. Die Schritte werden wie folgt zusammengefasst: (1) Wählen der für das System geeigneten Geschwindigkeitsgleichung (2) Laufen lassen bekannter DNA-Standards, um die Geschwindigkeitskonstanten zu bestimmen, (3) Überprüfen der Gültigkeit der Geschwindigkeitsgleichung durch Vergleich verschiedener Geschwindigkeitskonstanten, die sich von verschiedenen Verdünnungen ableiten, und (4) Verwendung der Geschwindigkeitskonstanten zur Bestimmung der DNA-Konzentration von Unbekannten aus deren Daten für das Sondenannealing.
Fluoreszenz-Feedback zur Steuerung des Thermocycling.
Im Gegensatz zur Endpunkt- und Cycle-by-cycle-Analyse kann Fluoreszenzmonitoring mit der vorliegenden Erfindung auch über jeden Temperaturzyklus hinweg erfolgen. Kontinuierliches Fluoreszenzmonitoring kann zur Steuerung der Parameter des Thermocycling genutzt werden. Die vorliegende Erfindung nutzt ein Fluoreszenz-Feedback zur Echtzeitsteuerung und Optimierung der Amplifikation. Kontinuierliches Fluoreszenzmonitoring von PCR-Proben, die einen doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoff oder fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsonden enthalten, kann für ein Monitoring von Hybridisierung und Aufschmelzen während einzelner Amplifikationszyklen verwendet werden. Diese Informationen können von den Algorithmen zur Temperatursteuerung in der Thermocycling-Apparatur verwendet werden, um die Bedingungen für das Thermocycling zu verbessern und für den Benutzer maßzuschneidern. Eine herkömmliche PCR wird durchgeführt, indem man vor der Amplifikation alle Cyclingparameter programmiert. Bei ei nem kontinuierlichen Monitoring kann eine Bestimmung der Erfordernisse für das Thermocycling während der Amplifikation erfolgen, basierend auf einer kontinuierlichen Beobachtung des Annealing, der Extension und der Denaturierung. Die potentiellen Vorteile einer Verwendung von Hybridisierungsinformationen zur Kontrolle des Thermocycling beinhalten:

1. Sicherstellung einer vollständigen Denaturierung des PCR-Produkts in jedem Zyklus und gleichzeitig: a. Minimieren der Exposition von übermäßig hohen Denaturierungstemperaturen um so eine durch Hitze induzierte Schädigung der Amplifikationsprodukte und der Polymerase zu vermeiden. Begrenzen der Dauer, für die das Produkt den Denaturierungstemperaturen ausgesetzt ist, ist besonders nützlich bei der Amplifikation langer Produkte. b. Erhöhen der Reaktionsspezifität durch Minimierung der Denaturierungstemperatur. Dies selektiert gegen Produkte mit einer Tm, die höher ist als die des angestrebten Amplifikationsprodukts.
2. Maximieren der Amplifikationseffizienz durch Sicherstellen einer für das Primerannealing bei jedem Zyklus ausreichenden Zeit und gleichzeitig: a. Minimieren der Zeitdauer, die zur Amplifikation erforderlich ist, indem man das Primerannealing nicht länger als nötig erlaubt, um eine bestimmte Effizienz zu erreichen. b. Verbesserung der Reaktionsspezifität durch Minimieren der Zeitdauer bei Annealingtemperatur.
3. Maximieren der Amplifikationseffizienz durch Sicherstellen einer für die Extension bei jedem Zyklus ausreichenden Zeit und gleichzeitig: a. Minimieren der Zeitdauer, die zur Amplifikation erforderlich ist, indem man nicht mehr Zeit als nötig erlaubt, um die Produktextension abzuschließen. b. Verbesserung der Reaktionsspezifität, indem man gegen Produkte selektioniert, die länger sind als das angestrebte Amplifikations produkt. Diese würden mehr als die zugeteilte Zeit brauchen, um die Produktextension abzuschließen.
4. Initiieren von Änderungen beim Thermocycling in Abhängigkeit von der erhaltenen Fluoreszenzstärke oder der momentanen Amplifikationseffizienz. Beispielsweise können Überamplifikation und unspezifische Reaktionsprodukte minimiert werden, indem man das Thermocycling beendet, wenn die Effizienz auf einen bestimmten Wert fällt. Als weiteres Beispiel können die Temperaturwechsel modifiziert werden, um langsamere Temperaturanstiege zur Aufnahme von Schmelzkurven zu initiieren, wenn die Fluoreszenz nachweisbar wird. Dies spart Zeit, weil die langsameren Anstiege nicht bei früheren Zyklen verwendet werden müssen. Andere wünschenswerte Veränderungen werden bei der weiteren Ausführung der Erfindung deutlich.

Die Steuerung basiert auf einer Abschätzung der Reaktionsparameter aus den Fluoreszenzdaten. Die originären Fluoreszenzdaten werden entweder als Änderung der Fluoreszenz mit der Zeit (temperaturspezifische Geschwindigkeiten von Denaturierung, Annealing und Extension), als Änderung der Fluoreszenz mit der Temperatur (Produkt- oder Sonden-Tm) oder als Änderung in der Stärke der Amplifikation (Amplifikationsausbeute und -effizienz) erhalten. Diese Geschwindigkeiten, Tm und ihre ersten und zweiten Ableitungen werden verwendet, um die optimalen Reaktionsparameter zu bestimmen, welche Temperatur und Zeit für die Denaturierung, Temperatur und Zeit für das Primerannealing, Temperatur und Zeit für das Sondenannealing, Temperatur und Zeit für die enzymatische Extension und die Zyklenzahlumfassen.
Doppelstrangspezifische DNA-Farbstoffe werden zur Kontrolle der Denaturierung, zur Kontrolle der Extension und zur Initiierung von Änderungen im Thermocycling bei einer bestimmten Amplifikationshöhe oder -effizienz verwendet. Zur Steuerung des Annealing werden Resonanzenergietransferfarbstoffe verwendet, was nach dem folgenden Beispiel beschrieben wird.
Beispiel 18
Ein kommerziell erhältlicher Thermocycler zum Fluoreszenzmonitoring (LC24 LightCycler, Idaho Technology Inc., Idaho Falls, Idaho) wurde so modifiziert, dass die Software nicht länger mit Temperatur/Zeit-Sollwerten programmiert ist, sondern auf die Erfassung der Fluoreszenzwerte programmiert ist, um diese Werte anschließend zur Steuerung des Thermocyclers zu verwenden.
Wie im Funktionalen Blockdiagramm (42) dargestellt ist, kommuniziert das Lauf-Zeit-Programm über serielle und DAQ-Board-Schnittstellen mit dem LightCycler. Dies ermöglicht einen Zugriff auf entweder Temperatur- oder Fluoreszenzdaten auf höchster Ebene und kann auch von der Board-Level-Software zur Temperatursteuerung verwendet werden. In der vorliegenden Ausführungsform des Geräts werden jedoch nur die Temperaturdaten auf der Controller-Hardware-Ebene in die digitale Form umgewandelt. Die Fluoreszenzdaten werden in analoger Form durch die Schnittstelle des Boards zur digitalen Erfassung geschickt, mit dem Lauf-Zeit-Programm analysiert und über die serielle Schnittstelle zur Board-Level-Software zurückgeschickt.
Steuerung des Aufschmelzens von Produkt:
Für das angestrebte PCR-Produkt wurde ein Schmelzpeak aufgenommen und für die Probe, die den Reaktionscocktail enthielt, wurde bei der Temperatur, bei der das Produkt vollständig geschmolzen war, eine Baseline-Fluoreszenz erfasst.
Jeder Zyklus der Reaktion verwendtae dann diesen Fluoreszenzwert als Sollwert. Die Annäherung an die Denaturierung des Produkts erfolgte in zwei Stufen, um die durch die Notwendigkeit begründete Zeitverzögerung zu umgehen, den Fluoreszenzwert zur Analyse zu einem entfernten Computer zu senden und anschließend die Anweisung, dass der Wert erreicht worden war, zurückzusenden. Mit jedem Schritt zum Schmelzen des Produkts wurde die Temperatur erhöht, bis die Fluoreszenz einen Zwischenwert erreichte, dann wurde die Heizstärke so reduziert, dass eine Temperaturanstiegsgeschwindigkeit von ungefähr 3 °C/s dem Computer die Zeit ließ, die Fluores zenz zu analysieren und dem Thermocycler das Signal zu geben, dass eine Produktdenaturierung stattgefunden hatte.
Das resultierende Temperatur/Zeit-Diagramm (43) zeigt einen charakteristischen Anstieg der Schmelztemperatur nach Zyklus 20, wenn die Konzentration des Amplifikationsprodukts ansteigt. Die Tm des Produkts ist eine Funktion der Produktkonzentration.
Produkt-Annealing/Extension:
Das Fluoreszenzmonitoring erfolgte bei einer längeren Haltezeit bei einer kombinierten Annealing/Extensionstemperatur und diese Information wurde verwendet um sicherzustellen, dass eine ausreichende, aber nicht übermäßige Zeit für die Produktextension erlaubt worden war. Das Fluoreszenzmonitoring erfolgte in Abständen von 10 Sekunden, wenn die Fluoreszenz höher als ein einstellbares Verhältnis (üblicherweise 1,00-1,05) anstieg, und dann wurde der Annealing/Extensionsschritt fortgesetzt. Ansonsten wurde der nächste Schritt zum Schmelzen des Produkts initiiert. Das Intervall von 10 Sekunden wurde gewählt, um bei der kombinierten Annealing/Extensionstemperatur ein Minimum von 20 Sekunden zu haben.
Das resultierende Fluoreszenz/Zeit-Diagramm (43) zeigt einen charakteristischen Anstieg in der Verweilzeit bei der kombinierten Annealing/Extensionstemperatur, wenn die Konzentration des Amplifikationsprodukts zunimmt. Da die Primerkonzentration und die Polymerase limitierend werden, wird bei jedem Zyklus mehr Zeit zur Beendigung der Produktextension benötigt.
Amplifikationsplateau:
Am Ende jedes Annealing/Extensionsschritts wurde der Fluoreszenzwert erfasst und gespeichert. Wenn dieser Wert auf das 1,2-fache des niedrigsten Fluoreszenzwerts am Ende eines Zyklus angestiegen war und danach unterhalb eines vom Benutzer einstellbaren Verhältnisses (üblicherweise 1,00-1,02) aufgehört hatte, zu steigen, wurde das Thermocycling beendet. Dazu wurde ein Schritt zur Erfassung der Schmelzkurven initiiert, indem ein langsamer Temperaturanstieg von 0,1-0,2 °C/Sekunde über die Produkt-Tm hinweg eingegeben und ein kontinuierliches Fluoreszenzmonitoring der Probe durchgeführt wurde.
Das resultierende Fluoreszenz/Zeit-Diagramm (43) zeigt, dass das Verhältnis der Cycle-by-cycle-Zunahme der Fluoreszenz nach 25 Amplifikationszyklen unter 1,00 fiel und die Reaktion beendet war.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Nachweis des Amplifikationsplateaus verwendet, um in einem Versuch mit mehreren Proben bei einem für jede Probe optimalen Temperaturzyklus für jede Probe hochaulösende Schmelzkurven zu erfassen. Wenn eine Probe ihr Amplifikationsplateau erreicht, wird für diese Probe eine Schmelzkurve aufgenommen, anschließend wird das reguläre Thermocycling wieder aufgenommen, bis eine andere Reaktion ihr Amplifikationsplateau erreicht.
Durch die vorliegende Erfindung wird auch Echtzeitmonitoring und eine Annealingsteuerung, die von einer Extension verschieden ist, bereitgestellt. Wenn einer der Primer 3'-markiert ist mit Cy5, kann keine Extension stattfinden. Wenn jedoch markierter Primer (1-10 %) gemischt wird mit nicht markiertem Primer (90-99 %), wird die Amplifikationseffizienz geringfügig abfallen, jedoch ist ein Annealing als ein Fluoreszenzenergietransfer von einem doppelstrangspezifischen Farbstoff auf Cy5 beobachtbar. Der Primer mit der geringsten Tm (bestimmt durch die Thermodynamik des nächsten Nachbarn, was im Stand der Technik bekannt ist) wird mit Cy5 markiert und SYBR^TM Green I wird als ein doppelstrangspezifischer Farbstoff eingeschlossen. Alternativ dazu kann ein Primerannealing indirekt mit äquivalenten komplementären Oligonucleotiden beobachtet werden. Ein Oligonucleotid derselben Menge und derselben Tm wie der am niedrigsten schmelzende Primer wird mit keiner Komplementarität zu der amplifizierten Sequenz entworfen. Dieses Oligonucleotid ist 5'-markiert mit Cy5 und sein Komplement ist 3'-markiert mit Fluorescein oder einem anderen Resonanzenergietransferpaar. Eine Hybridisierung dieser Oligonucleotide wird gefolgt von einem Resonanzenergietransfer. Die Konzentration von einer Sonde wird gleich der Konzentration des Primers mit der niedrigsten Tm gemacht und die Konzentration der anderen Sonde wird deutlich geringer als diese gemacht, um Kinetiken von pseudo-erster Ordnung zu erhalten, welche sich der Kinetiken von pseudo-erster Ordnung des Primerannealing an das Produkt annähern. Die Effizienz des Annealing wird überwacht und zur Steuerung der Annealingtemperatur und -zeit mittels eines dieser Verfahren verwendet.
Innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegt auch ein Ersetzen der gesamten Temperatur- und Zeit-Einstellpunkte durch eine Fluoreszenz-Feedbacksteuerung. Es werden zum Beispiel drei Proben in einen Fluoreszenztemperaturcycler mit Feedback-Kapazität gegeben. Die Proben sind:

1. eine nichtreagierende Probe, die amplifiziertes Produkt und SYBR^TM Green I enthält;
2. eine nichtreagierende Probe, die komplementär fluoreszierend markierte Primer mit einer Tm, die gleich dem Primer mit der niedrigsten Tm ist, und wie oben angegebene Konzentrationen enthält;
3. die zu amplifizierende Probe und SYBR^TM Green I.

Mit jedem Zyklus der Amplifikation wird eine Produktdenaturierung durch Überwachen der Probe 1 sichergestellt, wenn die Temperatur erhöht wird. Es wird in Echtzeit eine Schmelzkurve bestimmt, und wenn die Probe denaturiert wurde, wird der Übergang zum Annealingschritt begonnen. Ein Primerannealing wird indirekt durch die Hybridisierung von zwei komplementären Primern in der Probe 2 überwacht. Einer der Primer ist 3'-markiert mit Fluorescein, der andere ist 5'-markiert mit Cy5 oder einem ähnlichen Farbstoff. Die Temperatur wird verringert, bis die Probe 2 eine Primerhybridisierung zeigt, was angezeigt wird durch eine Erhöhung des Verhältnisses der Fluoreszenz bei 670 nm/540 nm. Dieses Verhältnis erhöht sich aufgrund des Resonanzenergietransfers zwischen den Fluorophoren, wenn diese durch Hybridisierung angenähert werden. Eine Produktextension wird gefolgt von einem Monitoring der Fluoreszenz von einer oder mehreren der aktuellen Proben, was in Beispiel 25 demonstriert wird.
Zusammenfassung.
Aus der vorhergehenden Diskussion wird deutlich, dass kontinuierliches Fluoreszenzmonitoring bei der DNA-Amplifikation zum Monitoring von Hybridisierung eine außergewöhnlich leistungsstarke analytische Methode ist. Mit den hier beschriebenen Verfahren und abhängig von der Zahl der zu Anfang vorhandenen Templatkopien, kann man in fünf bis zwanzig Minuten nach Beginn des Thermocycling eine Identifizierung und Quantifizierung des Produkts erreichen. Die vorliegende Erfindung bietet verschiedene Vorteile, die im Stand der Technik bislang nicht möglich waren. Die vorliegende Erfindung stellt beispielsweise Verfahren mit Einfarbenfluoreszenz zum Monitoring der Produktreinheit, zur relativen Quantifizierung mit Multiplex-PCR oder kompetitiver PCR, zur absoluten Produktquantifizierung mittels Reassoziationskinetik bereit, und ein verbessertes Verfahren zur Quantifizierung von anfänglichem Templat durch Diagramme von Fluoreszenz gegen Zyklenzahl. Die vorliegende Erfindung stellt auch zweifarbige, sequenzspezifische Verfahren zur Erfassung einer Sequenzvariation, zur relativen Quantifizierung mit Multiplex-PCR oder kompetitiver PCR, zur Produktquantifizierung durch Sondenannealingkinetiken und zur Quantifizierung von anfänglichem Templat durch Auftragungen der Fluoreszenz gegenüber der Zyklenzahl zur Verfügung.
Die folgende Tabelle vergleicht doppelstrangspezifische DNA-Farbstoffe, Hydrolysesonden und Hybridisierungssonden, die sich zum kontinuierlichen Monitoring von PCR eignen. Die Fluoreszenz doppelstrangspezifischer DNA-Farbstoffe hängt vom Strangstatus der DNA ab. Die zweifach markierten Hydrolysesonden werden gequencht, während sie intakt sind, und die Donorfluoreszenz steigt an, wenn die Sonde hydrolysiert wird. Hybridisierungssonden sind abhängig von einem erhöhten Resonanzenergietransfer, wenn die Hybridisierung zwei Fluorophore näher zusammenbringt.
Zusammenfassung der Fluoreszenzsonden zum kontinuierlichen Monitoring von PCR
Es werden Zeit, Temperatur und Fluoreszenz 1-10mal pro s erfasst und bei den Temperaturwechseln werden Feindetails von Produkt- und/oder Sondenhybridisierung beobachtet. Mit dem doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoff SYBR^TM Green I wird die Produkthybridisierung bezogen auf die Temperatur verwendet, um Produkte mit Hilfe der Schmelzkurven zu bestimmen. Zudem erreicht man eine relative Quantifizierung von Produkt durch Multiplex-Amplifikation zweier oder mehrerer verschiedener Produkte, die sich in der Tm unterscheiden. Ferner führt man eine kompetitive PCR durch, indem man die Sequenz innen in den gemeinsamen Primern so ändert, dass zwei oder mehr Produkte verschiedene Tm aufweisen. Eine absolute Produktquantifizierung erhält man durch schnelles Abkühlen des denaturierten Produkts und Beobachten der Reassoziationskinetik. Die Empfindlichkeit der Quantifizierung von anfänglichem Templat mit Diagrammen von Fluoreszenz gegen Zyklenzahl wird durch Analyse der Produktschmelzkurven zur Kontrolle auf unspezifische Amplifikation und durch Algorithmen zur Kurvenanpassung erhöht. Schließlich erhält man ein unmittelbares Fluoreszenz-Feedback zur Steuerung von Denaturierungsbedingungen, Elongationszeiten und der Produktausbeute durch Monitoring des Strangstatus des Produkts mit doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffen.
Die Fähigkeit zur Überwachung einer Sondenhybridisierung mit Fluoreszenz während eines Temperaturcycling ist ein mächtiges Werkzeug. Die vorliegende Erfindung stellt Zweifarbfluoreszenzverfahren zur Verfügung, die abhängig sind von einer Sondenhybridisierung (nicht einer Hydrolyse) für ei ne sequenzspezifische Erfassung und Quantifizierung während einer PCR. Die Annealingkinetiken und das Schmelzen von Hybridisierungssonden stellen Informationen zur Verfügung, die nicht verfügbar sind bei Sonden, die sich auf eine Exonucleasehydrolyse zwischen Fluorophoren stützen. Ein kontinuierliches Monitoring einer sequenzspezifischen Sondenhybridisierung kann mittels Resonanzenergietransfer über Temperaturänderungen verfolgt werden. Es findet ein Sondenschmelzen bei einer charakteristischen Temperatur statt, die bestimmt wird durch ihre Sequenz und Komplementarität zu dem Produkt. Es wurden für die vorliegende Erfindung zwei Schemata ausführlich beschrieben, (1) zwei benachbarte Hybridisierungssonden und (2) eine markierte Sonde, die an einem einsträngigen PCR-Produkt hybridisiert, das einen markierten Primer enthält. Die Schmelztemperatur von sequenzspezifischen Sonden identifiziert und unterscheidet Produkte während einer PCR. Durch eine Verschiebung der Tm einer Sonde werden DNA-Polymorphismen oder Mutationen, einschließlich einbasiger Mutationen, erfasst. Darüber hinaus ist durch eine multiplexe Amplifikation von zumindest zwei verschiedenen Produkten mit einer oder mehreren Sonden, die bei verschiedenen Temperaturen von ihren entsprechenden Produkten schmelzen, eine relative Produktquantifizierung erreicht. Ferner wird eine kompetitive PCR durchgeführt durch Verändern der inneren Sequenz der Primer, so dass eine oder mehrere Sonden bei unterschiedlichen Tm an den Kompetitor und das natürliche Templat hybridisieren. Alternativ dazu wird eine relative oder kompetitive PCR durchgeführt durch Mehrfarbanalysen mit Sonden, die mit unterschiedlichen Fluorophoren markiert sind, wie Cy5 und Cy5.5. Eine absolute Produktkonzentration wird durch Analyse der Sondenannealingkinetiken bestimmt. Die anfängliche Templatkopienzahl wird bestimmt aus Auftragungen der Fluoreszenz gegenüber der Zyklenzahl mittels eines Kurvenanpassungsalgorithmus.
Wenn eine Mulitplex-Analyse in einer PCR-Reaktion erwünscht ist, ist es üblich, zur Identifizierung mehrerer Produkte verschiedene Fluoreszenzmarker mit unterscheidbaren Emissionsspektren zu verwenden. Die Analyse wird durch die begrenzte Zahl verfügbarer Fluorophore und die überlappenden Emissionsspektren der verfügbaren Fluorophore kompliziert (siehe HM Shapiro, siehe oben). Die Analyse der Produkt- oder Sondenhybridisierung mit Hilfe von Schmelzkurven stellt ein weiteres Verfahren zur Unterschei dung multipler PCR-Produkte dar. Durch Verfolgen der Hybridisierung bei Temperaturwechseln kann die Anzahl an Sonden und/oder Spektralfarben, die zur Unterscheidung multipler Produkte notwendig sind, minimiert werden.
Die vorliegende Erfindung kann in anderen spezifischen Formen ausgeführt werden, ohne von ihrem Geist oder wesentlichen Charakteristiken abzuweichen. Die beschriebenen Ausführungsformen sind in jeglicher Hinsicht lediglich als veranschaulichend und nicht einschränkend anzusehen. Der Umfang der Erfindung wird daher vielmehr durch die anhängenden Ansprüche als durch die vorangegangene Beschreibung angegeben.

Claims

Ein Fluoreszenzresonanzenergietransferpaar zur Erzeugung eines Fluoreszenzsignals unter vorbestimmten Bedingungen, wobei das Paar ein Donorfluorophor mit einem Emissionsspektrum und ein Akzeptorfluorophor mit einem Absorptionsspektrum und einem Extinktionskoeffizienten von größer als 1000.000 M^–1 cm^–1 umfasst, wobei das Emissionsspektrum des Donorfluorophors und das Absorptionsspektrum des Akzeptorfluorophors mit weniger als 25 % überlappen, und wobei unter vorbestimmten Bedingungen das Donorfluorophor sich in einer Fluoreszenzresonanzenergietransferbeziehung mit dem Akzeptorfluorophor befindet, wobei das Donorfluorophor und das Akzeptorfluorophor als Markierungen auf einem oder zwei Oligonucleotiden bereitgestellt werden.
Das Fluoreszenzresonanzenergietransferpaar nach Anspruch 1, wobei das Donorfluorophor Fluorescein ist und das Akzeptorfluorophor Cy5 oder Cy5.5 ist.
Das Fluoreszenzresonanzenergietransferpaar nach den Ansprüchen 1 oder 2, wobei das Donorfluorophor als eine Markierung auf einem ersten Oligonucleotid bereitgestellt wird und das Akzeptorfluorophor als eine Markierung auf einem zweiten Oligonucleotid bereitgestellt wird.
Das Fluoreszenzresonanzenergietransferpaar nach Anspruch 3, wobei die vorbestimmten Bedingungen eine Hybridisierung des ersten und zweiten Oligonucleotids an eine Zielsequenz einschließen.
Das Fluoreszenzresonanzenergietransferpaar nach Anspruch 3, wobei das erste Oligonucleotid ein Primer für eine Polymerasekettenreaktion ist und die vorbestimmten Bedingungen eine Hybridisierung des zweiten Oligonucleotids an ein Amplifikationsprodukt, welches das erste Oligonucleotid umfasst, einschließt.
Das Fluoreszenzresonanzenergietransferpaar nach den Ansprüchen 1 oder 2, wobei das Donorfluorophor und das Akzeptorfluorophor auf einer einzelnen Oligonucleotidsonde bereitgestellt und in der Fluoreszenzresonanzenergietransferbeziehung gehalten werden, wobei die Oligonucleotidsonde eine Spezifität für eine Zielsequenz aufweist und das Donorfluorophor und das Akzeptorfluorophor durch eine 5'-Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase während der Amplifikation der Zielsequenz in der Gegenwart der Oligonucleotidsonde von der Fluoreszenzresonanzenergietransferbeziehung getrennt sind.
Das Fluoreszenzresonanzenergietransferpaar nach Anspruch 2, wobei das Donorfluorophor Fluorescein ist und das Akzeptorfluorophor Cy5.5 ist.
Das Fluoreszenzresonanzenergietransferpaar nach den Ansprüchen 1 oder 2, wobei das Emissionsspektrum des Donorfluorophors und das Absorptionsspektrum des Akzeptorfluorophors mit ungefähr 15 % überlappen.
Das Fluoreszenzresonanzenergietransferpaar nach Anspruch 8, wobei das Donorfluorophor Fluorescein ist und das Akzeptorfluorophor Cy5.5 ist.