CN103797132A - G形夹用于改进的等位基因特异性pcr的用途 - Google Patents

Abstract

本发明包括利用等位基因特异性寡核苷酸的等位基因特异性扩增方法，所述等位基因特异性寡核苷酸与靶序列的多于一种变体至少部分互补，但具有与靶序列的仅一种变体互补的至少一个选择性核苷酸，并且掺入至少一个“G形夹”核苷酸。

Description

G形夹用于改进的等位基因特异性PCR的用途

发明领域

本发明涉及核酸扩增领域且具体地涉及等位基因特异性扩增领域。

发明背景

核酸的等位基因特异性扩增允许靶序列的同时扩散和分析。在怀疑靶核酸在其序列中具有一个或多个具有变异（多态性）的亚群时，通常使用等位基因特异性扩增。DNA多态性用于DNA概况分析（法医取证、亲权认定、用于器官移植的组织分型）、遗传作图以及罕见突变的检测，所述罕见突变例如在具有正常DNA的细胞背景中的癌细胞中出现的那些。

在成功的等位基因特异性扩增中，靶核酸的所需变体被扩增，而其他变体则未被扩增，至少未扩增到可检测水平。一般的等位基因特异性扩增测定涉及聚合酶链反应（PCR），其中至少一条引物与具有可疑多态性的区域互补。等位基因特异性引物的设计使得引物延伸仅在存在多态性的某一变体时才发生。以其最简单的形式，等位基因特异性引物具有与靶中的多态性核苷酸的所需变体互补的3'末端核苷酸。通常在引物3'末端处的单个错配足以排除靶序列的不需要变体的扩增。然而，扩增的特异性在不同3'末端序列中变化极大：一些错配有效阻断通过聚合酶的延伸，而其他则不会，参见美国专利号5,639,611。

等位基因鉴别的成功取决于DNA聚合酶延伸错配引物的无能性（inability）。DNA聚合酶的这种无能性可以通过调整反应条件来进行调节以达到最大选择性。然而，对于许多多态性序列而言，等位基因特异性PCR低选择性仍是个问题。

增加特异性的一种方法涉及改造具有一个或多个内部错配核苷酸的扩增引物。这种方法在一些系统中证明是成功的，参见美国专利5,137,806。

增加特异性的另一种方法涉及引物的化学修饰。例如，发现引物中的一些核苷酸的脱氧核糖的某些2'-C和4'-C修饰增强通过聚合酶的等位基因鉴别，参见Gaster，J.和Marx，A.（2005）Chem. Eur. J. 11:1861-1870。在另一项研究中，发现等位基因鉴别通过在引物的核苷酸之一中使用非天然嘧啶碱基得到增强，特别是在嘧啶环的6位置中具有多个取代基的假异胞苷（pseudoisocytidine），参见美国专利号7,408,051。

在实时等位基因特异性PCR的背景下，测定的选择性可以测量为匹配和错配模板之间的阈值循环数目（Ct）中的差异。更大的差异指示错配模板扩增中的更大延迟和因此等位基因之间的更大区别。经修饰的脱氧核糖已显示导致在1-14个循环的Ct差异。假异胞苷的使用导致错配模板的扩增中7个循环的延迟。这种鉴别程度对于许多应用（其中样品含有均竞争扩增的模板的几种变体）而言是不足够的。通常错配模板以比匹配模板大得多的量存在。例如，在组织样品中，仅小部分细胞可以是恶性的且携带由等位基因特异性扩增测定靶向的突变（“匹配模板”）。在正常细胞中存在的模板可能以更低的效率被扩增，但极大数目的正常细胞将克服扩增中的任何延迟且消除突变型模板的任何优势。为了在野生型模板的存在下检测罕见突变，等位基因特异性扩增测定的特异性需要得到改进。

已提出了增强引物的等位基因特异性的许多方法。然而，对于许多临床上相关的核酸靶，PCR特异性的缺乏仍是问题。因此，设计等位基因特异性引物的新方法是必需的。

G形夹（G-clamp）是图1中所示的三环氨基乙氧基-吩噁嗪-2'-脱氧胞苷，其是胞嘧啶类似物。当掺入寡核苷酸内时，G形夹同时识别螺旋内的互补鸟嘌呤的Watson-Crick面和Hoogsteen面。因此，当与互补DNA和RNA链杂交时，含G形夹寡核苷酸充分增强螺旋热稳定性和错配区别。这些增强的亲和力和特异性的性质在基于核酸的诊断学和通过反义方法的RNA序列特异性靶向领域中是有利的。G形夹和相关嘧啶衍生物的进一步特征公开于美国专利号6,414,127、美国专利号6,951,931、美国专利号7,511,125和美国专利号RE39,324中。

发明概述

在第一个方面，本发明涉及靶序列变体的等位基因特异性扩增的方法，该靶以几种变体序列的形式存在，该方法包括（a）使第一和第二寡核苷酸与靶序列的至少一种变体杂交；其中第一寡核苷酸与靶序列的一种或多种变体至少部分互补，并且第二寡核苷酸与靶序列的一种或多种变体至少部分互补，并且具有与靶序列的仅一种变体互补的至少一个选择性核苷酸；其中第二寡核苷酸掺入至少一个“G形夹”核苷酸；（b）用核酸聚合酶延伸第二寡核苷酸，其中当第二寡核苷酸与和至少一个选择性核苷酸互补的靶序列变体杂交时，所述聚合酶能够有效延伸第二寡核苷酸，并且当第二寡核苷酸与和至少一个选择性核苷酸不互补的靶序列变体杂交时，则延伸效率明显更低。

在第二个方面，本发明涉及用于靶序列的等位基因特异性扩增的试剂盒，该靶以几种变体序列的形式存在，该试剂盒包含：（a）第一寡核苷酸，其与靶序列的一种或多种变体至少部分互补；和（b）第二寡核苷酸，其与靶序列的一种或多种变体至少部分互补，并具有与靶序列的仅一种变体互补的至少一个选择性核苷酸；其中第二寡核苷酸掺入至少一个“G形夹”核苷酸。

在第三个方面，本发明涉及用于进行靶序列的等位基因特异性扩增的寡核苷酸，该靶以几种变体序列的形式存在，该寡核苷酸包含：（a）与所述靶序列的一种或多种变体的部分至少部分互补的序列；（b）与靶序列的仅一种变体互补的至少一个选择性核苷酸；（c）至少一个“G形夹”核苷酸。

在第四个方面，本发明涉及用于靶序列的等位基因特异性扩增的反应混合物，该靶以几种变体序列的形式存在，该混合物包含：（a）第一寡核苷酸，其与靶序列的一种或多种变体至少部分互补；和（b）第二寡核苷酸，其与靶序列的一种或多种变体至少部分互补，但具有与靶序列的仅一种变体互补的至少一个选择性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸掺入至少一个“G形夹”核苷酸。

附图简述

图1显示了脱氧鸟嘌呤和脱氧胞苷之间（A）以及脱氧鸟嘌呤和G形夹之间（B）的氢键相互作用。

图2（A-C）显示了野生型人EGFR基因（SEQ ID NO: 1）的编码序列。

发明详述

定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。在描述和请求保护本发明中，将使用下述定义。

术语“核酸”指核苷酸（例如核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物等）聚合物，并且包含脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）、DNA-RNA杂交物、寡核苷酸、多核苷酸、适体、肽核酸（PNA）、PNA-DNA缀合物、PNA-RNA缀合物等，其包含以线性（linear）或分支（branched）方式共价连接在一起的核苷酸。核酸一般是单链或双链的，并且一般含有磷酸二酯键，尽管在一些情况下，包括可以具有替代骨架的核酸类似物，包括例如磷酰胺（Beaucage等人（1993）Tetrahedron 49（10）:1925）；硫代磷酸酯（Mag等人（1991）Nucleic Acids Res. 19:1437；和美国专利号5,644,048）、二硫代磷酸酯（Briu等人（1989）J. Am. Chem. Soc. 111:2321）、O-甲基亚磷酰胺连接（参见Eckstein，Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach，Oxford University Press（1992））、和肽核酸骨架和连接（参见Egholm（1992）J. Am. Chem. Soc. 114:1895）。其他类似物核酸包括具有带正电荷骨架的类似物核酸（Denpcy等人（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097）；非离子骨架的类似物核酸（美国专利号5,386,023，5,637,684，5,602,240，5,216,141和4,469,863）和非核糖骨架的类似物核酸，包括在美国专利号5,235,033和5,034,506中描述的类似物核酸。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义内（参见Jenkins等人（1995）Chem. Soc. Rev. 第169-176页），并且类似物还在例如Rawls，C & E News Jun. 2，1997，第35页中描述。可以完成磷酸核糖骨架的这些修饰，以促进另外部分例如标记的添加，或改变此类分子在生理环境中的稳定性和半衰期。

除了一般在核酸中发现的天然存在的杂环碱基（例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶）外，核苷酸类似物也可以包括非天然存在的杂环碱基，例如在Seela等人（1999）Helv. Chim. Acta 82:1640中所述的那些。在核苷酸类似物中使用的某些碱基充当解链温度（Tm）改性剂。例如，这些中的一些包括7-脱氮嘌呤（例如7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤等）、吡唑并[3,4-d]嘧啶、丙炔基-dN（例如丙炔基-dU、丙炔基-dC等）等，参见例如美国专利号5,990,303。其他代表性杂环碱基包括例如次黄嘌呤、肌苷、黄嘌呤；以下碱基的8-氮杂衍生物：2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤；以下碱基的7-脱氮-8-氮杂衍生物：腺嘌呤、鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤；6-氮杂胞苷；5-氟胞苷；5-氯胞苷；5-碘胞苷；5-溴胞苷；5-甲基胞苷；5-丙炔基胞苷；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶等。

“核苷”指包含与糖部分（核糖或脱氧核糖）、糖部分的衍生物、或糖部分的功能等同物（例如碳环）共价连接的碱基或碱性基团（包含至少一个同素环、至少一个杂环、至少一个芳基，等等（and/or the like））的核酸组分。例如，当核苷包括糖部分时，碱基一般连接至该糖部分的1'-位置。如上所述，碱基可以是天然存在的碱基或非天然存在的碱基。示例性核苷包括核糖核苷、脱氧核糖核苷、双脱氧核糖核苷和碳环核苷。

“核苷酸”指核苷的酯，例如核苷的磷酸酯，其具有共价连接至核苷糖部分的5'位置的一个、两个、三个或更多个磷酸基。

“嘌呤核苷酸”指包含嘌呤碱基的核苷酸，而“嘧啶核苷酸”指包含嘧啶碱基的核苷酸。

“G形夹”核苷酸指胞嘧啶类似物，9-(氨基乙氧基)-吩噁嗪-2'-脱氧胞苷，并且公开于US 6,414,127中。

“寡核苷酸”指包括至少两个，但一般为5-50个核苷酸且更一般为15-35个核苷酸的核酸聚合物。寡核苷酸的确切大小通常取决于多种因素，包括寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以通过本领域已知的任何合适方法进行制备，包括例如合适序列的克隆和限制性消化，或通过诸如下述方法的直接化学合成：Narang等人（1979）Meth. Enzymol. 68:90-99的磷酸三酯法；Brown等人（1979）Meth. Enzymol. 68:109-151的磷酸二酯法；Beaucage等人（1981）Tetrahedron Lett. 22:1859-1862的二乙基亚磷酰胺法；Matteucci等人（1981）J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191的三酯法；自动合成法；美国专利号4,458,066的固体载体法或本领域已知的任何其他化学方法。

“引物核酸”或“引物”是可以与模板核酸杂交且允许使用核苷酸掺入生物催化剂的链延伸或延长的寡核苷酸。尽管有时利用其他引物长度，但引物一般范围为15-35个核苷酸。短引物核酸一般利用更冷的温度，以与模板核酸形成足够稳定的杂交复合物。与模板核酸的子序列至少部分互补的引物核酸一般足以与模板核酸杂交以发生延伸。然而，延伸的成功通常需要在引物的3'端处更大的互补性（即与模板的更少错配）。需要时，引物核酸可以通过掺入标记进行标记，所述标记可通过放射学、光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学技术检测。

“延伸的引物”指一个或多个另外的核苷酸已加入其中的引物。“引物延伸”是另外的核苷酸通过其加入引物中的酶的作用。

“模板核酸”、“模板”或“靶”指引物核酸在合适条件下可以与之杂交且延伸的核酸。在核酸扩增的背景下，“靶”优选是双链核酸的区域，由与至少两条引物序列至少部分互补的序列及间插序列组成。靶还可以是单链核酸，由与一条引物至少部分互补的序列和与第二条引物部分相同的序列组成。模板核酸可以作为分离的核酸片段存在或可以是大核酸片段的部分。靶核酸可以衍生自或分离自基本上任何来源，例如培养的微生物、未培养的微生物、复杂的生物混合物、组织、血清、古老的或保存的组织或样品、环境分离物等。进一步地，模板核酸任选包括或来源于cDNA、RNA、基因组DNA、克隆的基因组DNA、基因组DNA文库、酶促断裂的DNA或RNA、化学断裂的DNA或RNA、物理断裂的DNA或RNA等。模板核酸还可以使用本领域已知的技术化学合成。

如本文使用的，“基因”指与生物功能相关的DNA的任何区段。因此，基因包括编码序列并任选包括编码序列表达所需的调节序列。

当另外的核苷酸例如通过核苷酸掺入生物催化剂在核酸的3'端处掺入核酸内时，核酸被“延伸”或“延长”。

“部分”或“基团”指某些事物例如分子分裂成的部分之一（例如官能团、取代基等）。例如，核苷酸一般包含碱基基团（例如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或类似物）、糖部分、和一个或多个磷酸基。

“等位基因特异性引物”是这样的引物，其可以与模板核酸的几种变体杂交，但当与模板核酸的仅一些变体杂交时，则允许通过聚合酶的延长。对于模板核酸的其他变体，引物-模板杂交物可能不延伸或由聚合酶以更低效率延伸。

当另外的核苷酸例如通过核苷酸掺入生物催化剂在核酸的3'端处掺入核酸内时，核酸被“延伸”或“延长”。

如果扩增测定获得一种产物超过其他可能产物的优势（即大多数但小于100%），则它是“选择性的”或“等位基因选择性的”。只要靶序列的不需要（错配）变体的扩增是可检测的，测定就描述为“等位基因选择性的”。如果可能产物之一唯一形成，则使用关于扩增测定的术语“特异性的”或“等位基因特异性的”。将其中不需要的靶的扩增是无法检测的测定称为“等位基因特异性的”。然而，应当理解随着检测方法变得更灵敏，先前已知为等位基因特异性的一些测定变成等位基因选择性的，即靶的不需要变体的一些扩增变得可检测。因此，在本发明的背景下，术语“等位基因特异性的”意在包含严格地等位基因特异性的以及等位基因选择性的扩增。

“基因型”指细胞或个体或者细胞或个体的组的全部或部分遗传组成。例如，基因型包括存在于给定基因座上或分布在基因组中的特定突变和/或等位基因（例如多态性，例如单核苷酸多态性（SNP）等）。

“核酸聚合酶”指催化核苷酸掺入核酸内的酶。示例性核酸聚合酶包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、末端转移酶、逆转录酶、端粒末端转移酶等。

“热稳定酶”指当将其置于高温下所选的时间段时是稳定的（即抵抗断裂或变性）且保留足够催化活性的酶。例如，当将其置于高温下双链核酸变性所需的时间时，热稳定聚合酶保留实现随后的引物延伸反应的足够活性。核酸变性所需的加热条件是本领域众所周知的且在美国专利号4,683,202和4,683,195中例示。如本文使用的，热稳定聚合酶一般适合于在温度循环反应例如聚合酶链反应（“PCR”）中使用。热稳定核酸聚合酶的实例包括水生栖热菌（Thermus aquaticus）Taq DNA聚合酶、栖热菌属物种（Thermus sp.）Z05聚合酶、黄栖热菌（Thermus flavus）聚合酶、海栖热袍菌（Thermotoga maritima）聚合酶例如TMA-25和TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶等。

“经修饰的”酶指包含氨基酸聚合物的酶，其中至少一个单体不同于参考序列，例如酶的天然或野生型形式或酶的另一种修饰形式。示例性修饰包括单体插入、缺失和取代。经修饰的酶还包括具有来源于两个或更多个亲本的可鉴定组分序列（例如结构或功能结构域等）的嵌合酶。在经修饰的酶的定义内还包括的是包含参考序列的化学修饰的那些。经修饰的聚合酶的实例包括G46E E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶、G46E E678G CS6 DNA聚合酶、Z05 DNA聚合酶、ΔZ05聚合酶、ΔZ05-Gold聚合酶、ΔZ05R聚合酶、E615G Taq DNA聚合酶、E678G TMA-25聚合酶、E678G TMA-30聚合酶等。

术语“5'至3'核酸酶活性”或“5'-3' 核酸酶活性”指一般与核酸链合成相关的核酸聚合酶的活性，由此核苷酸从核酸链的5'端去除，例如大肠杆菌DNA聚合酶I具有这种活性，而Klenow片段则没有。

“基本上缺乏5'-3'核酸酶活性”的聚合酶指具有Taq DNA聚合酶的50%或更低的（例如<25%、<20%、<15%、<10%）5'-3'核酸酶活性的聚合酶。测量5'-3'核酸酶活性的方法和用于测量的条件是本领域众所周知的，参见例如美国专利号5,466,591。基本上缺乏5'到3'核酸酶活性的DNA聚合酶的实例包括大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段；缺乏N末端235个氨基酸的水生栖热菌DNA聚合酶（Taq）（例如如美国专利号5,616,494中描述的且在本领域中通常被称为“Stoffel片段”）。其他实例包括具有足够缺失（例如N末端缺失）、突变或修饰以消除或失活负责5'-3'核酸酶活性的结构域的热稳定DNA聚合酶，参见例如美国专利号5,795,762。

术语“3'至5'核酸酶活性”或“3'-5'核酸酶活性”或“校正活性”指核酸聚合酶的活性，由此核苷酸从核酸链的3'端去除。例如，大肠杆菌DNA聚合酶III具有这种活性，而水生栖热菌（Taq）DNA聚合酶则没有。

“保真度”或“复制保真度”是核酸聚合酶在模板依赖性聚合过程中掺入正确核苷酸的能力。在复制保真度的背景下，在新生核苷酸链上的“正确核苷酸”是经由Watson-Crick碱基配对与模板核苷酸配对的核苷酸。特定聚合酶的复制保真度产生于掺入正确核苷酸和经由聚合酶的3'-5'核酸酶活性从新生核苷酸链的3'末端去除不正确核苷酸的组合。测量核苷酸聚合酶的保真度的多种方法在Tindall等人（1988）"Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase"，Biochemistry，27:6008-6013中综述。一般，具有3'-5'核酸酶（校正）能力的聚合酶比无校正活性的聚合酶具有更高的保真度。

“标记”指（共价或非共价）连接至分子且能够提供关于分子的信息的部分。示例性标记包括荧光标记、比色法标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记、质量修饰基团、抗体、抗原、生物素、半抗原和酶（包括过氧化物酶、磷酸酶等）。

在核酸扩增反应的背景下，“热启动”指其中至少一种关键试剂从反应混合物中被扣留（或如果存在于反应混合物中，则试剂保持无活性），直至温度足够升高以提供一种或多种引物的必需杂交特异性的方案。“热启动酶”是能够在热启动方案中充当“扣留”或无活性试剂的酶，一般为核酸聚合酶。

“Watson-Crick碱基配对”或简写的“碱基配对”指在双链核酸分子内的“常规的”氢键成键。Watson-Crick碱基配对是腺嘌呤和胸腺嘧啶之间、鸟嘌呤和胞嘧啶之间、腺嘌呤和尿嘧啶之间、以及这些碱基的类似物之间的氢键成键。

“选择性核苷酸”是对引物赋予等位基因选择性的等位基因特异性引物中的核苷酸。选择性核苷酸与靶核酸的所需变体中的相应核苷酸互补，但不与靶核酸的不需要变体中的核苷酸互补。在引物中，多于一个核苷酸可以与靶核酸的所需变体中的核苷酸互补，但不与靶核酸的不需要变体中的相应核苷酸互补。然而，选择性核苷酸位于引物内影响引物特异性的位置处。选择性核苷酸允许靶核酸的有效或无效扩增，这取决于它在靶核酸中是否发现互补配偶体。引物可以含有多于一个选择性核苷酸。

表达“其中当所述第二寡核苷酸与和至少一个选择性核苷酸互补的靶序列变体杂交时，所述聚合酶能够有效延伸所述第二寡核苷酸，并且当所述第二寡核苷酸与和至少一个选择性核苷酸不互补的靶序列变体杂交时，则延伸效率明显更低”意指第二寡核苷酸通过聚合酶的延伸在选择性核苷酸与靶形成碱基对时比所述选择性核苷酸不与靶形成碱基对时更有效。

如上所述，在一个方面，本发明涉及等位基因特异性扩增的方法，其包括（a）提供可能含有靶序列的至少一种变体的样品；（b）提供第一寡核苷酸，其与靶序列的多于一种变体至少部分互补；（c）提供第二寡核苷酸，其与靶序列的一种或多种变体至少部分互补，具有与靶序列的仅一种变体互补的选择性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸掺入至少一个“G形夹”核苷酸；（d）提供适合于所述第一和第二寡核苷酸与靶序列的至少一种变体杂交的条件；（e）提供适合于通过核酸聚合酶的寡核苷酸延伸的条件；其中当所述第二寡核苷酸与对其它具有所述互补选择性核苷酸的靶序列变体杂交时，所述聚合酶能够延伸所述第二寡核苷酸，并且当所述第二寡核苷酸与对其它具有非互补选择性核苷酸的靶序列变体杂交时，则延伸效率明显更低。

与靶序列的一种或多种变体至少部分互补，并具有与靶序列的仅一种变体互补的选择性核苷酸的第二寡核苷酸被称为“选择性寡核苷酸”、“选择性引物”或“等位基因选择性引物”。本发明的选择性寡核苷酸包含10-50、更优选15-35个核苷酸，它们的大多数与靶序列的多于一种变体中的序列互补。寡核苷酸的选择性核苷酸与待扩增的靶序列变体互补，并且不与其他变体互补。在一个实施方案中，选择性核苷酸是3'末端核苷酸。本发明的选择性寡核苷酸包括一个或多个“G形夹”核苷酸。在一些实施方案中，“G形夹”核苷酸在3'末端核苷酸处出现。在其他实施方案中，“G形夹”核苷酸在3'末端核苷酸上游的1-5个核苷酸处出现。在其他实施方案中，经修饰的碱基核苷酸是3'末端核苷酸。在一些实施方案中，“G形夹”核苷酸在3'末端处和在寡核苷酸内的其他地方的至少再一个位置处出现。

本发明的等位基因特异性引物可以掺入本领域已知的引物设计的多个方面。例如，引物可以采取称为“蝎形（scorpion）”且在Whitcombe等人（1999）"Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence"，Nature Biotech. 17:804-807中所述的单分子引物-探针组合的形式。根据本发明设计的蝎形引物掺入蝎形的一般元件，即探针部分、茎环部分和引物部分。进一步地，在根据本发明设计的蝎形中，引物部分具有与变体位置互补的3'端。在根据本发明设计的蝎形中的引物部分含有如本文描述的一个或多个“G形夹”核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，扩增涉及聚合酶链反应，即模板变性、寡核苷酸引物与模板退火（杂交）、和通过核酸聚合酶的引物延伸的重复循环。在一些实施方案中，退火和延伸在相同的温度步骤中发生。

在一些实施方案中，扩增反应涉及热启动方案。在等位基因特异性扩增的背景下，等位基因特异性引物关于错配靶的选择性可以通过使用热启动方案得到增强。许多热启动方案是本领域已知的，例如蜡的使用，将关键试剂与反应混合物的剩余部分分离（美国专利号5,411,876），通过抗体可逆失活的核酸聚合酶的使用（美国专利号5,338,671），通过设计为特异性结合其活性位点的寡核苷酸可逆失活的核酸聚合酶，或具有可逆化学修饰的核酸聚合酶的使用，如例如美国专利号5,677,152和5,773,528中描述的。

在本发明的一些实施方案中，等位基因特异性扩增测定是实时PCR测定。在实时PCR测定中，扩增的测量标准是“达到阈值的循环（cycles to threshold）”或Ct值。更早的Ct值反映阈值水平的快速实现且因此更有效的扩增。更晚的Ct值可以反映效率低的或受抑制的扩增。在等位基因特异性实时PCR测定的背景下，匹配和错配模板之间的Ct值中的差异是等位基因之间的鉴别或测定选择性的测量标准。

等位基因特异性扩增测定可以采用本领域已知的任何合适的核酸聚合酶。对于等位基因特异性PCR测定，可以使用任何热稳定的核酸聚合酶。有时希望使用无校正（3'-5'-外切核酸酶）活性的酶，例如如Taq DNA聚合酶。还可能希望使用基本上或完全缺乏5'-3'核酸酶活性的酶，例如美国专利号5,795,762中所述的。此类酶的一个实例是ΔZ05聚合酶。有时可能希望具有“热启动”能力的酶，例如美国专利号5,677,152和5,773,528中所述的可逆修饰的酶。热启动酶的一个实例是ΔZ05-Gold聚合酶。

扩增产物的检测可以通过本领域已知的任何方法完成。这些方法包括标记引物和探针以及多种核酸结合染料的使用。检测方法可以对于靶序列的一种变体是特异性的，或可以对于靶序列的所有变体或甚至对于所有双链DNA是非特异性的（generic）。当不需要的靶变体的扩增是最低限度的且预期会落入方法的检测限之下时，可以使用非特异性检测方法。

扩增产物可以在扩增已完成后例如通过未标记产物的凝胶电泳和用核酸结合染料染色凝胶进行检测。或者，由于在合成过程中的掺入或由于是标记引物的延伸产物，扩增产物可以携带放射性或化学标记。在电泳后或电泳过程中，标记的扩增产物可以用本领域已知的合适放射学或化学工具进行检测。在电泳后，产物还可以用通过本领域已知的方法的任何一种标记的靶特异性探针进行检测。标记探针还可以无需电泳即在“斑点印迹”测定等中应用于靶。

在其他实施方案中，扩增产物的存在可以在同质测定（homogeneous assay）中进行检测，所述同质测定即这样的测定，其中在扩增循环过程中或至少在同一未打开的管中检测新生产物，并且不需要扩增后处理。同质扩增测定已例如在美国专利号5,210,015中得到描述。使用核酸嵌入染料的同质扩增测定已例如在美国专利号5,871,908和6,569,627中得到描述。同质测定还可以采用由两种相互作用的荧光团标记的荧光探针，例如“分子信标”探针（Tyagi等人（1996）Nat. Biotechnol.，14:303-308）或荧光标记的核酸酶探针（Livak等人（1995）PCR Meth. Appl.，4:357-362）。在这些技术的某些变化中，扩增产物还可以由于其区别性的解链温度进行鉴定，参见美国专利号5,871,908和6,569,627。扩增产物还可以使用称为“蝎形”的单分子引物-探针组合进行检测。Whitcombe等人（1999）"Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence"，Nature Biotech. 17:804-807。蝎形寡核苷酸的引物部分可以是根据本发明设计的等位基因特异性引物。

在另一个方面，本发明提供了用于特异性或选择性扩增靶序列的所选变体的反应混合物，其包含第一寡核苷酸，其与靶序列的多于一种变体至少部分互补；第二寡核苷酸，其与靶序列的多于一种变体至少部分互补，但具有与靶序列的仅一种变体互补的选择性核苷酸，其中所述第二寡核苷酸包括至少一个“G形夹”核苷酸和已知以多于一种序列变体存在的靶核酸。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含核酸扩增通常所需的试剂和溶液，包括核酸聚合酶、核酸前体即核苷三磷酸、以及适合于支持核酸聚合酶活性的有机和无机离子。

在另一个方面，本发明提供了用于进行根据本发明的等位基因特异性扩增的试剂盒。试剂盒通常包括测定特异性组分以及进行DNA扩增测定通常所需的组分。作为测定特异性组分，本发明的等位基因特异性扩增试剂盒一般包括第一寡核苷酸，其与靶序列的一种或多种变体至少部分互补；和第二寡核苷酸，其与靶序列的多于一种变体至少部分互补，具有与靶序列的仅一种变体互补的选择性核苷酸，并且还具有至少一个“G形夹”核苷酸；和任选的对照核酸序列，其包含一些与试剂盒中装有的寡核苷酸至少部分互补的对照靶序列的至少一种变体。在一些实施方案中，可以装有对照核酸序列的多于一种变体。在某些实施方案中，在试剂盒中装有的对照核酸序列的几种变体中，至少一种变体与等位基因选择性寡核苷酸的选择性核苷酸互补。作为核酸扩增通常所需的组分，本发明的试剂盒一般包括下述中的一种或多种：核酸聚合酶、核酸前体例如核苷三磷酸（脱氧核糖核苷三磷酸或核糖核苷三磷酸）、任选的用于使核酸的焦磷酸解降到最低的焦磷酸酶、用于保护不受扩增反应的携带污染（carry-over contamination）的尿嘧啶 N-糖基化酶（UNG）、扩增反应和检测所需的预制试剂和缓冲液、和用于进行本发明的等位基因特异性扩增的一套说明书。

在另外一个方面，本发明提供了用于等位基因特异性PCR的寡核苷酸。用于本发明的等位基因特异性PCR的一般寡核苷酸包含10-50、更优选15-35个核苷酸，它们的大多数与靶序列的多于一种变体中的序列互补。然而，寡核苷酸的选择性核苷酸与靶序列的一种变体互补，并且与其他变体不互补。进一步地，本发明的寡核苷酸包括一个或多个“G形夹”核苷酸。在一些实施方案中，“G形夹”核苷酸在3'末端核苷酸处出现。在其他实施方案中，“G形夹”核苷酸在3'末端核苷酸上游的1-5个或例如1、2或3个核苷酸处出现。在一些实施方案中，“G形夹”核苷酸在3'末端处以及在寡核苷酸内的其他地方出现。

提供下述实施例和附图以帮助本发明的理解，本发明的真实范围在附加的权利要求中阐述。

实施例

实施例1

用于检测人EGFR基因中的突变L858R的引物

这个突变产生于野生型EGFR基因（SEQ ID NO: 1）中的核苷酸变化2573 T->G。用于检测野生型和突变型EGFR基因（SEQ ID NO: 2）的引物和探针显示于表1中。每个扩增引物对中的一条引物在3'末端处与突变型变体匹配且与野生型变体错配。剩余引物和探针对于突变型和野生型靶是共同的。

表1

对于每个扩增反应，野生型基因组DNA（K562）以每个反应10⁴拷贝存在。线性化突变型质粒DNA也以每个反应10⁴拷贝存在。突变型质粒通过插入500bp至pUC19载体（作为来自IDT的小基因提供；SEQ ID NOS: 15和16）内进行制备。

每个反应扩增突变型或野生型靶的10⁴拷贝（以10⁴拷贝输入）。匹配变体是具有掺入EGFR L858R突变型序列的插入片段的质粒DNA，而错配变体是K562 gDNA。匹配引物是未经修饰的或在3'末端处或在距离3'末端的位置N-1或N-2处G形夹修饰的。

每12 μL反应含有2.98%甘油，50mM Tris-HCl（pH 8.0），80mM KCl，200μM每种dATP、dCTP和dGTP，400μM dUTP，0.2μM正向引物，0.2μM反向引物，0.05μM检测探针，2.5% DMSO，0.02% Pierce Tween 20，0.036%叠氮化钠，0.1mM EDTA，0.2U/μL 尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG），200nM NTQ21-46A适体，40nM Z05突变型聚合酶和2.5mM乙酸镁（含0.09%叠氮化钠）。

扩增和分析使用Roche LightCycler 480仪器完成。对反应实施下述温度概况：50℃ 5分钟（UNG步骤），随后为95℃ 10秒和62℃ 30秒的2个循环，以及93℃ 10秒和62℃ 30秒的60个循环。在最后60个循环的每个62℃步骤结束时收集荧光数据。

一次实验的结果显示于表2上。扩增结果表示为在450-500 nm或540-580nm波长间隔中的荧光中的变化。扩增的选择性通过匹配和错配靶之间的Ct 值中的差异（ΔCt）进行测量。关于每次实验的ΔCt在表2上指出。数据显示靶的匹配（突变型）变体相对于错配（野生型）变体被选择性扩增。选择性通过引物中核苷酸的G形夹修饰得到增强。

表2

引物	平均L858R Ct	平均WT Ct	ΔCt（WT-L858R）
				SEQ ID NO: 3	36.7	21.6	-15.1
SEQ ID NO: 4	22.1	24.3	2.2
				SEQ ID NO: 5	23.8	26.2	2.4
SEQ ID NO: 6	22.5	26.6	4.1
				SEQ ID NO: 7	22.5	29.4	6.9

实施例2

用于检测在PIK3CA基因处的突变的引物

每个扩增引物对中的一条引物在3'末端处与突变型变体匹配且与野生型变体错配。剩余引物和探针对于突变型和野生型靶是共同的。野生型基因组DNA（K562）以每个反应10⁴拷贝存在。线性化突变型质粒DNA以每个反应10⁴拷贝存在。突变型质粒通过插入500bp至pUC19载体（作为来自IDT的小基因提供）内进行制备。

引物是未经修饰的或在从N-1到N-2的任何碱基位置处G形夹修饰的。在一些设计中，在G形夹修饰位点处或其附近的引物序列中引入另外的错配。

每一12 μL反应含有2.98%甘油，50mM Tris-HCl（pH 8.0），80mM KCl，200μM每种dATP、dCTP和dGTP，400μM dUTP，0.1μM正向引物，0.1μM反向引物，0.05μM检测探针，2.5% DMSO，0.02% Pierce Tween 20，0.036%叠氮化钠，0.1mM EDTA，0.2U/μL 尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG），200nM NTQ21-46A适体，40nM Z05突变型聚合酶和2.5mM乙酸镁（含0.09%叠氮化钠）。

扩增和分析使用Roche LightCycler 480仪器完成。对反应实施下述温度概况：50℃ 5分钟（UNG步骤），随后为95℃ 10秒和62℃ 30秒的2个循环，以及93℃ 10秒和62℃ 30秒的60个循环。在最后60个循环的每个62℃步骤结束时收集荧光数据。

一次实验的结果显示于表3上。扩增结果表示为在450-500 nm或540-580nm波长间隔中的荧光中的变化。扩增的选择性通过匹配和错配靶之间的Ct 值中的差异（ΔCt）进行测量。关于每次实验的ΔCt在表3上指出。数据显示对于未经修饰的突变型引物，靶的匹配（突变型）变体相对于错配（野生型）变体被选择性扩增。选择性通过突变型引物中的核苷酸的G形夹修饰得到增强。

表3

	平均突变型Ct	平均WT Ct	ΔCt（WT – 突变型）
				野生型引物	24.5	21.2	-3.3
未经修饰的突变型引物	22.6	33.6	11.0
				G形夹突变型引物	27.6	51.5	23.9

                         序列表

 

<110>  Roche Diagnostics GmbH

       F. Hoffmann-La Roche AG

 

<120>  G形夹用于改进的等位基因特异性PCR的用途

 

<130>  27369 WO

 

<150>  61/538,650

<151>  2011-09-23

 

<160>  16   

 

<170>  PatentIn版本3.5

 

<210>  1

<211>  3633

<212>  DNA

<213>  智人（Homo sapiens）

 

 

<220>

<221>  尚未归类的特征

<223>  EGFR野生型基因

 

<400>  1

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<210>  2

<211>  3633

<212>  DNA

<213>  智人

 

 

<220>

<221>  尚未归类的特征

<223>  EGFR 2573 T>G突变型基因

 

<400>  2

atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg       60

 

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ctgatggatg aagaagacat ggacgacgtg gtggatgccg acgagtacct catcccacag     3060

 

cagggcttct tcagcagccc ctccacgtca cggactcccc tcctgagctc tctgagtgca     3120

 

accagcaaca attccaccgt ggcttgcatt gatagaaatg ggctgcaaag ctgtcccatc     3180

 

aaggaagaca gcttcttgca gcgatacagc tcagacccca caggcgcctt gactgaggac     3240

 

agcatagacg acaccttcct cccagtgcct gaatacataa accagtccgt tcccaaaagg     3300

 

cccgctggct ctgtgcagaa tcctgtctat cacaatcagc ctctgaaccc cgcgcccagc     3360

 

agagacccac actaccagga cccccacagc actgcagtgg gcaaccccga gtatctcaac     3420

 

actgtccagc ccacctgtgt caacagcaca ttcgacagcc ctgcccactg ggcccagaaa     3480

 

ggcagccacc aaattagcct ggacaaccct gactaccagc aggacttctt tcccaaggaa     3540

 

gccaagccaa atggcatctt taagggctcc acagctgaaa atgcagaata cctaagggtc     3600

 

gcgccacaaa gcagtgaatt tattggagca tga                                  3633

 

 

<210>  3

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  野生型引物

 

<400>  3

gcacccagca gtttggcca                                                    19

 

 

<210>  4

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  突变型引物

 

<400>  4

gcgcccagca gtttggccc                                                    19

 

 

<210>  5

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  突变型引物

 

 

<220>

<221>  修饰的碱基

<222>  (19)..(19)

<223>  G形夹

 

<400>  5

gcgcccagca gtttggccc                                                    19

 

 

<210>  6

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  突变型引物

 

 

<220>

<221>  修饰的碱基

<222>  (18)..(18)

<223>  G形夹

 

<400>  6

gcgcccagca gtttggccc                                                    19

 

 

<210>  7

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  突变型引物

 

 

<220>

<221>  修饰的碱基

<222>  (17)..(17)

<223>  G形夹

 

<400>  7

gcgcccagca gtttggccc                                                    19

 

 

<210>  8

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  共同引物

 

<400>  8

gtcttctctg tttcagggca tgaac                                             25

 

 

<210>  9

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  探针

 

<400>  9

tactggtgaa aacaccgcag catgt                                             25

 

 

<210>  10

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  野生型引物

 

<400>  10

atgtcaagat cacagatttt gggct                                             25

 

 

<210>  11

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  突变型引物

 

<400>  11

atgtcaagat cacagatttt gggcg                                             25

 

 

<210>  12

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  突变型引物

 

 

<220>

<221>  修饰的碱基

<222>  (24)..(24)

<223>  G形夹

 

<400>  12

atgtcaagat cacagatttt gggcg                                             25

 

 

<210>  13

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  共同引物

 

<400>  13

ctggtccctg gtgtcaggaa aa                                                22

 

 

<210>  14

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  探针

 

<400>  14

taccatgcag aaggaggcaa agtaaggag                                         29

 

 

<210>  15

<211>  500

<212>  DNA

<213>  智人

 

 

<220>

<221>  尚未归类的特征

<223>  EGFR野生型小基因

 

<400>  15

tcttctttca tgcgcctttc cattctttgg atcagtagtc actaacgttc gccagccata       60

 

agtcctcgac gtggagaggc tcagagcctg gcatgaacat gaccctgaat tcggatgcag      120

 

agcttcttcc catgatgatc tgtccctcac agcagggtct tctctgtttc agggcatgaa      180

 

ctacttggag gaccgtcgct tggtgcaccg cgacctggca gccaggaacg tactggtgaa      240

 

aacaccgcag catgtcaaga tcacagattt tgggctggcc aaactgctgg gtgcggaaga      300

 

gaaagaatac catgcagaag gaggcaaagt aaggaggtgg ctttaggtca gccagcattt      360

 

tcctgacacc agggaccagg ctgccttccc actagctgta ttgtttaaca catgcagggg      420

 

aggatgctct ccagacattc tgggtgagct cgcagcagct gctgctggca gctgggtcca      480

 

gccagggtct cctggtagtg                                                  500

 

 

<210>  16

<211>  500

<212>  DNA

<213>  智人

 

 

<220>

<221>  尚未归类的特征

<223>  EGFR 2573 T>G突变型小基因

 

<400>  16

tcttctttca tgcgcctttc cattctttgg atcagtagtc actaacgttc gccagccata       60

 

agtcctcgac gtggagaggc tcagagcctg gcatgaacat gaccctgaat tcggatgcag      120

 

agcttcttcc catgatgatc tgtccctcac agcagggtct tctctgtttc agggcatgaa      180

 

ctacttggag gaccgtcgct tggtgcaccg cgacctggca gccaggaacg tactggtgaa      240

 

aacaccgcag catgtcaaga tcacagattt tgggcgggcc aaactgctgg gtgcggaaga      300

 

gaaagaatac catgcagaag gaggcaaagt aaggaggtgg ctttaggtca gccagcattt      360

 

tcctgacacc agggaccagg ctgccttccc actagctgta ttgtttaaca catgcagggg      420

 

aggatgctct ccagacattc tgggtgagct cgcagcagct gctgctggca gctgggtcca      480

 

gccagggtct cctggtagtg                                                  500

Claims (15)

1.靶序列变体的等位基因特异性扩增的方法，所述靶以几种变体序列的形式存在，所述方法包括：

（a）使第一和第二寡核苷酸与所述靶序列的至少一种变体杂交；其中所述第一寡核苷酸与所述靶序列的一种或多种变体至少部分互补，并且所述第二寡核苷酸与所述靶序列的一种或多种变体至少部分互补，并且具有与所述靶序列的仅一种变体互补的至少一个选择性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸掺入至少一个“G形夹”核苷酸；

（b）用核酸聚合酶延伸所述第二寡核苷酸，其中当所述第二寡核苷酸与和所述至少一个选择性核苷酸互补的所述靶序列变体杂交时，所述聚合酶能够有效延伸所述第二寡核苷酸，并且当所述第二寡核苷酸与和所述至少一个选择性核苷酸不互补的所述靶序列变体杂交时，则延伸效率明显更低。

2.权利要求1的方法，其中所述至少一个选择性核苷酸在3'末端核苷酸处。

3.权利要求1的方法，其中所述“G形夹”核苷酸在3'末端核苷酸处或在3'末端核苷酸附近的1-5个核苷酸的位置处。

4.权利要求1的方法，其进一步包括检测步骤（b）中的引物延伸产物的步骤（c）。

5.权利要求1的方法，其中所述核酸聚合酶选自Taq DNA聚合酶、Z05 DNA聚合酶、ΔZ05 DNA聚合酶和ΔZ05-Gold DNA聚合酶。

6.权利要求1的方法，其中所述核酸聚合酶具有3'-5'核酸酶活性。

7.权利要求6的方法，其中所述核酸聚合酶选自Pfu DNA聚合酶和海栖热袍菌（Thermatoga Maritima）。

8.权利要求1的方法，其中步骤（a）中的序列的所述变体是人PIK3CA或EGFR基因的突变。

9.权利要求1的方法，其中所述第二寡核苷酸选自SEQ ID NO: 5、6、7和12。

10.试剂盒，其用于靶序列的等位基因特异性扩增，所述靶以几种变体序列的形式存在，所述试剂盒包含：

（a）第一寡核苷酸，其与所述靶序列的一种或多种变体至少部分互补；和

（b）第二寡核苷酸，其与所述靶序列的一种或多种变体至少部分互补，具有与所述靶序列的仅一种变体互补的至少一个选择性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸掺入至少一个“G形夹”核苷酸。

11.权利要求10的试剂盒，其进一步包含核酸聚合酶、核苷三磷酸、适合于通过所述核酸聚合酶的核酸延伸的缓冲液和用于进行等位基因特异性扩增的一套说明书。

12.寡核苷酸，其用于进行靶序列的等位基因特异性扩增，所述靶以几种变体序列的形式存在，所述寡核苷酸包含：

（a）与所述靶序列的一种或多种变体的部分至少部分互补的序列；

（b）与所述靶序列的仅一种变体互补的至少一个选择性核苷酸；

（c）至少一个“G形夹”核苷酸。

13.权利要求12的寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO: 5、6、7和12的序列。

14.反应混合物，其用于靶序列的等位基因特异性扩增，所述靶以几种变体序列的形式存在，所述混合物包含：

（a）第一寡核苷酸，其与所述靶序列的一种或多种变体至少部分互补；和

（b）第二寡核苷酸，其与所述靶序列的一种或多种变体至少部分互补，但具有与所述靶序列的仅一种变体互补的至少一个选择性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸掺入至少一个“G形夹”核苷酸。

15.权利要求14的反应混合物，其进一步包含核酸聚合酶、核苷三磷酸和适合于通过所述核酸聚合酶的核酸延伸的缓冲液。

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