KR102097721B1 - 태그서열 snp를 이용한 단일 검출 프로브 기반 다중 표적 검출방법 - Google Patents

태그서열 snp를 이용한 단일 검출 프로브 기반 다중 표적 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단일 검출 프로브 기반의 다중 표적 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 SNP 함유 태그서열이 포함된 프라이머로 각 표적을 증폭한 다음, 각각의 태그서열에 모두 결합하되, 융해온도가 서로 상이하도록 설계된 단일 검출 프로브와 혼성화시켜 융해곡선을 분석하여 다중 표적을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 다중 표적 검출방법은 단일 프로브를 이용하여 다중 표적을 검출할 수 있어, 다중 표적 검출 시, 위양성이 낮고, 높은 민감도와 빠른 속도로 다중 표적을 검출할 수 있어 유용하다.

Description

태그서열 SNP를 이용한 단일 검출 프로브 기반 다중 표적 검출방법{Method for Detecting Multiple Target Based on Single Detection Probe using Tag sequence SNP}
본 발명은 단일 검출 프로브 기반의 다중 표적 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 증폭산물과 검출 프로브의 혼상화 반응물의 융해온도가 서로 상이하게 되도록 설계된 태그서열이 포함된 프라이머로 각 표적을 증폭한 다음, 각각의 태그서열에 모두 결합하는 단일 검출 프로브와 혼성화시켜 융해곡선을 분석하여 다중 표적을 검출하는 방법에 관한 것이다.
특정 핵산의 진단 분야는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)의 구별, 병원성 세균 또는 바이러스의 탐지 및 동정, 유전병 진단 등에 활용되고 있다. 이에 특정 핵산을 신속하고 정확하게 검출하기 위한 많은 방법들이 제시되어 왔으며, 현재에도 이와 관련된 많은 연구가 진행되고 있다(W. Shen et al., 2013, Biosen. and Bioele., 42:165-172.; M.L. Ermini et al., 2014, Biosen. and Bioele., 61:28-37.; K. Chang et al., 2015, Biosen. and Bioele., 66:297-307.).
구체적으로, 특정 핵산을 검출하기 위해 가장 보편적으로 사용하는 방법으로 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하는 방법, Real-time PCR 및 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex polymerase chain reaction, Multiplex PCR) 방법이 있다.
상기 중합효소 연쇄반응(PCR)은 주형 DNA와 결합할 수 있으며, 형광물질과 소광물질이 결합된 프라이머 또는 프로브를 임의로 설계함으로써 검출하고자 하는 유전자의 원하는 부위만을 정확하게 증폭할 수 있다는 장점이 있다. 그러나, 한번의 반응으로 하나의 핵산을 증폭시킬 수 있어 증폭하고자 하는 핵산의 개수가 많을 경우에는 동일한 작업을 반복해서 수행하여야 하는 번거로움이 있다.
상기 Real-time PCR은 실시간으로 증폭산물을 측정하고 cross-contamination을 감소시키며, 보다 정확한 정량적 분석을 가능하게 한다. Real-time PCR에 관한 종래 특허문헌으로는, U.S. Pat. Nos. 5,210,015, 5,538,848 및 6,326,145가 있다.
기존의 Real-time PCR 방법은 증폭과 검출이 동시에 수행되는 homogeneous assay 방식의 장점을 가지고 있지만, 형광 리포터 분자 종류의 한계로 인하여 동시에 검출할 수 있는 표적 핵산서열 수가 제한적인 multiplicity 문제점 및 high-throughput에 있어서 가장 큰 단점을 가지고 있다. 실시간 표적 핵산서열을 검출할 수 있는 현존의 thermocycler는 최대 5-plex까지 동시 검출이 가능하기 때문에, 동시에 검출할 수 있는 표적 핵산서열의 수가 제한적이며, 또한 대용량의 시료를 분석하기 위하여 많은 시간과 추가적인 고가의 실시간 모니터링 장비가 요구된다.
Real-time PCR의 대표적인 TaqMan probe 방식(U.S. Pat. No. 5,210,015)과 Self-quenching fluorescence probe 방식(U.S. Pat. No. 5,723,591)은 dual-labeled probe의 비특이적 결합에 의한 false positives가 발생되는 문제가 있기 때문에, 현실적으로 (practically) 5-plex도 어렵고, 숙련된 기술 및 노하우가 필수적으로 요구된다. 기존의 Real-time PCR 방식은 증폭과 검출을 동시해야 하기 때문에, Real-time PCR 장비의 High Throughput에 한계가 있다.
상기 다중 중합효소 연쇄반응(Multiplex PCR)은 여러 개의 중합효소연쇄반응을 한 튜브에서 수행함으로써 다수의 핵산을 동시에 분석할 수 있다는 장점이 있다. 그러나 많은 프라이머 또는 프로브를 한 튜브에서 동시에 사용함에 따라 프로브와 프라이머 또는 프라이머들 간의 교차반응이 발생하게 되기 때문에 한번에 증폭할 수 있는 핵산의 수에는 한계가 있으며, 반응 조건을 찾기 위한 많은 노력과 시간을 필요로 하고 민감도 및 특이도에서 좋은 결과를 얻을 수 없다는 단점이 있다(Hardenbol et al., 2003, Nat. Biotechnol., 21:673.).
또한, 검출하고자 하는 핵산 하나에 하나의 형광물질만 표지가 가능하고, 현재 형광물질을 검출하기 위해 사용되는 장비는 한번에 동시 분석이 가능한 형광 채널 개수가 통상 4~7종류로 제한되어 있으므로, 8개 이상의 핵산을 분석하기 위해서는 2번 이상의 동일한 작업이 반복하여 이루어져야 하는 문제가 있다.
따라서, 최근에는 다중 중합효소 연쇄반응을 사용하지 않고 공통 프라이머를 사용하여 다수의 핵산을 동시에 증폭하여 대량 분석을 가능하게 하는 연구가 활발히 이루어지고 있다. 대표적인 기술로는 SNPlex, Goldengate assay, molecular inversion probes(MIPs) 등이 있다.
상기 SNPlex는 OLA(oligonucleotide ligation assay) 이후에 엑소뉴클레아제(exonuclease)를 이용한 정제 과정을 수행하고 탐침(probe)의 양쪽 끝에 있는 공통 프라이머 염기서열로 중합효소연쇄반응 증폭을 한 다음, 마지막으로 탐침(probe)에 포함되어 있는 집코드(ZipCode) 염기서열을 이용해 DNA 칩에서 분석하는 방법이다(Tobler et al., J. Biomol. Tech., 16:398,2005).
Goldengate assay는 고체 표면에 고정화된 게놈 DNA(genomic DNA)에 업스트림(upstream) 탐침(probe)으로 대립 유전자 특이적 프라이머 연장 반응을 수행한 후에 다운스트림(downstream) 탐침(probe)과 DNA 연결 반응을 수행하고, 세척 과정을 거쳐 DNA 연결 반응이 되지 않은 탐침(probe)들을 제거한 다음, SNPlex와 같이 탐침(probe)에 포함되어 있는 공통 프라이머 염기서열로 증폭시키고, 증폭된 중합효소연쇄반응 결과물을 일루미나 비드칩(Illumina BeadChip)에서 분석하는 방법이다(Shen et al., Mutat. Res., 573:70,2005).
Molecular inversion probes(MIPs)는 Padlock 탐침(probe)을 사용하여 Gap-ligation을 한 이후에 DNA 연결이 되지 않은 탐침(probe)들과 게놈 DNA(genomic DNA)를 엑소뉴클레아제(exonucelase)를 이용하여 제거하고 우라실-N-글리코실라아제(uracil-N-glycosylase)를 이용해 Padlock 탐침(probe)을 선형화시킨 이후에 탐침에 포함된 공통 프라이머 염기서열을 이용해서 중합효소연쇄반응을 수행하고, GenFlex Tag Array(Affymetrix)에 혼성화시켜 여러 유전자 영역을 분석하는 방법이다(Hardenbol et al., Nat. Biotechnol., 21:673,2003).
그러나, 이러한 방법들은 첫 번째 튜브에서 반응시킨 생성물의 일부를 두 번째 튜브로 옮겨 반응을 수행해야 하거나 여러 종류의 효소를 이용하여야 하기 때문에 서로 다른 샘플들 간의 오염이 발생될 수 있으며, 실험방법이 복잡하다는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점들을 해결하고, 단일 프로브 기반의 다중 표적 검출방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 증폭산물과 검출 프로브의 혼상화 반응물의 융해온도가 서로 상이하게 되도록 설계된 태그서열이 포함된 프라이머로 다중 표적을 증폭하고, 각 태그서열과 모두 결합하는 단일 검출 프로브와 상기 증폭산물를 혼성화시킨 다음, 융해곡선을 분석할 경우, 높은 민감도와 정확도로 다중 표적을 검출할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 다중 표적 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 다중 표적 검출용 PCR 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 다중 표적 유전자 발현레벨 분석방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 다중 표적 함유 시료에서 DNA를 수득하는 단계; b) n개의 다중 표적핵산 각각을 증폭할 수 있는 n개의 프라이머 세트를 이용하여 다중 표적핵산을 증폭하는 단계(여기서, n은 2 내지 20의 정수임); c) n개의 증폭산물과 모두 혼성화할 수 있는 단일 검출 프로브를 이용하여 상기 n개의 증폭산물과 혼성화시키는 단계; 및 d) 상기 c) 단계에서 혼성화된 n개의 반응물 각각의 융해곡선을 분석하여 표적 핵산의 존재유무를 판별하는 단계를 포함하는 다중 표적 검출방법으로, 상기 n개의 프라이머 세트 각각은 정방향 프라이머와 태그서열을 함유하는 역방향 프라이머로 구성되고, 상기 태그서열은 혼성화된 n개의 반응물의 융해온도가 상이하게 되도록 설계된 것을 특징으로 하는 다중 표적 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, i) n개의 표적 각각을 증폭할 수 있는 n개의 프라이머 세트; 및 ii) n개의 프라이머로 세트로 증폭된 n개의 증폭산물과 모두 혼성화할 수 있는 검출 프로브(여기서, 상기 n은 2 내지 20의 정수임)를 포함하는 다중 표적 검출용 PCR 조성물로서, 상기 n개의 프라이머 세트 각각은 정방향 프라이머와 태그서열을 함유하는 역방향 프라이머로 구성되고, 상기 태그서열은 혼성화된 n개의 반응물의 융해온도가 상이하게 되도록 설계된 것을 특징으로 하는 다중 표적 검출용 PCR 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, a) 다중 표적 함유 시료에서 cDNA library를 수득하는 단계; b) 대조 유전자(reference gene)를 증폭할 수 있는 프라이머 세트 및 n개의 표적 유전자 각각을 증폭할 수 있는 n개의 프라이머 세트로 대조 유전자 및 표적 유전자를 증폭하는 단계(여기서, n은 2 내지 20의 정수임); c) 대조 유전자의 증폭산물 및 n개의 증폭산물과 모두 혼성화할 수 있는 검출 프로브를 상기 증폭산물과 혼성화시키는 단계; d) 상기 c) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선을 분석하는 단계; 및 e) 대조 유전자와 표적 유전자를 동시에 검출할 수 있는 융해 온도 및 표적 유전자만 검출할 수 있는 융해온도에서의 Ct값을 비교 분석하는 단계를 포함하는 다중 표적 유전자의 발현레벨 분석방법으로, 상기 n개의 프라이머 세트 각각은 정방향 프라이머와 태그서열을 함유하는 역방향 프라이머로 구성되고, 상기 태그서열은 혼성화된 n개의 반응물의 융해온도가 상이하게 되도록 설계된 것을 특징으로 하는 다중 표적 유전자의 발현레벨 분석방법을 제공한다.
본 발명에 따른 다중 표적 검출방법은 단일 프로브를 이용하여 다중 표적을 검출할 수 있어, 다중 표적 검출 시, 위양성이 낮고, 높은 민감도와 빠른 속도로 다중 표적을 검출할 수 있어 유용하다.
도 1은 본 발명에 따른 다중 표적 검출방법의 개념을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 다중 표적 검출방법을 이용하여 뇌수막염 관련 바이러스 및 세균을 검출하기 위한 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 조건을 나타내는 도식이다
도 3은 본 발명에 따른 다중 표적 검출방법으로 뇌수막염 바이러스 및 세균을 동시에 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 다중 표적 검출방법을 이용하여 대조 유전자(reference gene) 대비 표적 유전자의 발현레벨을 분석하기 위해 Tm 값을 결정하기 위한 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 조건을 나타내는 도식이다
도 5는 본 발명에 따른 다중 표적 검출방법을 이용하여 대조 유전자(reference gene) 대비 표적 유전자들의 발현레벨 확인을 위한 온도별 Ct값 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 다중 표적 검출방법을 이용하여 대조 유전자(reference gene) 대비 표적 유전자의 발현레벨을 분석하기 위한 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 조건을 나타내는 도식이다
도 7은 본 발명에 따른 다중 표적 검출방법을 이용하여 대조 유전자(reference gene) 대비 제1표적 유전자의 발현레벨을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 다중 표적 검출방법을 이용하여 대조 유전자(reference gene) 대비 제2표적 유전자의 발현레벨을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 증폭산물과 검출 프로브의 혼상화 반응물의 융해온도가 서로 상이하게 되도록 설계된 태그서열이 포함된 프라이머로 표적을 증폭하고, 각 태그서열과 모두 결합하는 단일 프로브와 상기 증폭산물을 혼성화한 다음, 융해곡선을 분석할 경우, 다중 표적 검출이 단일 프로브로 가능하다는 것을 확인하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는, 뇌수막염 원인 바이러스 6종(HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, EBV, HHV-6) 및 원인 세균 5종(Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Listeria monocytogenes, Group B Streptococcus, Neisseria meningitides)을 증폭할 수 있는 각각의 프라이머에 각 바이러스 및 세균별로 서로 상이한 태그서열을 융합하여 제작한 다음, 증폭산물을 생산하고, 바이러스 6종의 태그서열과 모두 결합할 수 있는 제1검출 프로브; 및 세균 5종의 태그서열과 모두 결합할 수 있는 제2검출 프로브를 상기 증폭산물과 혼성화 한 다음, 융해곡선을 분석할 경우, 높은 민감도로 각 바이러스 및 세균을 검출할 수 있다는 것을 확인하였다(도 1 내지 도 3).
따라서, 본 발명은 일관점에서,
a) 다중 표적 함유 시료에서 DNA를 수득하는 단계;
b) n개의 다중 표적핵산 각각을 증폭할 수 있는 n개의 프라이머 세트를 이용하여 다중 표적핵산을 증폭하는 단계(여기서, n은 2 내지 20의 정수임);
c) n개의 증폭산물과 모두 혼성화할 수 있는 단일 검출 프로브를 이용하여 상기 n개의 증폭산물과 혼성화시키는 단계; 및
d) 상기 c) 단계에서 혼성화된 n개의 반응물 각각의 융해곡선을 분석하여 표적 핵산의 존재유무를 판별하는 단계를 포함하는 다중 표적 검출방법으로,
상기 n개의 프라이머 세트 각각은
정방향 프라이머와 태그서열을 함유하는 역방향 프라이머로 구성되고,
상기 태그서열은 혼성화된 n개의 반응물의 융해온도가 상이하게 되도록 설계된 것을 특징으로 하는 다중 표적 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 “표적” 또는 “타겟”은 검출하고자 하는 모든 종류의 핵산을 의미하며, 서로 다른 종(species), 아종(subspecies), 또는 변종(variant) 유래의 염색체 염기서열 또는 동일 종 내 염색체 돌연변이를 포함한다. 이는 genomic DNA와 mitochondrial DNA, viral DNA를 포함하는 모든 종류의 DNA 또는 mRNA, miRNA, ribosomal RNA, non-coding RNA, tRNA, viral RNA 등을 포함하는 모든 종류의 RNA를 특징으로 할 수 있으나 이에 국한되지 않는다.
본 발명에서 표적은 이에 한정되는 것은 아니나, 염기서열의 변이를 포함하는 돌연변이 염기서열인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 돌연변이는 단일 염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP), 삽입(insertion), 결실(deletion), 점 돌연변이(point mutation), 융합 돌연변이(fusion mutation), 전좌(translocation), 역위(inversion) 및 LOH(loss of heterozygosity)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 표적은 이에 한정되는 것은 아니나, 특정 세균 또는 바이러스를 검출할 수 있는 핵산일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "뉴클레오시드"는 핵산 염기(핵염기)가 당 모이어티에 연결된 글리코실아민 화합물을 의미한다. "뉴클레오티드"는 뉴클레오시드 포스페이트를 의미한다. 뉴클레오티드는 표 1에 기재된 것과 같이, 그의 뉴클레오시드에 상응하는 알파벳 문자(문자 명칭)를 사용하여 표시될 수 있다. 예컨대, A는 아데노신(아데닌 핵염기를 함유하는 뉴클레오시드)을 지칭하고, C는 시티딘을 지칭하고, G는 구아노신을 지칭하고, U는 우리딘을 지칭하고, T는 티미딘(5-메틸 우리딘)을 지칭한다. W는 A 또는 T/U를 지칭하고, S는 G 또는 C를 지칭한다. N은 랜덤한 뉴클레오시드를 표시하고, dNTP는 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트를 의미한다. N은 A, C, G, 또는 T/U 중 어떤 것도 될 수 있다.
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본 발명에서 용어 "올리고뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 올리고머를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "핵산"은 뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "서열"은 올리고뉴클레오티드 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 명세서를 통틀어, 올리고뉴클레오티드 또는 핵산이 문자의 서열에 의해 표시될 때마다, 뉴클레오티드는 좌에서 우로 5'→순서이다. 올리고뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA, RNA, 또는 그의 유사체(예컨대, 포스포로티오에이트 유사체)일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 또는 핵산은 개질된 염기 및/또는 골격(예컨대, 개질된 포스페이트 연결부 또는 개질된 당 모이어티)도 또한 포함할 수 있다. 핵산에 안정성 및/또는 다른 이점을 부여하는 합성 골격의 비-제한적 예시는 포스포로티오에이트 연결부, 펩티드 핵산, 잠금 핵산, 자일로스핵산, 또는 그의 유사체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 “핵산”은 뉴클레오티드 폴리머를 지칭하며, 달리 한정되지 않는다면 자연적으로 발생한 뉴클레오티드와 유사한 방식(예컨대, 혼성화)으로 작용할 수 있는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체(analog)를 포함한다.
용어 핵산은, 예를 들어 유전체 DNA; 상보 DNA(cDNA)(이는 보통 전령 RNA(mRNA)의 역전사 또는 증폭으로 얻어지는 mRNA의 DNA 표현임); 합성으로 또는 증폭으로 생성된 DNA 분자; 및 mRNA를 포함한 임의의 형태의 DNA 또는RNA를 포함한다.
용어 핵산은 단일 가닥 분자뿐만 아니라 이중 또는 삼중 가닥 핵산을 포함한다. 이중 또는 삼중 가닥 핵산에서, 핵산 가닥은 동연(coextensive)일 필요는 없다(즉, 이중 가닥 핵산은 양 가닥의 전체 길이를 따라 이중 가닥일 필요는 없다).
용어 핵산은 또한 메틸화 및/또는 캡핑과 같은 것에 의한 이의 임의의 화학적 개질을 포함한다. 핵산 개질은 개별적인 핵산 염기 또는 핵산 전체에 추가적인 전하, 분극률, 수소 결합, 정전기 상호작용, 및 기능성을 포함하는 화학기의 첨가를 포함할 수 있다. 이러한 개질은 2' 위치 당 개질, 5 위치 피리미딘 개질, 8 위치 퓨린개질, 시토신 환외(exocyclic) 아민에서의 개질, 5-브로모-우라실의 치환, 주쇄 개질, 이소염기 이소시티딘 및 이소구아니딘과 같은 특이 염기 쌍 조합 등과 같은 염기 개질을 포함할 수 있다.
핵산(들)은 고상 매개 화학적 합성(solid phase-mediated chemical synthesis)과 같은 완전한 화학적 합성 과정으로부터, 핵산을 생성하는 임의의 종으로부터 분리를 통해서와 같은 생물학적 공급원으로부터, 또는 DNA 복제, PCR 증폭, 역전사와 같은 분자 생물학 도구에 의한 핵산의 취급과 관련된 과정으로부터, 또는 이들 과정의 결합으로부터 유도될 수 있다.
본 발명에서 용어 “상보”는 2개의 뉴클레오티드 사이의 정확한 쌍형성에 대한 능력을 지칭한다. 즉, 핵산의 주어진 위치에서 뉴클레오티드가 다른 핵산의 뉴클레오티드와 수소 결합을 할 수 있다면, 2개의 핵산은 그 위치에서 서로 상보적인 것으로 여겨진다. 뉴클레오티드의 일부만이 결합하여 2개의 단일 가닥 핵산 분자 사이의 상보성은 “부분적”일 수 있거나, 또는 전체 상보성이 단일 가닥 분자 사이에 존재할 때 상보성은 완전할 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화의 효율 및 강도에 상당한 영향을 미친다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 핵산 합성 반응을 프라이밍하기 위한 표적 핵산 서열(예컨대, 증폭될 DNA 주형)에 혼성화되는 짧은 선형 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머는 RNA 올리고뉴클레오티드, DNA 올리고뉴클레오티드, 또는 키메라 서열일 수 있다. 프라이머는 천연, 합성, 또는 개질된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 프라이머 길이의 상한 및 하한 둘 모두는 실험적으로 결정된다. 프라이머 길이의 하한은 핵산 증폭 반응 조건에서 표적 핵산과의 혼성화 후 안정한 듀플렉스를 형성하는데 필요한 최소 길이이다. 매우 짧은 프라이머(흔히 3 개 뉴클레오티드 미만 길이)는 이러한 혼성화 조건 하에서 표적 핵산과의 열열학적으로 안정한 듀플렉스를 형성하지 않는다. 상한은 표적 핵산에서 미리 결정된 핵산 서열 이외의 영역에서 듀플렉스 형성을 가질 수 있는 가능성에 의해 보통 결정된다. 일반적으로, 적합한 프라이머 길이는 약 3 개 뉴클레오티드 길이 내지 약 50개 뉴클레오티드 길이의 범위에 있다.
본 발명에서 용어 “프로브”는 하나 이상 유형의 화학 결합을 통하여, 일반적으로 상보적 염기 쌍형성을 통하여, 보통 수소 결합 형성을 통하여 상보적인 서열의 표적 핵산에 결합하고 따라서 이중나선(duplex) 구조를 형성할 수 있는 핵산이다. 프로브는 “프로브 결합 부위”에 결합 또는 혼성화한다. 특히, 일단 프로브가 프로브의 상보적인 표적에 혼성화하면 프로브의 검출을 용이하게 하도록 프로브는 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 그러나 대안적으로, 프로브는 표지화되지 않을 수 있지만, 표지화된 리간드와의 특이적 결합에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 프로브는 크기가 상당히 다양할 수 있다. 일반적으로 프로브는 길이가 적어도 7 내지 18개 뉴클레오티드이다. 다른 프로브는 길이가 적어도 20, 30 또는 40개 뉴클레오티드이다. 또 다른 프로브는 다소 더 길며, 길이가 적어도 50, 60, 70, 80, 또는 90개 뉴클레오티드이다. 또 다른 프로브는 더욱 더 길며, 길이가 적어도 100, 150, 200개 또는 그 이상의 뉴클레오티드이다. 프로브는 또한 상기 값(예컨대, 길이가 15~20개 뉴클레오티드)의 임의의 값으로 한정된 임의의 범위 내에 있는 임의의 길이의 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 “혼성화”는 상보적 염기서열을 가진 단일가닥 핵산들 간 수소결합에 의해 이중가닥 핵산이 형성되는 것을 의미하며, 어닐링(annealing)과 유사한 의미로 사용된다. 다만 조금 더 넓은 의미에서, 혼성화는 두 개의 단일가닥 간 염기서열이 완전히 상보적인 경우(perfect match)와 더불어 예외적으로 일부의 염기서열이 상보적이지 않은 경우(mismatch)까지 포함한다.
본 발명에서 "시료"는 표적을 함유하거나 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석이 행해질 조성물로, 액체, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 인체 유래물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 시료로부터 검출되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 액체는 물, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 림프 및 뇌척수액 등임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 물은 강수(江水), 해수(海水), 호수(湖水) 및 우수(雨水) 등을 포함하고, 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인체를 포함한다. 또한, 상기 동식물 조직으로는 점막, 피부, 외피, 털, 비늘, 안구, 혀, 뺨, 발굽, 부리, 주둥이, 발, 손, 입, 유두, 귀, 코 등의 조직을 포함한다.
바람직하게는 본 발명의 시료는 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biological sample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 바이러스 종(species)과 혼합된 시료이거나 상기 바이러스에 감염된 개체(예컨대, 인간, 포유류 및 어류 등)의 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 비대칭 PCR(asymmetric PCR)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 태그서열의 길이는 5-50 bp인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 태그서열의 GC 비율은 20-80%인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 태그서열에 의한 융해 온도는 태그서열의 구성 또는 길이에 의해 조절 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 태그서열은 프로브 서열 또는 프로브 서열을 포함하는 서열과 상보적인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융해 온도 차이는 융해 온도 차이가 분석 그래프 상 구별할 수 있을 정도로 발생하면 제한 없이 이용가능하나, 바람직하게는 2℃ 이상 40℃ 이하, 더욱 바람직하게는 5℃ 이상 30℃ 이하, 가장 바람직하게는 8℃이상 20℃ 이하인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 b) 단계는 p개의 표적 각각을 검출할 수 있는 p개의 프라이머 세트를 추가로 포함하고(여기서 p는 1 내지 20의 정수임),
상기 c) 단계는 상기 p개의 증폭산물과 모두 혼성화 할 수 있는 검출 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 검출 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), PNA(Peptide Nucleic Acid) 또는 LNA(Locked Nucleic Acid) 이고, 양 말단에 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 PNA(Peptide Nucleic Acid)는 LNA(Locked nucleic acid), MNA(Mopholino nucleic acid)처럼 유전자 인식 물질의 하나로, 인공적으로 합성하며 기본 골격이 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성 (selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다. 또한 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다. 또한 DNA-DNA 결합력 보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하여 1개의 핵산 불일치(nucleotide mismatch)에도 10~15℃가량 융해온도(Tm) 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP(single nucleotide polymorphism) 및 InDel(insertion/deletion) 핵산 변화를 검출할 수 있게 된다.
PNA 프로브의 핵산과 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 차이에 따라서도 Tm값의 변화를 나타내어 이를 이용한 응용기술의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 수화(hydrolysis) 반응과는 다른 혼성화(hybridization) 반응을 이용하여 분석하며, 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 표지 프로브(molecular beacon probe), 스콜피온 프로브(scorpion probe)가 있다.
본 발명에 있어서 상기 PNA 프로브는 제한되지는 않으나 리포터 또는 소광자가 결합되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적핵산과 혼성화 된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적 핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고 해상도의 융해곡선 분석을 통하여 표적핵산의 유무를 검출할 수 있다.
본 발명의 프로브는 양 말단에 리포터와 리포터 형광을 소광할 수 있는 소광자의 형광 물질이 결합할 수 있으며, 인터컬레이팅(intercalating) 형광 물질을 포함할 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX, Texas red, JOE, TAMRA, CY5, CY3, Alexa680 로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 또는 Dabcyl을 사용하는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 인터컬레이팅 형광 물질은 아크리딘 호모다이머(Acridine homodimer) 및 이의 유도체, 아크리딘 오렌지(Acridine Orange) 및 이의 유도체, 7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD) 및 이의 유도체, 액티노마이신 D(Actinomycin D) 및 이의 유도체, 에이씨엠에이(ACMA, 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) 및 이의 유도체, 디에이피아이(DAPI) 및 이의 유도체, 디하이드로에티듐(Dihydroethidium) 및 이의 유도체, 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-1(EthD-1) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-2(EthD-2) 및 이의 유도체, 에티듐 모노아자이드(Ethidium monoazide) 및 이의 유도체, 헥시디움 아이오다이드(Hexidium iodide) 및 이의 유도체, 비스벤지마이드(bisbenzimide, Hoechst 33258) 및 이의 유도체, 호에크스트 33342(Hoechst 33342) 및 이의 유도체, 호에크스트 34580(Hoechst 34580) 및 이의 유도체, 하이드로옥시스티바미딘(hydroxystilbamidine) 및 이의 유도체, 엘디에스 751(LDS 751) 및 이의 유도체, 프로피디움 아이오다이드(Propidium Iodide, PI)와 이의 유도체 및 사이다이스(Cy-dyes) 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서, 혼성화 반응의 분석 방법으로는 형광융해곡선분석(Fluorescence Melting Curve Analysis, FMCA)를 이용하며, 형광융해곡선분석은 PCR 반응 종료 후 생성된 산물과 투입한 프로브 간의 결합력 차이를 융해온도로 구분하여 분석한다. 다른 SNP 검출 프로브와는 다르게 프로브 디자인이 매우 간편하여 SNP를 포함하는 11~18 mer의 염기서열을 이용하여 제작한다. 따라서 원하는 융해온도를 갖는 프로브를 설계하기 위해서는 PNA 프로브의 길이에 따라 Tm값을 조절할 수 있으며, 같은 길이의 PNA 프로브라도 프로브에 변화를 주어 Tm 값을 조절할 수 있다. PNA는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 SNP라도 검출이 가능하다. 기존의 HRM method는 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 작아 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도변화가 요구되고 2개 이상의 SNP가 나타날 경우 분석이 어렵게 되는 반면, PNA 프로브는 프로브 서열 이외의 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 빠르고 정확한 분석이 가능하다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 융합 증폭산물의 검출은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 통해 이루어지며, 이때 융합 증폭산물의 증폭에 따른 증폭곡선(amplification curve)만을 수득하여 Ct (cycle threshold) 값을 측정하거나, 중합효소연쇄반응 후 융해곡선(melting curve)만을 수득하여 프로브에 의한 융해 피크(melting peak)를 측정하거나, 또는 증폭곡선과 융해곡선을 모두 수득하여 두 결과를 종합하여 이루어질 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
시료 내 표적핵산이 존재하여 융합 증폭산물이 일찍 증폭될수록, 검출 프로브에 의한 신호 발생량이 일찍 증가하므로 threshold에 도달하는 cycle 수가 줄어들어 Ct 값이 적게 측정되고, 이를 이용하여 표적핵산의 유무를 확인할 수 있다. 또한 융해곡선 분석은 일반적으로 실시간 중합효소연쇄반응의 핵산 증폭 과정 이후에 진행되며, 시료의 온도를 저온(25~55℃수준)으로 떨어뜨린 후에 고온(75~95℃수준)까지 1 내지 10초당 0.3 내지 1℃씩 증가시키거나 또는 시료의 온도를 고온으로 올린 후에 저온까지 1 내지 10초당 0.3 내지 1℃씩 감소시키면서 신호 패턴을 측정한다. 융합 증폭산물이 증폭된 경우, 상기 융해곡선 분석을 통해 융합 증폭산물과 결합한 프로브의 융해 온도(melting temperature, Tm) 부근에서 신호 패턴 변화가 나타나며, 이를 융해 피크(melting peak)로 분석하여 융합 증폭산물을 확인할 수 있다.
본 발명은 또한, i) n개의 표적 각각을 증폭할 수 있는 n개의 프라이머 세트; 및
ii) n개의 프라이머로 세트로 증폭된 n개의 증폭산물과 모두 혼성화할 수 있는 검출 프로브(여기서, 상기 n은 2 내지 20의 정수임)
를 포함하는 다중 표적 검출용 PCR 조성물로서,
상기 n개의 프라이머 세트 각각은
정방향 프라이머와 태그서열을 함유하는 역방향 프라이머로 구성되고,
상기 태그서열은 혼성화된 n개의 반응물의 융해온도가 상이하게 되도록 설계된 것을 특징으로 하는 다중 표적 검출용 PCR 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 PCR 조성물은
p개의 표적 각각을 검출할 수 있는 p개의 프라이머 세트를 추가로 포함하고(여기서 p는 1 내지 20의 정수임),
상기 p개의 증폭산물과 모두 혼성화 할 수 있는 검출 프로브를 추가로 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 다중 표적 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 버퍼(buffer), DNA 중합효소(DNA polymerase), DNA 중합효소 조인자(DNA polymerase cofactor) 및 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트(dNTP)와 같은 표적핵산 증폭 반응(예컨대, 중합효소연쇄반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 분자, 역전사효소(reverse transcriptase), 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트의 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 장비는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 시약을 포함하는 용기, 대리표적과 프라이머를 포함하는 용기 및 상기 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브를 포함하는 용기를 포함할 수 있다.
상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.
한편, 본 발명에서는 상기 검출방법을 이용하여 대조 유전자(reference gene) 대비 표적 유전자의 발현레벨을 비교분석 할 수 있을 것으로 예상하였다.
본 발명에서는 대조 유전자와 표적 유전자를 각각 태그서열이 포함된 프라이머로 증폭한 다음, 단일 검출 프로브로 융해곡선을 분석하여, 대조 유전자와 표적 유전자가 모두 검출되는 융해온도 및 표적 유전자만 검출되는 융해온도를 결정한 다음, 각 융해온도에서의 Ct값을 비교 분석할 경우, 대조 유전자 대비 표적 유전자의 발현레벨을 분석할 수 있음을 확인하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 β-actin을 대조 유전자로 설정하고, PD-1 및 PD-L1을 표적 유전자로 설정하여, Hcc827, MDA 및 MRC5 세포주의 mRNA를 cDNA로 제조한 다음, 각 유전자를 태그서열을 포함하는 프라이머로 증폭한 다음, 태그서열에 결합 가능한 검출 프로브와 상기 증폭산물을 혼성화시킨 후, 융해곡선을 분석하여, β-actin과 PD-1/PD-L1이 동시에 검출 가능한 온도는 50℃, PD-1/PD-L1만 검출 가능한 온도는 58℃ 인 것을 확인하였다.
그 후, 각 온도에서의 Ct 값을 측정하여 그 차이를 비교 분석한 결과, PD-1/PD-L1이 정상적으로 발현되는 MRC5 세포에서의 β-actin과 PD-1/PD-L1의 발현을 기준으로 Hcc827에서 PD-1/PD-L1은 β-actin 대비 각각 8배/18배 더 발현되는 것을 확인하였고, MDA에서는 5배/55배 더 발현되는 것을 확인하였다(도 6, 도 7).
따라서, 본 발명은 다른 관점에서,
a) 다중 표적 함유 시료에서 cDNA library를 수득하는 단계;
b) 대조 유전자(reference gene)를 증폭할 수 있는 프라이머 세트 및 n개의 표적 유전자 각각을 증폭할 수 있는 n개의 프라이머 세트로 대조 유전자 및 표적 유전자를 증폭하는 단계(여기서, n은 2 내지 20의 정수임);
c) 대조 유전자의 증폭산물 및 n개의 증폭산물과 모두 혼성화할 수 있는 검출 프로브를 상기 증폭산물과 혼성화시키는 단계;
d) 상기 c) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선을 분석하는 단계; 및
e) 대조 유전자와 표적 유전자를 동시에 검출할 수 있는 융해 온도 및 표적 유전자만 검출할 수 있는 융해온도에서의 Ct값을 비교 분석하는 단계를 포함하는 다중 표적 유전자의 발현레벨 분석방법으로,
상기 n개의 프라이머 세트 각각은
정방향 프라이머와 태그서열을 함유하는 역방향 프라이머로 구성되고,
상기 태그서열은 혼성화된 n개의 반응물의 융해온도가 상이하게 되도록 설계된 것을 특징으로 하는 다중 표적 유전자의 발현레벨 분석방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 e) 단계의 Ct값을 비교 분석하는 단계는
i) 대조 유전자와 표적 유전자를 동시에 검출할 수 있는 융해 온도에서의 Ct값과 표적 유전자만 검출할 수 있는 융해 온도에서의 Ct 값의 차이를 도출하는 단계;
ii) 하기 수식으로 Ct값의 차이를 환산하는 단계;
수식 1: 환산값 = 대조군의 2^(표적 유전자만 검출할 수 있는 융해 온도에서의 Ct 값-대조 유전자와 표적 유전자를 동시에 검출할 수 있는 융해 온도에서의 Ct값) / 검사군의 2^(표적 유전자만 검출할 수 있는 융해 온도에서의 Ct 값-대조 유전자와 표적 유전자를 동시에 검출할 수 있는 융해 온도에서의 Ct값)
및
iii) 상기 환산된 값을 통해 대조 유전자 대비 발현레벨을 확인하는 단계
로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 cDNA library는 시료에서 다양한 공지의 방법으로 수득하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 mRNA를 추출하여 RT-PCR(reverse transcriptase PCR)을 이용하여 cDNA library를 수득하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 검사군 또는 표적 유전자는 암의 진단 및 치료를 위해 PD-1, PD-L1, CTL4, LAG3, TIM3, BTLA, TIGIT, VISTA, KIR, A2AR, B7-H3, B7-H4, CD277 및 IDO로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 miR-17, miR-18a, miR-20a, miR-21, miR-27a 및 miR-155로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 대조군 또는 대조 유전자는 β-actin, a-tubuline 및 GAPDH로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 하우스 키핑 유전자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 뇌수막염 원인 바이러스 6종 및 세균 5종 검출
뇌수막염 원인 바이러스 6종(HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, EBV, HHV-6), 및 세균 5종(Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Listeria monocytogenes, Group B Streptococcus, Neisseria meningitides)을 검출하기 위한 정방향 프라이머, 태그서열을 포함하는 역방향 프라이머, 양기능성 PNA 형광 프로브를 제작하였다(표 2, 표 3).
프라이머 서열
서열번호 Name Sequence (5'-3') Target
1 V1-F GCTGTTCTCGTTCCTCACTGCC HSV-1
2 V1-R TGAAAATGCGAGTGTC CATACCCTACCCGCGTTCGGAC
3 V2-F CGCCAAATACGCCTTAGCAGAC HSV-2
4 V2-R TGAAAATGGAAGTGTC AGGTTCTTCCCGCGAAATCG
5 V3-F CCTTCAATTGCTTGGCGGACTCGG VZV
6 V3-R TGATAATGCAAGTCTC ACAAGATGAGCGAGTGTACCGATG
7 V4-F GCTGTAACTGTGGTTTCCATGACG CMV
8 V4-R TGAAAATGCAAGTGTC CGTGTGGCTTACCTGCTGCC
9 V5-F AGCGGGGTATGAGCTTTCCTGTTAC EBV
10 V5-R TCAAAATGCAAGTGTC CAGTCGGGCGAAATCTGTGTACC
11 V6-F GATATCGGATCGCAACAAGACCTCG HHV-6
12 V6-R TGAAGATGGAAGTGTC TCCGTTGCGTAATATGTCAAGGATGC
13 B1-F GGTCAATTCCTGTCGCAGTACC Streptococcus pneumoniae
14 B1-R CATGTGCCTACACCTG GTCCAAACAGCCTTAGGTCTTATGG
15 B2-F GTACGCTAACACTGCACGACG Haemophilus influenzae
16 B2-R CATGTGCATACACCTG GTAACACTGATGAACGTGGTACACCAG
17 B3-F GTTGACCGCAAATAGAGCCAAGC Listeria monocytogenes
18 B3-R CATGTGCCTACACGAG GTATTAGCGAGAACGGGACCATCATG
19 B4-F CAGCAACAACGATTGTTTCGCC Group B Streptococcus
20 B4-R CATGTCCATACACCTG CTTCCTCTTTAGCTGCTGGAAC
21 B5-F GCACACTTAGGTGATTTACCTGCAT Neisseria meningitidis
22 B5-R CATATCCCTACACCTG CCACCCGTGTGGATCATAATAGA

밑줄 친 문자; 역방향 프라이머의 5'- 태깅 서열
프로브 서열
서열변호 Name Sequence (5'-3') Fluor.
23 Detect P1 CAT　GTG　CCT　ACA　CCT　G FAM
24 Detect P2 TGA　AAA　TGC　AAG　TGT　C TxR
실시간 중합효소연쇄반응 실험 조건은 단일가닥 표적핵산을 생성하기 위해 비대칭 PCR (asymmetric PCR)을 이용하였다. 비대칭 PCR의 조건은 다음과 같다; 총 볼륨이 20㎕이 되도록 2X 시선바이오 리얼타임 FMCA™버퍼 (SeaSunBio Real-Time FMCA™buffer, 시선바이오, 한국), 2.5mM MgCl2, 200μM dNTPs, 1.0U Taq polymerase, 0.05μM 정방향 프라이머 (forward primer, 표 2) 및 0.5μM 역방향 프라이머 (reverse primer, 표 2)(asymmetric PCR), 0.5㎕ 형광 PNA 프로브(표 3)를 첨가하여 실시간 중합효소 연쇄반응 및 융해곡선 분석을 수행하였으며 분석 조건은 도 2와 같다.
그 결과, 도 3에 개시된 바와 같이, 뇌수막염 원인 세균 5종, 바이러스 6종의 검출이 가능한 것을 확인하였다.
각 바이러스 및 세균의 출처는 하기 표 4와 같다.
바이러스 및 세균 출처
No. Name 출처　
1 Streptococcus pneumoniae ATCC27336
2 Neisseria meningitidis ATCC13100
3 Haemophilus influenzae ATCC19418
4 Listeria monocytogenes ATCC15313
5 Streptococcus agalactiae ATCC14364
6 Human herpesvirus 1 KBPV-VR-52
7 Human herpesvirus 2 KBPV-VR-53
8 Varicella zoster virus AMX VZV Plasma Pnl ,Acrometrix
9 Epstein-Barr virus Acromatrix panel
10 Human cytomegalovirus KBPV-VR-7
11 Human herpesvirus 6 HHV-6 Virus 1st wHo International standard
실시예 2: 유전자 발현레벨 분석
2-1. 대조군과 실험군 융해 온도 결정
유전자 발현을 비교하기 위해 표준세포주 Hcc827, MDA 및 MRC5를 선정하였으며 (EA. Mittendorf et al, 2014, RHJ Janse et al, 2018, H Soliman et al, 2014), 해당 세포주들에서 추출한 RNA를 SuperiorScrip III Reverse Transcriptase (Enzynomics, RT006) kit를 사용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성을 위한 조건은 다음과 같다; 전체 볼륨이 20 ㎕가 되도록 5x Fist-Strand buffer, SuperiorScriptIII Reverse Transcriptase 200 units, dNTP Mixture 0.5mM, DTT 10mM, oligo dT 4uM, RNase inhibitor 20 units를 첨가하여 37℃에서 5분, 50℃에서 1시간, 70℃에서 15분간 반응하였다.
유전자 발현 분석을 위한 대조(reference) 유전자와 표적 유전자의 프라이머는 표 5와 같이 제작하였다. 실시예 1에서 제작한 양기능성 PNA 형광 프로브를 사용하여 CFX96™Real-Time 시스템 (BIO-RAD 사, 미국)에서 PCR을 수행하였다.
실시간 중합효소연쇄반응 실험 조건은 단일가닥 표적핵산을 생성하기 위해 비대칭 PCR (asymmetric PCR)을 이용하였다. 비대칭 PCR의 조건은 다음과 같다; 총 볼륨이 20㎕이 되도록 2X 시선바이오 리얼타임 FMCA™버퍼 (SeaSunBio Real-Time FMCA™buffer, 시선바이오, 한국), 2.5mM MgCl2, 200μM dNTPs, 1.0U Taq polymerase, 0.05μM 정방향 프라이머 (forward primer, 표 5) 및 0.5μM 역방향 프라이머 (reverse primer, 표4)(asymmetric PCR), 0.5㎕ 형광 PNA 프로브(표 3)를 첨가하여 실시간 중합효소 연쇄반응 및 융해곡선 분석을 수행하였으며 분석 조건은 도 4와 같다.
β-actin과 PD-1/PD-L1의 Ct값 분석에 적합한 annealing 온도를 결정하기 위해 PD-1/PD-L1의 검출 조건은 54℃~60℃, β-actin과 PD-1/PD-L1이 동시에 검출되는 조건은 48℃~52℃로 지정하여 분석한 결과 50℃와 58℃가 분석에 가장 용이하다는 것을 확인하였다(도 5).
프라이머 서열
서열번호 Name Sequence (5'-3') Target
25 β-actin-F GCACTCTTCCAGCCTTCC β-actin
26 β-actin-R TGAAAATGGAAGTGTC AGCACTGTGTTGGCGTACAG β-actin
27 PD-1-F CAGAGCTCAGGGTGACAGAGAG PD-1
28 PD-1-R TGAAAATGCAAGTCTC CCACGACACCAACCACCAGG PD-1
29 PD-L1-F TGCTGAACGCATTTACTGTCACGG PD-L1
30 PD-L1-R TGAAAATGCAAGTCTC ACCATAGCTGATCATGCAGCGGTA PD-L1

밑줄 친 문자; 역방향 프라이머의 5'- 태깅 서열
2-2. 대조군과 실험군의 발현레벨 분석
실시예 2-1의 방법으로 결정한 50℃와 58℃의 융해온도에서 Ct 값을 측정하기 위해 도 6의 조건으로 실시간 중합연쇄반응을 실시예 2-1과 같은 물질을 이용하여 수행한 다음, 하기 식으로 유전자 발현레벨을 분석하였다.
유전자 발현레벨 분석식: 대조 유전자의 2^(Ct58-Ct50)/ 표적 유전자의 2^(Ct58-Ct50)
그 결과, 도 7 및 도 8에 개시된 바와 같이, 대조군인 MRC-5 세포주와 비교하여 HCC-827, MDAMB-231 cell에서 PD-1, PD-L1 유전자의 발현레벨에 차이가 나타나는 것을 확인하였다.
각 세포주의 출처는 표 6과 같다.
세포주 출처
No. Cell line 이름 출처
1 MRC-5 KCLB10171
2 HCC-827 KCLB70827
3 MDAMB-231 ATCC HTB-26
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> SeasunBio Materials <120> Method for Detecting Multiple Target Based on Single Detection Probe using Tag sequence SNP <130> P18-B315 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> V1-F <400> 1 gctgttctcg ttcctcactg cc 22 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> V1-R <400> 2 tgaaaatgcg agtgtccata ccctacccgc gttcggac 38 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> V2-F <400> 3 cgccaaatac gccttagcag ac 22 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> V2-R <400> 4 tgaaaatgga agtgtcaggt tcttcccgcg aaatcg 36 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> V3-F <400> 5 ccttcaattg cttggcggac tcgg 24 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> V3-R <400> 6 tgataatgca agtctcacaa gatgagcgag tgtaccgatg 40 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> V4-F <400> 7 gctgtaactg tggtttccat gacg 24 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> V4-R <400> 8 tgaaaatgca agtgtccgtg tggcttacct gctgcc 36 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> V5-F <400> 9 agcggggtat gagctttcct gttac 25 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> V5-R <400> 10 tcaaaatgca agtgtccagt cgggcgaaat ctgtgtacc 39 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> V6-F <400> 11 gatatcggat cgcaacaaga cctcg 25 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> V6-R <400> 12 tgaagatgga agtgtctccg ttgcgtaata tgtcaaggat gc 42 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> B1-F <400> 13 ggtcaattcc tgtcgcagta cc 22 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> B1-R <400> 14 catgtgccta cacctggtcc aaacagcctt aggtcttatg g 41 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> B2-F <400> 15 gtacgctaac actgcacgac g 21 <210> 16 <211> 43 <212> DNA <213> B2-R <400> 16 catgtgcata cacctggtaa cactgatgaa cgtggtacac cag 43 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> B3-F <400> 17 gttgaccgca aatagagcca agc 23 <210> 18 <211> 42 <212> DNA <213> B3-R <400> 18 catgtgccta cacgaggtat tagcgagaac gggaccatca tg 42 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> B4-F <400> 19 cagcaacaac gattgtttcg cc 22 <210> 20 <211> 38 <212> DNA <213> B4-R <400> 20 catgtccata cacctgcttc ctctttagct gctggaac 38 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> B5-F <400> 21 gcacacttag gtgatttacc tgcat 25 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> B5-R <400> 22 catatcccta cacctgccac ccgtgtggat cataataga 39 <210> 23 <211> 16 <212> DNA <213> Detect P1 <400> 23 catgtgccta cacctg 16 <210> 24 <211> 16 <212> DNA <213> Detect P2 <400> 24 tgaaaatgca agtgtc 16 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> β-actin-F <400> 25 gcactcttcc agccttcc 18 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> β-actin-R <400> 26 tgaaaatgga agtgtcagca ctgtgttggc gtacag 36 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> PD-1-F <400> 27 cagagctcag ggtgacagag ag 22 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> PD-1-R <400> 28 tgaaaatgca agtctcccac gacaccaacc accagg 36 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> PD-L1-F <400> 29 tgctgaacgc atttactgtc acgg 24 <210> 30 <211> 40 <212> DNA <213> PD-L1-R <400> 30 tgaaaatgca agtctcacca tagctgatca tgcagcggta 40

Claims (13)

  1. a) 다중 표적 함유 시료에서 DNA를 수득하는 단계;
    b) n개의 다중 표적핵산 각각을 증폭할 수 있는 n개의 프라이머 세트를 이용하여 다중 표적핵산을 증폭하는 단계(여기서, n은 2 내지 30의 정수임);
    c) n개의 증폭산물과 모두 혼성화할 수 있는 단일 검출 프로브를 이용하여 상기 n개의 증폭산물과 혼성화시키는 단계; 및
    d) 상기 c) 단계에서 혼성화된 n개의 반응물 각각의 융해곡선을 분석하여 표적 핵산의 존재유무를 판별하는 단계를 포함하는 다중 표적 검출방법으로,
    상기 n개의 프라이머 세트 각각은
    정방향 프라이머와 태그서열을 함유하는 역방향 프라이머로 구성되고,
    상기 태그서열은 혼성화된 n개의 반응물의 융해온도가 상이하게 되도록 설계된 것을 특징으로 하는 다중 표적 검출방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 융해 온도 차이는 2℃ 내지 40℃인 것을 특징으로 하는 다중 표적 검출방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계는
    p개의 표적 각각을 검출할 수 있는 p개의 프라이머 세트를 추가로 포함하고(여기서 p는 1 내지 30의 정수임),
    상기 c) 단계는
    상기 p개의 증폭산물과 모두 혼성화 할 수 있는 검출 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 표적 검출방법.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 검출 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), PNA(Peptide Nucleic Acid) 또는 LNA(Locked Nucleic Acid) 이고, 양 말단에 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 다중 표적 검출방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 리포터 (reporter)는 FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro- 6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 다중 표적 검출방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 소광자 (quencher)는 TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 다중 표적 검출방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 다중 표적 검출방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 증폭은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 다중 표적 검출방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 시료는 물, 토양, 폐기물, 식품, 인체 유래물, 동식물 장내 및 동식물 조직으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 다중 표적 검출방법.
  10. i) n개의 표적 각각을 증폭할 수 있는 n개의 프라이머 세트; 및
    ii) n개의 프라이머로 세트로 증폭된 n개의 증폭산물과 모두 혼성화할 수 있는 검출 프로브(여기서, 상기 n은 2 내지 30의 정수임)
    를 포함하는 다중 표적 검출용 PCR 조성물로서,
    상기 n개의 프라이머 세트 각각은
    정방향 프라이머와 태그서열을 함유하는 역방향 프라이머로 구성되고,
    상기 태그서열은 혼성화된 n개의 반응물의 융해온도가 상이하게 되도록 설계된 것을 특징으로 하는 다중 표적 검출용 PCR 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    p개의 표적 각각을 검출할 수 있는 p개의 프라이머 세트를 추가로 포함하고(여기서 p는 1 내지 30의 정수임),
    상기 p개의 증폭산물과 모두 혼성화 할 수 있는 검출 프로브를 추가로 특징으로 하는 다중 표적 검출용 PCR 조성물.
  12. a) 다중 표적 함유 시료에서 cDNA library를 수득하는 단계;
    b) 대조 유전자(reference gene)를 증폭할 수 있는 프라이머 세트 및 n개의 표적 유전자 각각을 증폭할 수 있는 n개의 프라이머 세트로 대조 유전자 및 표적 유전자를 증폭하는 단계(여기서, n은 2 내지 20의 정수임);
    c) 대조 유전자의 증폭산물 및 n개의 증폭산물과 모두 혼성화할 수 있는 검출 프로브를 상기 증폭산물과 혼성화시키는 단계;
    d) 상기 c) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선을 분석하는 단계; 및
    e) 대조 유전자와 표적 유전자를 동시에 검출할 수 있는 융해 온도 및 표적 유전자만 검출할 수 있는 융해온도에서의 Ct값을 비교 분석하는 단계를 포함하는 다중 표적 유전자의 발현레벨 분석방법으로,
    상기 n개의 프라이머 세트 각각은
    정방향 프라이머와 태그서열을 함유하는 역방향 프라이머로 구성되고,
    상기 태그서열은 혼성화된 n개의 반응물의 융해온도가 상이하게 되도록 설계된 것을 특징으로 하는 다중 표적 유전자의 발현레벨 분석방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 e) 단계의 Ct값을 비교 분석하는 단계는
    i) 대조 유전자와 표적 유전자를 동시에 검출할 수 있는 융해 온도에서의 Ct값과 표적 유전자만 검출할 수 있는 융해 온도에서의 Ct 값의 차이를 도출하는 단계;
    ii) 하기 수식으로 Ct값의 차이를 환산하는 단계;
    수식 1= 환산값 = 대조군의 2^(표적 유전자만 검출할 수 있는 융해 온도에서의 Ct 값-대조 유전자와 표적 유전자를 동시에 검출할 수 있는 융해 온도에서의 Ct값) / 검사군의 2^(표적 유전자만 검출할 수 있는 융해 온도에서의 Ct 값-대조 유전자와 표적 유전자를 동시에 검출할 수 있는 융해 온도에서의 Ct값)
    및
    iii) 상기 환산된 값을 통해 대조 유전자 대비 발현레벨을 확인하는 단계
    로 수행되는 것을 특징으로 하는 다중 표적 유전자의 발현레벨 분석방법.
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