DE112020000525T5

DE112020000525T5 - Verfahren zum nachweis mehrerer ziele basierend auf einer einzigennachweissonde unter verwendung eines markierungs-sequenz-snp

Info

Publication number: DE112020000525T5
Application number: DE112020000525.9T
Authority: DE
Inventors: Si Seok LEE; Eun Ju Yang; Kyung Tak Kim; Mee-Hyang Jeon; Hee Kyung Park
Original assignee: Seasun Biomaterials
Current assignee: Seasun Biomaterials
Priority date: 2019-01-24
Filing date: 2020-01-22
Publication date: 2021-10-14
Also published as: TWI795626B; US20220145284A1; KR102097721B1; TW202208636A; TW202043485A; WO2020153764A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis mehrerer Ziele auf der Basis einer einzigen Nachweissonde und insbesondere ein Verfahren zum Nachweis mehrerer Ziele durch Amplifikation jedes Ziels mit Primern, die eine SNP-haltige Markierungs-Sequenz enthalten, Hybridisierung der Amplifikationsprodukte mit einer einzigen Nachweissonde, die in der Lage ist, an die Markierungs-Sequenzen zu binden und so gestaltet ist, dass die Schmelztemperaturen voneinander verschieden sind, und Analyse der Schmelzkurven. Ein Verfahren zum Nachweisen mehrerer Ziele gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht den Nachweis mehrerer Ziele unter Verwendung einer einzigen Sonde und ist daher nützlich für den Nachweis mehrerer Ziele, da falsch-positive Ergebnisse reduziert werden und mehrere Ziele mit hoher Sensitivität und mit einer schnellen Rate nachweisbar sind.

Description

[Technisches Gebiet]
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis mehrerer Ziele auf der Basis einer einzigen Nachweissonde und insbesondere ein Verfahren zum Nachweis mehrerer Ziele durch Amplifikation jedes Ziels mit Primern, die eine Markierungs-Sequenz enthalten, die so gestaltet ist, dass die Schmelztemperaturen der hybridisierten Reaktionsprodukte der Amplifikationsprodukte und einer Nachweissonde voneinander verschieden sind, und anschließende Hybridisierung der Amplifikationsprodukte mit einer einzigen Nachweissonde, die an alle Markierungs-Sequenzen bindet, und Analyse der Schmelzkurven.
[Hintergrund]
Der Bereich der Diagnose spezifischer Nukleinsäuren wird zur Unterscheidung von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), zum Nachweis und zur Identifizierung pathogener Bakterien oder Viren sowie zur Diagnose genetischer Krankheiten verwendet. Daher wurden viele Methoden zum schnellen und genauen Nachweis spezifischer Nukleinsäuren vorgeschlagen, und viele diesbezügliche Studien werden derzeit durchgeführt (W. Shen et al. , 2013, Biosen. and Bioele., 42:165-172.; M.L. Ermini et al., 2014, Biosen. and Bioele., 61:28-37.;K. Chang et al., 2015, Biosen. and Bioele., 66:297-307.).
Zu den am häufigsten verwendeten Methoden zum Nachweis einer spezifischen Nukleinsäure gehören insbesondere die Methode der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sowie Methoden der Echtzeit-PCR und der Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion (Multiplex-PCR).
Die PCR hat den Vorteil, dass sie an die Template-DNA binden kann und durch das Design eines Primers oder einer Sonde, an die ein fluoreszierendes Material und ein Quencher gebunden sind, eine exakte Amplifikation nur einer Zielregion eines nachzuweisenden Gens ermöglicht. Es kann jedoch nur eine Nukleinsäure in einer Reaktion amplifiziert werden, so dass bei einer großen Anzahl von zu amplifizierenden Nukleinsäuren derselbe Vorgang wiederholt werden muss, was umständlich ist.
Die Echtzeit-PCR misst Amplifikationsprodukte in Echtzeit, reduziert Kreuzkontaminationen und ermöglicht eine genauere quantitative Analyse. Als gängige Patentdokumente im Zusammenhang mit der Echtzeit-PCR gibt es die U.S. Pat. Nr. 5,210,015, 5,538,848 und 6,326,145 .
Bestehende Echtzeit-PCR-Methoden sind vorteilhaft in Bezug auf eine homogene Assay-Methode, bei der Amplifikation und Nachweis gleichzeitig durchgeführt werden, haben aber das Problem der Multiplizität, da die Anzahl der Ziel-Nukleinsäuresequenzen, die gleichzeitig nachgewiesen werden können, aufgrund einer Beschränkung bei der Art der fluoreszierenden Reportermoleküle begrenzt ist, was das größte Hindernis für die Realisierung eines hohen Durchsatzes darstellt. Bestehende Thermocycler, die in der Lage sind, Ziel-Nukleinsäuresequenzen in Echtzeit nachzuweisen, ermöglichen den gleichzeitigen Nachweis von maximal 5-Plex, und somit ist die Anzahl der Ziel-Nukleinsäuresequenzen, die gleichzeitig nachgewiesen werden können, begrenzt, und es sind viel Zeit und zusätzliche teure Echtzeit-Überwachungsgeräte erforderlich, um eine Probe mit einem großen Volumen zu analysieren.
Eine TaqMan-Sonden-Methode ( US-Patent Nr. 5,210,015 ) und eine selbstquenchende Fluoreszenzsonden-Methode ( US-Patent Nr. 5,723,591 ), die repräsentative Echtzeit-PCR-Methoden sind, haben das Problem des Auftretens von falschpositiven Ergebnissen aufgrund unspezifischer Bindung einer doppelt markierten Sonde, und daher ist es praktisch schwierig, 5-Plex-Reaktionen durchzuführen, und es sind notwendigerweise spezielle Fähigkeiten und Know-how erforderlich. Da eine herkömmliche Echtzeit-PCR-Methode gleichzeitig Amplifikation und Nachweis durchführt, gibt es eine Einschränkung beim hohen Durchsatz von Echtzeit-PCR-Geräten.
Die Multiplex-PCR hat den Vorteil, dass mehrere Polymerase-Kettenreaktionen in einem Röhrchen durchgeführt werden und somit eine Vielzahl von Nukleinsäuren gleichzeitig analysiert wird. Da jedoch viele Primer oder Sonden gleichzeitig in einem Röhrchen verwendet werden, kommt es zu Kreuzreaktionen zwischen den Sonden und den Primern bzw. zwischen den Primern, so dass die Anzahl der gleichzeitig amplifizierbaren Nukleinsäuren begrenzt ist, viel Aufwand und Zeit für die Festlegung der Reaktionsbedingungen erforderlich ist und keine guten Ergebnisse in Bezug auf Sensitivität und Spezifität erzielt werden können (Hardenbol et al., 2003, Nat. Biotechnol., 21:673.).
Da eine nachzuweisende Nukleinsäure nur mit einem fluoreszierenden Material markiert werden kann und die derzeit für den Nachweis fluoreszierender Materialien verwendeten Geräte eine Einschränkung dahingehend aufweisen, dass die Anzahl der Fluoreszenzkanäle, die gleichzeitig analysiert werden können, auf typischerweise 4 bis 7 Typen begrenzt ist, ergibt sich das Problem, dass zwei oder mehr identische Arbeitsgänge wiederholt werden müssen, um 8 oder mehr Nukleinsäuren zu analysieren.
Daher wurden in letzter Zeit aktiv Studien durchgeführt, um eine Massenanalyse durch die gleichzeitige Amplifikation einer Vielzahl von Nukleinsäuren mit gemeinsamen Primern zu ermöglichen, ohne die Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion zu verwenden. Zu den repräsentativen Technologien gehören SNPlex, Goldengate-Assay, molekulare Inversionssonden (MIPs) und dergleichen.
SNPlex ist eine Methode, bei der nach einem Oligonukleotid-Ligations-Assay (OLA) eine Aufreinigung mit einer Exonuklease durchgeführt wird und eine Polymerase-Kettenreaktion-Amplifikation mit gemeinsamen Primer-Basensequenzen, die an den gegenüberliegenden Enden einer Sonde vorhanden sind, durchgeführt wird und schließlich eine Analyse in einem DNA-Chip mit einer in der Sonde enthaltenen ZipCode-Basensequenz erfolgt (Tobler et al., J. Biomol. Tech., 16:398, 2005).
Der Goldengate-Assay ist eine Methode, bei der eine Allel-spezifische Primer-Extensionsreaktion an genomischer DNA, die auf einer festen Oberfläche immobilisiert ist, unter Verwendung einer Upstream-Sonde durchgeführt wird. Danach wird die DNA mit einer Downstream-Sonde ligiert und gewaschen, um die nicht an die DNA ligierten Sonden zu entfernen, die DNA wird unter Verwendung gemeinsamer Primer-Nukleotidsequenzen, die in den Sonden enthalten sind, wie im Fall von SNPlex, amplifiziert und die amplifizierten PCR-Produkte werden unter Verwendung von Illumina BeadChip analysiert (Shen et al, Mutat. Res., 573:70, 2005).
Bei den molekularen Inversionssonden (MIPs) handelt es sich um eine Methode, bei der eine Lückenligierung mit einer Padlock-Sonde durchgeführt wird, danach werden die Sonden und die nicht an die DNA ligierte genomische DNA mit einer Exonuklease entfernt und die Padlock-Sonde mit Uracil-N-Glykosylase linearisiert, gefolgt von einer Polymerase-Kettenreaktion mit gemeinsamen Primer-Nukleotidsequenzen, die in den Sonden enthalten sind, und einer Hybridisierung mit dem GenFlex-Tag-Array (Affymetrix), um verschiedene Genregionen zu analysieren (Hardenbol et al, Nat. Biotechnol., 21:673, 2003).
Diese Methoden haben jedoch das Problem, dass, da Teile der Reaktionsprodukte in einem ersten Röhrchen transferiert und in einem zweiten Röhrchen umgesetzt werden oder mehrere Arten von Enzymen verwendet werden sollten, Kreuzkontaminationen zwischen den Proben auftreten können und die experimentellen Methoden kompliziert sind.
Als Ergebnis intensiver Bemühungen, die oben beschriebenen Probleme zu lösen und ein Verfahren zum Nachweis mehrerer Ziele unter Verwendung einer einzigen Sonde zu entwickeln, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung daher bestätigt, dass bei der Amplifikation mehrerer Ziele mit Primern, die eine Markierungs-Sequenz enthalten, die so gestaltet ist, dass die Schmelztemperaturen der hybridisierten Produkte der Amplifikationsprodukte und einer Nachweissonde voneinander verschieden sind, bei der Hybridisierung der Ziele mit einer einzigen Nachweissonde, die an alle Markierungs-Sequenzen bindet, und bei der anschließenden Analyse der Schmelzkurven, mehrere Ziele mit hoher Empfindlichkeit und hoher Genauigkeit nachgewiesen werden können, wodurch die vorliegende Erfindung vervollständigt wird.
[Offenbarung]
[Technisches Problem]
Daher wurde die vorliegende Erfindung im Hinblick auf die oben genannten Probleme gemacht, und es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis mehrerer Ziele bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine PCR-Zusammensetzung zum Nachweis mehrerer Ziele bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Analyse der Expressionsniveaus mehrerer Zielgene bereitzustellen.
[Technische Lösung]
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung können die obigen und andere Aufgaben durch die Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweis mehrerer Ziele erreicht werden, wobei das Verfahren umfasst: a) Gewinnen von DNA aus einer Probe, die mehrere Ziele enthält; b) Amplifizieren von mehreren Ziel-Nukleinsäuren unter Verwendung von n Primersätzen, die in der Lage sind, jeweils n mehrere Ziel-Nukleinsäuren zu amplifizieren (wobei n eine ganze Zahl von 2 bis 20 ist); c) Hybridisieren der n Amplifikationsprodukte mit einer einzelnen Nachweissonde, die in der Lage ist, mit den n Amplifikationsprodukten zu hybridisieren; und d) Analysieren einer Schmelzkurve von jedem der n Reaktionsprodukte, die in Verfahren c) hybridisiert wurden, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit der Zielnukleinsäuren zu bestimmen, wobei jeder der n Primersätze einen Vorwärtsprimer und einen Rückwärtsprimer, der eine Markierungs-Sequenz umfasst, umfasst, wobei die Markierungs-Sequenzen so gestaltet sind, dass die Schmelztemperaturen der n hybridisierten Reaktionsprodukte voneinander verschieden sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine PCR-Zusammensetzung zum Nachweis mehrerer Ziele bereitgestellt, wobei die PCR-Zusammensetzung umfasst: i) n Primersätze, die in der Lage sind, jeweils n Ziele zu amplifizieren; und ii) eine Nachweissonde, die in der Lage ist, mit n Amplifikationsprodukten zu hybridisieren, die mit den n Primersätzen amplifiziert wurden (wobei n eine ganze Zahl von 2 bis 20 ist), wobei jeder der n Primersätze aus einem Vorwärtsprimer und einem Rückwärtsprimer besteht, die eine Markierungs-Sequenz umfassen, wobei die Markierungs-Sequenzen so gestaltet sind, dass die Schmelztemperaturen der n hybridisierten Reaktionsprodukte voneinander verschieden sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Analyse des Expressionsniveaus mehrerer Zielgene bereitgestellt, das Folgendes umfasst: a) Erhalten einer cDNA-Bibliothek aus einer Probe, die mehrere Ziele enthält; b) Amplifizieren eines Referenzgens und von Zielgenen mit einem Primersatz, der in der Lage ist, das Referenzgen zu amplifizieren, und n Primersätze, die in der Lage sind, jeweils n Zielgene zu amplifizieren (wobei n eine ganze Zahl von 2 bis 20 ist); c) Hybridisieren der Amplifikationsprodukte mit einer Nachweissonde, die in der Lage ist, mit dem gesamten Amplifikationsprodukt des Referenzgens und den n Amplifikationsprodukten zu hybridisieren; d) Analysieren von Schmelzkurven der in Verfahren c) hybridisierten Reaktionsprodukte; und e) Vergleichen und Analysieren von Ct-Werten bei einer Schmelztemperatur, bei der das Referenzgen und die Zielgene gleichzeitig nachweisbar sind, und bei einer Schmelztemperatur, bei der nur die Zielgene nachweisbar sind, wobei jeder der n Primersätze aus einem Vorwärtsprimer und einem Rückwärtsprimer einschließlich einer Markierungs-Sequenz besteht, wobei die Markierungs-Sequenzen so gestaltet sind, dass die Schmelztemperaturen der n hybridisierten Reaktionsprodukte voneinander verschieden sind.
Figurenliste
Die obigen und andere Aufgaben, Merkmale und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen klarer verstanden, in denen:

1 eine Ansicht ist, die das Konzept eines Verfahrens zum Nachweis mehrerer Ziele gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht;
2 die Bedingungen für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Echtzeit zum Nachweis von Viren und Bakterien, die mit Meningitis in Zusammenhang stehen, veranschaulicht, unter Verwendung eines Verfahrens zum Nachweis mehrerer Ziele gemäß der vorliegenden Erfindung;
3 die Ergebnisse des gleichzeitigen Nachweises von Meningitisviren und Bakterien unter Verwendung eines Verfahrens zum Nachweis mehrerer Ziele gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt;
4 eine Ansicht ist, die Echtzeit-PCR-Bedingungen für die Bestimmung von Tm-Werten zur Analyse der Expressionsniveaus von Zielgenen in Bezug auf ein Referenzgen unter Verwendung eines Verfahrens zum Nachweis mehrerer Ziele gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt;
5 die Ergebnisse der Analyse von Ct-Werten nach Temperatur zur Bestätigung der Expressionsniveaus von Zielgenen in Bezug auf ein Referenzgen unter Verwendung eines Verfahrens zum Nachweis mehrerer Ziele gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt;
6 eine Ansicht ist, die Echtzeit-PCR-Bedingungen für die Analyse der Expressionsniveaus von Zielgenen in Bezug auf ein Referenzgen unter Verwendung eines Verfahrens zum Nachweis mehrerer Ziele gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt;
7 die Ergebnisse der Analyse des Expressionsniveaus eines ersten Zielgens in Bezug auf ein Referenzgen unter Verwendung eines Verfahrens zum Nachweis mehrerer Ziele gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht; und
8 die Ergebnisse der Analyse des Expressionsniveaus eines zweiten Zielgens in Bezug auf ein Referenzgen zeigt, unter Verwendung eines Verfahrens zum Nachweis mehrerer Ziele gemäß der vorliegenden Erfindung.

[Detaillierte Beschreibung und beispielhafte Ausführungsformen]
Sofern nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie von einem Fachmann auf dem Gebiet, auf das sich die vorliegende Erfindung bezieht, allgemein verstanden werden. Im Allgemeinen sind die hier verwendete Nomenklatur und die im Folgenden beschriebenen experimentellen Methoden in der Fachwelt bekannt und gebräuchlich.
Die vorliegende Erfindung dient der Bestätigung, dass bei der Amplifikation von Zielen mit Primersätzen, die Markierungs-Sequenzen enthalten, die so gestaltet sind, dass die Schmelztemperaturen der hybridisierten Reaktionsprodukte von Amplifikationsprodukten und einer Nachweissonde unterschiedlich sind, bei der Hybridisierung der Amplifikationsprodukte mit einer einzigen Sonde, die an alle Markierungs-Sequenzen bindet, und bei der anschließenden Analyse der Schmelzkurven mehrere Ziele mit einer einzigen Sonde nachgewiesen werden können.
Das heißt, in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wenn entsprechende Primersätze, die in der Lage sind, 6 Arten von Viren, die Meningitis verursachen (HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, EBV und HHV-6), und 5 Arten von Bakterien, die Meningitis verursachen (Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Listeria monocytogenes, Streptococcus der Gruppe B, und Neisseria meningitides) zu amplifizieren, mit verschiedenen Markierungs-Sequenzen für jedes Virus und Bakterium fusioniert wurden und dann Amplifikationsprodukte hergestellt wurden und mit einer ersten Nachweissonde, die in der Lage ist, an alle Markierungs-Sequenzen von 6 Viren zu binden, und einer zweiten Nachweissonde, die in der Lage ist, an alle Markierungs-Sequenzen von 5 Bakterien zu binden, hybridisiert wurden, woraufhin Schmelzkurven analysiert wurden, wurde bestätigt, dass jedes Virus und jedes Bakterium mit hoher Empfindlichkeit nachgewiesen werden konnte (siehe 1 bis 3).
Daher bezieht sich eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auf ein Verfahren zum Nachweis mehrerer Ziele, umfassend:

a) Gewinnung von DNA aus einer Probe, die mehrere Ziele enthält;
b) Amplifizieren von mehreren Zielnukleinsäuren unter Verwendung von n Primersätzen, die jeweils in der Lage sind, n Zielnukleinsäuren zu amplifizieren (wobei n eine ganze Zahl von 2 bis 20 ist);
c) Hybridisieren der n Amplifikationsprodukte mit einer einzelnen Nachweissonde, die mit den n Amplifikationsprodukten hybridisieren kann; und
d) Analysieren einer Schmelzkurve von jedem der n Reaktionsprodukte, die in Verfahren c) hybridisiert wurden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit der Zielnukleinsäuren zu bestimmen,

einen Vorwärtsprimer und einen Rückwärtsprimer, die eine Markierungs-Sequenz enthalten, und
die Markierungs-Sequenzen so gestaltet sind, dass die Schmelztemperaturen der n hybridisierten Reaktionsprodukte unterschiedlich sind.

Der hier verwendete Begriff „Ziel“ bedeutet alle Arten von nachzuweisenden Nukleinsäuren und umfasst chromosomale Nukleotidsequenzen, die von verschiedenen Spezies, Unterspezies oder Varianten stammen, sowie chromosomale Mutationen innerhalb derselben Spezies. Das Ziel kann alle Arten von DNA, einschließlich genomischer DNA, mitochondrialer DNA und viraler DNA, oder alle Arten von RNA, einschließlich mRNA, miRNA, ribosomaler RNA, nichtkodierender RNA, tRNA und viraler RNA umfassen, aber die vorliegende Erfindung ist darauf nicht beschränkt.
In der vorliegenden Erfindung kann das Ziel eine mutierte Nukleotidsequenz sein, einschließlich einer Mutation in der Nukleotidsequenz, und die Mutation kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einem Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP), einer Insertion, einer Deletion, einer Punktmutation, einer Fusionsmutation, einer Translokation, einer Inversion und einem Verlust der Heterozygotie (LOH) besteht, aber die vorliegende Erfindung ist darauf nicht beschränkt.
In der vorliegenden Erfindung kann das Ziel eine Nukleinsäure sein, die in der Lage ist, ein spezifisches Bakterium oder Virus nachzuweisen, ist aber nicht darauf beschränkt.

Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Nukleosid“ auf eine Glykosylaminverbindung, in der eine Nukleinsäurebase (Nukleobase) mit einem Zuckerteil verbunden ist. Ein „Nukleotid“ bedeutet ein Nukleosidphosphat. Wie in Tabelle 1 gezeigt, können Nukleotide durch alphabetische Buchstaben (Buchstabennamen) dargestellt werden, die den Nukleosiden davon entsprechen. Zum Beispiel bezieht sich A auf Adenosin (ein Nukleosid, das eine Adenin-Nukleobase enthält), C bezieht sich auf Cytidin, G bezieht sich auf Guanosin, U bezieht sich auf Uridin und T bezieht sich auf Thymidin (5-Methyluridin). W bezieht sich auf A oder T/U, und S bezieht sich auf G oder C. N bezeichnet ein beliebiges Nukleosid, und dNTP bedeutet Desoxyribonukleosidtriphosphat. N kann eines von A, C, G oder T/U sein. [Tabelle 1]

Alphabetischer Buchstabe	Nukleotid, dargestellt durch den alphabetischen Buchstaben
G	G
A	A
T	T
C	C
U	U
R	G oder A
Y	T/U oder C
M	A oder C
K	G oder T/U
_S	G oder C
W	A oder T/U
H	A oder C oder T/U
B	G oder T/U oder C
V	G oder C oder A
D	G oder A oder T/U
N	G oder A oder T/U oder C

Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Oligonukleotid“ auf ein Oligomer von Nukleotiden. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Nukleinsäure“ auf ein Polymer aus Nukleotiden. Der hier verwendete Begriff „Sequenz“ bezieht sich auf die Nukleotidsequenz eines Oligonukleotids oder einer Nukleinsäure. Wenn in der gesamten Beschreibung ein Oligonukleotid oder eine Nukleinsäure durch eine Buchstabenfolge dargestellt wird, stehen die Nukleotide in einer 5'→ Reihenfolge von links nach rechts. Oligonukleotide oder Nukleinsäuren können DNA, RNA oder Analoga davon sein (z.B. Phosphorothioat-Analoga). Oligonukleotide oder Nukleinsäuren können auch modifizierte Basen und/oder Rückgrate enthalten (z.B. modifizierte Phosphatbindungen oder modifizierte Zuckereinheiten). Nicht einschränkende Beispiele für synthetische Rückgrate, die den Nukleinsäuren Stabilität und/oder andere Vorteile verleihen, können Phosphorothioat-Bindungen, Peptid-Nukleinsäuren, gesperrte Nukleinsäuren, Xylose-Nukleinsäuren oder Analoga davon umfassen.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Nukleinsäure“ auf ein Nukleotidpolymer und schließt bekannte Analoga natürlicher Nukleotide ein, die in ähnlicher Weise wie natürlich vorkommende Nukleotide wirken können (z.B. Hybridisierung), sofern nicht anders definiert.
Der Begriff „Nukleinsäure“ umfasst jede Form von DNA oder RNA, einschließlich z.B. genomischer DNA, komplementärer DNA (cDNA), die eine DNA-Darstellung von mRNA ist und in der Regel durch reverse Transkription oder Amplifikation von Boten-RNA (mRNA) gewonnen wird, sowie synthetisch oder durch Amplifikation hergestellte DNA-Moleküle und mRNA.
Der Begriff „Nukleinsäure“ umfasst sowohl doppel- oder dreistrangige Nukleinsäuren als auch einzelsträngige Moleküle. Bei doppel- oder dreisträngigen Nukleinsäuren müssen die Nukleinsäurestränge nicht koextensiv sein (d. h. doppelsträngige Nukleinsäuren müssen nicht über die gesamte Länge beider Stränge doppelsträngig sein).
Der Begriff „Nukleinsäure“ schließt auch jede chemische Modifikation derselben ein, z. B. durch Methylierung und/oder durch Kappen. Nukleinsäuremodifikationen können das Hinzufügen chemischer Gruppen umfassen, die einzelnen Nukleinsäurebasen oder einer Nukleinsäure als Ganzes eine zusätzliche Ladung, Polarisierbarkeit, Wasserstoffbrückenbindung, elektrostatische Wechselwirkung oder andere Funktionalität verleihen. Solche Modifikationen können Basenmodifikationen wie Zuckermodifikationen in 2'-Position, Pyrimidinmodifikationen in 5-Position, Purinmodifikationen in 8-Position, Modifikationen an exocyclischen Aminen von Cytosin, Substitutionen von 5-BromUracil, Modifikationen des Rückgrats und ungewöhnliche Basenpaarungskombinationen wie die Isobasen Isocytidin und Isoguanidin umfassen.
Die Nukleinsäure(n) kann/können durch ein vollständiges chemisches Syntheseverfahren, wie z. B. die Festphasenvermittelte chemische Synthese, aus einer biologischen Quelle, wie z. B. der Isolierung aus einer beliebigen Spezies, die eine Nukleinsäure produziert, aus Prozessen, die die Handhabung von Nukleinsäuren durch molekularbiologische Werkzeuge beinhalten, wie z. B. DNA-Replikation, PCR-Amplifikation und reverse Transkription, oder aus einer Kombination dieser Prozesse gewonnen werden.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „komplementär“ auf die Fähigkeit zur genauen Paarung zwischen zwei Nukleotiden. Das heißt, wenn ein Nukleotid an einer bestimmten Position einer Nukleinsäure in der Lage ist, eine Wasserstoffbrücke mit einem Nukleotid einer anderen Nukleinsäure zu bilden, werden zwei Nukleinsäuren an dieser Position als komplementär zueinander betrachtet. Die Komplementarität zwischen zwei einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen kann „partiell“ sein, wobei sich nur einige der Nukleotide binden, oder sie kann vollständig sein, wenn eine vollständige Komplementarität zwischen einzelsträngigen Molekülen besteht. Der Grad der Komplementarität zwischen Nukleinsäuresträngen hat erhebliche Auswirkungen auf die Effizienz und Stärke der Hybridisierung zwischen Nukleinsäuresträngen.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Primer“ auf ein kurzes lineares Oligonukleotid, das an eine Ziel-Nukleinsäuresequenz (z. B. eine zu amplifizierende DNA-Vorlage) zur Programmierung einer Nukleinsäuresynthesereaktion hybridisiert. Der Primer kann ein RNA-Oligonukleotid, ein DNA-Oligonukleotid oder eine chimäre Sequenz sein. Primer können natürliche, synthetische oder modifizierte Nukleotide enthalten. Sowohl die obere als auch die untere Grenze der Länge des Primers werden experimentell bestimmt. Die untere Grenze der Primerlänge ist die Mindestlänge, die erforderlich ist, um bei der Hybridisierung mit einer Zielnukleinsäure unter den Bedingungen der Nukleinsäureamplifikationsreaktion einen stabilen Duplex zu bilden. Sehr kurze Primer (üblicherweise weniger als 3 Nukleotide lang) bilden unter solchen Hybridisierungsbedingungen keine thermodynamisch stabilen Duplexe mit Zielnukleinsäuren. Die Obergrenze wird im Allgemeinen durch die Möglichkeit bestimmt, einen Duplex in einem anderen Bereich als der vorgegebenen Nukleinsäuresequenz zu bilden. Im Allgemeinen kann die Länge geeigneter Primer von etwa 3 Nukleotiden bis zu etwa 50 Nukleotiden reichen.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Sonde“ auf eine Nukleinsäure, die in der Lage ist, an eine Zielnukleinsäure mit einer komplementären Sequenz durch eine oder mehrere Arten von chemischen Bindungen zu binden, im Allgemeinen durch komplementäre Basenpaarung, in der Regel durch Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen, wodurch eine Duplexstruktur gebildet wird. Sonden binden oder hybridisieren an „Sonden-Bindungsstellen“. Sobald eine Sonde an ein zur Sonde komplementäres Ziel hybridisiert, kann die Sonde mit einer nachweisbaren Markierung versehen werden, um den Nachweis der Sonde zu erleichtern. Alternativ kann die Sonde jedoch auch unmarkiert sein, aber durch spezifische Bindung mit einem markierten Liganden, entweder direkt oder indirekt, nachweisbar sein. Sonden können in ihrer Größe erheblich variieren. Sonden haben im Allgemeinen eine Länge von mindestens 7 bis 18 Nukleotiden. Andere Sonden haben eine Länge von mindestens 20, 30 oder 40 Nukleotiden. Wieder andere Sonden sind etwas länger und haben eine Länge von mindestens 50, 60, 70, 80 oder 90 Nukleotiden. Wiederum andere Sonden sind viel länger und haben eine Länge von mindestens 100, 150, 200 oder mehr Nukleotiden. Sonden können auch eine Länge innerhalb eines beliebigen Bereichs haben, der durch einen der oben genannten Werte begrenzt ist (z. B. 15-20 Nukleotide Länge).
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Hybridisierung“ auf die Bildung von doppelsträngigen Nukleinsäuren durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen einzelsträngigen Nukleinsäuren mit komplementären Nukleotidsequenzen und wird austauschbar mit dem Begriff „Annealing“ verwendet. In einem etwas weiteren Sinne umfasst die Hybridisierung nicht nur den Fall, dass Nukleotidsequenzen zwischen zwei Einzelsträngen vollständig komplementär sind (perfekte Übereinstimmung), sondern ausnahmsweise auch den Fall, dass einige Nukleotidsequenzen nicht komplementär sind (fehlerhafte Übereinstimmung).
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Probe“ auf eine Zusammensetzung, die ein Ziel enthält oder von der angenommen wird, dass sie ein Ziel enthält und analysiert werden soll, und kann eine Probe sein, die aus einem oder mehreren, ausgewählt aus Flüssigkeit, Boden, Luft, Lebensmitteln, Abfall, von Menschen stammenden Substanzen, Tierdärmen und tierischen und pflanzlichen Geweben, entnommen wird, aber die vorliegende Erfindung ist darauf nicht beschränkt. In dieser Hinsicht kann die Flüssigkeit Wasser, Blut, Urin, Tränen, Schweiß, Speichel, Lymphe, zerebrospinale Flüssigkeit und dergleichen sein, das Wasser umfasst Flusswasser, Meerwasser, Seewasser, Regenwasser und dergleichen, der Abfall umfasst Abwasser, Schmutzwasser und dergleichen, und die tierischen und pflanzlichen Gewebe umfassen die von Menschen. Darüber hinaus umfassen die tierischen und pflanzlichen Gewebe Gewebe wie Schleimhäute, Haut, Rinden, Haare, Schuppen, Augen, Zungen, Wangen, Hufe, Schnäbel, Rüssel, Füße, Hände, Münder, Brustwarzen, Ohren und Nasen.
Vorzugsweise kann die Probe der vorliegenden Erfindung eine biologische Probe sein, die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung analysiert werden soll. Noch bevorzugter kann die Probe eine Probe sein, die mit einer Virusart gemischt ist, oder eine Probe eines Individuums (z. B. eines Menschen, eines Säugetiers und eines Fisches), das mit dem Virus infiziert ist, und eine biologische Probe, die von einer Pflanze, einem Tier, einem Menschen, einem Pilz, einem Bakterium und einem Virus stammt, kann analysiert werden. Wenn eine Probe aus einem Säugetier oder einem Menschen analysiert wird, kann die Probe aus einem bestimmten Gewebe oder Organ stammen. Repräsentative Beispiele für Gewebe sind Bindegewebe, Haut, Muskel- oder Nervengewebe. Repräsentative Beispiele für Organe sind die Augen, das Gehirn, die Lunge, die Leber, die Milz, das Knochenmark, die Thymusdrüse, das Herz, die Lymphe, das Blut, die Knochen, der Knorpel, die Bauchspeicheldrüse, die Nieren, die Gallenblase, der Magen, der Dünndarm, die Hoden, die Eierstöcke, der Uterus, das Rektum, das Nervensystem, die Drüsen und die inneren Blutgefäße. Die zu analysierende biologische Probe umfasst jede Zelle, jedes Gewebe oder jede Flüssigkeit biologischen Ursprungs oder jedes andere Medium, das gemäß der vorliegenden Erfindung analysiert werden kann, und schließt Proben von Menschen, Tieren oder für den Verzehr durch Menschen oder Tiere zubereitete Lebensmittel ein. Darüber hinaus umfasst die zu analysierende biologische Probe Körperflüssigkeitsproben, und Beispiele dafür sind unter anderem Blut, Serum, Plasma, Lymphe, Muttermilch, Urin, Kot, Augenflüssigkeit, Speichel, Sperma, Gehirnextrakte (z. B. gemahlene Gehirnprobe), Rückenmarksflüssigkeit, Blinddarm, Milz und Tonsillengewebeextrakte.
In der vorliegenden Erfindung kann die Amplifikation durch jede Art von Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt werden, aber vorzugsweise kann eine asymmetrische PCR verwendet werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können die Markierungs-Sequenzen eine Länge von 5 bp bis 50 bp haben.
In der vorliegenden Erfindung können die Markierungs-Sequenzen ein GC-Verhältnis von 20% bis 80% aufweisen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Schmelztemperatur durch die Markierungs-Sequenz je nach Zusammensetzung oder Länge der Markierungs-Sequenz angepasst werden.
In der vorliegenden Erfindung kann die Markierungs-Sequenz komplementär zu einer Sondensequenz oder einer Sequenz, die die Sondensequenz enthält, sein.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die Differenz zwischen den Schmelztemperaturen nicht besonders begrenzt, solange sie auf einer Analysegrafik unterscheidbar ist, kann aber vorzugsweise im Bereich von 2°C bis 40°C, weiter bevorzugt von 5°C bis 30°C und am meisten bevorzugt von 8°C bis 20°C liegen.
In der vorliegenden Erfindung können in Verfahren b) weiterhin p Primersätze enthalten sein, die jeweils p Ziele nachweisen können (wobei p eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist), und
in Verfahren c) kann weiterhin eine Nachweissonde enthalten sein, die mit allen p-Amplifikationsprodukten hybridisieren kann.
In der vorliegenden Erfindung kann die Nachweissonde ein Oligonukleotid, eine Peptidnukleinsäure (PNA) oder eine gesperrte Nukleinsäure (LNA) sein und kann einen Reporter und einen Quencher an ihren entgegengesetzten Enden haben.
In der vorliegenden Erfindung ist eine PeptidNukleinsäure (PNA) eine Substanz, die Gene erkennt, wie eine gesperrte Nukleinsäure (LNA) oder eine Morpholino-Nukleinsäure (MNA), die künstlich synthetisiert wird und ein Rückgrat aus Polyamid hat. PNA ist exzellent in Affinität und Selektivität und hat eine hohe Stabilität für nukleolytische Enzyme, wird also von existierenden Restriktionsenzymen nicht gespalten. Darüber hinaus hat PNA ausgezeichnete thermische/chemische Eigenschaften und Stabilität, so dass die Lagerung einfach ist und PNA nicht leicht zersetzt wird. Darüber hinaus ist die PNA-DNA-Bindungsaffinität viel höher als die DNA-DNA-Bindungsaffinität, so dass selbst bei Vorhandensein einer Einzel-Nukleotid-Fehlpaarung ein Unterschied in der Schmelztemperatur (Tm) von etwa 10°C bis 15°C besteht. Mit Hilfe dieses Unterschieds in der Bindungsaffinität können Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) und Insertion/Deletion(InDel)-Nukleotidveränderungen nachgewiesen werden.
Der Tm-Wert ändert sich auch in Abhängigkeit von der Differenz zwischen der Nukleinsäure einer PNA-Sonde und der komplementär dazu bindenden DNA, so dass die Entwicklung von Applikationstechniken unter Verwendung derselben einfach ist. Die PNA-Sonde wird mit einer Hybridisierungsreaktion analysiert, die sich von der Hydrolysereaktion einer TaqMan-Sonde unterscheidet. Zu den Sonden, die ähnliche Funktionen wie die PNA-Sonde haben, gehören Molecular-Beacon-Sonden und Skorpion-Sonden.
In der vorliegenden Erfindung ist die PNA-Sonde nicht beschränkt, sondern kann einen Reporter oder Quencher daran gebunden haben. Die PNA-Sonde der vorliegenden Erfindung, die einen Reporter und einen Quencher enthält, erzeugt ein Fluoreszenzsignal, nachdem sie an die Zielnukleinsäure hybridisiert hat. Wenn die Temperatur ansteigt, wird die PNA-Sonde bei einer geeigneten Schmelztemperatur der Zielnukleinsäure schnell mit dieser verschmolzen, und somit wird das Fluoreszenzsignal gequencht. Durch die Analyse einer hochauflösenden Schmelzkurve, die aus dem Fluoreszenzsignal in Abhängigkeit von Temperaturänderungen erhalten wird, kann das Vorhandensein oder Fehlen einer Zielnukleinsäure nachgewiesen werden.
Ein fluoreszierendes Material kann an die Sonde der vorliegenden Erfindung binden, die an ihren gegenüberliegenden Enden einen Reporter und einen Quencher enthält, der in der Lage ist, die Fluoreszenz des Reporters zu quenschen, und kann ein interkalierendes fluoreszierendes Material enthalten. Der Reporter kann einer oder mehrere sein, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus 6-Carboxyfluorescein (FAM), HEX, Texas Red, JOE, TAMRA, CY5, CY3 und Alexa680 besteht, und als Quencher wird vorzugsweise 6-Carboxytetramethyl-Rhodamin (TAMRA), BHQ1, BHQ2 oder Dabcyl verwendet, aber die vorliegende Erfindung ist darauf nicht beschränkt. Das interkalierende fluoreszierende Material kann ausgewählt werden aus einer Gruppe bestehend aus Acridin-Homodimer und Derivaten davon, Acridin-Orange und Derivaten davon, 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) und Derivaten davon, Actinomycin D und Derivaten davon, 9-Amino-6-chlor-2-methoxyacridin (ACMA) und Derivaten davon, DAPI und Derivaten davon, Dihydroethidium und Derivaten davon, Ethidiumbromid und Derivaten davon, Ethidiumhomodimer-1 (EthD-1) und Derivaten davon, Ethidiumhomodimer-2 (EthD-2) und Derivaten davon, Ethidiummonoazid und Derivaten davon, Hexidiumiodid und Derivaten davon, Bisbenzimid (Hoechst 33258) und Derivaten davon, Hoechst 33342 und Derivaten davon, Hoechst 34580 und Derivaten davon, Hydroxystilbamidin und Derivaten davon, LDS 751 und Derivaten davon, Propidiumiodid (PI) und Derivaten davon und Cy-Farbstoffderivate.
In der vorliegenden Erfindung wird die Fluoreszenz-Schmelzkurven-Analyse (FMCA) als Methode zur Analyse einer Hybridisierungsreaktion verwendet und durch Klassifizierung, basierend auf Schmelztemperaturen, Unterschieden in der Bindungsstärke zwischen Produkten, die nach Abschluss der PCR hergestellt wurden, und der eingeführten Sonde durchgeführt. Im Gegensatz zu anderen SNP-Nachweissonden ist das Design der Sonde sehr einfach, so dass die Sonde unter Verwendung von 11 bis 18 mer-Nukleotidsequenzen, die SNPs enthalten, hergestellt wird. Um also eine Sonde mit einer gewünschten Schmelztemperatur zu entwerfen, kann der Tm-Wert entsprechend der Länge der PNA-Sonde angepasst werden, und selbst bei PNA-Sonden gleicher Länge kann der Tm-Wert durch Austausch der Sonden angepasst werden. Da PNA eine höhere Bindungsstärke als DNA hat und einen hohen basischen Tm-Wert aufweist, ist es möglich, PNA mit einer kürzeren Länge als DNA zu entwerfen, so dass auch eng benachbarte SNPs nachgewiesen werden können. Bei einer konventionellen HRM-Methode beträgt der Unterschied im Tm-Wert nur etwa 0,5°C, so dass ein zusätzliches Analyseprogramm oder eine winzige Temperaturänderung erforderlich ist, und es ist schwierig, eine Analyse durchzuführen, wenn zwei oder mehr SNPs auftreten. Im Gegensatz dazu wird die PNA-Sonde nicht durch andere SNPs als die Sondensequenz beeinflusst und ermöglicht eine schnelle und genaue Analyse.
In einer beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Nachweis des fusionierten Amplifikationsprodukts durch Echtzeit-PCR durchgeführt und kann in dieser Hinsicht durchgeführt werden, indem nur eine Amplifikationskurve entsprechend der Amplifikation des fusionierten Amplifikationsprodukts erhalten wird, um einen Zyklusschwellenwert (Ct) zu messen, nur eine Schmelzkurve nach der Polymerase-Kettenreaktion erhalten wird, um einen Schmelzpeak durch die Sonde zu messen, oder sowohl die Amplifikationskurve als auch die Schmelzkurve erhalten werden und die beiden Ergebnisse zusammen genommen werden, aber die vorliegende Erfindung ist darauf nicht beschränkt.
Da das fusionierte Amplifikationsprodukt aufgrund des Vorhandenseins einer Zielnukleinsäure in einer Probe früh amplifiziert wird, steigt die Menge des von der Nachweissonde erzeugten Signals früh an und somit sinkt die Anzahl der Zyklen, die zum Erreichen des Schwellenwerts erforderlich sind, so dass ein niedriger Ct-Wert gemessen wird, der zur Identifizierung des Vorhandenseins oder Fehlens der Zielnukleinsäure verwendet werden kann. Darüber hinaus wird die Schmelzkurvenanalyse im Allgemeinen nach einem Nukleinsäure-Amplifikationsprozess der Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt, und ein Signalmuster wird gemessen, während die Temperatur einer Probe mit einer Rate von 0,3-1°C pro 1-10 Sekunden bis zu einer hohen Temperatur (ca. 75°C bis 95°C) erhöht wird, nachdem sie auf eine niedrige Temperatur (ca. 25°C bis 55°C) abgesenkt wurde, oder mit einer Rate von 0,3-1°C alle 1-10 Sekunden auf die niedrige Temperatur abgesenkt wird, nachdem sie auf die hohe Temperatur erhöht wurde. Wenn das fusionierte Amplifikationsprodukt amplifiziert wird, erscheint eine Änderung des Signalmusters um die Schmelztemperatur (Tm) einer an das fusionierte Amplifikationsprodukt gebundenen Sonde durch die Schmelzkurvenanalyse und kann anhand eines Schmelzpeaks analysiert werden, um das fusionierte Amplifikationsprodukt zu identifizieren.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine PCR-Zusammensetzung zum Nachweis mehrerer Ziele, umfassend:

i) n Primersätze, die jeweils n Ziele amplifizieren können; und
ii) eine Nachweissonde, die in der Lage ist, mit n Amplifikationsprodukten zu hybridisieren, die mit den n Primersätzen amplifiziert wurden (wobei n eine ganze Zahl von 2 bis 20 ist),

wobei jeder der n Primersätze aus einem Vorwärtsprimer und einem Rückwärtsprimer einschließlich einer Markierungs-Sequenz besteht, und
die Markierungs-Sequenzen so gestaltet sind, dass die Schmelztemperaturen der n hybridisierten Reaktionsprodukte unterschiedlich sind.

Bei der vorliegenden Erfindung kann die PCR-Zusammensetzung ferner p Primersätze enthalten, die jeweils p Ziele nachweisen können (wobei p eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist), und sie kann ferner eine Nachweissonde enthalten, die mit allen p Amplifikationsprodukten hybridisieren kann.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf einen Kit zum Nachweis mehrerer Ziele.
Bei der vorliegenden Erfindung kann der Kit optional Reagenzien enthalten, die für die Ziel-NukleinsäureAmplifikationsreaktion (z. B. Polymerase-Kettenreaktion) benötigt werden, wie z. B. einen Puffer, eine DNA-Polymerase, einen DNA-Polymerase-Cofaktor und Desoxyribonukleotid-5-triphosphate (dNTPs). Optional kann der Kit der vorliegenden Erfindung auch verschiedene Oligonukleotidmoleküle, reverse Transkriptase, verschiedene Puffer und Reagenzien sowie Antikörper zur Inhibierung der Aktivität von DNA-Polymerasen enthalten. Darüber hinaus kann die optimale Menge eines Reagenzes, das in einer spezifischen Reaktion des Kits verwendet wird, von einem Fachmann leicht bestimmt werden. Typischerweise kann die Ausrüstung der vorliegenden Erfindung in einer separaten Packung oder einem Kompartiment hergestellt werden, das die vorgenannten Komponenten enthält.
In einer Ausführungsform kann das Kit ein unterteiltes Trägermittel zur Aufnahme einer Probe, ein Gefäß mit einem Reagenz, ein Gefäß mit einem Surrogat-Ziel und Primern und ein Gefäß mit einer Sonde zum Nachweis der Amplifikationsprodukte enthalten.
Das Trägermittel ist geeignet, ein oder mehrere Gefäße wie Flaschen und Röhrchen zu enthalten, und jedes Gefäß enthält unabhängige Komponenten, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In der vorliegenden Beschreibung kann ein gewöhnlicher Fachmann die in den Gefäßen benötigten Wirkstoffe ohne weiteres dosieren.
Bei der vorliegenden Erfindung wurde erwartet, dass die Expressionsniveaus von Zielgenen in Bezug auf ein Referenzgen mit der Nachweismethode verglichen und analysiert werden können.
In der vorliegenden Erfindung wurden, um zu bestätigen, ob die Expressionsniveaus von Zielgenen in Bezug auf ein Referenzgen analysiert werden können, das Referenzgen und die Zielgene mit jeweiligen Primersätzen amplifiziert, die jeweils eine Markierungs-Sequenz enthalten, und dann wurde eine Schmelzkurve mit einer einzigen Nachweissonde analysiert, um eine Schmelztemperatur zu bestimmen, bei der alle Referenzgene und die Zielgene nachweisbar sind, und eine Schmelztemperatur, bei der nur die Zielgene nachweisbar sind, und Ct-Werte bei den jeweiligen Schmelztemperaturen wurden verglichen und analysiert.
Das heißt, in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde β-Actin als Referenzgen festgelegt, PD-1 und PD-L1 wurden als Zielgene festgelegt, cDNA wurde aus mRNA der Zelllinien Hcc827, MDA und MRC5 hergestellt, jedes Gen wurde mit Primern einschließlich einer Markierungs-Sequenz amplifiziert, eine Nachweissonde, die in der Lage ist, an die Markierungs-Sequenzen zu binden, wurde mit den Amplifikationsprodukten hybridisiert, und dann wurde eine Schmelzkurve analysiert. Aus den Analyseergebnissen wurde bestätigt, dass eine Temperatur, bei der β-Actin und PD-1/PD-L1 gleichzeitig nachweisbar sind, 50°C beträgt, und eine Temperatur, bei der nur PD-1/PD-L1 nachweisbar ist, 58°C beträgt.
Danach wurde ein Ct-Wert bei jeder Temperatur gemessen, und als Ergebnis des Vergleichs und der Analyse des Unterschieds zwischen diesen Werten wurde bestätigt, dass, basierend auf der Expression von β-Actin und PD-1/PD-L1 in MRC5-Zellen, in denen PD-1/PD-L1 normalerweise exprimiert wird, PD-1/PD-L1 in Hcc82 achtmal/18-mal mehr als β-Actin und in MDA fünfmal/55-mal mehr als β-Actin exprimiert wurde (siehe 6 und 7).
Daher bezieht sich eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auf ein Verfahren zur Analyse der Expressionsniveaus mehrerer Zielgene, einschließlich:

a) Gewinnung einer cDNA-Bibliothek aus einer Probe, die mehrere Ziele enthält;
b) Amplifizieren eines Referenzgens und von Zielgenen mit einem Primersatz, der in der Lage ist, das Referenzgen zu amplifizieren, und n Primersätzen, die in der Lage sind, jeweils n Zielgene zu amplifizieren (wobei n eine ganze Zahl von 2 bis 20 ist);
c) Hybridisierung der Amplifikationsprodukte mit einer Nachweissonde, die in der Lage ist, mit dem gesamten Amplifikationsprodukt des Referenzgens und den n Amplifikationsprodukten zu hybridisieren;
d) Analyse der Schmelzkurven der in Verfahren c) hybridisierten Reaktionsprodukte; und
e) Vergleich und Analyse der Ct-Werte bei einer Schmelztemperatur, bei der das Referenzgen und die Zielgene gleichzeitig nachweisbar sind, und bei einer Schmelztemperatur, bei der nur die Zielgene nachweisbar sind,

In der vorliegenden Erfindung kann der Vergleich und die Analyse der Ct-Werte von Prozess e) durchgeführt werden durch:

i) Gewinnen einer Differenz zwischen einem Ct-Wert bei einer Schmelztemperatur, bei der das Referenzgen und die Zielgene gleichzeitig nachweisbar sind, und einem Ct-Wert bei einer Schmelztemperatur, bei der nur die Zielgene nachweisbar waren;
ii) Umrechnung der Differenz zwischen den Ct-Werten unter Verwendung von Gleichung 1 unten; und $\begin{array}{l} umgerechneter Wert = 2 (Ct - Wert bei \\ Schmelztemperatur, bei der nur Zielgene nachweisbar sind - \\ Ct - Wert bei Schmelztemperatur, bei der Referenzgen und \\ Zielgene gleichzeitig nachweisbar sind) der Kontrolle / 2 (Ct - \\ Wert bei Schmelztemperatur, bei der nur Zielgene nachweisbar \\ sind - Ct - Wert bei Schmelztemperatur, bei der Referenzgen und \\ Zielgene gleichzeitig nachweisbar sind) der Versuchsgruppe \end{array}$
iii) Bestätigung der Expressionsniveaus im Vergleich zum Referenzgen durch den umgerechneten Wert.

In der vorliegenden Erfindung kann die cDNA-Bibliothek aus einer Probe mit verschiedenen bekannten Methoden erhalten werden, und vorzugsweise kann die cDNA-Bibliothek aus extrahierter mRNA durch Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR) erhalten werden.
In der vorliegenden Erfindung, zur Diagnose und Behandlung von Krebs, kann die experimentelle Gruppe oder das Zielgen ein beliebiges oder mehrere Gene sein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus PD-1, PD-L1, CTL4, LAG3, TIM3, BTLA, TIGIT, VISTA, KIR, A2AR, B7-H3, B7-H4, CD277 und IDO, oder kann ein beliebiges oder mehrere Gene sein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus miR-17, miR-18a, miR-20a, miR-21, miR-27a und miR-155, aber die vorliegende Erfindung ist darauf nicht beschränkt.
In der vorliegenden Erfindung kann das Kontroll- oder Referenzgen ein beliebiges oder mehrere Housekeeping-Gene sein, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus β-Actin, a-Tubulin und GAPDH besteht, aber die vorliegende Erfindung ist nicht darauf beschränkt.
Beispiele
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele näher beschrieben. Es wird für den Fachmann offensichtlich sein, dass diese Beispiele nur zur Veranschaulichung dienen und nicht als Einschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung verstanden werden sollten.
Beispiel 1: Nachweis von 6 Viren und 5 Bakterien, die eine Meningitis verursachen

Zum Nachweis von 6 Viren, die Meningitis verursachen (HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, EBV und HHV-6), und 5 Bakterien, die Meningitis verursachen (Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Listeria monocytogenes, Streptococcus der Gruppe B, Neisseria meningitides), wurden Vorwärtsprimer, Rückwärtsprimer, die jeweils eine Markierungs-Sequenz enthalten, und bifunktionale PNA-Fluoreszenzsonden hergestellt (siehe Tabellen 2 und 3). [Tabelle 2]

SEQ ID NO:	Name	Sequenz (5'-3')	Ziel
1	V1-F	GCTGTTCTCGTTCCTCACTGCC	HSV-1
2	V1-R	TGAAAATGCGAGTGTCCATACCCTACCCGCGTTCGGAC	HSV-1
3	V2-F	CGCCAAATACGCCTTAGCAGAC	HSV-2
4	V2-R	TGAAAATGGAAGTGTCAGGTTCTTCCCGCGAAATCG	HSV-2
5	V3-F	CCTTCAATTGCTTGGCGGACTCGG	VZV
6	V3-R	TGATAATGCAAGTCTCACAAGATGAGCGAGTGTACCGATG	VZV
7	V4-F	GCTGTAACTGTGGTTTCCATGACG	CMV
8	V4-R	TGAAAATGCAAGTGTCCGTGTGGCTTACCTGCTGCC	CMV
9	V5-F	AGCGGGGTATGAGCTTTCCTGTTAC	EBV
10	V5-R	TCAAAATGCAAGTGTCCAGTCGGGCGAAATCTGTGTACC	EBV
11	V6-F	GATATCGGATCGCAACAAGACCTCG	HHV-6
12	V6-R	TGAAGATGGAAGTGTCTCCGTTGCGTAATATGTCAAGGATGC	HHV-6
13	B1-F	GGTCAATTCCTGTCGCAGTACC	Streptococcus pneumoniae
14	B1-R	CATGTGCCTACACCTGGTCCAAACAGCCTTAGGTCTTATGG	Streptococcus pneumoniae
15	B2-F	GTACGCTAACACTGCACGACG	Haemophilus influenzae
16	B2-R	CATGTGCATACACCTGGTAACACTGATGAACGTGGTACACCAG	Haemophilus influenzae
17	B3-F	GTTGACCGCAAATAGAGCCAAGC	Listeria monocytogenes
18	B3-R	CATGTGCCTACACGAGGTATTAGCGAGAACGGGACCATCATG	Listeria monocytogenes
19	B4-F	CAGCAACAACGATTGTTTCGCC	Gruppe B-Streptococcus
20	B4-R	CATGTCCATACACCTGCTTCCTCTTTAGCTGCTGGAAC	Gruppe B-Streptococcus
21	B5-F	GCACACTTAGGTGATTTACCTGCAT	Neisseria meningitidis
22	B5-R	CATATCCCTACACCTGCCACCCGTGTGGATCATAATAGA	Neisseria meningitidis

Unterstrichene Buchstaben; 5'-Markierungssequenz des Rückwärtsprimers [Tabelle 3]

Sonden-Sequenzen

SEQ ID NO:	Name	Sequenz (5'-3')	Fluor.
23	Nachweis P1	CAT GTG CCT ACA CCT G	FAM
24	Nachweis P2	TGA AAA TGC AAG TGT C	TxR

Ein Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsexperiment wurde unter Verwendung der asymmetrischen PCR durchgeführt, um einzelsträngige Zielnukleinsäuren herzustellen. Die asymmetrischen PCR-Bedingungen sind wie folgt: 2X SeaSunBio Real-Time FMCA™-Puffer (SeaSunBio, Korea); 2,5 mM MgCl₂; 200 µM dNTPs; 1,0 U Taq-Polymerase; 0,05 µM Vorwärtsprimer (siehe Tabelle 2); und 0,5 µM Rückwärtsprimer (siehe Tabelle 2) (asymmetrische PCR), und 0,5 µl der fluoreszierenden PNA-Sonden (siehe Tabelle 3) wurden zu einem Endvolumen von 20 µl hinzugefügt, um die Echtzeit-PCR-Analyse und die Schmelzkurvenanalyse durchzuführen, und die Analysebedingungen sind in 2 dargestellt.
Als Ergebnis wurde, wie in 3 dargestellt, bestätigt, dass 5 Bakterien und 6 Viren, die eine Meningitis verursachen, nachweisbar waren.

Die Ursprünge jedes Virus und jedes Bakteriums sind in Tabelle 4 unten aufgeführt. [Tabelle 4]

Ursprünge von Viren und Bakterien

Nr.	Name	Ursprung
1	Streptococcus pneumoniae	ATCC27336
2	Neisseria meningitidis	ATCC13100
3	Haemophilus influenzae	ATCC19418
4	Listeria monocytogenes	ATCC15313
5	Streptococcus agalactiae	ATCC14364
6	Humanes Herpesvirus 1	KBPV-VR-52
7	Humanes Herpesvirus 2	KBPV-VR-53
8	Varizella-Zoster-Virus	AMX VZV Plasma Pnl, Acrometrix
9	Epstein-Barr-Virus	Acromatrix-Panel
10	Humanes Cytomegalovirus	KBPV-VR-7
11	Humanes Herpesvirus 6	HHV-6 Virus 1. WHo Internationaler Standard

Beispiel 2: Genexpressionsniveau-Analyse
2-1. Bestimmung der Schmelztemperaturen von Kontroll- und Versuchsgruppen
Für den Vergleich der Genexpression wurden die Standard-Zelllinien Hcc827, MDA und MRC5 ausgewählt (EA. Mittendorf et al., 2014, RHJ Janse et al., 2018, H Soliman et al. , 2014) und cDNA wurde aus RNA, die aus den entsprechenden Zelllinien extrahiert wurde, mit einem SuperiorScrip III Reverse Transcriptase (Enzynomics, RT006) Kit synthetisiert. Die Bedingungen für die cDNA-Synthese sind wie folgt: 5x Fist-Strand-Puffer, 200 Einheiten SuperiorScriptIII Reverse Transcriptase, 0,5 mM dNTP-Mischung, 10 mM DTT, 4 µM Oligo dT, 20 Einheiten RNase-Inhibitor wurden in einem Gesamtvolumen von 20 µl zugegeben, um eine Reaktion bei 37°C für 5 Minuten, 50°C für 1 Stunde und 70°C für 15 Minuten durchzuführen.
Zur Analyse der Genexpression wurden Primer eines Referenzgens und von Zielgenen wie in Tabelle 5 gezeigt hergestellt. Die PCR wurde in einem CFX96™Real-Time-System (BIO-RAD, USA) unter Verwendung der gemäß Beispiel 1 hergestellten bifunktionellen PNA-Fluoreszenzsonden durchgeführt.
Ein Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsexperiment wurde unter Verwendung der asymmetrischen PCR durchgeführt, um einzelsträngige Zielnukleinsäuren herzustellen. Die asymmetrischen PCR-Bedingungen sind wie folgt: 2X SeaSunBio Real-Time FMCA™-Puffer (SeaSunBio, Korea); 2,5 mM MgCl₂; 200µM dNTPs; 1,0 U Taq-Polymerase; 0,05 µM Vorwärtsprimer (siehe Tabelle 2); und 0,5 µM Rückwärtsprimer (siehe Tabelle 2) (asymmetrische PCR), und 0,5 µl der fluoreszierenden PNA-Sonden (siehe Tabelle 3) wurden zu einem Endvolumen von 20 µl hinzugefügt, um die Echtzeit-PCR-Analyse und die Schmelzkurvenanalyse durchzuführen, und die Analysebedingungen sind in 4 dargestellt.

Um geeignete Annealing-Temperaturen für die Analyse der Ct-Werte von β-Actin und PD-1/PD-L1 zu bestimmen, wurden die Nachweisbedingungen für PD-1/PD-L1 auf 54°C bis 60°C und die Bedingungen für die gleichzeitige Nachweisbarkeit von β-Actin und PD-1/PD-L1 auf 48°C bis 52°C eingestellt und die Analyse durchgeführt, wobei bestätigt wurde, dass 50°C und 58°C die geeignetsten Temperaturen für die Analyse sind (siehe 5). [Tabelle 5]

Primer-Sequenzen

SEQ ID NO:	Name	Sequenz (5'-3')	Ziel
25	β-Actin-F	GCACTCTTCCAGCCTTCC	β-Actin
26	β-Actin-R	TGAAAATGGAAGTGTCAGCACTGTGTTGGCGTACAG	β-Actin
27	PD-1-F	CAGAGCTCAGGGTGACAGAGAG	PD-1
28	PD-1-R	TGAAAATGCAAGTCTCCCACGACACCAACCACCAGG	PD-1
29	PD-L1-F	TGCTGAACGCATTTACTGTCACGG	PD-L1
30	PD-L1-R	TGAAAATGCAAGTCTCACCATAGCTGATCATGCAGCGGTA	PD-L1

Unterstrichene Buchstaben; 5'-Markierungssequenz des Rückwärtsprimers

2-2. Analyse der Expressionsniveaus von Kontroll- und Experimentalgruppen
Zur Messung der Ct-Werte bei Schmelztemperaturen von 50°C und 58°C, die mit der Methode von Beispiel 2-1 bestimmt wurden, wurde die Echtzeit-PCR mit den Materialien wie in Beispiel 2-1 unter den in 6 gezeigten Bedingungen durchgeführt und anschließend das Genexpressionsniveau mit Hilfe der folgenden Gleichung analysiert:

Gleichung für die Genexpressionsniveau-Analyse: 2^(Ct58-Ct50) des Referenzgens/2^(Ct58-Ct50) des Zielgens

Aus den Ergebnissen, wie in 7 und 8 dargestellt, wurde bestätigt, dass die PD-1- und PD-L1-Gene einen Unterschied im Expressionsniveau in HCC-827- und MDAMB-231-Zellen im Vergleich zu einer MRC-5-Zelllinie als Kontrolle aufwiesen.
Die Ursprünge der Zelllinien sind in Tabelle 6 dargestellt. [Tabelle 6]

Ursprünge der Zelllinien

Nr. Name der Zelllinie Ursprung

1 MRC-5 KCLB10171

2 HCC-827 KCLB7 0827

3 MDAMB-231 ATCC HTB-26
Während bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung im Detail beschrieben wurden, wird es für den Fachmann offensichtlich sein, dass solche detaillierten Beschreibungen nur zur Veranschaulichung dienen und nicht dazu gedacht sind, den Umfang der vorliegenden Erfindung zu begrenzen. Daher sollte der wesentliche Umfang der vorliegenden Erfindung durch die beigefügten Ansprüche und Äquivalente dazu definiert werden.
[Industrielle Anwendbarkeit]
Ein Verfahren zum Nachweis mehrerer Ziele gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht den Nachweis mehrerer Ziele mit einer einzigen Sonde und ist somit nützlich für den Nachweis mehrerer Ziele, da falsch-positive Ergebnisse reduziert werden und mehrere Ziele mit hoher Sensitivität und schneller Rate nachweisbar sind.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

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US 5538848 [0005]
US 6326145 [0005]
US 5723591 [0007]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Hardenbol et al., 2003, Nat. Biotechnol., 21:673 [0008]
Shen et al, Mutat. Res., 573:70, 2005 [0012]
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EA. Mittendorf et al., 2014, RHJ Janse et al., 2018, H Soliman et al. , 2014 [0078]

Claims

Verfahren zum Nachweisen mehrerer Ziele, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Gewinnung von DNA aus einer Probe, die mehrere Ziele enthält; b) Amplifizieren von mehreren Zielnukleinsäuren unter Verwendung von n Primersätzen, die jeweils in der Lage sind, n mehrere Zielnukleinsäuren zu amplifizieren (wobei n eine ganze Zahl von 2 bis 20 ist); c) Hybridisieren der n Amplifikationsprodukte mit einer einzelnen Nachweissonde, die mit den n Amplifikationsprodukten hybridisieren kann; und d) Analysieren einer Schmelzkurve von jedem der n Reaktionsprodukte, die in Verfahren c) hybridisiert wurden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit der Zielnukleinsäuren zu bestimmen, wobei jeder der n Primersätze umfasst: einen Vorwärtsprimer und einen Rückwärtsprimer, die eine Markierungs-Sequenz umfassen, wobei die Markierungs-Sequenzen so gestaltet sind, dass die Schmelztemperaturen der n hybridisierten Reaktionsprodukte voneinander verschieden sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Schmelztemperaturdifferenz im Bereich von 2°C bis 40°C liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt b) weiterhin p Primersätze enthalten sind, die jeweils p Ziele nachweisen können (wobei p eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist), und in Schritt c) weiterhin eine Nachweissonde enthalten ist, die mit allen p Amplifikationsprodukten hybridisieren kann.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei die Nachweissonde ein Oligonukleotid, eine Peptidnukleinsäure (PNA) oder eine verriegelte Nukleinsäure (LNA) ist und an ihren entgegengesetzten Enden einen Reporter und einen Quencher aufweist, die daran gebunden sind.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Reporter eines oder mehrere umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus 6-Carboxyfluorescein (FAM), Texas Red, 2',4',5',7'-Tetrachlor-6-carboxy-4,7-dichlorfluorescein (HEX) und CY5.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Quencher einen oder mehrere umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 6-Carboxytetramethyl-Rhodamin (TAMRA), BHQ1, BHQ2 und Dabcyl.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Analyse der Schmelzkurve mittels Fluoreszenz-Schmelzkurvenanalyse (FMCA) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Amplifizieren mittels Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe aus Wasser, Boden, Abfall, Lebensmitteln, von Menschen stammenden Substanzen, Tierdärmen und tierischen und pflanzlichen Geweben ausgewählt ist.
PCR-Zusammensetzung zum Nachweis mehrerer Ziele, wobei die PCR-Zusammensetzung umfasst: i) n Primersätze, die jeweils n Ziele amplifizieren können; und ii) eine Nachweissonde, die in der Lage ist, mit n Amplifikationsprodukten zu hybridisieren, die mit den n Primersätzen amplifiziert wurden (wobei n eine ganze Zahl von 2 bis 20 ist), wobei jeder der n Primersätze aus einem Vorwärtsprimer und einem Rückwärtsprimer besteht, die eine Markierungs-Sequenz umfassen, wobei die Markierungs-Sequenzen so gestaltet sind, dass die Schmelztemperaturen der n hybridisierten Reaktionsprodukte voneinander verschieden sind.
PCR-Zusammensetzung nach Anspruch 10, die ferner p Primersätze umfasst, die jeweils p Ziele nachweisen können (wobei p eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist), und die ferner eine Nachweissonde umfasst, die mit allen der p Amplifikationsprodukte hybridisieren kann.
Verfahren zum Analysieren von Expressionsniveaus mehrerer Zielgene, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Gewinnung einer cDNA-Bibliothek aus einer Probe, die mehrere Ziele enthält; b) Amplifizieren eines Referenzgens und von Zielgenen mit einem Primersatz, der in der Lage ist, das Referenzgen zu amplifizieren, und n Primersätzen, die in der Lage sind, jeweils n Zielgene zu amplifizieren (wobei n eine ganze Zahl von 2 bis 20 ist); c) Hybridisierung der Amplifikationsprodukte mit einer Nachweissonde, die in der Lage ist, mit dem gesamten Amplifikationsprodukt des Referenzgens und den n Amplifikationsprodukten zu hybridisieren; d) Analyse der Schmelzkurven der in Verfahren c) hybridisierten Reaktionsprodukte; und e) Vergleich und Analyse der Ct-Werte bei einer Schmelztemperatur, bei der das Referenzgen und die Zielgene gleichzeitig nachweisbar sind, und bei einer Schmelztemperatur, bei der nur die Zielgene nachweisbar sind, wobei jeder der n Primersätze aus einem Vorwärtsprimer und einem Rückwärtsprimer besteht, die eine Markierungs-Sequenz umfassen, wobei die Markierungs-Sequenzen so gestaltet sind, dass die Schmelztemperaturen der n hybridisierten Reaktionsprodukte voneinander verschieden sind.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Vergleichen und Analysieren der Ct-Werte von Schritt e) durchgeführt wird durch: i) Gewinnen einer Differenz zwischen einem Ct-Wert bei einer Schmelztemperatur, bei der das Referenzgen und die Zielgene gleichzeitig nachweisbar sind, und einem Ct-Wert bei einer Schmelztemperatur, bei der nur die Zielgene nachweisbar waren; ii) Umrechnung der Differenz zwischen den Ct-Werten unter Verwendung von Gleichung 1 unten; und $\begin{array}{l} umgerechneter Wert = 2 (Ct - Wert bei \\ Schmelztemperatur, bei der nur Zielgene nachweisbar sind - \\ Ct - Wert bei Schmelztemperatur, bei der Referenzgen und \\ Zielgene gleichzeitig nachweisbar sind) der Kontrolle / 2 (Ct - \\ Wert bei Schmelztemperatur, bei der nur Zielgene nachweisbar \\ sind - Ct - Wert bei Schmelztemperatur, bei der Referenzgen und \\ Zielgene gleichzeitig nachweisbar sind) der Versuchsgruppe \end{array}$
iii) Bestätigung der Expressionsniveaus im Vergleich zum Referenzgen durch den umgerechneten Wert.