DE60309817T2 - Mehrzweck-Primer und -Sonden für verbesserte Hybridisierungsassays durch Zerstörung von Sekundärstrukturen - Google Patents

Mehrzweck-Primer und -Sonden für verbesserte Hybridisierungsassays durch Zerstörung von Sekundärstrukturen Download PDF

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Diese Erfindung betrifft allgemein die Verwendung von Primern und Sonden in Nucleinsäure-Hybridisierungsassays, insbesondere Polymerasekettenreaktion (PCR) und anderen Amplifikationsassays, wie sie bei der Detektion und Quantifizierung von Einzelnucleotidpolymorphismen (SNPs) verwendet werden können.
  • HINTERGRUND
  • Nucleinsäurehybridisierung ist ein weithin verwendetes Verfahren zum Identifizieren spezifischer Sequenzen von Nucleinsäuren. Hybridisierung beruht auf Paarung zwischen komplementären Nucleinsäuresträngen. Einzelsträngige Oligonucleotide mit bekannten Sequenzen können als Hybridisierungssonden verwendet werden, um Zielsequenzen von Nucleinsäureanalyten zu identifizieren, indem die Sonden Probelösungen ausgesetzt werden, die einen Nucleinsäureanalyten von Interesse enthalten. Wenn ein Nucleinsäureanalyt mit einer Sonde hybridisiert, enthält der Analyt notwendigerweise die Zielsequenz. Zahlreiche Gesichtspunkte dieses Verfahrens sind im Detail untersucht worden. Im Wesentlichen erlauben es alle Variationen komplementärer Basensequenzen zu paaren und doppelsträngige Moleküle zu bilden, und eine Anzahl an Verfahren ist auf dem Fachgebiet bekannt, um zu bestimmen, ob Paarung aufgetreten ist, wie z.B. jene, die im US-Patent Nr. 5,622,822, erteilt an Ekeze et al., und im US-Patent Nr. 5,256,535, erteilt an Ylikoski et al., beschrieben sind.
  • Ein weiteres Verfahren zum Detektieren des Bindens einer Sonde an eine Zielsequenz wird beschrieben von Whitcombe et al. (1999), "Detection of PCR products using selfprobing amplicons and fluorescence", Nature Biotechnology 17:804–807. Das Verfahren umfasst Verwendung einer Sonde, die eine Nucleotidsequenz enthält, die während der Polymerasekettenreaktion (PCR) nicht amplifiziert wird, wobei die Sonde so entworfen ist, dass sie eine Haarnadelstruktur bildet, in der ein Fluorophor und ein Quencher in selbst-quenchender bzw. selbst-löschender Nähe sind. Bei Denaturierung und Hybridisierung mit einer Ziel-Nucleotidsequenz hybridisiert jedoch der Abschnitt der Sonde, der vorher in der Haarnadelstruktur war, mit der amplifizierten Zielsequenz und wird durch die erhöhte Fluoreszenz detektierbar. Diese "Scorpion"-Sonde kombiniert die Funktionen eines PCR-Primers und einer Detektionssonde und bietet gesteigerte Amplifikation und Detektion, teilweise aufgrund der unimolekularen Natur der Bindungsreaktion der Fluoreszenzsonde mit der Ziel-Nucleotidsequenz, was die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Reaktion erhöht. Diese Technologie wird auch im US-Patent Nr. 5,525,494, erteilt an Newton, beschrieben. Die Detektion von genetischer Variation zwischen Individuen ist eine andere Anwendung Sequenz-spezifischer Hybridisierungstechnologien. Detektion und Analyse von allelischen Variationen oder SNPs in DNA umfasst typischer Kettenverlängerung und Amplifikation unter Verwendung von Primern, die auf eine spezifische Sequenz zielen. Die amplifizierte DNA wird dann als ein Ziel für verschiedene markierte Oligonucleotidsonden verwendet, um Punktmutationen und allelische Sequenzvariation zu identifizieren. Wenn die Ziel-DNA jedoch intramolekulare Sekundärstrukturen bildet, ist die DNA möglicherweise nicht fähig, effektiv oder überhaupt mit dem Primer oder Markierungssonden zu hybridisieren, was daher in keinem Signal für das Vorliegen oder die Abwesenheit eines SNP an der Position der Sekundärstruktur resultiert.
  • Derartige intramolekulare Sekundärstrukturen in einer einzelsträngigen Nucleinsäure, wie z.B. rRNA oder denaturierte DNA, entstehen aufgrund der intramolekularen Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Nucleotidsequenzen innerhalb der einzelsträngigen Nucleinsäure selbst. Diese Rest-Sekundärstruktur kann Hybridbildung zwischen einem Oligonucleotid, z.B. ein DNA- oder RNA-Oligomer, das als Sonde verwendet wird, und seiner komplementären Sequenz in der RNA oder DNA (z.B. ribosomale RNA, mRNA oder DNA), die die Sonde targetiert, sterisch inhibieren oder sogar blockieren.
  • Es gibt zahlreiche Fälle, in denen es Schwierigkeiten gibt beim Bestimmen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von SNPs in einer bestimmten Ziel-Nucleinsäure. Beispielsweise existiert Cytochrom P450 in etlichen allelischen Variationen, die mit verändertem Metabolismus von Arzneimitteln und/oder Krebsanfälligkeit assoziiert sind. Eine Variante von Cytochrom P450, Cytochrom P450 CYP2D6, hat einen SNP in jedem der vier Exons des P450 CYP2D6-Gens. Bei Experimenten, die durchgeführt wurden, um auf das Vorhandensein dieser SNPs zu testen, sind Schwierigkeiten beim Detektieren von SNPs in den Exons 1 und 2 festgestellt worden, die an signifikanten Sekundärstrukturen in den Regionen von analytischem Interesse in diesen Exons liegen. Obwohl die Exons 1 und 2 mit herkömmlichen Primersätzen amplifiziert werden können, kann das Produkt im SNP-Assay nicht detektiert werden. Probleme beim Untersuchen der Exons 1 und 2 waren letztendlich verknüpft mit intramolekularer Sekundärstruktur in diesen zwei Amplicons. Diese Sekundärstruktur verhindert Hybridisierung von Allel-spezifischen Diskriminierungssonden ("discrimination probes"), die in einem Assay auf diese SNPs verwendet werden würden. Die Strukturen dieser Exons sind in 1 dargestellt, wo ersichtlich ist, dass die Exons 6 und 9 relativ geringe Schwierigkeiten für PCR und Hybridisierung mit Diskriminierungssonden aufweisen, wohingegen die Exons 1 und 2 signifikante Sekundärstruktur in der Region des SNP zeigen. Die Analysenregion und der SNP sind in 1 in rot dargestellt.
  • Eine Lösung für dieses Problem des Verstärkens von Hybridisierung einer Sonde mit einer Ziel-Nucleotidsequenz, wenn die Zielsequenz intramolekulare Sekundärstrukturen bildet, ist in US-Patent Nr. 5,030,557, erteilt an Hogan et al., vorgeschlagen worden. In diesem Patent beschreiben Hogan et al., wie die Zugabe einer Helfer-Nucleinsäuresequenz in molarem Überschuss (wenigstens 5-fach in Bezug auf die Sonde und bis zu 100-fach oder mehr in Bezug auf die Sonde) zu der Nucleinsäure-Sondensequenz zur Hybridisierung der Sondensequenz mit der Zielsequenz beiträgt. Tatsächlich zeigen Hogan et al. die Wirksamkeit ihres Ansatzes unter Verwendung molarer Verhältnisse von Helfer-Oligonucleotid zu Sonden-Oligonucleotid von 60:1, 100:1 und 250:1. Zusätzlich stellen Hogan et al. fest, dass die Helfer-Oligonucleotide länger als näherungsweise 20 bis näherungsweise 50 Oligonucleotide lang sein sollten, um beim Blockieren der Bildung der Sekundärstruktur wirksam zu sein.
  • Deshalb besteht auf dem Fachgebiet ein Bedarf daran, verbesserte Hybridisierungssonden und Verfahren zum Detektieren von Sequenzen, die in Regionen eines Zielmoleküls enthalten sind, das dazu neigt, eine unerwünschte Sekundärstruktur zu bilden, bereitzustellen. Das von Hogan et al. beschriebene Verfahren stellt eine derartige Lösung bereit. Dieses Verfahren hat jedoch die Nachteile, dass es einen großen Überschuss an Helfer-Oligonucleotid gegenüber dem Sonden-Oligonucleotid erfordert und die Länge des Helfer-Oligonucleotids beschränkt.
  • Wilton et al., Human Mutation, 1988, Band 11, S. 252–258 und Honeyman et al., American Journal of Veterinary Research, 1999, Band 60, S. 734–737 beschreiben die Entwicklung eines Selbsthybridisierungs- bzw. "Snapback"-Verfahrens zur Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft den oben genannten Bedarf auf dem Fachgebiet. In einer ersten Ausführungsform stellt die Verwendung die Verwendung eines Mehrzweck-Primers ("dual-purpose primer") beim Amplifizieren einer Ziel-Nucleotidsequenz in einem Zielmolekül bereit, wobei die Ziel-Nucleotidsequenz ein interessierender Ort, proximal zu oder enthalten in einer Sekundärstruktur-bildenden Region, die, in der Abwesenheit des Primers, eine unerwünschte Sekundärstruktur in einem unter Amplifikationsbedingungen gebildeten Amplikon bewirkt, um Detektion des interessierenden Ortes zu verhindern, enthält, wobei der Primer umfasst: eine Primersequenz, komplementär zu einem anderen Abschnitt der Ziel-Nucleotidsequenz als der Sekundärstruktur-bildenden Region und eine blockierende Sequenz ("blocking sequence"), im Wesentlichen komplementär zu einem Abschnitt der Sekundärstruktur-bildenden Region, um Bildung der unerwünschten Sekundärstruktur zu verhindern. Ein Primer mit diesen kombinierten Merkmalen ist verwendbar in einem Verfahren zum Detektieren des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines interessierenden Ortes (z.B. ein SNP), der enthalten ist in oder proximal zu der Sekundärstruktur-bildenden Region, wobei der interessierende Ort, in Abwesenheit des Primers, durch Bildung der unerwünschten Sekundärstruktur verborgen wäre. Im Gegensatz zu früheren Verfahren zum Detektieren von Nucleinsäuresequenzen, die potentiell in einer Sekundärstruktur "versteckt" sind, wie z.B. die oben diskutierten Verfahren, ermöglicht die vorliegende Erfindung Amplifikation unter Verwendung eines einzelnen Primer-Oligonucleotids, wobei der Primer eine blockierende Sequenz enthält, die wesentlich kürzer sein kann als die blockierenden Sonden des Standes der Technik (z.B. jene, die von Hogan et al. beschrieben wurden) und muss keine perfekte Komplementarität mit der Region im Zielmolekül besitzen, die die unerwünschte Sekundärstruktur bildet.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verwendung der Merkzweck-Primer in einem Verfahren, das eine Ziel-Nucleotidsequenz in einem Zielmolekül amplifiziert, bereitgestellt, wobei die Ziel-Nucleotidsequenz einen interessierenden Ort proximal zu oder enthalten in einer Sekundärstruktur-bildenden Region enthält, die fähig ist, eine unerwünschte Sekundärstruktur in einem Amplikon, das unter Amplifikationsbedingungen gebildet wurde, zu bilden, um Detektion des interessierenden Ortes zu verhindern, und das Verfahren umfasst: Inkontaktbringen der Ziel-Nucleotidsequenz unter Hybridisierungsbedingungen, zusammen oder sequenziell, mit einem zu einem Terminus eines ersten Stranges des Zielmoleküls komplementären erfindungsgemäßen Mehrzweck-Primer, einem zu dem gegenüberliegenden Terminus des Zweitstrangs des Zielmoleküls komplementären zweiten Primer, zur Amplifikation geeigneten Nucleotiden und ein Agens zur Polymerisation der Nucleotide (z.B. eine Polymerase), wobei während des Verfahrens gebildete Amplicons die unerwünschte Sekundärstruktur nicht enthalten, so dass der interessierende Ort einem hybridisierenden Oligonucleotid zugänglich ist.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung einer Hybridisierungssonde in einem Hybridisierungsassay zum Detektieren des Vorhandenseins einer Ziel-Nucleotidsequenz in einem Zielmolekül bereit, wobei die Hybridisierungssonde umfasst (a) eine zu einer ersten Nucleotidsequenz im Zielmolekül komplementäre Sonden-Nucleotidsequenz; und (b) eine blockierende Sequenz, die im Wesentlichen komplementär ist zu einer zweiten Nucleotidsequenz im Zielmolekül, wobei Hybridisierung der blockierenden Sequenz mit der zweiten Nucleotidsequenz Sekundärstrukturbildung in der zweiten Nucleotidsequenz verhindert, die sonst Hybridisierung der Sondensequenz mit der ersten Nucleotidsequenz stören würde. Die Hybridisierungssonde kann in jedem beliebigen Assay-Format verwendet werden. Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Durchführen eines Hybridisierungsassays zum Detektieren des Vorhandenseins einer Ziel-Nucleotidsequenz in einem Zielmolekül bereit, wobei die Ziel-Nucleotidsequenz proximal zu oder enthalten in einer Sekundärstruktur-bildenden Region ist, die zum Bilden einer unerwünschten Sekundärstruktur, die Detektion der Ziel-Nucleotidsequenz verhindern würde, fähig ist, wobei das Verfahren umfasst: Inkontaktbringen des Zielmoleküls unter Hybridisierungsbedingungen mit solch einer Hybridisierungssonde und so, dass Hybridisierung der Sonde mit dem Zielmolekül Bildung der unerwünschten Sekundärstruktur verhindert und Detektion der Ziel-Nucleotidsequenz erlaubt.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 erläutert schematisch die Struktur der Exons 1, 2, 6 und 9 (SEQ ID NOS: 24–27) von Cytochrom P450 CYP2D6, wobei der Ort jeder SNP-Region in grau schattiert ist.
  • 2 illustriert schematisch ein Gesamtschema der Primer und Sonden, die verwendet wurden, um einen SNP in einem Multiplex-Modus zu detektieren, und Detektion unter Verwendung von LuminexTM-Mikrosphären.
  • 3 illustriert schematisch die störende Sekundärstruktur, die den SNP in Exon 1 (Reste 142–195 von SEQ ID NO: 24) von Cytochrom P450 CYP2D6 enthält, wobei gezeigt wird, dass der SNP an einer einzelsträngigen Haarnadel beteiligt ist (wobei die SNP-Region in grau schattiert ist). Ein blockierendes Oligonucleotid (SEQ ID NO: 28) wird mit den Oligonucleotiden hybridisieren, die an der potentiellen intramolekularen Sekundärstruktur beteiligt sind, um dessen Bildung zu inhibieren und daher die Detektion des SNP zu ermöglichen.
  • 4 ist ein Diagramm, das das Detektionssignal für den SNP in Exon 1 vom Cytochrom P450 CYP2D6 zeigt, wenn die blockierende Sequenz vorhanden ist, und das korrespondierende Detektionssignal, wenn die blockierende Sequenz abwesend ist.
  • 5 illustriert schematisch die Struktur und den Wirkmechanismus eines erfindungsgemäßen Mehrzweck-Primers. Die Blocker-Sequenz (bezeichnet als "Blocker-Region" und "B" in der Figur) und die Primersequenz (bezeichnet als die "Primer-Region" und "P" in der Figur) sind über eine Spacer-Region "S" verknüpft, wobei eine optionale Base "O" zwischen S und P gezeigt ist. Die optionale Base verhindert unerwünschtes Priming bzw. unerwünschte Initialreaktion 5' zu der Primersequenz P. Die Primersequenz ist komplementär zu einem Terminus des Zielmoleküls, das den SNP-Ort (bezeichnet mit "X") enthält, und die blockierende Sequenz ist im Wesentlichen komplementär zu einer Sequenz B', die X unmittelbar benachbart ist, wobei B' der Abschnitt des Zielmoleküls ist, der verantwortlich ist für die Bildung einer intramolekularen Sekundärstruktur, die, in Abwesenheit des Mehrzweck-Primers, den SNP-Ort vor einer komplementären Sequenz verbergen würde (wodurch Hybridisierung und Detektion verhindert werden). Nach Amplifikation der Ziel-Nucleotidsequenz und Re-Annealing bzw. Wiederaufschmelzen hybridisiert B mit B' im Amplikon, wobei die Bildung der unerwünschten Sekundärstruktur blockiert wird. Die Detektion des SNP-Orts wird unter Verwendung einer Markierungssonde (in der Figur als die "ASH-Markierungs-Sonde" bezeichnet) bewerkstelligt.
  • 6 zeigt ein analytisches Gel, das belegt, dass die Mehrzweck-Primer mit Blocker-Sequenz-Inserts von 8, 10 und 12 Nucleotiden alle eine Hauptbande der erwarteten Größe erzeugen.
  • 7 illustriert schematisch differenzielle Multiplex-Hybridisierung mit dem erfindungsgemäßen Mehrzweck-Primer.
  • 8 ist ein Balkendiagramm, das die Ergebnisse des Multiplex-PCR-Assays, der zum Detektieren von SNPs in Exon 1 des Cytochrom P450 CYP2D2-Gens verwendet wurde (SNP-Assay), wobei erfindungsgemäße Mehrzweck-Primer mit 8, 10 oder 12 Nucleotid-Inserts, konventionelle Primer und konventionelle Primer in Kombination mit einem blockierenden Oligonucleotid verwendet wurden.
  • 9 ist ein Balkendiagramm, das die Cytochrom P450-Genotypisierungsergebnisse eines an vier individuellen Patientenproben durchgeführten Multiplex-SNP-Assays zeigt.
  • 10 illustriert schematisch eine Mehrzwecksonde, die Bildung einer unerwünschten Sekundärstruktur verhindert und auch Ligationsdetektion von SNPs ermöglicht.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Vor dem detaillierten Beschreiben der vorliegenden Erfindung ist zu verstehen, dass, sofern nicht Anders angegeben, diese Erfindung nicht auf spezielle DNA-Quellen, spezifische Sequenzen oder spezielle Assay-Formate beschränkt ist, da diese variieren können. Es ist auch zu verstehen, dass die hierin verwendete Terminologie nur zum Zweck des Beschreibens bestimmter Ausführungsformen dient und nicht beschränkend sein soll.
  • Es muss festgestellt werden, dass wie in dieser Beschreibung und den angehängten Ansprüchen verwendet, die Singularformen "ein", "eine", "einer" und "der", "die", "das" Bezüge auf den Plural umfassen, sofern der Kontext dies nicht eindeutig anders bestimmt. Beispielsweise ist deshalb beabsichtigt, dass der Begriff "ein Oligonucleotid" ein Oligonucleotid oder zwei oder mehrere Oligonucleotide bedeutet, die das gleiche oder unterschiedlich sein können, und dergleichen.
  • Beim Beschreiben und Beanspruchen der vorliegenden Erfindung wird die folgende Terminologie gemäß den nachstehenden Definitionen verwendet werden.
  • Es wird verstanden werden, dass sich die Begriffe "Nucleosid" und "Nucleotid", wie hierin verwendet, auf Nucleoside und Nucleotide beziehen, die nicht nur die herkömmlichen Purin- und Pyrimidinbasen, d.h. Adenin (A), Thymin (T), Cytosin (C), Guanin (G) und Uracil (U), enthalten, sondern auch auf modifizierte Nucleoside und Nucleotide. Derartige Modifikationen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Methylierung oder Acylierung einer Purin- oder Pyrimidingruppierung, Substitution einer anderen heterocyclischen Ringstruktur durch einen Pyrimidinring oder durch einen oder beide Ringe im Purin-Ringsystem und Schützung einer oder mehrer Funktionalitäten, z.B. unter Verwendung einer Schutzgruppe, wie z.B. Acetyl, Difluoracetyl, Trifluoracetyl, Isobutyryl, Benzoyl und dergleichen. Modifizierte Nucleoside und Nucleotide können auch Modifikationen an der Zuckergruppierung umfassen, z.B. wobei eine oder mehrere der Hydroxylgruppen durch Halogenid- und/oder Hydrocarbylsubstituenten (typischerweise aliphatische Gruppen, im letzteren Fall) ersetzt sind oder funktionalisiert sind als Ether, Amine oder dergleichen. Übliche Analoga umfassen, ohne Beschränkung darauf, 1-Methyladenin, 2-Methyladenin, N6-Methyladenin, N6-Isopentyladenin, 2-Methylthio-N6-isopentyladenin, N,N-Dimethyladenin, 8-Bromadenin, 2-Thiocytosin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, 5-Ethylcytosin, 4-Acetylcytosin, 1-Methylguanin, 2- Methylguanin, 7-Methylguanin, 2,2-Dimethylguanin, 8-Bromguanin, 8-Chlorguanin, 8-Aminoguanin, 8-Methylguanin, 8-Thioguanin, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, 5-Ethyluracil, 5-Propyluracil, 5-Methoxyuracil, 5-Hydroxymethyluracil, 5-(Carboxyhydroxymethyl)uracil, 5-(Methylaminomethyl)uracil, 5-(Carboxymethylaminomethyl)uracil, 2-Thiouracil, 5-Methyl-2-thiouracil, 5-(2-Bromvinyl)uracil, Uracil-5-oxyessigsäure, Uracil-5-methylester, Pseudouracil, 1-Methylpseudouracil, Queosin, Inosin, 1-Methylinosin, Hypoxanthin, Xanthin, 2-Aminopurin, 6-Hydroxyaminopurin, 6-Thiopurin und 2,6-Diaminopurin. Isoguanin und Isocytosin können in Oligonucleotide eingebaut werden, um mögliche Kreuzreaktivität zwischen Sequenzen zu verringern, wenn Hybridisierung nicht erwünscht ist.
  • Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff "Oligonucleotid" Polydesoxyribonucleotide (enthaltend 2-Desoxy-D-ribose), Polyribonucleotide (enthaltend D-Ribose), jeden beliebigen anderen Polynucleotidtyp, der ein N-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase ist, und andere Polymere, die nicht-nucleotidische Grundgerüstketten (z.B. Protein-Nucleinsäuren und synthetische sequenzspezifische Nucleinsäurepolymere, die als NeugeneTM-Polymere von der Anti-Gene Development Group, Corvallis, Oregon kommerziell erhältlich sind) oder Nicht-standard-Verknüpfungen bzw. -Bindungen enthalten, unter der Maßgabe, dass die Polymere Nucleobasen in einer Konfiguration enthalten, die Basenpaarung und Basenstapelung ermöglicht, so wie sie in DNA und RNA gebunden wird. Deshalb umfasst "Oligonucleotide" hierin doppel- und einzelsträngige DNA, sowie doppel- und einzelsträngige RNA und DNA:RNA-Hybride und umfasst auch bekannte Typen modifizierter Oligonucleotide, wie z.B. Oligonucleotide, worin ein oder mehrere natürlich auftretende Nucleotide durch ein Analogon ersetzt sind; Oligonucleotide, die Internucleotidmodifikationen enthalten, wie z.B. jene mit ungeladenen Verknüpfungen bzw. Bindungen (Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoramidate, Carbamate, usw.), negativ geladenen Verknüpfungen bzw. Bindungen (z.B. Phosphothioate, Phosphordithioate, usw.) und positiv geladenen Verknüpfungen bzw. Bindungen (z.B. Aminoalkylphosphoramidate, Aminoalkylphosphotriester), jene, die Seitengruppierungen enthalten, wie z.B. Protein (einschließlich Nucleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L-lysin usw.), jene mit Interkalatoren (z.B. Acridin, Psoralen usw.), jene, die Chelatoren enthalten (z.B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxidierende Metalle usw.) und jene, die Alkylatoren enthalten. Es gibt keine beabsichtigte Unterscheidung bei der Länge zwischen den Begriffen "Polynucleotid" und "Oligonucleotid", und diese Begriffe werden austauschbar verwendet werden. Diese Begriffe beziehen sich nur auf Primärstruktur des Moleküls. Wie sie hierin verwendet werden, sind die Symbole für Nucleotide und Polynucleotide gemäß den Empfehlungen der IUPAC-IUB Commission of Biochemical Nomenclature (Biochemistry 9:4022, 1970).
  • Oligonucleotide können durch bekannte Verfahren synthetisiert werden. Literaturverweise zum Hintergrund, die allgemein Verfahren zum Synthetisieren von Oligonucleotiden betreffen, umfassen jene, die 5'-nach-3'-Synthesen, basierend auf der Verwendung von β-Cyanoethylphosphat-Schutzgruppen, betreffen, z.B. de Napoli et al. (1984) Gazz Chim. Ital. 114:65; Rosenthal et al. (1983) Tetrahedron Lett 24:1691; Belagaje und Brush (1977) Nuc. Acids Res. 10:6295; Literaturverweise, die Lösungs-Phasen 5'-nach-3'-Synthesen beschreiben, umfassen Hayatsu und Khorana (1957) J. Am. Chem. Soc. 89:3880; Gait und Sheppard (1977) Nuc. Acids Res. 4: 1135; Cramer und Koster (1968) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 7:473; und Blackburn et al. (1967), J. Chem. Soc. Teil C, bei 2438. Weiterhin beschrieben Matteucci und Caruthers (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185–91 die Verwendung von Phosphochloriditen bei der Herstellung von Oligonucleotiden. Beaucage und Caruthers (1981) Tetrahedron Lett 22:1859–62, und das US-Patent Nr. 4,415,732 beschrieben die Verwendung von Phosphoramiditen für die Herstellung von Oligonucleotiden. Smith, Am. Biotech. Lab. (ABL) 15–24 (Dezember 1983) beschreibt automatisierte Feststoffphasen-Oligodesoxyribonucleotidsynthese. Siehe auch die dort zitierten Literaturverweise und Warner et al. (1984) DNA 3:401–11, deren Offenbarungen hierin durch Literaturverweis aufgenommen sind. T. Horn und M. S. Urdea (1986) DNA 5:421–25 beschrieben Phosphorylierung von DNA-Fragmenten an Trägern unter Verwendung von Bis(cyanoethoxy)-N,N-diisopropylaminophosphin. Siehe auch T. Horn und M. S. Urdea (1986) Tetrahedron Lett 27:4705–08.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Sonde" auf eine Struktur, bestehend aus einem Polynucleotid, das eine Hybridstruktur mit einer Zielsequenz, enthalten in einem Molekül (ein "Zielmolekül") in einer Probe, die einer Analyse unterworfen wird, aufgrund der Komplementarität von wenigstens einer Sequenz in der Sonde mit der Zielsequenz bildet. Die Nucleotide jeder speziellen Sonde können Desoxyribonucleotide, Ribonucleotide und/oder synthetische Nucleotidanaloga sein. Der Begriff "Primer" bezieht sich auf ein Oligonucleotid, ungeachtet, ob es auf natürliche Weise in einem aufgereinigten Reqstriktionsverdau hergestellt wurde oder synthetisch hergestellt wurde, das fähig ist, als Initiationspunkt der Synthese zu wirken, wenn es unter Bedingungen gebracht wird, unter denen die Synthese eines Primer- Verlängerungsprodukts, das zu einem Nucleinsäurestrang komplementär ist, induziert wird, d.h. in Gegenwart geeigneter Nucleotide und eines Mittels zur Polymerisation, wie z.B. DNA-Polymerase in einem geeigneten Puffer und bei einer geeigneten Temperatur.
  • Der Begriff "Träger" bezieht sich auf jede beliebige feste Oberfläche (einschließlich halbfester Oberflächen), an der eine Sonde, ein Analytmolekül oder eine andere chemische Entität verankert werden kann. Geeignete Trägermaterialien umfassen, ohne Beschränkung darauf, Träger, die typischerweise für chemische Festphasen-Synthese verwendet werden, z.B. polymere Materialien (z.B. Polystyrol, Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylonitril, Polyacrylamid, Polymethylmethacrylat, Polytetrafluorethylen, Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylidenfluorid, Polycarbonat, Divinylbenzolstyrol-basierte Polymere), Agarose (z.B. Sepharose®, Dextran (z.B. Sephadex®), Cellulosepolymere und andere Polysaccharide, Siliziumdioxid und Siliziumdioxid-basierte Materialien, Glas (insbesondere Poren-kontrolliertes Glas oder "CPG") und funktionalisierte Glasarten und Keramiken. Bevorzugte Träger sind feste Substrate in der Form von Kügelchen oder Partikeln, einschließlich Mikropartikeln und Nanopartikeln.
  • Mit "PCR" ist hierin die Polymerasekettenreaktions (PCR)-Technik gemeint, die offenbart wurde von Mullis in den US-Patenten Nrn. 4,683,195 (Mullis et al.) und 4,683,202, die hier durch Literaturverweis aufgenommen sind. Bei der PCR-Technik werden kurze Oligonucleotide-Primer hergestellt, die zu gegenüberliegenden Enden einer gewünschten Sequenz passen. Die Sequenz zwischen den Primern muss nicht bekannt sein. Eine Probe-DNA (oder -RNA) wird extrahiert und denaturiert (bevorzugt durch Hitze). Dann werden Oligonucleotidprimer in molarem Überschuss, zusammen mit dNTPs und einer Polymerase (bevorzugt Taq-Polymerase, die hitzestabil ist) zugefügt. Die DNA wird repliziert und dann wiederum denaturiert. Dies ergibt zwei "lange Produkte", die mit den jeweiligen Primern beginnen, und die zwei Originalstränge (pro Duplex-DNA-Molekül). Das Reaktionsgemisch wird dann wieder auf Polymerisationsbedingungen gebracht (z.B. durch Absenken der Temperatur, Inaktivieren eines Denaturierungsmittels oder durch Zugabe von weiterer Polymerase), und ein zweiter Zyklus wird initiiert. Der zweite Zyklus ergibt die zwei ursprünglichen Stränge, die zwei langen Produkte aus Zyklus 1, zwei neue lange Produkte (von den ursprünglichen Strängen repliziert) und zwei "kurze Produkte", die von den langen Produkten repliziert wurden. Die kurzen Produkte haben die Sequenz der Zielsequenz (Sense oder Antisense bzw. Sinn oder Gegensinn) mit einem Primer an jedem Ende. Bei jedem zusätzlichen Zyklus werden zwei zusätzliche lange Produkte erzeugt und eine Anzahl an kurzen Produkten, die gleich der Anzahl an langen und kurzen Produkten ist, die am Ende des vorherigen Zyklus verbleiben. Deshalb wächst die Anzahl kurzer Produkte mit jedem Zyklus exponentiell. Diese Amplifikation einer spezifischen Analytsequenz ermöglicht die Detektion extrem kleiner DNA-Mengen.
  • Der Begriff "3SR", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Verfahren der Ziel-Nucleinsäureamplifikation und ist auch als das "selbst-fortsetzende Sequenzreplikations-System" ("self-sustained sequence replication system") bekannt, das im Europäischen Patent Veröffentlichungsnummer 0 373 960 (veröffentlicht am 20. Juni 1990) beschrieben ist.
  • Der Begriff "LCR", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Verfahren zur Ziel-Nucleinsäureamplifikation, das auch als die "Ligase-Kettenreaktion" bekannt ist und von Barany (1991) Proc. Nat. Acad. Sci. 88:189–193 beschrieben wurde.
  • Der Begriff "Hybridisierungsbedingungen" soll jene Bedingungen von Zeit, Temperatur und pH und die notwendigen Mengen und Konzentrationen von Reaktanten und Reagenzien bedeuten, die hinreichend sind, um wenigstens einen Anteil an komplementären Sequenzen miteinander assoziieren zu lassen. Wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist, hängen die Zeit-, Temperatur- und pH-Bedingungen, die erforderlich sind, um Hybridisierung zu bewirken, ab von der Größe und der zu hybridisierenden Oligonucleotidsonde, dem Grad an Komplementarität zwischen der Oligonucleotidsonde und dem Ziel bzw. Target und dem Vorhandensein von anderen Materialien im Hybridisierungsreaktionsgemisch. Die tatsächlichen Bedingungen, die für jede Hybridisierungsstufe nötig sind, sind auf dem Fachgebiet bekannt oder können ohne unzumutbares Experimentieren bestimmt werden.
  • Typische Hybridisierungsbedingungen umfassen die Verwendung von Lösungen, die auf einen pH von näherungsweise 7 bis näherungsweise 8,5 gepuffert sind, und Temperaturen von näherungsweise 30°C bis näherungsweise 60°C, bevorzugt von näherungsweise 37°C bis näherungsweise 55°C, für eine Zeitdauer von näherungsweise 1 Sekunde bis näherungsweise 1 Tag, bevorzugt von näherungsweise 15 Minuten bis näherungsweise 16 Stunden, und am bevorzugtesten von näherungsweise 15 Minuten bis näherungsweise 3 Stunden.
  • "Hybridisierungsbedingungen" umfassen auch einen wirksamen Puffer. Jeder beliebige Puffer, der kompatibel ist, d.h. chemisch inert hinsichtlich der Sonden und anderen Komponenten, aber noch Hybridisierung zwischen komplementären Basenpaaren ermöglicht, kann verwendet werden. Ein besonders bevorzugter Puffer umfasst drei 3 × SSC, 50 % Formamid, 10 % Dextransulfat (Molekulargewicht 500.000), 0,2 % Casein, 10 μg/ml poly-A und 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA, wobei 1 × SSC 0,15 M Natriumchlorid und 0,015 M Natriumcitrat ist. Ein weiterer besonders bevorzugter Puffer umfasst 5 × SSC, 0,1 bis 0,3 % Natriumdodecylsulfat, 10 % Dextransulfat, 1 mM ZnCl2 und 10 mM MgCl2, wobei 1 × SSC wie obenstehend definiert ist. Andere geeignete Puffer sind Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet bekannt.
  • Der Begriff "Zielmolekül" bezieht sich auf ein Molekül, das einen nucleotidischen Abschnitt, entweder oligomer oder polymer, enthält oder das vollständig aus einem Oligonucleotid oder Polynucleotid besteht. Ein "Zielgenom", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Polynucleotid, das für ein oder mehrere Proteine codiert, das durch ein erfindungsgemäßes Verfahren untersucht werden soll. Das Zielgenom ist im Allgemeinen ein Säugergenom und bevorzugt ein humanes Genom, kann aber auch viral oder bakteriell sein. Zielgenome umfassen, sind aber nicht beschränkt darauf, humanen Hepatitis A-Virus (HAV), Heptatitis B-Virus (HBV), Hepatitis C-Virus (HCV), Hepatitis D-Virus (HDV), humanen Immundefizienzvirus (HIV), humanen Papilloma-Virus (HPV), Cytomegalovirus (CMV), Herpes simplex-Virus (HSV) und Rinder-Papilloma-Virus (BPV).
  • Der Begriff "Singleplex" bezieht sich auf einen einzelnen Assay, der nicht gleichzeitig mit anderen Assays durchgeführt wird. Ein "Singleplex"-Assay wird verwendet, um sich auf einzelne Assays zu beziehen, die sequenziell durchgeführt werden. Im Allgemeinen sind die Assays Hybridisierungsassays.
  • Der Begriff "Multiplex" bezieht sich auf mehrfache Assays, die gleichzeitig durchgeführt werden, in denen Detektions- und Untersuchungsstufen im Allgemeinen parallel ausgeführt werden. Wie oben sind die Assays typischerweise Hybridisierungsassays.
  • Die Begriffe "komplementär" und "im Wesentlichen komplementär" beziehen sich auf Basenpaarung zwischen Nucleotiden und Nucleinsäuren, wie z.B. zwischen den zwei Strängen eines doppelsträngigen DNA-Moleküls oder zwischen einem Oligonucleotid-Primer und einer Primer-Bindungsstelle auf einer zu sequenzierenden oder zu amplifizierenden einzelsträngigen Nucleinsäure. Komplementäre Nucleotide sind im Allgemeinen A und T (oder A und U) oder C und G. Zwei einzelsträngige RNA- oder DNA-Moleküle werden als "komplementär" bezeichnet, wenn die Nucleotide eines Strangs, optimal angeordnet und verglichen und mit geeigneten Nucleotidinsertionen oder -deletionen, zu wenigstens 90 % bis 95 % und bevorzugt zu wenigstens etwa 98 bis 99,5 % paaren. Zwei einzelsträngige RNA- oder DNA-Moleküle werden als "im Wesentlichen komplementär" bezeichnet, wenn die Nucleoti de eines Stranges, optimal angeordnet und verglichen und mit geeigneten Nucleotidinsertionen oder -deletionen, mit wenigstens näherungsweise 80 % der Nucleotide des anderen Stranges paaren.
  • Der Begriff "arretierender Linker" ("arresting linker"), wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Nucleotid- oder Nicht-Nucleotidlinker in einer Sonde oder einem Primer, der durch das Amplifikationsenzym nicht amplifiziert wird. Der Begriff "detektierbare Markierung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein beliebiges Atom oder Molekül, das verwendet werden kann, um ein detektierbares (bevorzugt quantifizierbares) Signal bereitzustellen, und das über eine kovalente Bindung oder eine nicht-kovalente Wechselwirkung (z.B. durch ionische oder Wasserstoffbindung) oder über Immobilisierung, Adsorption oder dergleichen) an eine Nucleinsäure oder ein Protein gebunden sein kann. Markierungen stellen im Allgemeinen Signale bereit, die durch Fluoreszenz, Chemilumineszenz, Radioaktivität, Kolorimetrie, Massenspektrometrie, Röntgenstrahlenbeugung oder -absorption, Magnetismus, Enzymaktivität oder dergleichen detektierbar sind. Geeignete Markierungen umfassen Fluorophore, Chromophore, radioaktive Atome (insbesondere 32P und 125I), elektronendichte Reagenzien, Enzyme und Liganden mit spezifischen Bindungspartnern. Enzyme werden typischerweise aufgrund ihrer Aktivität detektiert. Beispielsweise wird Meerrettichperoxidase (HRP) üblicherweise aufgrund ihrer Fähigkeit detektiert, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) zu einem blauen Pigment umzuwandeln, das mit einem Spektrofotometer quantifizierbar ist. Es sollte verstanden werden, dass die obenstehende Beschreibung nicht dazu gedacht ist, die verschiedenen Markierungen in bestimmte Klassen zu kategorisieren, da eine einzelne Markierung unter Verwendung von zwei oder mehreren verschiedenen Verfahren detektiert werden kann. Beispielsweise kann 125I als eine radioaktive Markierung und als ein elektronendichtes Reagens dienen. HRP kann als ein Enzym oder als ein Antigen für einen monoklonalen Antikörper (MAb) dienen. Weiterhin kann man verschiedene Markierungen für einen gewünschten Effekt kombinieren. Beispielsweise erfordern MAbs und Avidin auch Markierungen bei der Ausführung dieser Erfindung: deshalb könnte man eine Sonde mit Biotin markieren und ihr Vorhandensein mit Avidin, das mit 125I markiert ist, oder mit einem mit HRP markierten Anti-Biotin-MAb oder mit einem mit Avidin oder Streptavidin konjugierten HRP-Molekül detektieren. Andere Permutationen und Möglichkeiten werden Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet leicht ersichtlich sein und werden als Äquivalente betrachtet.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "überlappende Sequenzen" auf zwei Oligonucleotidsequenzen, die eine partielle gemeinsame Sequenz haben. Zum Beispiel überlappen die Oligonucleotide GAATTC und AATTCC in ihrer gemeinsamen Sequenz AATTC. Weil diese zwei Oligonucleotide beide von der Sequenz GAATTCC stammen, aber einen Startpunkt haben, der um ein Nucleotid beabstandet ist, werden die zwei Nucleotide hierin als um ein Nucleotid überlappend bezeichnet.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "diskontinuierliche Sonde" auf eine Oligonucleotidsonde mit zwei oder mehreren Regionen, die zwei oder mehreren nicht-zusammenhängenden Regionen einer Ziel-Nucleinsäure entsprechen. Die zwei oder mehreren Regionen einer Sonde sind kovalent verbunden, entweder direkt, über eine intervenierende Nucleotidsequenz, oder über eine organische Linkergruppierung (wobei sich eine "organische Linkergruppierung" auf ein im Wesentlichen lineares organisches Spacer-Molekül bezieht, das fähig ist, an seinen zwei Enden an zwei verschiedene Oligonucleotide gebunden zu sein).
  • Der Begriff "Amplikon" bezieht sich auf das Amplifikationsprodukt, das aus der Amplifikation einer Nucleinsäuresequenz unter Verwendung von Polymerasekettenreaktion (PCR), Ligasekettenreaktion (LCR) oder einer alternativen Amplifikationstechnik resultiert.
  • Für die Verwendung in dem vorliegenden Verfahren muss das Amplikon markiert sein. Bei einer ersten Technik werden markierte Primer während der Amplifikationsstufe verwendet, wodurch markierte Amplikons erzeugt werden, wenn die markierten Primer in die Amplikons eingebaut werden. Markierte Primer sind im Handel erhältlich, z.B. von CPG, Inc. (Lincoln Park, New Jersey), oder sie können über Konjugation einer Markierung mit einem unmarkierten Primer hergestellt werden. Markierung von Oligonucleotiden, wie z.B. Primern, kann unter Verwendung herkömmlicher Kupplungs-Verfahrensweisen durchgeführt werden. Spezielle Kupplungs-Verfahrensweisen werden jedoch, abhängig von der reaktiven Gruppe oder Gruppen, die an der Markierung und/oder an dem Oligonucleotid vorhanden sind, variieren.
  • Zum Beispiel sind Nick-Translationsverfahrensweisen, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, verfügbar zum Substituieren eines unmarkierten Nucleotids durch ein markiertes Nucleotid durch die Verwendung von DNase I und von anderen Enzymen, wodurch ein markiertes Amplikon bereitgestellt wird. Ein weiteres Verfahren zum Markieren umfasst die Zugabe einer terminalen Desoxynucleotidyltransferase für markierte Desoxynucleotide ("labeled deoxynucleotide terminal deoxynucleotidyl transferase") (TdT, im Handel erhältlich von Händlern, wie z.B. Pan Vera Corp., Madison, Wisconsin), eine DNA-Polymerase, die die Addition von markierten Desoxynucleotiden an das 3'-Ende von DNA-Fragmenten katalysieren kann.
  • Eine zweite Technik zum Herstellen markierter Amplikons umfasst eine getrennte Markierungsstufe, worin unmarkierte Amplikons nachfolgend mit einer Markierung gekoppelt werden. Die Techniken, die obenstehend hinsichtlich des Markierens von Primern beschrieben wurden, können auch verwendet werden, um Markierungen an unmarkierte Amplikons zu binden.
  • Jeder beliebige Markierungstyp kann an das Amplikon gebunden werden. Bevorzugte Markierungen umfassen jene Gruppierungen, die durch spektroskopische, fotochemische, biochemische, immunchemische oder chemische Mittel detektierbar sind. Derartige Markierungen umfassen, ohne Beschränkung darauf, fluoreszierende Stoffe ("fluorescers"), chemilumineszierende Stoffe ("chemiluminescers"), Farbstoffe, Biotin, Haptene, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzym-Co-Faktoren, Enzyminhibitoren, Enzymuntereinheiten, Metallionen, elektronendichte Reagenzien und radioaktive Isotope (z.B. 32P). Die Markierungsgruppierung kann direkt oder indirekt an das Amplikon gebunden sein. Die Markierung sollte bevorzugt so ausgewählt sein, dass die denaturierenden Bedingungen widerstehen, wenn sie direkt an den Primer gebunden ist. Es ist bevorzugt, obgleich nicht notwendig, dass die Markierung Biotin ist, das über Bindung mit Streptavidin, gekoppelt an einen fluoreszierenden Stoff, z.B. ein Streptavidin-Phycoerythrin-Konjugat, detektiert werden kann.
  • Der Begriff "Probe", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Flüssigkeit oder ein Gewebe, das von einem Organismus (z.B. einem Säugerorganismus, wie z.B. einem Menschen), erhalten wurde, das den zu charakterisierenden Nucleinsäureanalyten enthält. Solche Proben sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen, ohne Beschränkung darauf: Blut; Plasma; Serum; Spinalflüssigkeit; Lymphflüssigkeit; Zelllysate; Samenflüssigkeit; Sekretionen der Haut oder der Atemwege, des Intestinaltrakts oder des Urogenitaltrakts; Tränen; Speichel; Milch und weiße Blutkörperchen.
  • Der Begriff "Einzelnucleotidpolymorphismus" (oder "SNP") bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, die sich in der Sequenz durch nur eine Nucleinsäure von einer Referenz-Nucleinsäuresequenz unterscheidet, wobei das Vorhandensein des SNP mit einer Krankheit oder einem anderen eindeutigen Zustand verknüpft ist und deshalb als eine wichtige Diagnosefunktion dient. Wie in 1 dargestellt, kann ein interessierender Ort, wie z.B. ein SNP, innerhalb oder nahe einer intramolekularen Sekundärstruktur angeordnet sein und folglich zur Hybridisierung mit einer Sequenz-spezifischen Hybridisierungssonde unzugänglich bzw. nicht verfügbar sein. Um die Sekundärstruktur aufzubrechen und die "maskierten" Sequenzen detektierbar zu machen, ist es wünschenswert, die Region der Zielnucleotidsequenz unter Verwendung einer blockierenden Sonde aufzubrechen, so dass die interessierende Sequenz nicht an einer unerwünschten Sekundärstruktur beteiligt und im Wesentlichen vor einer Hybridisierungssonde "verborgen" ist. Das US-Patent Nr. 5,030,557, erteilt an Hogan et al., schlägt vor, dass die Zugabe einer fremden blockierenden Sonde ("extraneous blocking probe") wirksam ist beim Verhindern der Bildung einer derartigen Sekundärstruktur und es ermöglicht, eine interessierende Sequenz zu detektieren. Fremde blockierende Sonden müssen jedoch in einem großen molaren Überschuss in Bezug auf die Konzentration der Zielnucleotidsequenz vorliegen, um wirksam zu sein, und haben deshalb den Nachteil, dass sie Beschränkungen hinsichtlich der Größe der blockierenden Sequenz, die wirksam sein wird, auferlegen. Im Gegensatz dazu verwendet die vorliegende Erfindung Primer und Sonden, die wirksam sind zum Verhindern der Bildung der unerwünschten Sekundärstruktur ohne Bedarf an einem separaten "Blocker"-Molekül. Die erfindungsgemäßen Primer und Sonden umfassen eine Kombination aus einer blockierenden Sequenz und einer Hybridisierungssequenz (d.h. eine "Primersequenz") in einem Primer und eine "Ziel-Bindungssequenz" in einer Sonde). Die Kombinationsprimer oder "Mehrzweck"-Primer ("dual-purpose" primers") stellen eine wenigstens 100-fache Erhöhung des Signals relativ zu der Verwendung herkömmlicher Primer und wenigstens eine 5-fache bis 7-fache Erhöhung des Signals relativ zu einem entsprechenden Amplifikationsverfahren, das mit einer äußeren blockierenden Sonde wie oben beschrieben (siehe Beispiel 1) durchgeführt wird, bereit. Eine Sonde, die eine blockierende Sequenz umfasst, kann verwendet werden, um einen beliebigen speziellen interessierenden Ort zu detektieren und ist nicht beschränkt auf SNPs oder allelische Varianten, obwohl diese im Allgemeinen die bevorzugten interessierenden Orten innerhalb einer Ziel-Nucleotidsequenz sind. Während eine Sonde, die eine blockierende Sequenz umfasst, mit jeder beliebigen Ziel-Nucleotidsequenz verwendet werden kann, ist sie am nützlichsten, wenn die Ziel-Nucleotidsequenz eine intramolekulare Sekundärstruktur bildet, die die Detektion der spezifischen Sequenz maskiert.
  • Um die Empfindlichkeit der Detektion einer spezifischen Ziel-Nucleotidsequenz (z.B. eine Sequenz, die mit einer allelischen Variante oder einem SNP verbunden ist) ist ein Primer entworfen worden, der eine "Blocker"-Sequenz umfasst, wobei die "Blocker"-Sequenz mit einer Region der intramolekularen Sekundärstruktur im Amplikon (entsprechend der Region, die eine intramolekulare Sekundärstruktur in der Ziel-Nucleotidsequenz bildet) hybridisiert, so dass die Bildung der störenden intramolekularen Sekundärstruktur durch den "Blocker" gestört bzw. unterbrochen wird. Eine spezifische Hybridisierungssonde, wie z.B. eine allelspezifische Hybridisierungssonde, kann dann verwendet werden, um die interessierende Sequenz im Amplikon zu detektieren.
  • Die in der Erfindung verwendeten Primer und Sonden und die Verfahren zur Verwendung der Primer und Sonden sind nachstehend detaillierter beschrieben.
  • In dieser Ausführungsform wird ein Mehrzweck-Primer bereitgestellt, der verwendet wird, um eine Ziel-Nucleotidsequenz in einem Zielmolekül zu amplifizieren, wobei das Produkt davon ein "Amplikon" genannt wird. Die Ziel-Nucleotidsequenz enthält einen interessierenden Ort proximal zu oder enthalten in einer Sekundärstruktur bildenden Region, die, in der Abwesenheit des Mehrzweckprimers, eine unerwünschte Sekundärstruktur in dem Amplikon bewirkt, die den interessierenden Ort verbirgt, d.h., den Zutritt eines hybridisierenden Oligonucleotids zu dem interessierenden Ort verhindert. Der interessierende Ort ist eine Nucleinsäuresequenz von zwei oder mehr Nucleotiden, typischerweise drei oder mehr Nucleotiden. Häufig ist der interessierende Ort eine 3-Nucleotid-Sequenz, die einem möglichen Einzelnucleotidpolymorphismus entspricht.
  • Wie in 5 dargestellt, ist der Mehrzweck-Primer komplementär zu einem Terminus des die Ziel-Nucleotidsequenz enthaltenden Zielmoleküls. Der Primer enthält eine Primersequenz (P), komplementär zu einem anderen Abschnitt der Ziel-Nucleotidsequenz als der Sekundärstruktur bildenden Region (B'), und eine blockierende Sequenz (B), im Wesentlichen komplementär zu einem Abschnitt der Sekundärstruktur bildenden Region, um die Bildung der unerwünschten Sekundärstruktur zu verhindern. Die Primersequenz ist relativ kurz, im Allgemeinen in der Größenordnung von 10 bis 30 Basenlänge. Die blockierende Sequenz kann auch relativ kurz sein, signifikant kürzer als die in Verfahren des Standes der Technik verwendeten blockierenden Sonden, wie hierin an anderer Stelle diskutiert. Zum Beispiel kann die blockierende Sequenz nur näherungsweise 8 bis 12 Basen lang sein.
  • Der Primer umfasst weiterhin einen optionalen Spacer zwischen der Primersequenz und der blockierenden Sequenz, wobei der Spacer so entworfen ist, dass er nicht hybridisiert oder mit den Hybridisierungs-Ereignissen interferiert, die zum Ausführen der vorliegenden Verfahren nötig sind, und wird als solcher hierin als ein "nicht-hybridisierender" Spacer bezeichnet. Der Spacer kann nucleotidisch sein, z.B. bestehend aus einer Sequenz aus nicht natürlichen Nucleotiden, wie z.B. Isoguanin und Isocytosin, oder einer Sequenz aus einem wiederkehrenden einzelnen Nucleotid. Der Spacer kann auch nicht-nucleotidisch sein, d.h. bestehend aus einem synthetischen hydrophilen Oligomer, wie z.B. einer Poly(alkylenoxid)-Kette. Verfahren, die zum Herstellen der optionalen Spacer geeignet sind, sind aus der Literatur bekannt. Die Herstellung von Polyethylenglykolspacern wird beispielsweise von Kern et al. (1979) Makromol. Chem. 150:2539 beschrieben. Andere Spacer können auf eine ähnliche Weise hergestellt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Primer ein Mittel zum Anhalten der Transkription zwischen der Sondensequenz und einem nucleotidischen Spacer. Im Allgemeinen ist das Mittel zum Anhalten der Transkription ein die zwei Primerabschnitte verbindender Linker, der die verwendete Polymerase daran hindert, die Replikation über die Sondensequenz-nucleotidische-Spacer-Verbindungsstelle hinweg fortzusetzen. Derartige Linker werden hierin als "arretierende Linker" ("arresting linkers") bezeichnet. Bevorzugte arretierende Linker umfassen wenigstens ein modifiziertes Nucleotid, um so in einer zuvor genannten Weise zu wirken, wobei die Modifikation ein Molekülabschnitt ist, der sich aus dem Molekülkern eines Nucleosids erstreckt, typischerweise aus einem Stickstoffatom, das in einer Purin- oder Pyrimidinringstruktur enthalten ist. Beispiele besonders bevorzugter arretierender Linker umfassen, ohne Beschränkung darauf, N4-modifizierte Pyrimidine, wie z.B. 5-Methyl-N4-(O-6-oxyhexyl)-2'-desoxycytidin, 5-Methyl-N4-(O-FMOC-6-oxyhexyl)-2'-desoxycytidin, 5-Methyl-N4-(O-levulinyl-6-oxyhexyl)-2'-desoxycytidin und 5-Methyl-N4-(O-6-oxyhexyl)-2'-thymidin, die im Allgemeinen, aber nicht notwendigerweise, während der Primersynthese unter Verwendung der entsprechenden 3'- und 5'-substituierten Nucleoside, z.B. ein an der 3'-Position mit DMT und an der 5'-Position mit einem Phosphoramidit substituiertes Nucleosid, eingeführt werden. Weitere Information hinsichtlich geeigneter arretierender Linker, einschließlich detaillierter Verfahren zum Einbau in ein Primeroligonucleotid, kann im US-Patent Nr. 5,200,314, erteilt an Urdea, gefunden werden.
  • Der Primer kann eine detektierbare Markierung umfassen, obwohl eine Markierung auch, z.B. über eine Markierungssonde, während des Amplifikationsassays eingeführt werden kann. Im ersteren Fall wird der markierte Primer ein markiertes Amplikon ergeben, da die markierten Primer in die Amplikons eingebaut werden. Markierte Primer sind im Handel von Quellen wie z.B. CPG, Inc. (Lincoln Park, New Jersey), erhältlich, oder sie können hergestellt werden, indem eine Markierung mit einem nicht-markierten Primer konjugiert wird. Das Markieren von Oligonucleotiden, wie z.B. Primern, kann unter Anwendung herkömmlicher Kupplungs-Verfahrensweisen durchgeführt werden. Spezielle Kupplungs-Verfahrensweisen werden jedoch, abhängig von der/den reaktiven Gruppe oder Gruppen, die an der Markierung und/oder an dem Oligonucleotid vorhanden sind, variieren. Bevorzugte Markierungen umfassen jene Gruppierungen, die durch spektroskopische, fotochemische, biochemische, immunchemische oder chemische Mittel detektierbar sind. Derartige Markierungen umfassen, ohne Beschränkung, fluoreszierende Stoffe, chemilumineszierende Stoffe, Farbstoffe, Biotin, Haptene, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzym-Co-Faktoren, Enzyminhibitoren, Enzymuntereinheiten, Metallionen, elektronendichte Reagenzien und radioaktive Isotope (z.B. 32P). Die Markierungsgruppierung kann direkt oder indirekt an den Primer gebunden sein. Bevorzugt sollte die Markierung so ausgewählt sein, dass sie denaturierenden Bedingungen widersteht, wenn sie direkt an den Primer gebunden werden soll. Es ist bevorzugt, wenngleich nicht notwendig, dass die Markierung Biotin ist, das über Bindung mit Streptavidin, gekoppelt an einen fluoreszierenden Stoff, z.B. ein Strepavidin-Phycoerythrin-Konjugat, detektiert werden kann.
  • Wie obenstehend angegeben, ist der Mehrzweck-Primer verwendbar in einem Verfahren zum Amplifizieren einer Ziel-Nucleotidsequenz in einem Zielmolekül, wobei die Zielnucleotidsequenz einen interessierenden Ort proximal zu oder enthalten in einer Sekundärstruktur bildenden Region enthält, die fähig ist, eine unerwünschte Sekundärstruktur in einem unter Amplifikationsbedingungen gebildeten Amplikon zu bilden. Die Amplifikation kann unter Anwendung herkömmlicher Techniken durchgeführt werden, und obwohl jedes beliebige bekannte Amplifikationsverfahren verwendet werden kann, umfassen bevorzugte Verfahren PCR, 3SR und LCR, wobei PCR am stärksten bevorzugt ist.
  • Eine PCR-Amplifikation unter Verwendung der erfindungsgemäßen Mehrzweck-Primer wird in einem Gemisch durchgeführt, enthaltend das Zielmolekül, einen zu einem Terminus eines ersten Stranges eines doppelstrangigen Zielmoleküls komplementären Mehrzweck-Primer, einen zu dem gegenüberliegenden Terminus des Zweitstranges des Zielmoleküls komplementären zweiten Nucleotidprimer, einen Überschuss an den vier Oligonucleotid (dNTP)-Monomeren und Wasser, das einen für die Durchführung von PCR geeigneten Puffer enthält (einschließlich herkömmlicher Puffer, die Tris-HCl, KCl und MgCl2 umfassen), und ein Mittel zur Polymerisation der Nucleotide, z.B. eine Polymerase, wie z.B. Taq-Polymerase.
  • Das Gemisch wird dann einer Reihe von Replikationszyklen ausgesetzt, die auf der Temperatur beruhen. Beispielsweise wird das Gemisch mehrere Minuten lang auf 94–96°C erhitzt, während dieser Zeit wird jede beliebige doppelsträngige DNA zu einzelsträngiger DNA denaturiert. Als Nächstes wird die Temperatur des Gemischs auf etwa 50–65°C abgesenkt, während dieser Zeit hybridisieren die Oligonucleotidprimer über Wasserstoffbrückenbindungen mit komplementären Sequenzen. Schließlich wird die Temperatur des Gemischs auf etwa 72°C erhöht, während dieser Zeit bindet die Polymerase und verlängert einen komplementären Strang, ausgehend von jedem Primer. Da sich die Sequenz, die amplifiziert wird, nach jeder Probe verdoppelt, kann eine theoretische Amplifikation von einer Milliarde erreicht werden, wenn reichlich bzw. ausreichend Nucleinsäureanalyt für das vorliegende Verfahren bereitgestellt wird.
  • Ein Verfahren zur Verwendung der Primer zur Amplifikation einer Ziel-Nucleotidsequenz ist in 2 dargestellt. Die im Amplikon bereitgestellte blockierende Sequenz unterbricht die Bildung der unerwünschten Sekundärstruktur im Amplikon und erleichtert deshalb die Untersuchung des interessierenden Ortes (nun in dem Amplikon) unter Verwendung der Sonde, die in 2 als die "Sonde für differenzielle Hybridisierung" ("Differential Hybridization Probe") bezeichnet wird (siehe auch 5). Wenn der interessierende Ort eine allelische Variation oder eine SNP-Stelle enthält, wird der Primer die Region der Ziel-Nucleotidsequenz amplifizieren, die die allelische Variation oder die SNP-Stelle enthält; und dann kann die allelische Variation oder die SNP-Stelle unter Verwendung einer Sonde für differenzielle Hybridisierung, die eine detektierbare Markierung oder dergleichen umfasst, detektiert werden. Deshalb sind die erfindungsgemäßen Primer und Verfahren auch verwendbar in einem Verfahren zum Bestimmen des Genotyps eines Individuums. Ein besonders bevorzugtes Verfahren wird in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 03 255 859.5 (EP-A-1 400 601) der Anmelderin für "Verfahren zur Detektion von multiplen Nucleinsäuresequenzvariationen", die am gleichen Tag wie die vorliegende Anmeldung eingereicht wurde, beschrieben.
  • Bei der Amplifikation der Zielnucleotidsequenz, vermittelt durch den Primer und ein Polymerisationsmittel, z.B. eine DNA-Polymerase oder ein anderes Enzym, das fähig ist, ein Komplement zu der Ziel-Nucleotidsequenz zu erzeugen, sind die Amplikons durch das Vorhandensein einer detektierbaren Markierung, wie obenstehend beschrieben, detektierbar, und die Primer werden verwendet, um Ziel-Nucleotidsequenzen zu amplifizieren, die von genomi scher DNA eines zu testenden Individuums stammen bzw. abgeleitet sind, was in einem Verfahren zum Bestimmen des Genotyps eines Individuums verwendet werden kann.
  • Für die Detektion einer spezifischen Ziel-Nucleotidsequenz werden die erfindungsgemäßen allelspezifischen Sonden zum Detektieren eines SNP oder einer anderen interessierenden Sequenz innerhalb des amplifizierten Produktes, das unter Verwendung der Primer mit der Ziel-Nucleotidsequenz als einer Matrize erzeugt wurde, verwendet, wie obenstehend erwähnt. Die Erfindung erleichtert auch die Detektion und Analyse bzw. Untersuchung eines SNP oder einer anderen Ziel-Nucleotidsequenz in einem Multiplexmodus, d.h. in parallelen Hybridisierungsexperimenten, die gleichzeitig durchgeführt werden, wobei die allelspezifischen Hybridisierungssonden jeweils mit einer eindeutigen Markierung markiert sind, wie in 2 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die an jede allelspezifische Hybridisierungssonde gebundene eindeutige Markierung eine Mikrosphäre, die vorteilhafterweise unter Verwendung eines Durchflusszytometers detektiert und untersucht werden kann.
  • Optimalerweise wird ein Durchflusszytometer, das mit einem oder mehreren Detektionsmittel(n) verbunden ist, zum Detektieren der Komplexe verwendet, obwohl andere Mittel zum Detektieren und Auszählen der gefangenen bzw. gebundenen Komplexe auch verwendet werden können, und zwar abhängig vom Typ der Markierung und des Signals. Die Komplexe in der Hybridisierungslösung werden durch das Durchflusszytometer geleitet, wodurch die Detektion jedes Komplexes ermöglicht wird. Bevorzugt ist das Durchflusszytometer mit einem ersten Detektionsmittel zum Detektieren der Markierung (des markierten Amplikons) sowie mit einem zweiten Detektionsmittel zum Detektieren des mit dem festen Substrat verknüpften Signals verbunden. Geeignete Ausrüstungsgegenstände und Verfahren zum Detektieren der Markierungen und Signale unter Verwendung von Durchflusszytometrie und mit der Fähigkeit, eine Multiplex-Untersuchung durchzuführen, sind in den US-Patenten Nrn. 5,981,180, erteilt an Chandler et al., und 6,046,807 und 6,139,800, erteilt an Chandler, beschrieben. Im Handel erhältliche Systeme sind auch von Luminex Corp. (Austin, Texas) erhältlich und umfassen z.B. die LuminexTM 100-Maschine. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform sind die Mikrosphären LuminexTM-Mikrosphären. Für Zwecke der Bestimmung des Genotyps eines Individuums hinsichtlich einer einzelnen allelischen Variation sind jedoch zwei eindeutige Markierungen hinreichend, um zwischen der Bindung der allelspezifischen Hybridisierungssonde an das Wildtyp-Allel im Vergleich zu der Bindung der allelspezifischen Hybridisierungssonde an das variante Allel zu differenzieren.
  • Es wird verstanden werden, dass die Sonde und die Primersequenzen keine perfekte Komplementarität besitzen müssen, um mit der Ziel-Nucleotidsequenz oder dem Amplikon davon unter Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren. Beim Verwenden der erfindungsgemäßen Sonde als eine Hybridisierungssonde zum Detektieren einer spezifischen Sequenz, die in einer Ziel-Nucleotidsequenz vorhanden sein kann, ist es wünschenswert, dass die Stabilität der Hybridisierung der blockierenden Sequenz mit der Ziel-Nucleotidsequenz näherungsweise die gleiche ist, wie die Stabilität der Hybridisierung des sequenzspezifischen Anteils der Sonde mit der Ziel-Nucleotidsequenz. In dieser Ausführungsform hybridisiert die blockierende Sequenz mit der Sekundärstruktur bildenden Region der Ziel-Nucleotidsequenz und blockiert die Sekundärstruktur, die die Hybridisierung des sequenzspezifischen Anteils der Sonde stören würde, ohne ein falsch-positives Ergebnis für die Hybridisierung des sequenzspezifischen Anteils der Sonde zu ergeben. In der Praxis werden zwei Sonden hergestellt, die so entworfen sind, dass sie zwischen zwei ähnlichen Ziel-Nucleotidsequenzen unterscheiden bzw. diskriminieren, wie z.B. einem Wildtyp- und einem mutierten Allel, das zu detektieren gewünscht wird. Die Sonden umfassen weiterhin eine eindeutige identifizierende Markierung und einen sequenzspezifischen Anteil, der so entworfen ist, dass er spezifisch mit der Sequenz der Ziel-Nucleotidsequenz hybridisiert, die zu detektieren gewünscht wird.
  • Alternativ kann die Sekundärstruktur blockierende Sequenz der Sonde stärker mit der Ziel-Nucleotidsequenz hybridisieren als der sequenzspezifische Anteil der Sonde. Um das Auftreten eines falsch-positiven Ergebnisses zu vermeiden, muss der sequenzspezifische Anteil der Hybridisierungssonde anzeigen oder signalisieren, dass er mit der Ziel-Nucleotidsequenz hybridisiert ist. Das Vorhandensein einer Markierung, wie z.B. einer fluoreszierenden Sonde, bei der die Fluoreszenz durch das Vorhandensein eines Duplex-Nucleotids entweder verstärkt oder gequencht bzw. gelöscht wird, würde dieses Ergebnis erzielen. Ein weiteres nützliches Signal wäre ein selbst-gequenchtes Fluorophor-Quencher-Paar im sequenzspezifischen Anteil der Sonde, wobei, bei Bindung an die Ziel-Nucleotidsequenz, die Sequenz, die das Fluorophor-Quencher-Paar enthält, eine lineare Konfiguration annimmt, in der die Fluoreszenz nicht länger gequencht ist.
  • Zusätzlich zu den obenstehend beschriebenen Primern stellt die Erfindung auch neuartige "Mehrzweck"-Hybridisierungssonden ("dual-purpose" hybridization probes) bereit. Die Sonden umfassen: 1) eine erste Sonden-Nucleotidsequenz, die zu einer ersten Ziel-Nucleotidsequenz komplementär ist, und 2) eine zweite Sondensequenz, die im Wesentlichen komplementär zu einer zweiten Ziel-Nucleotidsequenz ist, wobei Hybridisierung der zweiten Sondensequenz mit der zweiten Ziel-Nucleotidsequenz eine Sekundärstrukturbildung bei der Ziel-Nucleotidsequenz blockiert, die anderenfalls die Bindung der ersten Sondensequenz an die erste Nucleotidsequenz stören würde. Die Mehrzwecksonden können in Verbindung mit beliebigen auf dem Fachgebiet bekannten Hybridisierungsassays verwendet werden. Die Mehrzwecksonden sind insbesondere nützlich, wenn die Ziel-Nucleotidsequenz, egal, ob DNA oder RNA, unerwünschte Sekundärstrukturen bildet, wie obenstehend beschrieben, wobei die Sekundärstrukturen den interessierenden Ort, der in der Ziel-Nucleotidsequenz enthalten ist, auf wirksame Weise maskieren. Die zweite (blockierende) Sequenz der Sonde unterbricht die Bildung der Sekundärstruktur in der Ziel-Nucleotidsequenz und erleichtert die Untersuchung des interessierenden Ortes mit der ersten Sonden-Nucleotidsequenz. Die Sonde ist insbesondere nützlich, wenn die interessierende Sequenz eine allelische Variation oder eine SNP-Stelle enthält, die anderenfalls nicht detektierbar wären, und sie stellt deshalb ein verbessertes Verfahren zum Bestimmen des Genotyps eines Individuums bereit.
  • Die neuartige Sonde der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden für den doppelten Zweck des Sekundärstruktur-Aufbrechens gekoppelt mit Ligationsdetektion. Ligationsassays werden in dem der Anmelderin gehörenden US-Patent Nr. 5,800,994, erteilt an Martinelli et al., diskutiert, das hierin durch Literaturverweis aufgenommen ist. Eine schematische Wiedergabe dieser Verfahrensweise ist in 10 angegeben.
  • Eine detektierbare Markierung kann an den Mehrzweck-Hybridisierungssonden vorhanden sein oder daran beim Abschluss eines Hybridisierungsassays gebunden werden.
  • Die Erfindung umfasst auch Sonden, die für einen Anteil der Sequenz einer Ziel-Nucleotidsequenz spezifisch sind. Bevorzugte Sonden sind sequenzspezifisch für ein bestimmtes Allel oder einen bestimmten SNP und können verwendet werden, um einen bestimmten Genotyp bei einem Individuum zu detektieren. Eine allelspezifische Hybridisierungs-(ASH) Sonde ist ein Beispiel einer bevorzugten Sonde. Wenn eine Ziel-Nucleotidsequenz unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Mehrzweck-Primers amplifiziert wird, hybridisiert die blockierende Sequenz des Primers mit der Sekundärstruktur bildenden Region der amplifizierten Ziel-Nucleotidsequenz, die das bestimmte Allel oder den bestimmten SNP enthält. Weil die blockierende Sequenz mit der Ziel-Nucleotidsequenz hybridisiert, ist die ASH-Sonde fähig, mit der Region der Ziel-Nucleotidsequenz zu hybridisieren, die das Allel oder den SNP enthält, wodurch die Detektion des Allels oder des SNPs ermöglicht wird.
  • Die neuartigen Sonden können weiterhin eine Fangsequenzdomäne ("capture sequence domain") umfassen, die so entworfen ist, dass sie mit einer detektierbaren Sonde hybridisiert. Bevorzugte ASH-Sonden umfassen eine Sequenz, die mit einer Fangsequenzdomäne hybridisiert, die mit eindeutigen Sequenzen, die an Detektionsmittel gebunden sind, hybridisiert, was nachstehend detaillierter beschrieben ist. Die Detektion von hybridisierten Sonden gemäß der Erfindung kann unter Verwendung eines beliebigen auf dem Fachgebiet bekannten Verfahrens durchgeführt werden. Beispielsweise kann das Vorhandensein einer Fluoreszenzsonde oder das Fehlen des Fluoreszenzsignals, wie bei Fluoreszenzlöschung, verwendet werden. In einem anderen Detektionsverfahren kann eine Sonde mit einer radioaktiven Markierung markiert werden und beispielsweise mit einem Szintillationszähler ("scintillant") detektiert werden. In einem bevorzugten Verfahren kann eine Sonde an ein Fluorophor oder einen anderen Farbstoff gebunden sein, oder die Sonde kann an ein festes Substrat gebunden sein, das mit einem Fluorophor oder einem anderen Farbstoff markiert ist. In einem bevorzugten Verfahren enthält die Sonde eine Nucleotidsequenz, die komplementär zu einer Nucleotidsequenz ist, die mit einer detektierbaren Markierung markiert ist, z.B. eine Nucleinsäuresonde, die mit einem Fluorophor markiert ist. In einem besonders bevorzugten Verfahren wird die Detektion in einem Multiplex-Assay unter Verwendung von LuminexTM-Mikrosphären bewerkstelligt.
  • Es kann gewünscht sein, das durch die markierten Sonden erzeugte Signal zu amplifizieren. Die Signalamplifikation/Signalvervielfachung kann die Verwendung von Nucleinsäure-Multimeren umfassen, wie es in den der Anmelderin gehörenden US-Patenten Nrn. 5,200,314; 5,124,246; 5,624,802; 5,710,264; und 5,849,481 beschrieben ist, die die Herstellung von großen verzweigten Kamm-Typ-Polynucleotid-Multimeren ("large comb-type branched polynucleotide multimers") zur Verwendung im obenstehend beschriebenen Lösungsphasenassay beschreiben. Die Kämme stellen eine größere Signalverstärkung in den Assays bereit, als die kleineren Multimere. Nucleinsäure-Multimere sind verzweigte Polynucleotide, die so konstruiert sind, dass sie einen Abschnitt, der spezifisch mit der Analyt-Nucleinsäure oder einer Nucleinsäure (verzweigt oder linear), die an den Analyten gebunden ist, hybridisiert und Iterationen eines zweiten Abschnitts besitzen, der spezifisch mit der markierten Sonde hybridisiert. In einem Assay, der das Multimer verwendet, werden die Anfangsstufen, gefolgt von der Hybridisierung des Analyten mit Markierungs- oder Vervielfältigersondensätzen, Fangen der Sondensätze in einem ersten Gefäß und Transferieren des Komplexes in ein anderes Gefäß, das immobilisierte Nucleinsäure enthält, die mit einem Abschnitt der Fangsonden hybridisieren wird. Das Multimer wird dann mit dem immobilisierten Komplex hybridisiert, und die markierten Sonden werden wiederum mit den Zweitsegmentiterationen auf dem Multimer hybridisiert. Da das Multimer eine große Anzahl an Stellen für die Anheftung markierter Sonden bereitstellt, wird das Signal verstärkt. Die erfindungsgemäßen Sonden können mit nicht amplifizierten Ziel-Nucleotidsequenzen verwendet werden, wenn die Empfindlichkeit der Detektion hinreichend hoch ist. Zum Beispiel kann durch Verwendung der obenstehend diskutierten Multimere zum Detektieren einer Sonde, die an eine Ziel-Nucleotidsequenz gebunden ist, wie es im US-Patent Nr. 5,624,802 beschrieben ist, die Empfindlichkeit hinreichend sein, um einige Kopien der Zielsequenz zu detektieren.
  • In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform wird die Detektion von hybridisierten allelspezifischen Hybridisierungssonden bewerkstelligt unter Verwendung detektierbarer Partikel, die kovalent gebunden sind an die allelspezifische Hybridisierungssonde, wobei die Partikel Mikropartikel, Mikrosphären, Nanopartikel, Partikel-funktionalisierte Kügelchen usw. sein können. Eine weitere Leichtigkeit der Verwendung wird durch Verwendung allelspezifischer Hybridisierungssonden erreicht, die eine eindeutige bzw. einzigartige Fangsequenz umfassen, die dann mit komplementären Sequenzen hybridisiert, die kovalent an Mikrosphären oder Mikropartikel gebunden sind.
  • Geeignete detektierbare Mikropartikel umfassen, ohne Beschränkung darauf, jene, die im US-Patent Nr. 6,268,222 beschrieben sind, das Partikel mit einem Durchmesser von weniger als 1 mm beschreibt, bevorzugt mit einer Größe im Bereich von näherungsweise 0,1 bis 1000 μm im Durchmesser, bevorzugt 1–100 μm, stärker bevorzugt 2–50 μm, noch stärker bevorzugt 3–25 μm und am stärksten bevorzugt näherungsweise 6–12 μm. Mikropartikel sind bevorzugt aus einem polymeren Material, wie z.B. Polystyrol, hergestellt. Jedoch umfassen verwendbare polymere Materialien, aber ohne darauf beschränkt zu sein, bromiertes Polystyrol, Polyacrylsäure, Polyacrylnitril, Polyamid, Polyacrylamid, Polyacrolein, Polybutadien, Polycaprolacton, Polycarbonat, Polyester, Polyethylen, Polyethylenterephthalat, Polydimethylsiloxan, Polyisopren, Polyurethan, Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polyvinylpyridin, Polyvinylbenzylchlorid, Polyvinyltoluol, Polyvinylidenchlorid, Polydivinylbenzol, Polymethylmethacrylat, Polylactid, Polyglycolid, Poly(lactid-co-glycolid), Polyanhydrid, Polyorthoester, Polyphosphazen, Polyphosophaze, Polysulfon oder Kombinationen davon. Andere Polymermaterialien (wie z.B. Kohlenhydrate, z.B. Carboxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Proteinpolymere, Polypeptide), sowie Agar, Gel, eukaryotische und prokaryotische Zellen, Viren, Lipid, Metall, Harz, Latex, Gummi, Silicon (z.B. Polydimethyldiphenylsiloxan), Glas, Keramik, Holzkohle, Kaolinit, Bentonit und dergleichen, können gleichermaßen verwendet werden. Diese Polymere können auch magnetisches oder magnetisch-reaktives Metalloxid enthalten, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus super-paramagnetischem, paramagnetischem, ferromagnetischem, antiferromagnetischem oder ferromagnetischem Metalloxid.
  • Die Mikropartikel umfassen weiterhin fluoreszierende oder gefärbte Farbstoffe, um die Detektion zu erleichtern. Bevorzugt sind solche Farbstoffe hydrophob und sind fähig, die Mikropartikel zu färben. Bevorzugte Farbstoffe sind Cyaninfarbstoffe. Die Farbstoffe können kovalent an die Mikropartikel gebunden sein oder absorbiert sein. Zusätzlich kann ein Farbstoffgemisch verwendet werden, um eine eindeutige bzw. einzigartige Markierung für eine bestimmte Anwendung oder für eine bestimmte Sondensequenz zu schaffen.
  • Wie es auch im US-Patent Nr. 6,268,222 beschrieben ist, kann ein Mikropartikel auf seiner Oberfläche eine oder mehrere Populationen fluoreszierend gefärbter Nanopartikel tragen, wobei alle Nanopartikel in einer gegebenen Population mit der gleichen Konzentration eines Farbstoffs gefärbt sind. Die Anheftung bzw. Bindung einer bekannten Menge dieser Nanopartikel der gleichen oder unterschiedlichen Farbe an die Mikropartikel resultiert in einer mehrfach gefärbten oder mehrfach fluoreszierenden Mikrosphäre. Durch Variieren der Menge und des Verhältnisses an unterschiedlichen Populationen von Nanopartikeln ist es möglich, eine große Anzahl diskreter Populationen von Trägerpartikeln mit eindeutigen Emissionsspektren zu etablieren und zu unterscheiden. Die Träger-Mikropartikel können gefärbt sein, um eine zusätzliche Farbe oder ein zusätzliches Signal bereitzustellen. Derartige eindeutig markierte Mikropartikel sind insbesondere nützlich für die Multiplexanalyse von Sequenzen und können unter Verwendung von Durchflusszytometrie auf zweckdienliche Weise detektiert und analysiert werden. Natürlich wird die Verwendung von Kombinationen von Farbstoffen, die an Nucleotidsequenzen oder andere feste Substrate als Mikropartikel oder Mikrosphären gebunden sind, auf eine gleiche Weise funktionieren und würde keine Verwendung von Mikropartikeln erfordern.
  • Die erfindungsgemäßen Primer und Sonden können auch unter Verwendung von Massenspektrometrie, zum Detektieren von mit Massemarkierungen markierten Sequenzen, detektiert werden. Zum Beispiel können eindeutige Fangsequenzen verwendet werden, die mit spezifischen Sequenzen hybridisieren, die kovalent an die Massemarkierungen gebunden sind.
  • Das Vorhandensein der Massemarkierungen würde dann das Vorhandensein der spezifischen Fangsequenz und folglich des Primers oder der allelspezifischen Hybridisierungssonde, der/die die jeweilige Fangsequenz enthält/enthalten, anzeigen. Massemarkierungen sind beschrieben in und werden als Überblick dargestellt von Mir und Southern (2000), "Sequence Variation in Genes and Genomic DNA: Methods for Large-Scale Analysis," Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 1:329–360.
  • Die Anwendung der vorliegenden Erfindung wird, sofern nicht anders angegeben, herkömmliche Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA und Immunologie anwenden, die innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns liegen. Derartige Techniken sind in der Literatur vollständig erklärt. Siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning; a Laboratory Manual, dritte Auflage (2001); DNA Cloning, Bände I und II (D. N. Glover, Hrsg., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Hrsg., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, Hrsg., 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins, Hrsg., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, Hrsg., 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press 1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller und M. P. Calos, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory, 1987); Methods in Enzymology, Bände 154 and 155 (Wu und Grossman, bzw. Wu, Hrsg., Academic Press); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes (Mayer und Walker, Hrsg. 1987), Protein Purification: Principles and Practice, 2. Auflage (Springer-Verlag, N.Y.); und Handbook of Experimental Immunology, Bände I–IV (D. M. Weir und C. C. Blackwell, Hrsg, 1986).
  • Es ist zu verstehen, dass, während die Erfindung in Zusammenhang mit den bevorzugten speziellen Ausführungsformen davon beschrieben worden ist, die obenstehende Beschreibung sowie die Beispiele, die folgen, erläutern sollen und den Umfang der Erfindung nicht beschränken. Andere Gesichtspunkte, Vorteile und Modifikation innerhalb des Umfangs der Erfindung werden Fachleuten auf dem Gebiet, das die Erfindung betrifft, offensichtlich sein.
  • Alle Patente, Patentanmeldungen und Veröffentlichungen, die hierin erwähnt sind, sowohl supra als auch infra, sind hierin durch Literaturverweis aufgenommen.
  • EXPERIMENTELLE VERFAHRENSWEISEN
  • Die folgenden experimentellen Verfahrensweisen sind angegeben, um Durchschnittsfachleuten eine vollständige Offenbarung und Beschreibung zu geben, wie die Hybridisie rungssonden und Primer, die hierin offenbart und beansprucht werden, herzustellen und zu verwenden sind, und wie die Verfahren, die diese verwenden, auszuführen sind; die Beispiele sollen den Umfang dessen nicht beschränken, den die Erfinder als ihre Erfindung betrachten. Anstrengungen sind unternommen worden, um Genauigkeit hinsichtlich der Zahlen (z.B. Mengen, Temperatur usw.) sicherzustellen, aber einige Fehler und Abweichungen sollten berücksichtigt werden. Sofern nicht anders angegeben, sind Teile Gewichtsteile, ist die Temperatur in Celsius Graden (°C), und der Druck ist bei oder nahe Atmosphärendruck auf Meereshöhe.
  • In den untenstehend angegebenen Verfahrensweisen und in dieser Beschreibung haben die verwendeten Abkürzungen ihre allgemein akzeptierten Bedeutungen, wie folgt:
    • C
    Celsius (oder Centigrad)
    mM
    millimolar
    μM
    mikromolar
    pmol
    Picomol (10–12 mol)
    mg
    Milligramm
    μg
    Mikrogramm
    ml
    Milliliter
    μl
    Mikroliter
    μm
    Mikrometer
    Tm
    Schmelztemperatur
    U
    Units
  • Um die untenstehend dargelegten Verfahrensweisen durchzuführen, ist eine Vielfalt an Software für Primerdesign und Tm-Vorhersage verwendet worden, einschließlich Primer3, GCG®, VNTI, Primer Express® und Hybsimulator. Es wurde festgestellt, dass Hybsimulator die bevorzugte Software für Tm-Vorhersage ist.
  • BEISPIEL 1
  • VERGLEICH DES MEHRZWECK-PRIMERSYSTEMS MIT EINER UND OHNE EINE UNABHÄNGIGE(N) BLOCKIERENDEN SONDE
  • Die nachstehenden Verfahrensweisen wurden ausgeführt, um das Mehrzweck-Primersystem mit einem und ohne einen unabhängigen "Blocker" zu vergleichen.
  • EXTRAKTION GENOMISCHER DNA:
  • Humane genomische DNA wurde aus 200 μl EDTA-behandeltem Vollblut unter Verwendung von QIAamp® DNA Blood Mini Kit, wie es vom Hersteller (Qiagen) beschrieben ist, extrahiert.
  • HERSTELLUNG KONVENTIONELLER PRIMERSEQUENZEN:
  • Primersequenzen wurden entworfen, um die speziellen DNA-Regionen zu amplifizieren, die dem Cytochrom P450 CYP2D6-Gen entsprechen, wobei die Exons 1, 2, 6 und 9 die vier interessierenden SNP-Stellen enthalten. Die biotinylierten Sequenzen wirken auch als die allelspezifischen Hybridisierungssonden für die vier SNP-Stellen.
  • Figure 00290001
  • HERSTELLUNG VON SINGLEPLEX- ODER MULTIPLEX-PCR-PRODUKTEN:
  • Singleplex- oder Multiplex-Reaktionen wurden durchgeführt unter Verwendung von 2 μl (5970 ng) isolierter genomischer DNA. Reaktionsvolumina von 25 μl enthielten 1 × Titanium-Taq-PCR-Puffer, 2,5 mM von jedem der dNTPs (dATP, dCTP, dGTP und dTTP); 0,2 μM von jedem der vorwärts-(biotinylierten) und rückwärts-Primer, und 2,5 U Titanium-Taq-DNA-Polymerase. Es wurde ein PE 9600-Thermocycler verwendet. Die thermischen Zyklusbedingungen waren 94°C für 2 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen von 95°C für 30 Sekunden, 68°C für 1 Minute, gefolgt von einer abschließenden Verlängerung von 5 Minuten bei 68°C.
  • HERSTELLUNG VON MULTIPLEX-ARBEITSREAGENS:
  • Das Multiplex-Arbeitsreagens ("multiplex working reagent") wurde hergestellt durch Mischen von 0,1 pmol von jeder der allelspezifischen Hybridisierungs-(ASH) Sonde für die vier SNP-Regionen und 2000 der jeweiligen individuellen LuminexTM-Mikrosphären pro 25 μl 50 mM Hepes (enthaltend 500 mM LiCl, 1 % LDS, 1 % Rinderserumalbumin, 10 mM MgCl2, 0,01 mM ZnCl2, 0,5 % Natriumazid und Proclin-300 als einen Konservierungsstoff (HIV 3.0 Label Diluent, Bayer Diagnostics), mit einem End-pH von 7,5).
  • DER MULTIPLEX-PCR-ASSAY:
  • Nach Abschluss der PCR-Reaktion, wie sie obenstehend dargelegt ist, wurden 25 μl Multiplex-Arbeitsreagens (mit den ASH-Sonden) zu den einzelnen Kavitäten bzw. Wells zugegeben, die die Multiplex-PCR-Produkte enthielten. Die Platte wurde mit Mylar verschlossen, und die Inkubation wurde in dem PE 9600-Thermocycler fortgesetzt. Die PCR-Platte mit dem Multiplex-Arbeitsreagens wurde 10 Minuten lang bei 95°C inkubiert, um doppelsträngige DNA zu dissoziieren, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei 50°C, um allelspezifische Hybridisierung zu erreichen. Die Platte wurde entfernt und 100 μl Waschpuffer wurden zu jeder Kavität zugegeben (HIV 3.0 Wash A, Bayer Diagnostics). Die Inhalte der Kavitäten wurden in eine vorbefeuchtete 96 Kavitäten-Filterplatte (Multiscreen®-BV 1,2 μm, Millipore, Bedford MA) transferiert. Der Waschpuffer wurde unter sanftem Vakuum hindurchgezogen und ein 200 μl-Waschschritt wurde wiederholt. Die Mikrosphären wurden in 50 μl eines Gemischs aus Streptavidin-Phycoerythrin (0,05 μg/50 μl) und TTL-Puffer (50 mM Tris, 400 mM LiCl, 0,1 % Tween20, pH 8,0) resuspendiert. Die Platte wurde dann in Aluminiumfolie eingepackt und unter sanftem Schütteln (Titer Plate-Schüttler, Labline Instruments) 15 Minuten bei 25°C inkubiert. Der vorherige Waschschritt wurde wiederholt und die Mikrosphären wurden in 80 μl TTL-Puffer resuspendiert und auf dem LuminexTM 100 ausgelesen, indem das Vorliegen von Phycoerythrin (und folglich der ursprüngliche Vorwärtsprimer) und die für jede spezielle ASH spezifische Mikrosphäre detektiert wurden.
  • BESTIMMUNG DER WIRKSAMKEIT EINES UNABHÄNGIGEN "BLOCKER"-MOLEKÜLS
  • Um die Wirksamkeit des unabhängigen "Blocker"-Moleküls auf die oben dargelegten herkömmlichen PCR-Produkte zu bestimmen, wurde 1 pmol/25 μl Blocker im Multiplex-Arbeitsreagens zu dem herkömmlichen Cytochrom P450 CYP2D6 Exon 1-PCR-Produkt zugegeben. Wie in 4 gezeigt, erhöhte die Zugabe des Blockermoleküls zum Multiplex-Arbeitsreagens das Signal 30-fach gegenüber dem Signal, das erzeugt wurde, wenn kein Blocker zu dem Multiplex-Arbeitsreagens zugesetzt wurde.
  • HERSTELLUNG VON MEHRZWECK-PRIMERSEQUENZEN
  • Wie in 1 ersichtlich ist, weist das Exon 1 des Cytochrom P450 CYP2D6-Gens die größte Menge an Sekundärstruktur an SNP auf. Das Gel in 6 zeigt, dass Exon 1 keine detektierbare SNP-Produktbande erzeugt. Um das Signal von Exon 1 zu erhöhen, wurden blockierende Sequenzen von 8, 10 und 12 Nucleotiden in die biotinylierten Vorwärtsprimer von Exon 1 des Cytochrom P450 CYP2D6-Gens eingefügt, wie es untenstehend dargelegt ist; der vierte Exon 1-Primer stellt den Rückwärtsprimer dar.
    Figure 00310001
  • AUFBRECHEN DER SEKUNDÄRSTRUKTUR:
  • Um die Wirksamkeit der Mehrzweck-Primermoleküle beim Aufbrechen der innerhalb des PCR-Amplikons von Cytochrom P450 CPY2D2-Exon 1 gebildeten Sekundärstruktur zu bestimmen, wurden 1 pmol/25 μl individuelle Mehrzweck-Primermoleküle mit blockierenden Sequenzen von 8, 10 und 12 Nucleotiden, wie obenstehend dargelegt, zu dem Multiplex-Arbeitsreagens zugesetzt. Kontroll-Blocker-Moleküle wurden in der gleichen Konzentration zugesetzt. Der Cytochrom P450-SNP-Assay, wie er obenstehend dargelegt ist, wurde dann unter Verwendung der Mehrzweck-Primer durchgeführt. 7 ist eine schematische Wiedergabe dieses Protokolls. Wie in 8 gezeigt, erhöhte sich das im SNP-Assay detektierte Nettosignal mit der steigenden Länge der blockierenden Sequenzen. Wenn keine Blocker-Sequenz verwendet wurde, wurde im Gegensatz dazu nur ein geringes Signal erzeugt (siehe die mit "herkömmlich" in 8 markierte Säule). Wenn eine externe Blocker-Sequenz mit 25 Nucleotiden zusammen mit dem herkömmlichen Primer verwendet wurde, wurde eine 15- bis 20-fache Erhöhung des Signals gegenüber dem Primer festgestellt, der keinen Blocker aufweist (siehe die Säule in 8, die mit "herkömmlich + Blocker" markiert ist); jedoch war die Wirksamkeit des externen Blockers mit 25 Nucleotiden signifikant geringer als die Wirk samkeit des Mehrzweck-Primers mit dem Blockerinsert von 12 Nucleotiden; der letztere zeigt eine 2-fache Nettoerhöhung des Signals gegenüber dem externen Blocker mit 25 Nucleotiden.
  • BEISPIEL 2
  • DETEKTION VON WILDTYP- ODER MUTIERTEN ALLELEN BEI DEN EXONS 1, 2, 6 und 9 von CYTOCHROM P450 CPY2D6
  • Um Wildtyp- oder mutierte Allele bei den Exons 1, 2, 6 und 9 des Cytochroms P450 CPY2D6-Gens zu detektieren, wurde der oben dargelegte Multiplex-PCR-Assay verwendet, um SNPs in jedem der vier Exons zu detektieren. Um diese Verfahrensweise durchzuführen, wurden Primersätze zum Amplifizieren der speziellen Regionen, die den Exons 1, 2, 6 und 9 des Cytochrom P450 CYP2D6-Gens entsprechen, entworfen. Die resultierenden Amplikons wurden über einen direkten Fangvorgang ("direct capture") mit ASH-Sonden hybridisiert, die für die Wildtyp- und mutierten Allele spezifisch sind. Wo es angebracht war, wurden Mehrzweck-Primer verwendet, um Sekundärstrukturen aufzubrechen. Jede der ASH-Sonden enthielt eindeutige Sequenzdomänen, die zu einer Zielsequenz auf einer spezifischen farbcodierten LuminexTM-Mikrosphäre komplementär waren. Um die mögliche Kreuzreaktivität zwischen Fangsequenzen auf den ASH-Sonden und den LuminexTM-Mikrosphären zu verringern, wurden nicht-natürliche Isocytosin- und Isoguaninbasen in die Fangsequenzen auf den ASH-Sonden und den LuminexTM-Mikrosphären eingebaut. Unter Verwendung dieses Multiplex-Assays waren die mutierten und Wildtyp-Allele leicht entsprechend der Farbe der LuminexTM-Mikrosphären identifizierbar.
  • Die ASH-Sonden und die Tm für die Wildtyp-(oben) und mutierten (unten) Allele der Exons 1, 2, 6 und 9 des Cytochrom P450 CPY2D6-Gens sind untenstehend angegeben. Die Tm für die ASH-Sonden, die entworfen wurden, um mit den Wildtyp-Amplikon-Sequenzen zu hybridisieren, sind wenigstens 10°C stabiler (d.h. schmelzen um wenigstens 10°C höher) als die ASH-Sonden, die entworfen wurden, um mit mutierten Amplikonsequenzen zu hybridisieren. Diese Schmelztemperaturen sind konsistent mit der vorhergesagten Differenz von 10°C bei den Schmelztemperaturen für Sequenzen, die eine Fehlpaarung von einem Basenpaar aufweisen. Unter dieser Anweisung bzw. unter dieser Rubrik wird die allelspezifische Hybridisierungssonde für mutierte Amplikon-Sequenzen wenigstens um 10°C stabiler sein, wenn die mutierten Amplikonsequenzen vorhanden sind.
    Figure 00330001
    wobei gilt J = Isoguanin und F = Isocytosin.
  • 2 zeigt eine schematische Darstellung des Multiplex-PCR-Assays und des Fangens der Wildtyp- und mutierten Allele durch ihre jeweiligen LuminexTM-Mikrosphären; 7 zeigt schematisch das Wechselspiel der Mehrzweck-Primer im SNP-Assay; und 9 zeigt die Ergebnisse des Multiplex-PCR-Assays zum Detektieren des Genotyps der Exons 1, 2, 6 und 9 des Cytochrom P450 CYP2D2-Gens bei vier einzelnen Patienten.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00340001
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  • Figure 00400001

Claims (27)

  1. Verwendung eines Mehrzweck-Primers ("dual-purpose primer") beim Amplifizieren einer Ziel-Nucleotidsequenz in einem Zielmolekül, wobei die Ziel-Nucleotidsequenz einen interessierenden Ort, proximal zu oder enthalten in einer Sekundärstruktur-bildenden Region, die, in der Abwesenheit des Primers, eine unerwünschte Sekundärstruktur in einem unter Amplifikationsbedingungen gebildeten Amplikon bewirkt, um Detektion des interessierenden Ortes zu verhindern, enthält, wobei der Primer umfasst: (a) eine Primersequenz, komplementär zu einem anderen Abschnitt der Ziel-Nucleotidsequenz, als der Sekundärstruktur-bildenden Region und (b) eine blockierende Sequenz ("blocking sequence"), im Wesentlichen komplementär zu einem Abschnitt der Sekundärstruktur bildenden Region, um Bildung der unerwünschten Sekundärstruktur zu verhindern.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der interessierende Ort eine Nukleinsäuresequenz ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei der interessierende Ort ein EinzelNucleotid-Polymorphismus ist.
  4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Primersequenz komplementär ist zu einem Terminus des Zielmoleküls, enthaltend die Ziel-Nucleotidsequenz.
  5. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, die weiterhin einen nicht-hybridisierenden Spacer zwischen der Primersequenz und der blockierenden Sequenz einschließt.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Spacer nicht-nucleotidisch ist.
  7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei der Spacer aus einem synthetischen hydrophilen Oligomer besteht.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei der Spacer aus 3 bis 50 Alkylenoxideinheiten, ausgewählt aus Ethylenoxid und Kombinationen von Ethylenoxid und Propylenoxid, besteht.
  9. Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Spacer nucleotidisch ist.
  10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Spacer aus einer Sequenz nicht-natürlicher Nucleotide besteht.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die nicht-natürlichen Nucleotide Isoguanin oder Isocytosin sind.
  12. Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Spacer ein oligomerer Abschnitt, bestehend aus einem wiederkehrenden einzelnen Nucleotid, ist.
  13. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Sondensequenz und der Spacer voneinander durch ein Mittel zum Anhalten der Transkription dazwischen getrennt sind.
  14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Mittel zum Anhalten der Transkription ein arretierender Linker ("arresting linker") ist.
  15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei der arretierende Linker mindestens ein modifiziertes Nucleosid umfasst.
  16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei das modifizierte Nucleosid ein N4-modifiziertes Pyrimidin ist.
  17. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, weiterhin eine detektierbare Markierung umfassend.
  18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei die detektierbare Markierung ein fluoreszierender Stoff ("fluorescer"), chemilumineszierender Stoff ("chemiluminescer"), Farbstoff, Biotin, Hapten, Enzym, Enzymsubstrat, Enzym-Cofaktor, Enzyminhibitor, Enzymuntereinheit, Metallion, Elektronen-dichtes Reagens oder radioaktives Isotop ist.
  19. Verfahren zum Amplifizieren einer Ziel-Nucleotidsequenz in einem Zielmolekül, wobei die Ziel-Nucleotidsequenz einen interessierenden Ort, proximal zu oder enthalten in einer Sekundärstruktur-bildenden Region, die fähig ist, eine unerwünschte Sekundärstruktur in einem unter Amplifikationsbedingungen gebildeten Amplikon zu bilden, um Detektion des interessierenden Ortes zu verhindern, enthält, wobei das Verfahren umfasst: In-Kontakt-Bringen der Ziel-Nucleotidsequenz unter Hybridisierungsbedingungen, zusammen oder sequenziell, mit einem zu einem Terminus eines ersten Stranges des Zielmoleküls komplementären Mehrzweck-Primer, einem zum gegenüberliegenden Terminus des Zweitstrangs des Zielmoleküls komplementären zweiten Primer, zur Amplifikation geeigneten Nucleotiden und einem Agens zur Polymerisation der Nucleotide, wobei der Mehrzweck-Primer umfasst (a) eine Primersequenz, komplementär zu einem anderen Abschnitt der Ziel-Nucleotidsequenz als der Sekundärstruktur bildenden Region; und (b) eine blockierende Sequenz, im Wesentlichen komplementär zu einem Abschnitt der Sekundärstruktur- bildenden Region, um Bildung der unerwünschten Sekundärstruktur zu verhindern und wobei während des Verfahrens gebildete Amplikons die unerwünschte Sekundärstruktur nicht enthalten, so dass der interessierende Ort einem hybridisierenden Oligonucleotid zugänglich ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Agens zur Polymerisation eine DNA-Polymerase, DNA-Ligase, RNA-Polymerase oder eine RNA-Umkehrtranskriptase ist.
  21. Verwendung einer Hybridisierungssonde in einem Hybridisierungsassay zum Detektieren des Vorhandenseins einer Ziel-Nucleotidsequenz in einem Zielmolekül, wobei die Hybridisierungssonde umfasst: (a) eine zu einer ersten Nucleotidsequenz im Zielmolekül komplementäre Sonden-Nucleotidsequenz; und (b) eine blockierende Sequenz, im Wesentlichen komplementär zu einer zweiten Nucleotidsequenz im Zielmolekül, wobei Hybridisierung der blockierenden Sequenz mit der zweiten Nucleotidsequenz Sekundärstrukturbildung in der zweiten Nucleotidsequenz verhindert, die sonst Hybridisierung der Sondensequenz mit der ersten Nucleotidsequenz stören würde.
  22. Verwendung nach Anspruch 21, wobei die Hybridisierungssonde weiterhin eine detektierbare Markierung umfasst.
  23. Verwendung nach Anspruch 22, wobei die detektierbare Markierung eine chemilumineszente Markierung, fluoreszierende Markierung, radioaktive Markierung, multimere DNA-Markierung, ein Farbstoff, Enzym, Enzymmodulator, detektierbares festes Substrat oder Metallion ist.
  24. Verfahren zum Durchführen eines Hybridisierungsassays zum Detektieren des Vorhandenseins einer Ziel-Nucleotidsequenz in einem Zielmolekül, wobei die Ziel-Nucleotidsequenz proximal zu oder enthalten in einer Sekundärstruktur bildenden Region ist, die zum Bilden einer unerwünschten Sekundärstruktur, die Detektion der Ziel-Nucleotidsequenz verhindern würde, fähig ist, wobei das Verfahren umfasst: In-Kontakt-Bringen des Zielmoleküls unter Hybridisierungsbedingungen mit einer Hybridisierungssonde, umfassend: (a) eine zu einer ersten Nucleotidsequenz im Zielmolekül komplementäre Sonden-Nucleotidsequenz; und (b) eine blockierende Sequenz, im Wesentlichen komplementär zu einer zweiten Nucleotidsequenz im Zielmolekül, so dass Hybridisierung der Sonde mit dem Zielmolekül Bildung der unerwünschten Sekundärstruktur verhindert und Detektion der Ziel-Nucleotidsequenz erlaubt.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Zielmolekül von einem menschlichen Individuum erhalten wird.
  26. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Zielmolekül bakteriellen oder viralen Ursprungs ist.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei Hybridisierung der ersten Hybridisierungs-Sondensequenz mit der Ziel-Nucleotidsequenz diagnostisch für eine durch das Virus verursachte Krankheit ist.
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