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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft menschliche Papillomaviren und insbesondere
betrifft sie Oligonukleotide zur Detektion von menschlichen Papillomaviren
in einer Testprobe.
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Hintergrund der Erfindung
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Bis
jetzt wurden ungefähr
70 verschiedene menschliche Papillomavirus-(HPV)-Typen entdeckt.
HPV ist vom diagnostischen Standpunkt her betrachtet interessant,
weil verschiedene der derzeit bekannten HPV-Typen mit der Entwicklung
von Gebärmutterhalskrebs
verknüpft
sind. Wie bei jeder Form von Krebs, ist eine frühe Entdeckung entscheidend,
um die Krankheit erfolgreich zu behandeln. Weil bestimmte HPV-Stämme mit
der Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs
assoziiert sind, kann die Detektion von HPV in einer geeigneten
Probe das beste Mittel für
die frühe
Detektion von Gebärmutterhalskrebs
bereitstellen.
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Die
Polymerase-Kettenreaktion in Kombination mit Southern Blot Analyse
war das vorherrschende Verfahren zur Detektion bestimmter Typen
von HPV in einer Testprobe. Insbesondere veranschaulicht Snijders,
P. J. F. et al., J. of Gen. Virol., Band 71, Seiten 173–181 (1990)
eine solche Technologie, wo Amplifikations-Primer verwendet werden,
um vielfache Kopien einer Sequenz innerhalb des HPV-Genoms zu erzeugen und
radiomarkierte DNA-Sonden, die spezifisch sind für einen speziellen HPV-Typ,
werden verwendet, um den speziellen HPV-Typ, der in der Testprobe
vorhanden ist, zu detektieren und dabei zu bestimmen. Leider ist Southern
Blotting ein relativ arbeitsintensives und zeitraubendes Verfahren,
insbesondere wenn mehrfache verschiedene HPV-Typen zu detektieren
versucht werden. Dementsprechend besteht ein Bedürfnis nach Verfahren und Reagenzien,
die geeignet sind, schnell und genau zu bestimmen, ob verschiedene
der HPV-Typen, die mit Gebärmutterhalskrebs
assoziiert sind, in einer Testprobe vorhanden sind oder nicht.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt Oligonukleotid-Cocktails bereit, die
verwendet werden können,
um onkogene HPV-Typen 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58,
59 und 68 (hiernach "onkogene
HPV-Typen") spezifisch
zu detektieren. Diese Oligonukleotid-Cocktails schließen mindestens
ein Oligonukleotid von jedem der folgenden Sets ein: Sequenzidentifikationsnummer
4 und ihr Komplement Sequenzidentifikationsnummer 5; Sequenzidentifikationsnummer
7 und ihr Komplement Sequenzidentifikationsnummer 8; Sequenzidentifikationsnummer
10 und ihr Komplement Sequenzidentifikationsnummer 11; Sequenzidentifikationsnummer
13 und ihr Komplement Sequenzidentifikationsnummer 14; Sequenzidentifikationsnummer
16 und ihr Komplement Sequenzidentifikationsnummer 17; Sequenzidentifikationsnummer
19 und ihr Komplement Sequenzidentifikationsnummer 20; Sequenzidentifikationsnummer
22 und ihr Komplement Sequenzidentifikationsnummer 23; Sequenzidentifikationsnummer
25 und ihr Komplement Sequenzidentifikationsnummer 26; Sequenzidentifikationsnummer
28 und ihr Komplement Sequenzidentifikationsnummer 29; Sequenzidentifikationsnummer
31 und ihr Komplement Sequenzidentifikationsnummer 32; Sequenzidentifikationsnummer
34 und ihr Komplement Sequenzidentifikationsnummer 35; Sequenzidentifikationsnummer
37 und ihr Komplement Sequenzidentifikationsnummer 38; ebenso wie Sequenzidentifikationsnummer
40 und ihr Komplement Sequenzidentifikationsnummer 41.
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Vorzugsweise
werden die Oligonukleotide als Hypridisierungs-Sonden verwendet,
um mit Zielsequenzen, für
welche sie spezifisch sind, zu hybridisieren und sie zu detektieren.
Somit schließen
die Verfahren, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt
werden, Hybridisierungs-Assays,
ebenso wie Amplifikations-basierte Assays, ein. Gemäß einem
Verfahren umfasst ein Verfahren zur Detektion des Vorhandenseins
von mindestens einem onkogenen HPV-Typ in einer Testprobe die folgenden
Schritte: (a) in Kontakt bringen der Testprobe mit einem Oligonukleotid-Cocktail,
wie oben definiert; und (b) Detektieren der Hybridisierung zwischen mindestens
einer der obigen Sequenzen und einer onkogenen HPV-Zielsequenz als
ein Hinweis auf das Vorhandensein von mindestens einem onkogenen
HPV-Typ in der Testprobe.
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Gemäß einer
anderen Ausführungsform
umfasst ein Verfahren zur Detektion des Vorhandenseins von mindestens
einem onkogenen HPV-Typ in einer Testprobe die folgenden Schritte:
(a) Bilden einer Reaktionsmischung, die Nukleinsäure-Amplifikations-Reagenzien, eine
Testprobe, von der vermutet wird, dass sie eine onkogene HPV-Zielsequenz
enthält,
mindestens einen (und vorzugsweise zwei) Primer, die in der Lage
sind, eine HPV-Zielsequenz
zu amplifizieren, zum Beispiel diejenige, die hierin als Sequenzidentifikationsnummer 3,
Sequenzidentifikationsnummer 6, Sequenzidentifikationsnummer 9,
Sequenzidentifikationsnummer 12, Sequenzidentifikationsnummer 15,
Sequenzidentifikationsnummer 18, Sequenzidentifikationsnummer 21,
Sequenzidentifikationsnummer 24, Sequenzidentifikationsnummer 27,
Sequenzidentifikationsnummer 30, Sequenzidentifikationsnummer 33,
Sequenzidentifikationsnummer 36, und Sequenzidentifikationsnummer
39 bezeichnet sind, und einen Oligonukleotid-Cocktail, wie oben
definiert, umfasst; (b) Unterwerfen der Mischung Hybridisations-Bedingungen,
um mindestens eine Nukleinsäure-Sequenz
zu erzeugen, die komplementär
ist zu der Zielsequenz; (c) Hybridisieren des Cocktails an die Nukleinsäure-Sequenz,
die komplementär
ist zu der Zielsequenz, um mindestens einen Komplex zu bilden, der
das Oligonukleotid und die komplementäre Nukleinsäure-Sequenz umfasst; und (d)
Detektieren des so gebildeten Komplexes als ein Hinweis auf das
Vorhandensein von mindestens einem onkogenen HPV-Typ in der Probe.
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Gemäß einer
anderen Ausführungsform
stellt die Erfindung Kits bereit, welche ein Set von Oligonukleotid-Primern,
Amplifikations-Reagenzien und Sonden, einschließlich mindestens einem Oligonukleotid
aus jedem der oben definierten Sets, umfassen.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Wie
zuvor erwähnt,
stellt die vorliegende Erfindung Oligonukleotide bereit (hiernach "Oligos" oder "Sonden"), Verfahren zur
Verwendung der Sonden und Kits, welche die Sonden enthalten, wobei
alle davon verwendet werden können,
um onkogene HPV-Typen spezifisch zu detektieren (d.h. HPV-Typen
16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und 68). Die Sonden,
die hierin bereitgestellt werden, können als Primer in einer Amplifikations-Reaktion
verwendet werden, werden aber vorzugsweise verwendet als Hybridisations-Sonden,
weil jede der Sonden für
mindestens einen HPV-Typ spezifisch ist, und in einem Fall (Sequenzidentifikationsnummer
34) für
zwei HPV-Typen. Vorteilhafterweise hybridisieren alle der Sonden
innerhalb einer ungefähr
140 bp Region des L1-Gens, die in dem HPV-Genom gefunden wird. Somit
kann, während
die Sonden individuell verwendet werden können, um den/die onkogenen
HPV-Typ(en), für
welche sie spezifisch sind, zu detektieren, ein Cocktail wie oben
definiert verwendet werden, um verschiedene HPV-Typen auf einmal
zu detektieren. Dies ist besonders vorteilhaft in einer Amplifikations-Reaktions-Einstellung,
wo alle, ganz oder teilweise, der ungefähr 140 bp Region amplifiziert
werden können,
und das amplifizierte Produkt mit einem Cocktail von Sonden in Kontakt
gebracht werden kann, um das Vorhandensein von mindestens einem
der onkogenen HPV-Typen in der Testprobe zu bestimmen. Dementsprechend
kann eine einzelne Amplifikations-Reaktion die Basis sein zur Detektion
von mehreren HPV-Typen. Tabelle 1 unten stellt die Sequenzidentifikationsnummern
der hierin bereitgestellten Oligos, die Sequenzen und den/die HPV-Typ(en), die sie
spezifisch detektieren, bereit.
| SequenzidentifikationsNummer | Sequenz
5' → 3' | HPV
Typ Spezifität |
| 4 | GCTGCCATAT
CTACTTCA | 16 |
| 5 | TGAAGTAGAT
ATGGCAGC | 16 |
| 7 | GTAGCATCAT
ATTGCC | 18 |
| 8 | GGCAATATGA
TGCTAC | 18 |
| 10 | GCAATTGCAA
ACAGTGAT | 31 |
| 11 | ATCACTGTTT
GCAATTGC | 31 |
| 13 | ATGCACACAA
GTAACTAGT | 33 |
| 14 | ACTAGTTACT
TGTGTGCAT | 33 |
| 16 | CTGCTGTGTC
TTCTAGTG | 35 |
| 17 | CACTAGAAGA
CACAGCAG | 35 |
| 19 | CTCTATAGAG
TCTTCCATAC C | 39 |
| 20 | GGTATGGAAG
ACTCTATAGA G | 39 |
| 22 | CTACACAAAA
TCCTGTG | 45 |
| 23 | CACAGGATTT
TGTGTAG | 45 |
| 25 | CGGTTTCCCC
AACAT | 51 |
| 26 | ATGTTGGGGA
AACCG | 51 |
| 28 | GTGCTGAGGT
TAAAAAG | 52 |
| 29 | CTTTTTAACC
TCAGCAC | 52 |
| 31 | CTACAGAACA
GTTAAGTAA | 56 |
| 32 | TTACTTAACT
GTTCTGTAG | 56 |
| 34 | AACTAAGGAA
GGTACAT | 58/33 |
| 35 | ATGTACCTTC
CTTAGTT | 58/33 |
| 37 | CTACTACTCT
CTATTCCTAA TG | 59 |
| 38 | CATTAGGAAT
AGAGAGTAGT AG | 59 |
| 40 | CTTTGTCTAC
TACTACTGA | 68 |
| 41 | TCAGTAGTAG
TAGACAAAG | 68 |
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Die
hierin offenbarten Sonden können
Desoxyribonukleinsäure
(DNA), Ribonukleinsäure
(RNA) oder Nukleinsäure-Analoge,
wie zum Beispiel ungeladene Nukleinsäure-Analoge umfassen, einschließlich, aber nicht
beschränkt
auf Peptidnukleinsäuren
(PNAs), welche in der internationalen Patentanmeldung
WO92/20702 offenbart sind, oder Morpholino-Analoge,
welche in
US-Patenten mit den
Nummern 5,185,444 ,
5,034,506 und
5,142,047 beschrieben sind.
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Solche
Sequenzen können
routinemäßig unter
Verwendung einer Vielzahl von Techniken, die derzeit erhältlich sind,
synthetisiert werden. Zum Beispiel kann eine DNA-Sequenz unter Verwendung
von konventioneller Nukleotid-Phosphoramidit-Chemie und den Instrumenten,
die von Applied Biosystems, Inc., (Foster Citym CA); DuPont, (Wilmington,
DE); oder Milligen, (Redford, MA) erhältlich sind, synthetisiert
werden. In ähnlicher
Weise, und wenn wünschenswert,
können
die Sequenzen unter Verwendung von Methodiken markiert werden, die
im Fachgebiet wohl bekannt sind, wie zum Beispiel beschrieben in
den
US-Patent-Anmeldungen mit
den Nummern 5,464,746 ;
5,424,414 ;
und
4,948,882 .
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Der
Ausdruck "Marker", wie hierin verwendet,
bedeutet ein Molekül
oder eine Einheit mit einer Eigenschaft oder einer Charakteristik,
die zur Detektion in der Lage ist. Ein Marker kann direkt detektierbar
sein, wie zum Beispiel mit Radio-Isotopen,
Fluorophoren, Chemiluminophoren, Enzymen, kolloidalen Partikeln,
fluoreszierenden Mikropartikeln und dergleichen; oder ein Marker
kann indirekt detektierbar sein, wie zum Beispiel mit spezifischen
Bindegliedern. Es wird verstanden werden, dass direkt detektierbare
Marker zusätzliche
Komponenten erfordern können,
wie zum Beispiel Substrate, Trigger-Reagenzien, Licht und dergleichen,
um die Detektion des Markers zu ermöglichen. Wenn indirekt detektierbare
Marker verwendet werden, werden sie typischerweise in Kombination
mit einem "Konjugat" verwendet. Ein Konjugat
ist typischerweise ein spezifisches Bindeglied, welches an einen
direkt detektierbaren Marker angeheftet oder gekoppelt wurde. Kopplungs-Chemien
zur Synthetisierung eines Konjugats sind im Fachgebiet wohl bekannt
und können
zum Beispiel jedes chemische Mittel und/oder physikalische Mittel
einschließen,
das die spezifische Bindungs-Eigenschaft des spezifischen Bindungsglieds
oder die detektierbare Eigenschaft des Markers nicht zerstört. Wie
hierin verwendet, bedeutet "spezifisches
Bindungsglied" ein
Glied eines Bindungspaares, d.h. zwei unterschiedliche Moleküle, wo eines
der Moleküle
durch beispielsweise chemische oder physikalische Mittel spezifisch
an das andere Molekül
bindet. Zusätzlich
zu Antigen- und Antikörper-spezifischen
Bindungspaaren schließen
andere spezifische Bindungspaare folgende ein, sollen aber nicht
darauf beschränkt
sein: Avidin und Biotin; Haptene und Antikörper spezifisch für Haptene;
komplementäre
Nukleotidsequenzen; Enzymkofaktoren oder Substrate und Enzyme; und
dergleichen.
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Im
Allgemeinen können
die hierin bereitgestellten Sonden verwendet werden, um das Vorhandensein eines
onkogenen HPV-Typs in einer Testprobe zu detektieren, durch in Kontakt
bringen einer Testprobe mit einem Cocktail, der hierin bereitgestellt
ist, unter Hybridisierungs-Bedingungen, und Detektieren der Hybridisierung
zwischen einer HPV-Zielsequenz und mindestens einer der Sequenzen,
die hierin als Sequenzidentifikationsnummer 4, Sequenzidentifikationsnummer
5, Sequenzidentifikationsnummer 7, Sequenzidentifikationsnummer
8, Sequenzidentifikationsnummer 10, Sequenzidentifikationsnummer
11, Sequenzidentifikationsnummer 13, Sequenzidentifikationsnummer
14, Sequenzidentifikationsnummer 16, Sequenzidentifikationsnummer
17, Sequenzidentifikationsnummer 19, Sequenzidentifikationsnummer
20, Sequenzidentifikationsnummer 22, Sequenzidentifikationsnummer
23, Sequenzidentifikationsnummer 25, Sequenzidentifikationsnummer
26, Sequenzidentifikationsnummer 28, Sequenzidentifikationsnummer
29, Sequenzidentifikationsnummer 31, Sequenzidentifikationsnummer
32, Sequenzidentifikationsnummer 34, Sequenzidentifikationsnummer
35, Sequenzidentifikationsnummer 37, Sequenzidentifikationsnummer
38, Sequenzidentifikationsnummer 40 und Sequenzidentifikationsnummer 41
bezeichnet sind. Verschiedene wohlbekannte Verfahren zur Detektion
der Hybridisierung können
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, und sie können zum Beispiel die Verwendung
von Gelen und Farbstoffen einschließen, oder die Detektion eines
Markers, assoziiert mit einer oder mehreren der hierin bereitgestellten
Sequenzen nach der Durchführung
von zum Beispiel einer Dot-Blot oder Amplifikations-Reaktion.
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Der
Ausdruck "Testprobe", wie hierin verwendet,
bedeutet irgendetwas, von dem vermutet wird, dass es eine Zielsequenz
enthält.
Die Testprobe kann von jeder biologischen Quelle abgeleitet sein,
und kann (i) direkt verwendet werden, wie erhalten von der Quelle,
oder (ii) nach einer Vorbehandlung, um den Charakter der Probe zu
modifizieren. Somit kann die Testprobe vor der Verwendung vorbehandelt
werden, durch beispielsweise das Zerstören von Zellen, die Herstellung
von Flüssigkeiten
aus festen Materialien, das Verdünnen von
viskosen Flüssigkeiten,
das Filtern von Flüssigkeiten,
das Destillieren von Flüssigkeiten,
das Konzentrieren von Flüssigkeiten,
das Inaktivieren von störenden
Komponenten, das Hinzufügen
von Reagenzien, die Reinigung von Nukleinsäuren und dergleichen. Typischerweise
wird die Testprobe aus Gebärmutterhals-Ausschabungen bestehen
oder davon abgeleitet sein, oder aus ähnlichen Proben.
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Eine "Zielsequenz", wie hierin verwendet,
bedeutet eine Nukleinsäure-Sequenz,
die detektiert, amplifiziert, sowohl amplifiziert als auch detektiert
wird, oder anderweitig komplementär ist zu einer der hierin bereitgestellten
Sonden. Zusätzlich
werden, während
auf den Ausdruck Zielsequenz manchmal als einzelsträngig Bezug
genommen wird, diejenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, erkennen,
dass die Zielsequenz tatsächlich
doppelsträngig
sein kann.
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"Hybridisierung" oder "Hybridisierungs-" Bedingungen werden
im Allgemeinen definiert als Bedingungen, welche das Annealing zwischen
komplementären
Nukleinsäure-Sequenzen,
oder das Annealing und die Verlängerung
von einer oder mehreren Nukleinsäure-Sequenzen
fördert.
Es ist im Fachgebiet wohl bekannt, dass ein solches Annealing in
einer eher voraussehbaren Art und Weise abhängig ist von verschiedenen
Parametern, einschließlich
der Temperatur, der Innenstärke,
der Sequenzlänge,
der Komplementarität
und dem G:C-Gehalt der Sequenzen. Zum Beispiel fördert das Erniedrigen der Temperatur
in der Umgebung von komplementären
Nukleinsäure-Sequenzen
das Annealing. Für
jedes gegebene Set von Sequenzen kann die Schmelz-Temperatur, oder
Tm, durch irgendeines von verschiedenen bekannten Verfahren geschätzt werden. Typischerweise
verwenden diagnostische Anwendungen Hybridisierungs-Temperaturen,
welche nahe zu (d.h. innerhalb 10°C)
der Schmelz-Temperatur sind. Die Innenstärke oder "Salz"-Konzentration
beeinflusst auch die Schmelz-Temperatur, da kleine Kationen dazu
tendieren, die Bildung von Doppelsträngen zu stabilisieren, indem
die negative Ladung auf dem Phosphodiester-Gerüst aufgehoben wird. Typische
Salz-Konzentrationen hängen
ab von der Natur und der Valenz des Kations, werden aber leicht
von denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, verstanden. In ähnlicher
Weise sind ein hoher G:C-Gehalt und eine erhöhte Sequenzlänge auch
dafür bekannt,
dass sie die Bildung von Doppelsträngen stabilisieren, weil G:C-Paarungen drei Wasserstoff-Brücken einschließen, während A:T-Paare nur zwei haben,
und weil längere
Sequenzen mehr Wasserstoff-Bindungen haben, die die Sequenzen zusammenhalten.
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Somit
beeinflussen ein hoher G:C-Gehalt und niedrigere Sequenzlängen die
Hybridisierungs-Bedingungen durch Erhöhen der Schmelz-Temperatur.
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Wenn
die Sequenzen einmal für
eine diagnostische Anwendung gewählt
sind, wird der G:C-Gehalt und die Länge bekannt sein und kann bei
der genauen Bestimmung, welche Hybridisierungs-Bedingungen umfasst werden, in Erwägung gezogen
werden. Da die Innenstärke
typischerweise für
die enzymatische Wirksamkeit optimiert wird, ist der einzige Parameter,
der übrig
bleibt zu variieren, die Temperatur. Im Allgemeinen wird die Hybridisierungs-Temperatur
nahe oder bei der Tm der Primer oder der Sonde gewählt. Somit
ist die Erhaltung von geeigneten Hybridisierungs-Bedingungen für einen
speziellen Primer, eine Sonde, oder ein Primer- und Sonden-Set wohl
innerhalb des üblichen
Könnens
eines Fachmanns, der in diesem Gebiet tätig ist.
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Die
hierin bereitgestellten Sequenzen können auch als Amplifikations-Primer
verwendet werden, entsprechend Amplifikations-Verfahren, die im
Fachgebiet wohl bekannt sind. Solche Reaktionen schließen ein, sollen
aber nicht beschränkt
sein auf die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), beschrieben in
US-Patenten 4,683,195 und
4,683,202 , die Ligase-Kettenreaktion
(LCR), beschrieben in
EP-A-320
308 , und die Gap-LCR (GLCR), beschrieben in
US-Patent Nr. 5,427,930 .
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
werden die Sonden in der "Oligonukleotid-Hybridisierungs-PCR" (variabel hierin
bezeichnet als OH PCR")-Amplifikations-Reaktion,
wie in
WO97/07235 beschrieben,
verwendet.
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Kurz
gesagt umfassen die Reagenzien, die in dem bevorzugten Verfahren
verwendet werden, mindestens einen Amplifikations-Primer (vorzugsweise
zwei) und mindestens eine Sonde, ebenso wie andere Reagenzien zur
Durchführung
einer Amplifikations-Reaktion.
Die Primer-Sequenz wird verwendet, um die Verlängerung einer Kopie einer Zielsequenz
(oder ihres Komplements) zu starten, und wird mit entweder einem
Einfang-Marker oder einem Detektions-Marker markiert. Die Sonden-Sequenz
wird verwendet, um mit der Sequenz zu hybridisieren, die durch die
Primer-Sequenz erzeugt
wird, und sie hybridisiert typischerweise mit einer Sequenz, die
die Primer-Sequenz oder ihr exaktes Komplement nicht einschließt. Ähnlich zu
der Primer-Sequenz wird auch die Sonden-Sequenz mit entweder einem
Einfang-Marker oder einem Detektions-Marker markiert mit dem Einwand,
dass, wenn der Primer mit einem Einfang-Marker markiert ist, die
Sonde mit einem Detektions-Marker markiert ist und umgekehrt. Detektions-Marker haben die
selbe Definition wie "Marker", zuvor definiert, und "Einfang-Marker" werden üblicherweise
verwendet, um die Verlängerungs-Produkte, und
Sonden, die mit irgendwelchen solchen Produkten assoziiert sind,
von anderen Amplifikations-Reaktanden
zu trennen. Spezifische Bindeglieder (wie zuvor definiert), sind
wohl geeignet für
diesen Zweck. Auch werden Sonden, die gemäß dem OH PCR Verfahren verwendet
werden, vorzugsweise an ihren 3'-Enden
blockiert, so dass sie unter Hybridisierungs-Bedingungen nicht verlängert werden.
Verfahren zur Verhinderung der Verlängerung einer Sonde sind wohl
bekannt und sind eine Sache der Auswahl für jemanden, der im Fachgebiet bewandert
ist. Zum Beispiel wird das Hinzufügen einer Phosphatgruppe oder
eines Markers zu dem 3'-Ende der
Sonde im Allgemeinen ausreichen für die Zwecke der Blockierung
der Verlängerung
der Sonde.
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"Andere Reagenzien
zur Durchführung
einer Amplifikations-Reaktion" oder "Nukleinsäure-Amplifikations-Reagenzien" schließen Reagenzien
ein, welche wohl bekannt sind und sie können folgende einschließen, sind
aber nicht darauf beschränkt:
ein Enzym, das Polymerase-Aktivität hat, Enzym-Kofaktoren, wie
zum Beispiel Magnesium; Salze; Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD);
und Desoxynukleotid-Triphosphate (dNTPs), wie zum Beispiel Desoxyadenin-Triphosphat,
Desoxyguanin-Triphosphat, Desoxycytosin-Triphosphat und Desoxythymin-Triphosphat.
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Das
OH-PCR-Verfahren umfasst im Allgemeinen die folgenden Schritte:
(a) Bilden einer Reaktions-Mischung, die Nukleinsäure-Amplifikations-Reagenzien,
eine oder mehrere Sonden, welche hierin bereitgestellt sind, mindestens
einen Amplifikations-Primer
und eine Testprobe, vor der vermutet wird, dass sie eine Zielsequenz
enthält,
umfasst; (b) Unterwerfen der Mischung Hybridisations-Bedingungen,
um mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure-Sequenz zu erzeugen, die
komplementär
ist zu der Zielsequenz; (c) Hybridisieren der Sonde an die Nukleinsäure-Sequenz, die komplementär ist zu
der Zielsequenz, um ein Hybrid zu bilden, das die Sonde und die
Nukleinsäure-Sequenz
umfasst, die komplementär
ist zu der Zielsequenz; und (d) Detektieren des Hybrids als ein
Hinweis auf das Vorhandensein von mindestens einem onkogenen HPV-Typ
in der Probe. Es wird verstanden werden, dass Schritt (b) des obigen
Verfahrens mehrere Male vor Schritt (c) wiederholt werden kann,
durch Thermocycling der Reaktions-Mischung, wie es im Fachgebiet wohl
bekannt ist.
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Gemäß dem obigen
Verfahren ist es vorzuziehen, Primer, Sonden und Reaktions-Bedingungen
so auszuwählen,
dass die Sonden-Sequenz eine niedrigere Schmelz-Temperatur als die
Primer-Sequenzen hat, so dass nach dem Aussetzen der Reaktions-Mischung gegenüber Hybridisierungs-Bedingungen
Kopien der Zielsequenz oder ihres Komplements bei einer Temperatur
oberhalb der Tm der Sonde erzeugt werden. Nachdem solche Kopien
synthetisiert wurden, werden sie denaturiert und die Mischung wird
abgekühlt,
um die Bildung von Hybriden zwischen den Sonden und jeglichen Kopien
des Ziels oder seines Komplements zu ermöglichen. Die Geschwindigkeit
der Temperatur-Reduktion von der Denaturierungs-Temperatur hinab
zu einer Temperatur, bei welcher die Sonden an einzelsträngige Kopien
binden werden, ist vorzugsweise recht schnell (zum Beispiel 8 bis
15 Minuten) und insbesondere durch den Temperatur-Bereich hindurch,
in welchem ein Enzym mit Polymerase-Aktivität aktiv für die Primer-Verlängerung
ist. Ein solches schnelles Abkühlen
begünstigt die
Kopie-Sequenz/Sonden-Hybridisierung eher als die Primer/Kopie-Sequenz-Hybridisierung
und -Verlängerung.
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Nach
der Bildung der Kopie-Sequenz/Sonden-Hybride, können die unterschiedlichen
Marker (d.h. Einfang- und Detektions-Marker) auf der Kopie-Sequenz und der
Sonde verwendet werden, um solche Hybride zu trennen und zu detektieren.
Vorzugsweise wird die Detektion gemäß den Protokollen durchgeführt, die
von der kommerziell erhältlichen
Abbott LCx®-Instrumentierung
(Abbott Laboratories; Abbott Park, IL) erhältlich sind.
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Somit
schließen,
wenn man das bevorzugte Verfahren im Kopf behält, bevorzugte Reaktions-Mischungen
nicht nur einen Oligonukleotid-Cocktail der vorliegenden Erfindung
ein, sondern auch einen Primer oder ein Set von Primern, der/die
die Verlängerung
von Kopien von Zielsequenzen mit den Sequenzidentifikationsnummern
3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 und 39 starten (d.h.
mindestens eine Primer-Sequenz und Sonden-Sequenzen, die komplementär sind zu
dem Verlängerungs-Produkt
des Primers, wenn vorhanden).
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Sequenzidentifikationsnummer
1 und/oder Sequenzidentifikationsnummer 2 sind beispielhafte Sequenzen,
die geeignet sind zur Erzeugung von Kopien der Zielsequenzen, an
welche die Sonden in den Cocktails der vorliegenden Erfindung hybridisieren.
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Wie
zuvor erwähnt,
wird gemäß einer
anderen Ausführungsform
ein Cocktail verwendet, um zu detektieren, ob mindestens ein onkogener
HPV-Typ in einer Testprobe vorhanden ist. Am bevorzugtesten ist
der Cocktail eine Komponente einer Amplifikations-Reaktions-Mischung,
worin alle Sonden der vorliegenden Erfindung Teil des Cocktails
sind. Die Sonden werden mit den Amplifikations-Produkten hybridisiert,
um Komplexe zu bilden und jegliche Komplexe werden dann als ein
Anzeichen detektiert, ob mindestens ein onkogener HPV-Typ in der
Testprobe vorhanden war.
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Die
Sonden in den Cocktails der vorliegenden Erfindung können als
Teil eines Kits bereitgestellt werden, nützlich für die Detektion des Vorhandenseins
von mindestens einem onkogenen HPV-Typ in einer Testprobe. Die Kits
umfassen einen oder mehrere geeignete Behälter, die die Sequenzen der
Cocktails gemäß der vorliegenden
Erfindung, ein Enzym mit Polymerase-Aktivität, und Desoxynukleotid-Triphosphate
enthalten. Typischerweise trägt
mindestens eine Sequenz einen Marker, aber die Detektion ist ohne
dies möglich.
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Die
folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung
weiter zu veranschaulichen und sie sind nicht beabsichtigt, die
Erfindung einzuschränken.
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Beispiele
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Die
folgenden Beispiele zeigen die Detektion von onkogenen Stämmen von
menschlichen Papillomaviren (HPV) unter Verwendung von Primern,
um die Zielsequenzen und die hierin bereitgestellten Sonden zu amplifizieren.
Diese DNA-Primer und Sonden werden identifiziert als Sequenzidentifikationsnummer
1, Sequenzidentifikationsnummer 2, Sequenzidentifikationsnummer
4, Sequenzidentifikationsnummer 7, Sequenzidentifikationsnummer
10, Sequenzidentifikationsnummer 13, Sequenzidentifikationsnummer
16, Sequenzidentifikationsnummer 19, Sequenzidentifikationsnummer
22, Sequenzidentifikationsnummer 25, Sequenzidentifikationsnummer
28, Sequenzidentifikationsnummer 31, Sequenzidentifikationsnummer
34, Sequenzidentifikationsnummer 37 und Sequenzidentifikationsnummer
40. Alle obigen Primer und Sonden sind spezifisch für eine Region
in dem L1-Gen von HPV. In den folgenden Beispielen werden Sequenzidentifikationsnummern
1 und 2 als Consensus-Amplifikations-Primer verwendet, die spezifisch
sind für
diese Region in onkogenen und nicht-onkogenen Typen von HPV. Ein
Abschnitt der L1-Sequenz im onkogenen HPV-Typ 16 wird hierin als
Sequenzidentifikationsnummer 3 bezeichnet. Sequenzidentifikationsnummer
4 wird als eine Typen-spezifische interne Hybridisierungs-Sonde
für den
onkogenen HPV-Typ 16 verwendet. Ein Abschnitt der L1-Sequenz in
onkogenem HPV-Typ 18 wird hierin als Sequenzidentifikationsnummer
6 bezeichnet. Sequenzidentifikationsnummer 7 wird als eine Typen-spezifische
interne Hybridisierungs-Sonde für
den onkogenen HPV-Typ 18 verwendet. Ein Abschnitt der L1-Sequenz
in dem onkogenen HPV-Typ 31 wird hierin als Sequenzidentifikationsnummer
9 bezeichnet. Sequenzidentifikationsnummer 10 wird als eine Typen-spezifische
interne Hybridisierungs-Sonde für
den onkogenen HPV-Typ 31 verwendet. Ein Abschnitt der L1-Sequenz
in onkogenem HPV-Typ 33 wird hierin als Sequenzidentifikationsnummer
12 bezeichnet. Sequenzidentifikationsnummer 13 wird als eine Typen-spezifische
interne Hybridisierungs-Sonde für
den onkogenen HPV-Typ 33 verwendet. Ein Abschnitt der L1-Sequenz
in onkogenem HPV-Typ 35 wird hierin als Sequenzidentifikationsnummer
15 bezeichnet. Sequenzidentifikationsnummer 16 wird als eine Typen-spezifische
interne Hybridisierungs-Sonde für den
onkogenen HPV-Typ 35 verwendet. Ein Abschnitt der L1-Sequenz in
dem onkogenen HPV-Typ 39 wird hierin als Sequenzidentifikationsnummer
18 bezeichnet. Sequenzidentifikationsnummer 19 wird als eine Typen-spezifische
interne Hybridisierungs-Sonde für
den onkogenen HPV-Typ 39 verwendet. Ein Abschnitt der L1-Sequenz
in onkogenem HPV-Typ 45 wird hierin als Sequenzidentifikationsnummer
21 bezeichnet. Sequenzidentifikationsnummer 22 wird als eine Typen-spezifische
interne Hybridisierungs-Sonde für
den onkogenen HPV-Typ 45 verwendet. Eine Abschnitt der L1-Sequenz
im onkogenen HPV-Typ 51 wird hierin als Sequenzidentifikationsnummer
24 bezeichnet. Sequenzidentifikationsnummer 25 wird als eine Typen-spezifische
interne Hybridisierungs-Sonde für
den onkogenen HPV-Typ 51 verwendet. Ein Abschnitt der L1-Sequenz
in dem onkogenen HPV-Typ 52 wird hierin als Sequenzidentifikationsnummer
27 bezeichnet. Sequenzidentifikationsnummer 28 wird als eine Typen-spezifische
interne Hybridisierungs-Sonde für
den onkogenen HPV-Typ 52 verwendet. Ein Abschnitt der L1-Sequenz
in dem onkogenen HPV-Typ 56 wird hierin als Sequenzidentifikationsnummer
30 bezeichnet. Sequenzidentifikationsnummer 31 wird als eine Typen-spezifische
interne Hybridisierungs-Sonde für
den onkogenen HPV-Typ 56 verwendet. Ein Abschnitt der L1-Sequenz
im onkogenen HPV-Typ 58 wird hierin als Sequenzidentifikationsnummer
33 bezeichnet. Sequenzidentifikationsnummer 34 wird als eine Typen-spezifische
interne Hybridisierungs-Sonde für
den onkogenen HPV-Typ 58 verwendet. Ein Abschnitt der L1-Sequenz
im onkogenen HPV-Typ 59 wird hierin als Sequenzidentifikationsnummer
36 bezeichnet. Sequenzidentifikationsnummer 37 wird als eine Typen-spezifische
interne Hybridisierungs-Sonde für den
onkogenen HPV-Typ 59 verwendet. Ein Abschnitt der L1-Sequenz im
onkogenen HPV-Typ 68 wird hierin als Sequenzidentifikationsnummer
39 bezeichnet. Sequenzidentifikationsnummer 40 wird als eine Typen-spezifische
interne Hybridisierungs-Sonde für
den onkogenen HPV-Typ 68 verwendet.
-
Beispiel 1
-
Herstellung von HPV-Primern und Sonden
-
A.
L1 Consensus-Primer. Zielspezifische Consensus-Primer wurden entwickelt,
um die HPV-L1-Zielsequenz von onkogenen und nicht onkogenen HPV-Typen
durch Oligonukleotid-Hybridisierungs-PCR zu detektieren. Diese Primer waren
Sequenzidentifikationsnummer 1 und Sequenzidentifikationsnummer
2. Primer-Sequenzen wurden synthetisiert unter Verwendung von Standard-Oligonukleotid-Synthese-Methodik,
und mit Adamantan an ihren 5'-Enden
haptenisiert, unter Verwendung von Standard-Cyanoethyl-Phosphoramidid-Kopplungs-Chemie,
wie beschrieben in
US-Patent
Nr. 5,424,414 .
-
B.
L1 HPV-Typ-spezifische Sonden. Die Detektions-Sonden wurden entwickelt,
um mit der amplifizierten HPV-L1-Zielsequenz durch Oligonukleotid-Hybridisierung
zu hybridisieren. Diese Sonden sind Sequenzidentifikationsnummer
4 für HPV-Typ
16, Sequenzidentifikationsnummer 7 für HPV-Typ 18, Sequenzidentifikationsnummer
10 für
HPV-Typ 31, Sequenzidentifikationsnummer 13 für HPV-Typ 33, Sequenzidentifikationsnummer
16 fpr HPV-Typ 35, Sequenzidentifikationsnummer 19 für HPV-Typ
39, Sequenzidentifikationsnummer 22 für HPV-Typ 45, Sequenzidentifikationsnummer
25 für
HPV-Typ 51, Sequenzidentifikationsnummer 28 für HPV-Typ 52, Sequenzidentifikationsnummer
31 für
HPV-Typ 56, Sequenzidentifikationsnummer 34 für HPV-Typ 58, Sequenzidentifikationsnummer
37 für
HPV-Typ 59, und Sequenzidentifikationsnummer 40 für HPV-Typ
68. Sonden-Sequenzidentifikationsnummern
7, 10, 22, 25, 28, 31, 34, 37 und 40 wurden unter Verwendung von
Standard-Oligonukleotid-Synthese-Methodik
synthetisiert und mit zwei Carbazolen an dem 5'-Ende unter Verwendung von Standard-Cyanoethyl-Phosphoramidit-Kopplungs-Chemie
haptenisiert, wie beschrieben im
US-Patent
Nr. 5,464,746 (hierin durch die Bezugsnahme eingeschlossen),
und mit Phosphat an dem 3'-Ende
blockiert. Sonden- Sequenzidentifikationsnummern
4, 13, 16 und 19 wurden unter Verwendung von Standard-Oligonukleotid-Synthese-Methodik
synthetisiert und mit zwei Carbazolen an dem 3'-Ende unter Verwendung von Standard-Cyanoethyl-Phosphoramidit-Kopplungs-Chemie haptenisiert,
wie beschrieben in
US-Patent
Nr. 5,464,746 . Die Reaktivität wurde gegen einen bekannten
Standard von HPV-DNA bewertet.
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Beispiel 2
-
Empfindlichkeit der HPV-Detektion
-
Plasmide,
individuell umfassend die 13 onkogenen HPV-Typen (HPV 16, 18, 31,
33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und 68) wurden hergestellt unter
Verwendung des Qiagen-Plasmid-Kits (Qiagen Inc., Chatsworth, CA)
gemäß den Angaben
des Herstellers. Genau wurden für
jedes Plasmid einzelne Bakterien-Kulturen, die die Plasmide enthielten, über Nacht
in 500 ml TB-Medium gezüchtet
(1,2% Bakto-Trypton, 2,4% Bakto-Hefe-Extrakt, 0,4% v/v Glycerol,
17 mM KH2PO4, 72
mM K2HPO4, 50 μg/ml Ampicillin).
Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt (4°C, 10 Minuten
bei 6000 × g)
und das Pellet wurde in 10 ml 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 100 μg/ml RNase
A (pH 8,0) resuspendiert. 10 ml von 0,2 N NaOH, 1% SDS wurden dann
zu dem resuspendierten Pellet hinzugefügt und die resultierende Lösung wurde
bei Raumtemperatur für
5 Minuten inkubiert. Nach dem Inkubations-Zeitraum wurden 10 ml von 3 M KAc (pH
5,5) zu der Lösung
hinzugefügt und
diese Lösung
wurde dann auf Eis für
20 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurde die zelluläre Debris durch
Zentrifugation aus den Mischungen entfernt (4°C, 30 Minuten bei 15.000 × g) und
die resultierenden Überstände wurden
auf eine QIAGEN-tip 500 (Qiagen Inc.) geladen, welche mit 10 ml
von 750 mM NaCl, 50 mM MOPS, 15% Ethanol, 0,15% Triton® X-100
(pH 7,0) ins Gleichgewicht gebracht wurde. Die QIAGEN-tip 500 wurde
zweimal mit 1,0 M NaCl, 50 mM MOPS, 15% Ethanol (pH 7,0) gewaschen,
bevor die DNA mit 1,25 M NaCl, 50 mM MOPS, 15% Ethanol, 0,15% Triton® X-100
(pH 8,5) eluiert wurde. Die DNA wurde aus dem Eluierungs-Mittel
mit 0,7 Volumina von Isopropanol ausgefällt und durch Zentrifugation
wiedergewonnen (4°C, 30
Minuten bei 15.000 × g).
Die DNA-Pellets wurden mit 15 ml kaltem 70% Ethanol gewaschen, für 5 Minuten luftgetrocknet
und in 500 μl
TE-Puffer aufgelöst
(10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris®),
1 mM Ethylendiamintetraessigsäure
(EDTA), pH 8,0).
-
Die
HPV-Plasmide wurden quantitativ bestimmt durch Vergleich mit einem
bekannten DNA-Standard (lineare M13 rf DNA von New England Biolabs,
Berverly, MA) unter Verwendung von Agarose-Gel-Elektrophorese. Um
dies zu erzielen, wurde die SYBR Green 1 (Molekular-Sonden, Eugene
OR)-Fluoreszenz der Standards und der HPV-Proben mit einem IS-1000
digitalen Bilgebungs-System (Alpha Innotech, San Leandro CA) gemessen,
und die HPV-Plasmid-Konzentration
wurde aus der M13 Standard-Kurve berechnet.
-
Separate
Verdünnungs-Sets
der gereinigten HPV-DNAs wurden PCR-amplifiziert und unter Verwendung
der HPV-Consensus-Primer (Sequenzidentifikationsnummern 1 und 2)
und der HPV-Detektions-Sonden (Sequenzidentifikationsnummern
4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37 und 40 für die HPV-Typen
16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 beziehungsweise 68),
beschrieben in Beispiel 1, detektiert. Die PCR-Verlängerung
wurde durchgeführt
unter Verwendung von 10 mM Tris HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 0,5 mM EDTA,
10 μg/ml
Rinder-Serum-Albumin (BSA) und 0,04 NaN3.
Taq-Polymerase wurde
verwendet bei einer Konzentration von 3,75 Einheiten und Nukleotide
wurden hinzugefügt,
was eine jeweilige Endkonzentration von 0,4 mM ergab. Primer wurden
jeweils verwendet bei einer Konzentration von 0,5 μM, mit Sonden
für HPV-Typen
51, 52, 56, 58 und 68 verwendet bei 3 μM, für HPV-Typen 18 und 31 verwendet bei 4,5 μM, für HPV-Typ
59 verwendet bei 6 μM,
und für
HPV-Typen 16, 33, 35, 39 und 45 verwendet bei 12 μM. Eine Endkonzentration
von 7 mM MgCl2 wurde zur selben Zeit wie
die Probe hinzugefügt.
Der Test wurde gemacht unter Verwendung von 50 μl Probe in einem Gesamt-Reaktions-Volumen
von 0,2 ml, mit Proben, die zweifach getestet wurden, unter Verwendung
von Lachshoden-DNA als eine negative Kontrolle.
-
Die
Reaktions-Mischungen wurden in einem Perkin-Elmer 480 Thermal Cycler
amplifiziert. Die folgenden Cycling-Bedingungen wurden verwendet:
94°C für 2 Minuten,
gefolgt von Cycling bei 95°C
für 20
Sekunden/44°C
für 1,5
Minuten/72°C
für 1 Minute
für 5 Zyklen,
dann 95°C
für 5 Sekunden/54°C für 30 Sekunden/72°C für 15 Sekunden
für 40
Zyklen, dann 72°C
für 4 Minuten.
Nachdem die Reaktions-Mischungen thermisch gecycelt wurden, wurden
die Mischungen bei 97°C
für 2 Minuten
gehalten und Sonden-Oligo-Hybridisierung wurde erzielt durch schnelles
Absenken der Temperatur auf 4°C.
-
Nachdem
die Reaktions-Produkte 4°C
erreicht hatten, wurden sie auf dem Abbott LCx
®-System
(erhältlich
von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) detektiert. Eine Suspension
von anti-Carbazol-Antikörper-beschichteten
Mikropartikeln und einem anti-Adamantan-Antikörper/alkalische Phosphatase-Konjugat,
(von denen alle kommerziell erhältlich
sind von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) wurde miteinander
verwendet mit dem LCx
®, um die Reaktions-Produkte
einzufangen und zu detektieren. Die Durchschnittswerte aus diesem Experiment
(berechnet als Zählungen/Sekunde/Sekunde;
C/S/S) sind in Tabelle 2 gezeigt und zeigen, dass die Empfindlichkeit
der Detektion von verschiedenen onkogenen HPV-Typen ungefähr 10
3 bis 10
4 Moleküle von DNA
ist, abhängig
von dem Typ. Tabelle 2
| HPV-Typ | Moleküle von HPV-DNA
(LCx® Rate:
C/S/S) |
| | 0 | 103 | 104 | 105 | 106 | 107 | 108 |
| HPV 16 | 96,7 | 307 | 1043,8 | 1266,5 | 1141,5 | 1001,7 | 993,4 |
| HPV
18 | 100,6 | 1022,9 | 1345,2 | 1397,9 | 1361,4 | 1320,8 | 1256,8 |
| HPV
31 | 99,0 | 262,8 | 970,0 | 1336,8 | 1344,2 | 1369,8 | 1282,7 |
| HPV
33 | 103,8 | 280,9 | 896,2 | 963,2 | 846,0 | 665,4 | 654,6 |
| HPV
35 | 100,5 | 303,9 | 1003,3 | 887,0 | 735,8 | 740,5 | 647,7 |
| HPV
39 | 100,2 | 296,4 | 823,7 | 1009,3 | 899,5 | 733,4 | 640,5 |
| HPV
45 | 94,2 | 429,7 | 923,7 | 1067,5 | 962,0 | 943,1 | 998,9 |
| HPV
51 | 95,9 | 158,3 | 539,6 | 878,7 | 968,9 | 952,7 | 949,1 |
| HPV
52 | 100,1 | 112,0 | 415,5 | 1146,4 | 1257,8 | 1167,9 | 1029,6 |
| HPV
56 | 98,8 | 643,6 | 1100,8 | 1162,9 | 11244 | 1061,1 | 1157,2 |
| HPV
58 | 104,4 | 306,3 | 1153,7 | 1463,3 | 1495,3 | 1520,6 | 1502,4 |
| HPV
59 | 100,3 | 546,8 | 785,7 | 863,4 | 990,5 | 984,7 | 1014,8 |
| HPV
68 | 86,4 | 279,1 | 349,6 | 1000,7 | 1011,9 | 899,5 | 877,7 |
-
Beispiel 3
-
Spezifität der HPV-Detektion
-
Zusätzlich zu
den 13 Plasmiden von onkogenen Typen von HPV, die in Beispiel 2
erhalten wurden, wurden 12 Plasmide von nicht onkogenen Typen von
HPV (HPV 6, 11, 13, 26, 32, 40, 42, 54, 55, 57, 61 und 66) erhalten.
-
DNA
wurde aus diesen Plasmiden wie in Beispiel 2 gereinigt und auf 108 Moleküle
von DNA/Reaktion verdünnt.
Die HPV-Consensus-Primer
(Sequenzidentifikationsnummern 1 und 2) und die HPV-Detektions-Sonden
(Sequenzidentifikationsnummern 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28,
31, 34, 37 und 40 für
HPV-Typen 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 beziehungsweise
68), die in Beispiel 1 beschrieben sind, wurden verwendet, um die
verdünnten
DNA-Proben wie oben in Beispiel 2 beschrieben zu amplifizieren und
zu detektieren, außer
dass die Detektions-Sonden
bei einer Endkonzentration von 4 nM jeweils in separaten Reaktionen
verwendet wurden, um die Amplifikations-Produkte, die durch die
HPV-Consensus-Primer erzeugt wurden, zu detektieren.
-
Die
Daten aus diesem Experiment sind in Tabelle 3 gezeigt, und zeigen
spezifische Amplifikation und Detektion nur von onkogenen Typen
von HPV, wobei die nicht onkogenen Typen von HPV nicht reaktiv waren. Tabelle 3
| HPV-Typ | HPV-Sonden-Typ
(LCx® Rate:
C/S/S) |
| Onc | 16 | 18 | 31 | 33 | 35 | 39 | 45 | 51 | 52 | 56 | 58 | 59 | 68 |
| 16 | 135
0 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 18 | - | 1291 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 31 | - | - | 1479 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 33 | - | - | - | 836 | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 35 | - | - | - | - | 1211 | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 39 | - | - | - | - | - | 1039 | - | - | - | - | - | - | - |
| 45 | - | - | - | - | - | - | 1015 | - | - | - | - | - | - |
| 51 | - | - | - | - | - | - | - | 1016 | - | - | - | - | - |
| 52 | - | - | - | - | - | - | - | - | 1049 | - | - | - | - |
| 56 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 1282 | - | - | - |
| 58 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 1249 | - | - |
| 59 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 1296 | - |
| 68 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 979 |
| Nicht-Onc |
| 6 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 11 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 13 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 26 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 32 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 40 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 42 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 54 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 55 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 57 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 61 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 66 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | nt |
- (Onc = onkogene HPV-Typen; nicht-onc nicht
onkogene HPV-Typen; ein negatives Symbol (–) bezeichnet, dass die LCx®-Rate
geringer als 120 C/S/S war; nt = nicht getestet).
-
Die
Daten in Tabelle 3 zeigen, dass die onkogenen HPV-Sonden spezifisch
die HPV-Typen detektieren, für
welche sie zur Detektion entwickelt wurden.
-
Beispiel 4
-
HPV-Detektion in klinischen Proben
-
A.
Detektion von HPV in klinischen Proben unter Verwendung des HPV
LCx
®-Assays
und eines kommerziellen Hybrid-Einfang-Assays. Achtundneunzig klinische Proben
wurden auf onkogenes HPV getestet durch Digene's Hybrid-Einfang-Assay (Digene Diagnostics,
Silver Spring MD) und verglichen mit der HPV-Detektion unter Verwendung der HPV-Consensus-Primer
(Sequenzidentifikationsnummern 1 und 2) und den HPV-Detektions-Sonden (Sequenzidentifikationsnummern
4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37 und 40 für HPV-Typen
16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 beziehungsweise 68),
die in Beispiel 1 beschrieben sind. Proben wurden in Digene Proben-Puffer
gesammelt und gemäß den Anweisungen
des Herstellers verarbeitet. Ein Teil der Probe wurde mit Ethanol
bei –70°C ausgefällt und
das Pellet wurde in 50 μl
10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 resuspendiert. Zehn μl dieser
Probe wurden dann zu 90 μl
von 50 mM EPPS (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[3-propansulfonsäure], pH 8,0 (Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO), 14 mM MgCl
2, hinzugefügt und auf
95–100°C für 10 Minuten
erhitzt. Nach Abkühlen
für 15
Minuten auf Raumtemperatur wurde die Probe amplifiziert und in einem
Gesamtvolumen von 0,2 ml wie in Beispiel 2 detektiert (außer dass
MgCl
2 während
der Proben-Zubereitung,
wie oben angegeben, hinzugefügt
wurde). Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4
| | HPV-LCx® Assay |
| Positiv | Negativ |
| Digene Hybrid-Einfang-Assay | Positiv | 28 | 2 |
| Negativ | 20 | 48 |
-
In
Tabelle 4 oben waren 28 von 98 Proben HPV-positiv durch beide Assays,
und 48 von 98 Proben waren HPV-negativ durch beide Assays. Die 2
Proben, die als positiv identifiziert wurden durch den Digene-Assay
aber negativ in dem HPV-LCx®-Assay, wurden in einem
alternativen PCR-Assay als negativ bestätigt, der an der Johns Hopkins
Universität
durchgeführt
wurde, wo die klinischen Proben erhalten wurden. Zwanzig Proben
wurden als HPV-positiv identifiziert durch den LCx®-Assay,
wurden aber durch den Digene-Assay
nicht detektiert. Sechzehn von diesen 20 Proben wurden als positiv
bestätigt
in dem Assay bei Johns Hopkins; die anderen 4 Proben wurden wieder
als positiv getestet in dem LCx®-Assay
und als onkogen typisiert, unter Verwendung von jeder Sonde in einer
separaten Reaktion wie in Beispiel 3 beschrieben. Ein weiterer Beweis
dafür wurde
gezeigt durch das Entnehmen von 14 der Digene negativ/LCx®-positiv
Proben, Erstellen von seriellen zehnfach Verdünnungen von 1:10 bis 1:1000,
und Testen dieser Verdünnungen
in dem LCx®-Format.
Alle 14 von diesen Proben wurden bei der höchsten 1:1000 Verdünnung detektiert.
-
B.
Detektion von HPV in Biopsie-bestätiqten Krebs-Proben. Achtunddreißig Proben
wurden von Patienten mit Biopsiebestätigtem Krebs erhalten. Diese
Proben wurden auf onkogenes HPV durch Digene's Hybrid-Einfang-Assay getestet (Digene
Diagnostics, Silver Spring, MD) und verglichen mit HPV-Detektion
unter Verwendung der HPV-Consensus-Primer (Sequenzidentifikationsnummern
1 und 2) und der HPV-Detektions-Sonden
(Sequenzidentifikationsnummern 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28,
31, 34, 37 und 40 für
HPV-Typen 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 beziehungsweise
68) beschrieben in Beispiel 1. Die Proben wurden gesammelt in Digene
Proben-Puffer und gemäß den Anweisungen
des Herstellers verarbeitet. Ein Teil der Probe wurde mit Ethanol
bei –70°C ausgefällt und
das Pellet wurde in 50 μl
10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 resuspendiert. Drei μl der Probe
wurden in 97 ml von 10 mM Tris, pH 8,0, 14 mM MgCl
2 verdünnt, und
auf 95–100°C für 10 Minuten
erhitzt. Nach Abkühlen
für 15
Minuten auf Raumtemperatur wurde die Probe amplifiziert und in einem
Gesamt-Reaktions-Volumen von 0,2 ml wie in Beispiel 2 detektiert
(außer
dass MgCl
2 während der Proben-Zubereitung hinzugefügt wurde,
wie oben angegeben). Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5
| | HPV-LCx® Assay |
| Positiv | Negativ |
| Digene
Hybrid-Einfang-Assay | Positiv | 18 | 0 |
| Negativ | 15 | 5 |
-
Beide
Assays detektieren onkogenes HPV in 18 von 38 Krebs-Proben und beide
sind negativ für
5 von den 38 Proben. Diese 5 Proben wurden auch als HPV-negativ
befunden durch den Johns Hopkins alternativen PCR-Assay. Fünfzehn der
Krebs-Proben wurden durch den LCx®-Assay
als onkogenes HPV enthaltend detektiert, waren aber negativ in dem
Digene-Assay. Jedoch sollte bemerkt werden, dass der Digene-Test
keine Sonden für
zwei der detektierten 15 LCx® positiven/Digene negativen
Subtypen (HPV-Typen
39 und 58) einschließt.
-
C.
Detektion von HPV in Biopsie-bestätigen hochgradigen Cervix interepithelialen
Neoplasie-Proben. Zweiundzwanzig Proben wurden erhalten von Patienten
mit Biopsie-bestätigter
hochgradiger Cervix interepithelialen Neoplasie (H-CIN), hergestellt
und getestet wie oben in Beispiel 4.B., wobei der HPV-LCx
®-Assay
mit dem Digene's
Hybrid-Einfang-Assay für
die Detektion von onkogenem HPV verglichen wurde. Ergebnisse sind in
Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6
| | HPV LCx® Assay |
| Positiv | Negativ |
| Digene
Hybrid-Einfang-Assay | Positiv | 10 | 0 |
| Negativ | 9 | 3 |
-
Beide
Assays detektieren onkogenes HPV in 10 von 22 H-CIN-Proben und beide
sind negativ für
3 der 22 Proben. Diese 3 Proben wurden auch HPV negativ befunden
durch den Johns Hopkins alternativen PCR-Assay. Neun der H-CIN-Proben
wurden durch den LCx®-Assay als onkogenes HPV
enthaltend detektiert, waren aber negativ in dem Digene-Assay. Es
sollte bemerkt werden, dass von diesen 9 diskrepanten Proben 2 einen
HPV-Typ enthielten (HPV-Typ 58) auf welchen in dem Digene-Assay
nicht getestet wurde.
-
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