JP2001502546A - 発癌性ヒトパピローマウイルスを検出するための核酸プライマー及びプローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、発癌性ＨＰＶ１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型及び６８型を検出するために有用なプローブ配列を提供する。これらの配列は試験サンプル中のこれらの発癌性ＨＰＶ型の存在を検出するように設計されたハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅利用アッセイで使用できる。更に、配列はキットの一部として提供され得る。

Description

【発明の詳細な説明】発癌性ヒトパピローマウイルスを検出するための核酸プライマー及びプローブ 発明の分野 本発明はヒトパピローマウイルスに関する。より詳細には本発明は試験サンプ ル中のヒトパピローマウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドに関する。発明の背景 今日まで、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）では約７０の異なる型が発見さ れている。現在知られているＨＰＶ型のうちの幾つかは子宮頚癌の増殖に関連す ることか知見されており、従って子宮頚癌の診断の見地からＨＰＶが重要視され ている。すべての形態の癌と同様にこの疾病の治療に成功するためには早期発見 が最も重要である。幾つかのＨＰＶ株は子宮頚癌の増殖に関連しているので、適 当なサンプル中のＨＰＶの検出は子宮頚癌を早期検出するための最良の手段を提 供し得る。 試験サンプル中の特定のＨＰＶ型の検出方法としては主として、サザンブロッ ト分析に組合せたポリメラーゼ連鎖反応が使 用されている。特に、Ｓｎｉｊｄｅｒｓ，Ｐ．Ｊ．Ｆ．ら，Ｊ．ｏｆ Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７１，ｐｐ．１７３−１８１（１９９０）は、増幅プラ イマーを使用してＨＰＶゲノム内部の配列の多数コピーを作製し、特定のＨＰＶ 型に特異的な放射性標識ＤＮＡプローブを使用して試験サンプル中に存在する特 定のＨＰＶ型を検出しこれによってこのＨＰＶ型を判定する方法を例示している 。残念なことに、サザンブロット法は、特に多数の異なるＨＰＶ型を検出する試 験の場合には比較的労働集約的及び時間消費的な方法である。従って、子宮頚癌 に関連する１つまたは複数のＨＰＶ型が試験サンプル中に存在するか否かを迅速 に且つ正確に判定するための適当な方法及び試薬が要望されている。発明の概要 本発明は、発癌性ＨＰＶ１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、 ４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型及び６８型（以後“発癌性Ｈ ＰＶ型”と呼ぶ）を特異的に検出するために使用できるオリゴヌクレオチドを提 供する。 これらのオリゴヌクレオチドは、配列４及びその相補配列である配列５、配列７ 及びその相補配列である配列８、配列１０及 びその相補配列である配列１１、配列１３及びその相補配列である配列１４、配 列１６及びその相補配列である配列１７、配列１９及びその相補配列である配列 ２０、配列２２及びその相補配列である配列２３、配列２５及びその相補配列で ある配列２６、配列２８及びその相補配列である配列２９、配列３１及びその相 補配列である配列３２、配列３４及びその相補配列である配列３５、配列３７及 びその相補配列である配列３８、配列４０及びその相補配列である配列４１で示 される。２種類以上の上記オリゴヌクレオチドから成るプローブのカクテルが好 ましい。 好ましくは、オリゴヌクレオチドを、該オリゴヌクレオチドの特異的ターゲッ ト配列とハイブリダイズさせ該ターゲット配列を検出するハイブリダイゼーショ ンプローブとして使用する。従って、本発明によって提供される方法は、ハイブ リダイゼーションアッセイ及び増幅利用アッセイを包含する。１つの方法によれ ば、試験サンプル中の少なくとも１つの発癌性ＨＰＶ型の存在を検出する方法が 、（ａ）試験サンプルを上記に挙げた配列の１つ以上に接触させる段階と、（ｂ ）試験サンプル中の少なくとも１つの発癌性ＨＰＶ型の存在の指標として少なく と も１つの上記配列と発癌性ＨＰＶターゲット配列とのハイブリダイゼーションを 検出する段階とから成る。 別の実施態様によれば、試験サンプル中の少なくとも１つの発癌性ＨＰＶ型の 存在を検出する方法は、（ａ）核酸増幅試薬と、発癌性ＨＰＶのターゲット配列 を含む試験サンプルと、本文中に配列３、配列６、配列９、配列１２、配列１５ 、配列１８、配列２１、配列２４、配列２７、配列３０、配列３３、配列３６及 び配列３９で示すＨＰＶターゲット配列を増幅し得る少なくとも１つ（好ましく は２つ）のプライマーと、配列４、配列７、配列１０、配列１３、配列１６、配 列１９、配列２２、配列２５、配列２８、配列３１、配列３４、配列３７、配列 ４０及び夫々の相補配列から成るグループから選択された１つまたは複数のオリ ゴヌタレオチドと、から成る反応混合物を形成する段階と、（ｂ）該混合物をタ ーゲット配列に相補的な少なくとも１つの核酸配列を生じさせるハイブリダイゼ ーション条件で処理する段階と、（ｃ）ターゲット配列に相補的な核酸配列に１ つまたは複数のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて、オリゴヌクレオチ ドと相補的核酸配列とから成る少なくとも１つの複合体を形成させる段階と、（ ｄ）このように形成さ れた複合体をサンプル中の少なくとも１つの発癌性ＨＰＶ型の存在の指標として 検出する段階とから成る。 別の実施態様によれば、本発明は、１組のオリゴヌクレオチドプライマーと、 増幅試薬と、配列４、配列５、配列７、配列８、配列１０、配列１１、配列１３ 、配列１４、配列１６、配列１７、配列１９、配列２０、配列２２、配列２３、 配列２５、配列２６、配列２８、配列２９、配列３１、配列３２、配列３４、配 列３５、配列３７、配列３８、配列４０及び配列４１で示されるオリゴヌクレオ チドの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つとから成るキットを提供する 。発明の詳細な説明 上述のように、本発明は、オリゴヌクレオチド（本文中の以後の記載では“オ リゴ”または“プローブ”と呼ぶ）、プローブの使用方法、及び、プローブを含 むキットを提供する。これらはいずれも、発癌性ＨＰＶ型（即ちＨＰＶ１６型、 １８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、 ５８型、５９型及び６８型）を特異的に検出するために使用され得る。本発明に よって提供されるプローブは増幅反応のプライマーとして使用できるが、プロー ブの各々が少なく とも１つのＨＰＶ型に特異的であり１つの場合（配列３４）には２つのＨＰＶ型 に特異的なので、好ましくはハイブリダイゼーションプローブとして使用される 。すべてのプローブが、ＨＰＶゲノム中に見出されるＬ１遺伝子の約１４０ｂｐ の領域の内部にハイブリダイズするという利点がある。従って、プローブは、該 プローブの各々が特異的な発癌性ＨＰＶ型を検出するために個別に使用すること もでき、また、複数のＨＰＶ型を同時に検出するために２つ以上のオリゴから成 るカクテルを使用することもできる。これは、約１４０ｂｐの領域の全部、大半 部または一部を増幅させ、試験サンプル中の発癌性ＨＰＶ型の少なくとも１つの 存在を判定するために増幅産物をプローブのカクテルに接触させるように設計し た増幅反応に特に有利である。これによって、単一の増幅反応で多数のＨＰＶ型 を検出する基盤が得られる。以下の表１は、本発明で提供されるオリゴの配列番 号と配列とそれらが特異的に検出する（１つまたは複数の）ＨＰＶ型とを示す。 本文中に開示されたプローブは、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)、リホ核酸（ＲＮ Ａ）、または、非電荷の核酸類似体のような核酸類似体でよい。その非限定例は 、国際特許出願ＷＯ９２／２０７０２に開示されたペプチト核酸（ＰＮＡ）、ま たは、米国特許第５，１８５，４４４号、第５，０３４，５０６号及び第５，１ ４２，０４７号に記載されたモルホリノ類似体である。これらのすべての特許の 記載内容は参照によって本明細書に含まれるものとする。このような配列は、現 在利用できる種々の技術を使用して常套的に合成できる。例えば、ＤＮＡ配列は 、慣用のヌクレオチドホスホラミジット化学法及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）；ＤｕＰｏｎｔ，（ Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）；またはＭｉｌｌｉｇｅｎ，（Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）から得られる器具を用いて合成できる。また、所望の場合には、米国特許 出願第５，４６４，７４６号、第５，４２４，４１４号及び第４，９４８，８８ ２号に記載のような当業界で公知の方法を使用して配列をラベルで標識し得る。 これらのすべての特許の記載内容は参照によって本明細書に含まれるものとする 。 本文中で使用された“ラベル”なる用語は、検出可能な特性 または特徴を有する分子または部分を意味する。ラベルは、例えば放射性同位体 、蛍光体、化学発光体、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子などのような直接検出 可能なラベルでもよく、または、特異的結合成分のような間接検出可能なラベル でもよい。直接検出可能なラベルが、例えば基質、トリガー試薬、光などのよう なラベル検出用の追加成分を必要とする場合があることは理解されよう。間接検 出可能なラベルを使用する場合、これらのラベルは典型的には、“コンジュゲー ト”と組合せて使用される。コンジュゲートは典型的には、直接検出可能なラベ ルに付着または結合した特異的結合成分である。コンジュゲートを合成する結合 化学法は当業界で公知であり、例えば、特異的結合成分の特異的結合特性または ラベルの検出可能特性を破壊しない任意の化学的手段及び／または物理的手段を 包含する。本文中で使用された“特異的結合成分”なる用語は、一方の分子が例 えば化学的または物理的手段を介して他方の分子に特異的に結合するような結合 対を構成している成分、即ち異なる２つの成分を意味する。抗原と抗体のような 特異的結合対の他にも、特異的結合対の非限定例としては、アビジンとビオチン 、ハプテンとハプテン特異的抗体、互いに相補的なヌクレオチド 配列、酵素の補因子または基質と酵素、などがある。 一般に、本発明で提供されるプローブは、試験サンプル中の発癌性ＨＰＶ型の 存在を検出するために、試験サンプルを本発明で提供される配列の少なくとも１ つにハイブリダイズ条件下で接触させ、ＨＰＶのターゲット配列と本文中で配列 ４、配列５、配列７、配列８、配列１０、配列１１、配列１３、配列１４、配列 １６、配列１７、配列１９、配列２０、配列２２、配列２３、配列２５、配列２ ６、配列２８、配列２９、配列３１、配列３２、配列３４、配列３５、配列３７ 、配列３８、配列４０及び配列４１によって示される配列の少なくとも１つとの ハイブリダイゼーションを検出することによって使用できる。公知の複数のハイ ブリダイゼーション検出方法を本発明に使用できる。その非限定例としては、ケ ル及び色素を使用する方法または例えばドットブロット法もしくは増幅反応を行 った後に１つまたは複数の本発明の配列に結合したラベルを検出する方法がある 。 本文中で使用された“試験サンプル”なる用語は、ターゲット配列を含有する 疑いのある任意のサンプルを意味する。試験サンプルは、生物ソースに由来でき 、（ｉ）ソースから得られ たサンプルを直接使用してもよく、または、（ｉｉ）サンプルの特性を修飾する 前処理後に使用してもよい。即ち、試験サンプルを使用に先立って、例えば、細 胞を破壊する、固体材料から液体を調製する、粘性流体を希釈する、液体を濾過 する、液体を蒸留させる、液体を濃縮する、干渉成分を失活させる、試薬を添加 する、核酸を精製する、などの方法で前処理し得る。典型的には、試験サンプル は子宮頚部の掻取りサンプルまたは同様のサンプルでもよくまたはこれらに由来 するサンプルでもよい。 本文中で使用された“ターゲット配列”なる用語は、本発明で提供されるプロ ーブの１つで検出されるか、増幅されるか、検出及び増幅されるか、あるいは本 発明で提供されるプローブの１つに相補的である核酸配列を意味する。更に、タ ーゲット配列なる用語はときどきは一本鎖であるかのように使用されているが、 ターゲット配列が実際には二重鎖であることは当業者に理解されよう。 “ハイブリダイゼーション”または“ハイブリダイズ”条件は一般には、互い に相補的な核酸配列間のアニーリングまたは１つ以上の核酸配列のアニーリング 及び伸長を促進する条件で あると定義される。このようなアニーリングが、温度、イオン強度、配列の長さ 、相補性及び配列のＧ：Ｃ含量などの複数のパラメーターにかなり予測可能に依 存することは当業界で公知である。例えば、互いに相補的な核酸配列の環境の温 度を低下させることによってアニーリングか促進される。所与の任意の配列セッ トについて、融解温度即ちＴｍは複数の公知の手段のいずれかによって推定でき る。診断用途では通常は、融解温度に近い（即ち、温度差１０℃以内の）ハイブ リダイゼーション温度を使用する。イオン強度または“塩”濃度も融解温度に影 響を与える。小さいカチオンはホスホジエステル主鎖の負電荷を中和することに よって二重鎖の形成を安定させ易いからである。典型的な塩濃度は、カチオンの 種類及び原子価に依存するが、当業者には容易に理解されよう。同様に、高Ｇ： Ｃ含量及び配列の長さの増加も二重鎖の形成を安定させることが知られている。 その理由は、Ａ：Ｔ対の水素結合が２筒所しかないのに比べてＧ：Ｃ対は３筒所 に水素結合を有しているからであり、また、配列が長いほど配列を結合させる水 素結合の数が多いからである。従って、高Ｇ：Ｃ含量及び配列の長さの増加は融 解温度を上昇させ、これによってハイブリダイゼーション条件に 影響を与える。 所与の診断用途に使用するために配列を選択したとき、これらの配列のＧ：Ｃ 含量及び長さを知ることかできるので、それらの値に基づいてハイブリダイゼー ション条件を正確に決定できる。イオン強度は典型的には酵素活性に対して最適 化されるので、残った可変パラメーターは温度だけである。ハイブリダイゼーシ ョン温度は通常は、プライマーまたはプローブの融解温度Ｔｍまたはこの温度に 近い値に選択される。従って、特定のプライマー、プローブ、または、プライマ ーとプローブとのセットに好適なハイブリダイゼーション条件は当業者の平均的 な知識の範囲内で得られる。 本発明で提供される配列はまた、当業界で公知の増幅手順による増幅プライマ ーとして使用され得る。このような反応の非限定例は、米国特許第４，６８３， １９５号及び第４，６８３，２０２号に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） 、欧州特許公開ＥＰ−Ａ−３２０，３０８に記載のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ） 、米国特許第５，４２７，９３０号に記載のギャップＬＣＲ（ＧＬＣＲ）である 。これらのすべての特許の記載内容は参照によって本明細書に含まれるものとす る。 好ましい実施態様によれば、プローブは、１９９５年８月１４日出願の米国特許 出願第０８／５１４，７０４号に記載の“オリゴヌクレオチドハイブリダイゼー ションＰＣＲ”（本文中では“ＯＨＰＣＲ”とも呼ふ）増幅反応に使用される。 該特許出願の記載内容は参照によって本明細書に含まれるものとする。簡単に説 明すると、この好ましい方法で使用される試薬は、少なくとも１つ（好ましくは ２つ）の増幅プライマーと、少なくとも１つのプローブと、増幅反応を惹起する 他の試薬とから成る。 プライマー配列は、ターゲット配列（またはその相補配列）のコピーの伸長を プライムするために使用され、捕獲ラベルまたは検出ラベルによって標識されて いる。プローブ配列は、プライマー配列によって作製された配列にハイブリダイ ズするために使用され、典型的にはプライマー配列またはその正確な相補配列を 含まない配列にハイブリダイズする。プライマー配列と同様に、プローブ配列も 捕獲ラベルまたは検出ラベルによって標識されるが、但し、プライマーを捕獲ラ ベルで標識したときはプローブを検出ラベルで標識し、逆にプライマーを検出ラ ベルで標識したときはプローブを捕獲ラベルで標識する。検出 ラベルは前記に定義の“標識”と同義であり、“捕獲ラベル”は典型的には、伸 長産物及びこのような産物に結合しているプローブを他の増幅反応試薬から分離 するために使用される。（前記に定義したような）特異的結合成分はこの目的に 好適である。また、ＯＨＰＣＲ法に従って使用されるプローブは好ましくは、ハ イブリダイゼーション条件下で伸長しないように３’端がブロックされている。 プローブの伸長を阻止する方法は当業界で公知であり、当業者によって選択され る。例えば、プローブの伸長をブロックする目的のためには、プローブの３’端 にリン酸基またはラベルを付加するだけで通常は十分であろう。 “増幅反応を惹起する他の試薬”または“核酸増幅試薬”は公知の試薬であり 、その非限定例は、ポリメラーゼ活性を有する酵素、マグネシウムのような酵素 の補因子、塩、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、並びに、例 えばデオキシアデニン三リン酸、デオキシグアニン三リン酸、デオキシシトシン 三リン酸及びデオキシチミン三リン酸などのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄ ＮＴＰ）である。 ＯＨＰＣＲ法は一般に、（ａ）核酸増幅試薬と、本発明で提供される１つまた は複数のプローブと、少なくとも１つの増幅 プライマーと、ターゲット配列を含有する疑いのある試験サンプルとから成る反 応混合物を形成する段階と、（ｂ）ターゲット配列に相補的な核酸配列の少なく とも１つのコピーを作製するために混合物をハイブリダイゼーション条件で処理 する段階と、（ｃ）プローブをターゲット配列に相補的な核酸配列にハイブリダ イズさせて、プローブとターゲット配列に相補的な核酸配列とのハイブリッドを 形成させる段階と、（ｄ）サンプル中の少なくとも１つの発癌性ＨＰＶ型の存在 の指標としてハイブリッドを検出する段階とから成る。上記方法の段階（ｃ）の 前に、当業界で公知の反応混合物の熱サイクル処理によって段階（ｂ）を複数回 反復できることは理解されよう。 上記方法によれば、プライマーとプローブと反応条件との選択に関しては、反 応混合物をハイブリダイゼーション条件下に配置したときにターゲット配列また はその相補配列のコピーがプローブのＴｍよりも高い温度で産生されるように、 プローブ配列がプライマー配列よりも低い融解温度を有するのが好ましい。この ようなコピーが合成された後、コピーを変性し、プローブとターゲットまたはそ の相補配列のコピーとのハイブリッドが形成され得るように混合物を冷却する。 変性温度からプロ ーブが一本鎖コピーに結合する温度まで極めて高速で温度を低下させるのが好ま しく（例えば８〜１５分）、ポリメラーゼ活性を有する酵素がプライマー伸長に 活性である温度範囲では特に高速で温度を低下させる。このような高速冷却は、 プライマー／コピー配列のハイブリダイゼーションと伸長よりもコピー配列／プ ローブのハイブリダイゼーションを促進する。 コピー配列／プローブのハイブリッドを形成する場合、このようなハイブリッ ドを分離及び検出するためにコピー配列及びプローブに異なるラベル（即ち、捕 獲ラベル及び検出ラベル）を使用し得る。好ましくは、市販のＡｂｂｏｔｔ Ｌ Ｃｘ（登録商標）器具操作方式（Ａｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ａｂ ｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）によって使用されるプロトコルに従って検出を行う 。 従って、この好ましい方法を参酌すれば、好ましい反応混合物は、１つまたは 複数の本発明のプローブと、配列３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、 ２７、３０、３３、３６及び３９を有するターゲット配列のコピーの伸長をプラ イムするプライマーまたはプライマーセット（即ち、少なくとも１つのプライマ ー配列とプライマーの伸長産物に相補的な少なくとも１ つのプローブ配列）とを含む。配列１及び／または配列２は、本発明のプローブ とハイブリダイズするターゲット配列のコピーを作製するために好適な配列の代 表例である。 前述のように、別の実施態様によれば、少なくとも１つの発癌性ＨＰＶ型が試験 サンプル中に存在するか否かを検出するために２つ以上のプローブから成るカク テルが使用される。最も好ましくは、カクテルは、本発明の全部のプローブがカ クテルの成分を構成する増幅反応混合物の成分である。これらのプローブは増幅 産物とハイブリダイズして複合体を形成し、複合体は次に、少なくとも１つの発 癌性ＨＰＶ型か試験サンプル中に存在するか否かの指標として検出される。最も 好ましくは、本発明のカクテルは少なくとも配列３７またはその相補配列である 配列３８と、配列４０またはその相補配列である配列４１とを含有するであろう 。 本発明のプローブは、試験サンプル中の少なくとも１つの発癌性ＨＰＶ型の存 在を検出するために有用なキットの一部として提供され得る。キットは、１つま たは複数の本発明の配列とポリメラーゼ活性を有する酵素とデオキシヌクレオチ ド三リン酸とを収容した１つまたは複数の適当な容器から成る。通常は 少なくとも１つの配列がラベルを有しているが、ラベルなしでも検出は可能であ る。 以下の非限定的実施例によって本発明を更に詳細に説明する。実施例 以下の実施例は、ターゲット配列と本発明で提供されるプローブとを増幅する プライマーを使用するヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の発癌性株の検出を示 す。これらのＤＮＡプライマー及ひプローブは、配列１、配列２、配列４、配列 ７、配列１０、配列１３、配列１６、配列１９、配列２２、配列２５、配列２８ 及び配列３１、配列３４、配列３７及び配列４０によって示されている。上記の プライマー及びプローブの全部がＨＰＬのＬ１遺伝子中の１つの領域に特異的で ある。以下の実施例では、配列１及び配列２を、発癌性ＨＰＶ型及び非発癌性Ｈ ＰＶ型の該領域に特異的なコンセンサス増幅プライマーとして使用する。発癌性 ＨＰＶ１６型のＬ１配列の一部分を配列３で示す。配列４は、発癌性ＨＰＶ１６ 型の型特異的内部ハイブリダイゼーションプローブとして使用する。発癌性ＨＰ Ｖ１８型のＬ１配列の一部分を配列６で示す。配列７は、発癌性ＨＰＶ１８型の 型特異的内部ハイブリダイゼーションプローブとして 使用する。発癌性ＨＰＶ３１型のＬ１配列の一部分を配列９で示す。配列１０は 、発癌性ＨＰＶ３１型の型特異的内部ハイブリダイゼーションプローブとして使 用する。発癌性ＨＰＶ３３型のＬ１配列の一部分を配列１２で示す。配列１３は 、発癌性ＨＰＶ３３型の型特異的内部ハイブリダイゼーションプローブとして使 用する。発癌性ＨＰＶ３５型のＬ１配列の一部分を配列１５で示す。配列１６は 、発癌性ＨＰＶ３５型の型特異的内部ハイブリダイゼーションプローブとして使 用する。発癌性ＨＰＶ３９型のＬ１配列の一部分を配列１８で示す。配列１９は 、発癌性ＨＰＶ３９型の型特異的内部ハイブリダイゼーションプローブとして使 用する。発癌性ＨＰＶ４５型のＬ１配列の一部分を配列２１で示す。配列２２は 、発癌性ＨＰＶ４５型の型特異的内部ハイブリダイゼーションプローブとして使 用する。発癌性ＨＰＶ５１型のＬ１配列の一部分を配列２４で示す。配列２５は 、発癌性ＨＰＶ５１型の型特異的内部ハイブリダイゼーションプローブとして使 用する。発癌性ＨＰＶ５２型のＬ１配列の一部分を配列２７で示す。配列２８は 、発癌性ＨＰＶ５２型の型特異的内部ハイブリダイゼーションプローブとして使 用する。発癌性ＨＰＶ５６型のＬ１配列の一部分を配列３０で 示す。配列３１は、発癌性ＨＰＶ５６型の型特異的内部ハイブリダイゼーション プローブとして使用する。発癌性ＨＰＶ５８型のＬ１配列の一部分を配列３３で 示す。配列３４は、発癌性ＨＰＶ５８型の型特異的内部ハイブリダイゼーション プローブとして使用する。発癌性ＨＰＶ５９型のＬ１配列の一部分を配列３６で 示す。配列３７は、発癌性ＨＰＶ５９型の型特異的内部ハイブリダイゼーション プローブとして使用する。発癌性ＨＰＶ６８型のＬ１配列の一部分を配列３９で 示す。配列４０は、発癌性ＨＰＶ６８型の型特異的内部ハイブリダイゼーション プローブとして使用する。実施例１ ＨＰＶプライマー及びプローブの作製 Ａ．Ｌ１コンセンサスプライマー ターゲット特異的コンセンサスプライマーは、発癌性ＨＰＶ型及び非発癌性Ｈ ＰＶ型のＨＰＶ Ｌ１ターゲット配列をオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーシ ョンＰＣＲによって検出するように設計した。これらのプライマーは配列１及び 配列２で示される配列を有していた。標準オリゴヌクレオチド合成法を用いてプ ライマーを合成し、参照によって本明細書に含まれる 米国特許第５，４２４，４１４号に記載の標準シアノエチルホスホラミジット結 合化学法を用いて５’端をアダマンタンでハプテン化した。 Ｂ．Ｌ１ ＨＰＶ型特異的プローブ 検出プローブは、増幅したＨＰＶ Ｌ１ターゲット配列にオリゴヌクレオチド ハイブリダイゼーションによってハイブリダイズするように設計した。これらの プローブは、ＨＰＶ１６型に対しては配列４、ＨＰＶ１８型に対しては配列７、 ＨＰＶ３１型に対しては配列１０、ＨＰＶ３３型に対しては配列１３、ＨＰＶ３ ５型に対しては配列１６、ＨＰＶ３９型に対しては配列１９、ＨＰＶ４５型に対 しては配列２２、ＨＰＶ５１型に対しては配列２５、ＨＰＶ５２型に対しては配 列２８、ＨＰＶ５６型に対しては配列３１、ＨＰＶ５８型に対しては配列３４、 ＨＰＶ５９型に対しては配列３７及びＨＰＶ６８型に対しては配列４０で示され る配列を有していた。プローブ配列７、１０、２２、２５、２８、３１、３４、 ３７及び４０は、標準オリゴヌクレオチド合成法を用いて合成し、（参照によっ て本明細書に含まれる）米国特許第５，４６４，７４６号に記載の標準シアノエ チルホスホラミジット結合化学法を用いて５’端を２つ のカルバゾールでハプテン化し、３’端をリン酸でブロックした。プローブ配列 ４、１３、１６及び１９は、標準オリゴヌクレオチド合成法を用いて合成し、米 国特許第５，４６４，７４６号に記載の標準シアノエチルホスホラミジット結合 化学法を用いて３’端を２つのカルバゾールでハプテン化した。既知のＨＰＶ ＤＮＡ標準に対して反応性を評価した。実施例２ ＨＰＶ検出感度 Ｑｉａｇｅｎプラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，ｃｈａｔｓｗｏｒ ｔｈ，ＣＡ）を製造業者の指示通りに使用し、１３種類の発癌性ＨＰＶ型（ＨＰ Ｖ１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５２型、５６型 、５９型及び６８型）をそれぞれ含むプラスミドを調製した。より詳細に説明す ると、各プラスミド毎に、該プラスミドを含む細菌培養物の各々を５００ｍｌの ＴＢ培地（１．２％のバクトートリプトン、２．４％のバクトー酵母エキス、０ ．４％ｖ／ｖのグリセロール、１７ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄、７２ｍＭのＫ₂ＨＰＯ₄、 ５０μｇ／ｍｌのアンピシリン）で一夜増殖させた。細胞を遠心（４℃、６，０ ００×ｇで１０分）によって収集し、ペレッ トを１０ｍｌの５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＥＤＴＡ、１００μｇ／ ｍｌのＲＮアーゼＡ（ｐＨ８．０）に再懸濁させた。次に、１０ｍｌの０．２Ｎ のＮａＯＨ、１％のＳＤＳを再懸濁ペレットに添加し、得られた溶液を室温で５ 分間インキュベートした。インキュベーション期間の終了後、１０ｍｌの３Ｍの ＫＡｃ（ｐＨ５．５）を溶液に添加し、この溶液を次に氷上で２０分間インキュ ベートした。インキュベーション後、細胞落屑を遠心（４℃、１５，０００×ｇ で３０分）によって混合物から除去し、得られた上清を、１０ｍｌの７５０ｍＭ のＮａＣｌ、５０ｍＭのＭＯＰＳ、１５％のエタノール、０．１５％のトリトン （登録商標）Ｘ−１００（ｐＨ７．０）で平衡させたＱＩＡＧＥＮ−チップ５０ ０（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）に充填した。ＱＩＡＧＥＮ−チップ５００を１． ０ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＭＯＰＳ、１５％のエタノール（ｐＨ７．０）で２ 回洗浄した後、ＤＮＡを１．２５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＭＯＰＳ、１５％の エタノール、０．１５％のトリトン（登録商標）Ｘ−１００（ｐＨ８．５）で溶 出させた。０．７倍容量のイソプロパノールでＤＮＡを溶出剤から沈殿させ、遠 心（４℃、１５，０００×ｇで３０分）によって回収した。ＤＮＡペレッ トを１５ｍｌの低温７０％エタノールで洗浄し、５分間風乾し、５００μｌのＴ Ｅバッファ（１０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス（登 録商標）、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ），ｐＨ８．０）に溶解 した。 アガロースケル電気泳動を用い、既知のＤＮＡ標準（直鎖状Ｍ１３ ｒｆ Ｄ ＮＡ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に比 較することによってＨＰＶプラスミドを定量した。このために、標準及びＨＰＶ サンプルのＳＹＢＲグリーン１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅ ｎｅ ＯＲ）蛍光をＩＳ−１０００ディジタル造影装置（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏ ｔｅｃｈ，Ｓａｎ ｌｅａｎｄｒｏＣＡ）で測定し、ＨＰＶプラスミド濃度をＭ １３標準曲線から計算した。 精製したＨＰＶ ＤＮＡの個別の希釈セットを、実施例１に記載のＨＰＶコン センサスプライマー（配列１及び２）及びＨＰＶ検出プローブ（ＨＰＶ１６型、 １８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、 ５８型、５９型及び６８型のそれぞれに対する配列４、７、１０、１３、１６、 １９、２２、２５、２８、３１、３４、３７及び４０） を用いてＰＣＲ増幅し検出した。ＰＣＲ伸長は、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐ Ｈ８．３、５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌのウシ血 清アルブミン（ＢＳＡ）及ひ０．０４％のＮａＮ₃を用いて行った。Ｔａｑポリ メラーゼを３．７５単位の濃度で使用し、ヌクレオチドは各々が最終濃度０．４ ｍＭとなるように添加した。プライマーは各々０．５μＭの濃度で使用し、プロ ーブは、ＨＰＶ５１型、５２型、５６型、５８型及び６８型に対しては３μＭで 使用し、ＨＰＶ１８型及び３１型に対しては４．５μＭで使用し、ＨＰＶ５９型 に対しては６μＭで使用し、ＨＰＶ１６型、３３型、３５型、３９型及び４５型 に対しては１２μＭで使用した。サンプルと同時に最終濃度７ｍＭのＭｇＣｌ₂ を添加した。総反応容量０．２ｍｌ中に５０μｌのサンプルを用いて試験した。 サケ精巣ＤＮＡを陰性対照として用いてサンプルを重複試験した。 反応混合物をパーキン−エルマー４８０サーマルサイクラーで増幅させた。９ ４℃で２分処理し、９５℃で２０秒／４４℃で１．５分／７２℃で１分のサイク ルを５回、次いで９５℃で５秒／５４℃で３０秒／７２℃で１５秒のサイクルを ４０回、次に７２℃で４分処理するサイクル条件を使用した。反応混合 物を熱サイクル処理した後、混合物を９７℃で２分間維持し、温度を４℃まで急 降下させることによってプローブオリゴハイブリダイセーションを完了させた。 反応生成物が４℃に達すると、Ａｂｂｏｔｔ ＬＣｘ（登録商標）システム（ Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから 入手可能）で反応生成物を検出した。抗カルバゾール抗体で被覆した微粒子の懸 濁液と抗アダマンタン抗体／アルカリホスファターゼのコンジュゲート（いずれ もＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ，Ｐａｒｋ，ＩＬか ら市販されている）とをＬＣｘ（登録商標）と共に使用して、反応生成物を捕獲 し検出した。この実験で得られた平均値（カウント数／秒／秒；ｃ／ｓ／ｓで計 算）を表２に示す。この値は、種々の発癌性ＨＰＶ型の検出感度が型次第で約１ ０３〜１０４のＤＮＡ分子に相当することを示す。 実施例３ ＨＰＶ検出の特異性 実施例２で得られた１３種類の発癌性ＨＰＶ型のプラスミド以外に、１２種類の 非発癌性ＨＰＶ型（ＨＰＶ６型、１１型、１３型、２６型、３２型、４０型、４ ２型、５４型、５５型、５７型、６１型及び６６型）のプラスミドを調製した。 実施例２と同様にしてこれらのプラスミドからＤＮＡを精製し、反応液あたり １０８分子のＤＮＡとなるように希釈した。実施例１に記載のＨＰＶコンセンサ スプライマー（配列１及び２）とＨＰＶ検出プローブ（ＨＰＶ１６型、１８型、 ３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、 ５９型及び６８型のそれぞれに対する配列４、７、１０、１３、１６、１９、２ ２、２５、２８、３１、３４、３７及び４０）とを使用し、ＨＰＶコンセンサス プライマーによって産生された増幅産物を検出するために個々の反応物中で検出 プローブの各々を４ｎＭの最終濃度で使用した以外は実施例２に記載の手順で希 釈ＤＮＡサンプルを増幅及び検出した。この実験から得られたデータを表３に示 す。これらのデータは、発癌性ＨＰＶ型だけが特異的に増幅及び検出され非発癌 性のＨＰＶ型は反応しないことを示す。 表３の脚注：Ｏｎｃ＝発癌性ＨＰＶ型；Ｎｏｎ−ｏｎｃ＝非発癌性ＨＰＶ型；負 記号（−）はＬＣｘ（登録商標）速度が１２０ｃ／ｓ／ｓ未満であったことを表 す；ｎｔ＝試験せず。 表３のデータは、発癌性ＨＰＶのプローブは、プローブの設計目的である検出 対象ＨＰＶ型を特異的に検出することを示す。実施例４ 臨床サンプル中のＨＰＶ検出 Ａ．ＨＰＶ ＬＣｘ（登録商標）アッセイ及び市販のハイブリッド捕獲アッセイ を用いる臨床サンプル中のＨＰＶの検出 ９８の臨床サンプル中の発癌性ＨＰＶの存在をＤｉｇｅｎｅのハイブリッド捕 獲アッセイ（Ｄｉｇｅｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉ ｎｇ，ＭＤ）によって試験し、実施例１に記載のＨＰＶコンセンサスプライマー （配列１及び２）とＨＰＶ検出プローブ（ＨＰＶ１６型、１８型、３１型、３３ 型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型及び６ ８型のそれぞれに対する配列４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２ ８、３１、３４、３７及び４０）とを用いたＨＰＶ検出に比較した。サンプルを Ｄｉｇｅｎｅサンプルバッファに収集し、製造業者の指示に従って処理した。 サンプルの一部分を−７０℃のエタノールで沈殿させ、ペレットを５０μｌの１ ０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０に再懸濁させた。１０μｌのこ のサンプルを次に、９０μｌの５０ｍＭのＥＰＰＳ（Ｎ−〔２−ヒドロキシエチ ル〕ピペラジン−Ｎ’−〔３−プロパンスルホン酸〕，ｐＨ８．０（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１４ｍＭのＭｇＣｌ₂ に添加し、９５〜１００℃で１０分間加熱した。１５分間で室温に冷却後、（ 上述のようにサンプル調製中にＭｇＣｌ₂を添加した以外は）実施例２と同様に してサンプルを総反応容量０．２ｍｌで増幅し検出した。結果を表４に示す。 上記の表４で、９８サンプル中の２８サンプルが双方のアッセイでＨＰＶ陽性 であり、９８サンプル中の４８サンプルが双方のアッセイでＨＰＶ陰性であった 。Ｄｉｇｅｎｅアッセイでは陽性を示したがＨＰＶ ＬＣｘ（登録商標）アッセ イでは陰性を示した２つのサンプルは、臨床サンプルを提供したジョ ン・ホプキンス大学で行った交互ＰＣＲアッセイでは陰性であると確認された。 ２０のサンプルがＬＣｘ（登録商標）アッセイではＨＰＶ陽性を示したかＤｉｇ ｅｎｅアッセイでは陽性とは認められなかった。これらの２０サンプル中の１６ のサンプルはジョン・ホプキンス大学のアッセイで陽性であることが確認された 。残りの４つのサンプルはＬＣｘ（登録商標）アッセイで再試験すると陽性を示 し、実施例３と同様の各プローブの個別反応によって発癌性の型であると判定さ れた。，この確認試験として、Ｄｉｇｅｎｅ陰性／ＬＣｘ（登録商標）陽性の１ ４サンプルについて、これらのサンプルを１：１０から１：１０００まで１０倍 ずつ系列希釈し、これらの希釈物をＬＣｘ（登録商標）フォーマットで試験した 。これらの１４のサンプル全部が１：１０００の最大希釈度で検出された。 Ｂ．生検で確認された癌標本中のＨＰＶの検出 生検で確認された癌患者から３８のサンプルを採取した。これらのサンプル中 の発癌性ＨＰＶの存在をＤｉｇｅｎｅのハイブリッド捕獲アッセイ（Ｄｉｇｅｎ ｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）によって試 験し、実施例１に記載のＨＰＶコンセンサスプライマー（配列１及び２）と ＨＰＶ検出プローブ（ＨＰＶ１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型 、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型及び６８型のそれぞれに対 する配列４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３ ７及び４０）を用いたＨＰＶ検出に比較した。サンプルをＤｉｇｅｎｅサンプル バッファに収集し、製造業者の指示に従って処理した。サンプルの一部分を−７ ０℃のエタノールで沈殿させ、ペレットを５０μｌの１０ｍＭのトリス、１ｍＭ のＥＤＴＡ，ｐＨ８．０に再懸濁させた。３μｌのサンプルを、９７μｌの１０ ｍＭのトリス，ｐＨ８．０、１４ｍＭのＭｇＣｌ₂に希釈し、９５〜１００℃で １０分間加熱した。１５分間で室温に冷却後、（上述のようにサンプル調製中に ＭｇＣｌ₂を添加した以外は）実施例２と同様にしてサンプルを総反応容量０． ２ｍｌで増幅し検出した。結果を表５に示す。 双方のアッセイは３８の癌標本中の１８サンプルで発癌性ＨＰＶを検出し、３ ８サンプル中の５つのサンプルが双方のアッセイで陰性であった。これらの５つ のサンプルはジョン・ホプキンス大学で行った交互ＰＣＲアッセイでもＨＰＶ陰 性であることか確認された。１５の癌標本は、ＬＣｘ（登録商標）アッセイでは 発癌性ＨＰＶ含有が認められたがＤｉｇｅｎｅアッセイでは陰性であった。しか しながらＤｉｇｅｎｅ試験は、ＬＣｘ（登録商標）陽性／Ｄｉｇｅｎｅ陰性の１ ５のサンプルで検出された２つのサブタイプ（ＨＰＶ３９型及び５８型）に対す るプローブを含まないことに留意すべきである。 Ｃ．生検で確認された進行段階の子宮頸部上皮間新生物標本中のＨＰＶの検出 生検で確認された進行段階の子宮頸部上皮間腫瘍（Ｈ−ＣＩＮ）の患者から２２ のサンプルを採取し、実施例４．Ｂ．で前述したように準備し試験して、発癌性 ＨＰＶの検出についてＨＰＶ ＬＣｘ（登録商標）アッセイをＤｉｇｅｎｅのハ イブリッド捕獲アッセイに比較した。結果を表６に示す。 双方のアッセイは２２のＨ−ＣＩＮ標本中の１０の標本中で発癌性ＨＰＶを検出 し、２２サンプル中の３つのサンプルが双方のアッセイで陰性を示した。これら の３つのサンプルは、ジョン・ホプキンス大学の交互ＰＣＲアッセイでもＨＰＶ 陰性であることが確認された。９つのＨ−ＣＩＮ標本がＬＣｘ（登録商標）アッ セイで発癌性ＨＰＶ含有と認められたが、Ｄｉｇｅｎｅアッセイでは陰性であっ た。双方のアッセイ結果が一致しないこれらの９つのサンプルのうちの２つのサ ンプルはＤｉｇｅｎｅアッセイで試験できないＨＰＶ型（ＨＰＶ５８型）を含ん でいたことに留意されたい。 本発明を特定の実施態様について詳細に記載したが、これらの実施態様に本発 明の要旨及び範囲を逸脱しない種々の変更及び修正が可能であることは当業者に 明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ゴルゾウスキ，ヤセク・ジエイ アメリカ合衆国、イリノイ・60073、ラウ ンド・レイク・パーク、ノース・リンデ ン・ドライブ・210 (72)発明者 ホエンル，ロバート・ジエイ アメリカ合衆国、イリノイ・60014、クリ スタル・レイク、テインバー・ヒル・ドラ イブ・97 (72)発明者 ムーア，ジエニフアー・ジエイ アメリカ合衆国、イリノイ・60614、シカ ゴ、ノース・セミナリー・2520、アパート メント・１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．試験サンプル中の発癌性ＨＰＶ１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、 ３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型及び６８型の少なく とも１つの型の存在を検出するオリゴヌクレオチドカクテルであって、前記カク テルが、配列４、配列５、配列７、配列８、配列１０、配列１１、配列１３、配 列１４、配列１６、配列１７、配列１９、配列２０、配列２２、配列２３、配列 ２５、配列２６、配列２８、配列２９、配列３１、配列３２、配列３４、配列３ ５、配列３７、配列３８、配列４０及び配列４１から成るグループから選択され た少なくとも２つのプローブを含むことを特徴とするオリゴヌクレオチドカクテ ル。 ２．前記少なくとも２つのプローブの一方が、配列３７、配列３８、配列４０及 び配列４１から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の カクテル。 ３．配列４、配列５、配列７、配列８、配列１０、配列１１、配列１３、配列１ ４、配列１６、配列１７、配列１９、配列２０、配列２２、配列２３、配列２５ 、配列２６、配列２８、 配列２９、配列３１、配列３２、配列３４、配列３５、配列３７、配列３８、配 列４０及び配列４１から成るグループから選択されたプローブ。 ４．試験サンプル中の発癌性ＨＰＶ型の存在を検出する方法であって、 （ａ）前記試験サンプルを少なくとも１つの請求項３に記載のプローブに接触 させる段階と、 （ｂ）前記試験サンプル中の発癌性ＨＰＶ型の存在の指標として前記プローブと 発癌性ＨＰＶ型ターゲット配列とのハイブリダイゼーションを検出する段階とか ら成る方法。 ５．前記オリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とする請求項４に記載 の方法。 ６．前記試験サンプルを少なくとも２つのプローブから成るプローブカクテルに 接触させることを特徴とする請求項４に記載の方法。 ７．前記少なくとも２つのプローブが配列３７及び配列４０を含むことを特徴と する請求項６に記載の方法。 ８．試験サンプル中の少なくとも１つの発癌性ＨＰＶ型の存在を検出する方法で あって、 （ａ）核酸増幅試薬と、発癌性ＨＰＶターゲット配列を増幅させる少なくとも １つの増幅プライマーと、発癌性ＨＰＶ型ターゲット配列を含有する試験サンプ ルと、少なくとも１つの請求項３に記載のプローブとから成る反応混合物を形成 する段階と、 （ｂ）前記混合物を前記ターゲット配列に相補的な少なくとも１つの核酸配列 を生じさせるハイブリダイゼーション条件で処理する段階と、 （ｃ）前記プローブを前記ターゲット配列に相補的な前記核酸にハイブリダイ ズさせて前記プローブと前記核酸とから成るハイブリッドを形成させる段階と、 （ｄ）前記ハイブリッドを前記サンプル中の少なくとも１つの発癌性ＨＰＶ型 の存在の指標として検出する段階とから成る方法。 ９．前記プローブが捕獲ラベルで標識されており、前記プライマーが検出ラベル で標識されていることを特徴とする請求項８に記載の方法。 １０．前記プローブが検出ラベルで標識されており、前記プライマーが捕獲ラベ ルで標識されていることを特徴とする請求項 ８に記載の方法。 １１．（ａ）少なくとも１つの請求項３に記載のプローブと、 （ｂ）増幅試薬とから成るキット。