NL9000134A - Primers en werkwijze voor het detecteren van humaan papilloma virus genotypen m.b.v. pcr. - Google Patents

Description

BESCHRIJVING

Primers en werkwijze voor het detecteren van humaan papillomavirus genotypen m.b.v. PCR

De uitvinding heeft betrekking op primers en primerparen\ voor gebruik in een polymerase Chain reactie (PCR) teramplificatie van DNA van genitale humane papilloma virus (HPV)genotypen. Tevens betreft de uitvinding een werkwijze voor hetamplificeren van genitaal HPV DNA en een werkwijze voor hetonderzoeken van een monster, zoals een baarmoederhals uitstrijk,op de aanwezigheid daarin van genitale HPV genotypen.

Het testen op baarmoederhalskanker en voorstadia daarvangebeurt heden ten dage meestal aan de hand van het opsporen vanmorfologisch afwijkende cellen in celuitstrijken van debaarmoederhals. Hierbij worden uitstrijkjes gekleurd met dePapanicoloau techniek. Door de patholoog-anatoom wordenpremaligne en maligne cellen opgespoord met behulp van eenlichtmicroscoop. Morfologisch afwijkende cellen worden dan naarde ernst van de celafwijking ingedeeld in de PAP klassen I-V.

Bij PAP I worden alleen normale cellen aangetroffen terwijl bijPAP V echte kankercellen worden waargenomen. Aan dezecytomorfologische methode kleven echter enkele nadelen. Naastgrote inter-observer variaties kunnen afwijkende cellen wordengemist door "sample error" of door de microscopist. Daarnaastlevert de PAP III klasse vele problemen op omtrent het te volgengynaecologische beleid. Bij PAP III, die vrij frequent wordtaangetroffen, kan in de loop van de tijd progressie naar kankerplaatsvinden maar ook kan er persistentie of regressie naar denormale toestand optreden. Dit is dan ook de reden dat er grotebehoefte bestaat aan betere prognostische markers voorbaarmoederhalskanker.

De laatste jaren is veel onderzoek verricht naar de oor¬zaken van baarmoederhalskanker. Hierbij is vooral de betrokken¬heid van het sexueel overdraagbare humaan papilloma virus (HPV)duidelijk geworden. Van dit virus zijn tot nu toe 23 typengeassocieerd met afwijkingen van het baarmoederhals slijmvlies.Het onderscheid tussen deze HPV typen berust op een verschil inde base-volgorde van het HPV DNA. Ruwweg blijkt dat er 50%verschil in base-volgorde bestaat tussen de verschillende HPVtypen. Onderzoek heeft uitgewezen dat de HPV typen 6 en 11 vooral worden aangetroffen in goedaardige genitale afwijkingen \ zoals genitale wratten en in normale tot matig dysplastischeuitstrijken. Deze worden "low-risk" HPV typen genoemd. VooralHPV typen 16 en 18 en in mindere mate 31, 33 en 35 komen voor inernstig dysplastische en "maligne” cervicale uitstrijken (PAPlila en hoger) en worden daarom "high risk" HPV typen genoemd.Van de andere 18 genitale HPV typen is nog vrij weinig bekend.Het ziet er naar uit dat het vroeg aantonen van de verschillendeHPVs in cervix uitstrijken in de toekomst een belangrijkeprognostische factor kan zijn om het biologische gedrag vancervicale cellen te voorspellen.

Er bestaan nu diverse methoden om de verschillende humaanpapilloma virus genotypen te bepalen. De meest gevoelige methodeis de polymerase Chain reactie (PCR), ook wel DNA amplificatiemethode genoemd, waarmee in principe één HPV DNA molecuul in eenuitstrijk kan worden aangetoond. Bij deze methode worden aan eenklinisch monster (in casu een baarmoederhals uitstrijk) na eenisolatie van het daarin aanwezige DNA (of in het geval van deonderhavige uitvinding eventueel na een korte voorbehandeling)onder specifieke omstandigheden 2 kleine synthetische stukjesenkelstrengs DNA, waarvan de base-volgorde complementair is aaneen deel van één van beide strengen van een bepaald HPV genotypetoegevoegd. Deze stukjes DNA, die primers worden genoemd,flankeren op grond van hun base-volgorde één HPV type-specifiekDNA fragment (het target DNA) van zo'n 100 tot 500 basenzodanig, dat het in het reactiemengsel aanwezige enzym Taq DNApolymerase op de beide primers start en de beide strengen inoverlappende richting synthetiseert. Het verkregen produkt wordt amplimeer genoemd. De procedure waarbij het target éénmaal wordtgesynthetiseerd wordt een cyclus genoemd. Zo'n HPV-specifiekecyclus omvat drie stappen, die elk bij een andere temperatuurplaatsvinden: het HPV target DNA wordt gedenatureerd bij 94°C(1 minuut), gevolgd door een primer annealing stap bij 58°C(2 minuten) en polymerisatie bij 72°C (1,5 minuut). Door zo'ncyclus 30-40 keer te herhalen neemt het aantal amplimeren meteen factor 230-40 toe, zodat een hoeveelheid HPV type-specifiekDNA in de orde van nanogrammen wordt geproduceerd.

Deze methode heeft echter ook een aantal nadelen, te weten: \ a) Ten gevolge van zijn grote gevoeligheid bestaat een grotekans dat vals positieve uitslagen worden verkregen. Hierbijspelen vooral allerlei vormen van contaminatie een rol. Echter,door een fysische scheiding van de verschillende amplificatiestappen, speciale primer keuze, gebruik van speciale pipetten enstrenge laboratorium discipline kan het contaminatie probleemsterk worden gereduceerd. Zie in dit verband bijv. van den Bruleet al., 1989, waarvan de inhoud hier door verwijzing opgenomenmoet worden geacht; in dit artikel worden speciale primersvoorgesteld die het contaminatie probleem verkleinen.

b) Met de PCR methode kunnen alleen HPV typen worden opgespoordwaarvoor primers ter beschikking staan, hetgeen betekent dat deDNA base-volgorde bekend moet zijn. Momenteel is alleen nog maarde DNA base-volgorde bekend van de genitale HPV typen 6, 11, 16,18, 31 en 33. Het detecteren van niet gesekwenste HPV typen iseen lastig probleem dat direct verband houdt met het principevan de amplificatie methode zelf. De PCR methode is in principealleen succesvol als hij wordt uitgevoerd met twee HPV genotype-specifieke -primers (TS-PCR). Elk HPV genotype heeft zijn eigenspecifieke primers.

De primers worden meestal geselecteerd met behulp vanmatrix-analyse computer programma's, waarbij gezocht wordt naaroligonucleotiden (van ongeveer 20 basen lang) die heel specifiekvoor de verschillende HPV genotypen zijn. Uit onderzoek isgebleken dat deze specifieke sequenties bij de HPV's in alleopen leesramen (potentiële genen) liggen. Daarom is het vrijgemakkelijk om HPV type specifieke primers te selecteren en kunnen de HPV typen 6, 11, 16, 18, 31 en 33 via de PCR vrijgemakkelijk worden gedetecteerd. Zoals reeds eerder is opgemerktworden door van den Brule et al., 1989, primers beschreven dietot een aanzienlijke verkleining van het contaminatie risicoleiden, zg. anti-contaminatie primers. Dit zijn primers die deHPV kloneringsplaats van de in het laboratorium gebruikte HPVplasmiden flankeren. Doordat deze plasmiden meestal in grotehoeveelheden worden opgekweekt, vormen ze in beginsel eenbelangrijke contaminatiebron in de PCR. Indien echter primers worden gebruikt, die de kloneringsplaats flankeren en dus aan de \ twee uiteinden van de HPV insertie liggen, zal de niet bedoeldeaanwezigheid van dergelijke plasmiden in de PCR ruimte nietstorend zijn.

Een efficiënte en betrouwbare screening op de genitale HPVgenotypen dient echter antwoord te geven op de volgende tweevragen: 1) Is er in het monster (zoals een uitstrijk) HPV aanwezig? 2) Welke specifieke HPV genotypen komen voor in het monster?

Aangezien PCRs met HPV type-specifieke primers niet goed opdeze beide vragen antwoord geven, is gezocht naar mogelijkhedenom meer algemene primers te gebruiken, die in staat zouden zijnom in één keer een breed spectrum van HPVs (multipele HPVgenotypes) te detecteren. Matrix analyse van alle thans bekendeHPV DNA sequenties levert echter wel enkele gebieden in het HPVgenoom op die ruwweg in alle HPV genotypen voorkomen, met namein de twee verschillende genen El en LI, maar er blijkt geenstel oligonucleotiden van ca. 20 baseparen te kunnen wordengevonden, dat in alle HPV genotypen, waarvan thans de sequentiebekend is, voorkomt. Indien men aanneemt, dat een succesvollePCR staat of valt met de beschikbaarheid van primers met eenperfecte complementariteit met hun targets, zal duidelijk zijndat bijzondere kunstgrepen nodig zijn om tot een algemene primerte komen.

Door Manos et al., 1989, is dit probleem omzeild door alsprimers een complex mengsel van oligonucleotiden te gebruiken.

De door hen beschreven primers zijn de primers MY11 en MY09: 51-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-31 resp. 5'-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3'.

Doordat hierin M zowel A als C, R zowel A als G, W zowel A als T

en Y zowel C als T voorstelt, bestaat elk van deze twee primers uit een mengsel van verschillende oligonucleotiden. Hierdoor willen Manos et al. verzekeren dat een voor elk HPV genotype geschikt primerpaar, d.w.z. met de noodzakelijk geachte volkomen complementariteit tussen primers en target DNA, aanwezig is. De noodzaak om dergelijke primermengsels te synthetiseren is reeds een direct in het oog springend nadeel van deze benadering. Een belangrijker nadeel echter is dat ten gevolge van het gebruik van een mengsel de concentratie van de voor een bepaald HPV type \ werkzame primers aanzienlijk verlaagd wordt, hetgeen een lagereefficiëntie van de PCR veroorzaakt.

Gregoire et al., 1989, hebben een andere weg gekozen, nl.het gebruik van primers die op plaatsen van variatie tussen deverschillende HPV genotypen een inosine-base bevatten, die in dehybridisatie niet stoort. Om toch een goede annealing en tevensvoldoende specificiteit te verzekeren moeten de primers in depraktijk langer dan normaal worden gemaakt. Ook deze primerslaten wat gevoeligheid betreft nog te wensen over.

Geen van de beide hierboven beschreven kunstgrepen geefteen echt bevredigende oplossing voor het vermelde probleem.

De onderhavige uitvinders hebben nu een wel bevredigendeoplossing gevonden. Tegen de bestaande overtuiging in dat eensuccesvolle PCR bepaald wordt door een in essentie perfectecomplementariteit tussen de primers en hun targets, hebben deuitvinders twee sets van primers ontworpen waarmee zowel degenitale HPV typen waarvan de sequentie bekend is, als ookgenitale HPV typen waarvan de sequentie nog niet bekend is,kunnen worden gedetecteerd en waarbij de daaraan inherentemismatches tot maximaal 4 basen toch in de PCR geaccepteerdworden. Om de nieuwe primer sets goed te laten werken verdienthet echter wel sterke aanbeveling om in vergelijking tot destandaard PCR enigszins gewijzigde PCR condities aan te houden,met name wat de Mg2+ concentratie en de annealing temperatuurbetreft.

De uitvinding betreft op de eerste plaats een primer voorgebruik in een polymerase chain reactie (PCR) ter amplificatie van DNA van genitale humane papilloma virus (HPV) genotypen,bestaande uit een oligonucleotide dat aan het 3'-uiteinde éénvan de hierna volgende sequenties: 51-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3’ 51-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3' 5 *-TGGTACAATGGGCATATGAT-3' 5'-AATGGCTTTTGGAATTTACA-3' of een sequentie, die voor ten minste 75%, bij voorkeur voor tenminste 90% met één van deze vier sequenties homoloog is, omvat.

Primers volgens de uitvinding hebben een lengte van ten\ minste 20 basen of nucleotiden. Om vooral praktische redenenzullen de primers bij voorkeur echter niet langer zijn dan 40nucleotiden. De relatief kortere primers, zoals die uit precies20 basen, kunnen gemakkelijker met een goede opbrengst wordenbereid; de relatief langere primers (d.w.z. primers met een vande hierboven weergegeven sequenties aan het 3'-uiteinde en eenuitbreiding aan het 5'-uiteinde) blijken daarentegen in de PCRefficiënter te werken.

De voorkeur heeft volgens de uitvinding een primer voorgebruik in een PCR ter amplificatie van DNA van genitale HPVgenotypen, bestaande uit een oligonucleotide met een lengte van20-40 nucleotiden dat aan het 3'-uiteinde één van de hiernavolgende sequenties: 51-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3' 5'-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3' 5'-TGGTACAATGGGCATATGAT-315'-AATGGCTTTTGGAATTTACA-3'omvat.

De hierboven weergegeven sequenties bestaan uit 20 basen ofnucleotiden. De uitvinding omvat, zoals gezegd, de mogelijkheiddat de primers een lengte van precies 20 basen hebben en dus uitdeze specifieke sequenties bestaan. Dergelijke primers zijn éénvan de voorkeursuitvoeringsvormen volgens de uitvinding: zebestaan dus uit één van de volgende, precies 20 nucleotidenlange oligonucleotiden: 5'-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3' (GP 5) 5'-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3' (GP 6) 5'-TGGTACAATGGGCATATGAT-3' (GP1) 5'-AATGGCTTTTGGAATTTACA-3' (GP2).

De primers mogen evenwel aan het 5'- uiteinde uitgebreidzijn met additionele sequenties, waarbij met name primers meteen lengte van meer dan 20 nucleotiden de voorkeur hebben, welkeaan het 5'-uiteinde één of meer restrictie-enzym herkennings-sequenties omvatten. Enkele voorbeelden van dergelijkegeprefereerde primers volgens de uitvinding zijn de hiernavolgende, 29 nucleotiden lange oligonucleotiden: 5'-ACAGGATCCTTTGTTACTGTGGTAGATAC-3' (B-GP5) 5'-ACAGGATCCGAAAAATAAACTGTAAATCA-3' (B-GP 6) 5'-ACAGAATCCTTTGTTACTGTGGTAGATAC-3' (E-GP5) 5'-ACAGAATCCGAAAAATAAACTGTAAATCA-3' (E-GP 6) 5'-ACAAAGCTTTTTGTTACTGTGGTAGATAC-3' (H-GP5) 5'-ACAAAGCTTGAAAAATAAACTGTAAATCA-3' (H-GP 6) 5 '-ACAGGATCCTGGTACAATGGGCATATGAT-3· (B-GP1) 5'-ACAGGATCCAATGGCTTTTGGAATTTACA-3' (B-GP2) 5'-ACAGAATCCTGGTACAATGGGCATATGAT-3' (E-GP1) 5'-ACAGAATCCAATGGCTTTTGGAATTTACA-3' (E-GP2) 5'-ACAAAGCTTTGGTACAATGGGCATATGAT-3' (H-GP1) 5'-ACAAAGCTTAATGGCTTTTGGAATTTACA-3' (H-GP2).

De primers worden in de praktijk als paren toegepast. Eenprimerpaar volgens de hier beschreven uitvinding bestaat uit eeneerste oligonucleotide, dat aan het 3'-uiteinde de sequentie5’-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3', of een sequentie, die voor tenminste 75% (bij voorkeur ten minste 90%) met deze sequentiehomoloog is omvat, en een tweede oligonucleotide, dat aan het3'-uiteinde de sequentie 5'-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3', of een sequentie, die voor tenminste 75% (bij voorkeur ten minste 90%) met deze sequentiehomoloog is omvat, dan wel bestaande uit een eerste oligonucleotide, dat aan het3'-uiteinde de sequentie 5'-TGGTACAATGGGCATATGAT-31, of een sequentie, die voor tenminste 75% (bij voorkeur ten minste 90%) met deze sequentiehomoloog is omvat, en een tweede oligonucleotide, dat aan het3'-uiteinde de sequentie 5'-AATGGCTTTTGGAATTTACA-3', of een sequentie, die voor tenminste 75% (bij voorkeur ten minste 90%) met deze sequentiehomoloog is omvat.

Meer in het bijzonder gaat volgens de uitvinding voorkeuruit naar een primerpaar, bestaande uit een eerste, 20-40 nucleotiden lang oligonucleotide, dat aan het3'-uiteinde de sequentie 5'-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3’ omvat, eneen tweede, 20-40 nucleotiden lang oligonucleotide, dat aan het3'-uiteinde de sequentie 5'-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3' omvat, dan wel bestaande uit \ een eerste, 20-40 nucleotiden lang oligonucleotide, dat aan het3'-uiteinde de sequentie 5'-TGGTACAATGGGCATATGAT-31 omvat, eneen tweede, 20-40 nucleotiden lang oligonucleotide, dat aan het3'-uiteinde de sequentie 5'-AATGGCTTTTGGAATTTACA-3' omvat.

Hierbij gaat bijzondere voorkeur uit naar een dergelijkprimerpaar, bestaande uit hetzij het oligonucleotidenpaar 51-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3* (GP5), en 5'-GAAAAATAAACTGTAAATCA-31 (GP 6) hetzij bestaande uit het oligonucleotidenpaar5'-TGGTACAATGGGCATATGAT-3' (GP1), en 5'-AATGGCTTTTGGAATTTACA-3' (GP2).

Verder gaat ook voorkeur uit naar primerparen, waarbij elkvan beide oligonucleotiden meer dan 20 nucleotiden lang is enaan het 5‘-uiteinde één of meer restrictie-enzym herkennings-sequenties omvat. Dergelijke aan het 5'-uiteinde verlengdeprimerparen blijken, zoals hierboven is opgemerkt, tot eenefficiëntere general primer (GP)-PCR te leiden. Voorbeelden vandergelijke primerparen zijn de volgende oligonucleotidenparen:Res GP LI 51-ACAGGATCCTTTGTTACTGTGGTAGATAC-3' (B-GP5), en 5'-ACAGGATCCGΑΑΆΑΑΤAAACTGTAAATCA-3 * (B-GP 6); 5'-ACAGAATCCTTTGTTACTGTGGTAGATAC-3' (E-GP5), en 5'-ACAGAATCCGAAAAATAAACTGTAAATCA-3' (E-GP 6); 5'-ACAAAGCTTTTTGTTACTGTGGTAGATAC-3' (H-GP5), en 5'-ACAAAGCTTGAAAAATAAACTGTAAATCA-3' (H-GP 6);

Res GP El 5'-ACAGGATCCTGGTACAATGGGCATATGAT-3' (B-GP1), en 51-ACAGGATCCAATGGCTTTTGGAATTTACA-3' (B-GP 2); 5'-ACAGAATCCTGGTACAATGGGCATATGAT-3' (E-GP1), en 5'-ACAGAATCCAATGGCTTTTGGAATTTACA-3 * (E-GP2); 5'-ACAAAGCTTTGGTACAATGGGCATATGAT-3' (H-GP1), en 5'-ACAAAGCTTAATGGCTTTTGGAATTTACA-3' (H-GP2).

Hierin duidt B op een BamHl site, E op een EcoRl site, en Hop een HindlII site.

De primers kunnen aan de 5' kant in principe met alle totnu bekende restrictie sites worden uitgebreid. De BamHl, EcoRlen HindlII sites zijn hier slechts als voorbeeld gekozen omdatze de meest gangbare kloneringssites zijn.

Deze Res primers hebben nog een extra voordeel doordat deamplimeren die bij een Res GP-PCR worden verkregen, gemakkelijkgekloneerd kunnen worden, bijv. in het plasmide pBR322 en indaarvan afgeleide plasmiden zoals p.Gemini vectoren. Hierdoorkunnen de amplimeren geschikt worden gemaakt voor conventioneledubbelstrengs sequencing (kloneringscapaciteit van 100 bp totmeerdere kb). Ook kunnen de amplimeren in de faag M13 (mp 18 en19) worden gekloneerd voor enkelstrengs sequencing (klonerings¬capaciteit 100-500 bp). Door snelle ontwikkelingen op het gebiedvan sequencing technieken behoort direct sequencing van deamplimeren ook tot de mogelijkheden. Direct sequencing van deamplimeerprodukten lijkt zelfs de beste identificatie voor hetvirus. Res GP-PCR condities zijn identiek aan de hierin eerderbeschreven condities. Met Res primers is het inmiddels gelukt omde PCR produkten van HPV 30 te analyseren.

De uitvinding wordt verder belichaamd in een werkwijze voorhet onderzoeken van een monster, zoals een baarmoederhalsuitstrijk, op de aanwezigheid daarin van genitale humanepapilloma virus (HPV) genotypen door het eventueel in hetmonster aanwezige DNA van een genitaal HPV door middel van eenpolymerase chain reactie (PCR) te amplificeren en vervolgens tedetecteren, waarbij in de PCR een primerpaar volgens deuitvinding, zoals hierboven gedefinieerd, wordt toegepast.

Het heeft daarbij volgens de uitvinding de voorkeur dattijdens de primer annealing stap een temperatuur van 30-50°Cwordt toegepast, of liever dat tijdens de primer annealing stapeen temperatuur van 35-45°C, liefst van 38-42°C wordt toegepast.

Voorts heeft het volgens de uitvinding de voorkeur dat eenMg2+ concentratie van 2-10 mM wordt toegepast, of liever nog dateen magnesiumionen (Mg2+) concentratie van 2,5-5 mM, liefst van3,0-4,0 mM wordt toegepast.

De optimale PCR condities zijn bepaald door middel vanproeven, waarbij een 14-tal verschillende moleculair gekloneerdeHPV genotypen (pHPv'la, 2a, 6b, 8, 11, 13, 16, 18, 30, 31, 32,33, 45, 51) en controle pBR322 DNA als target werden gebruikt inde GP-PCR. Bij een annealing temperatuur van 40°C (normaal 58°C)en een Mg2+ concentratie van 3,5 mM (normaal 1,5 mM Mg2+) werdende optimale resultaten verkregen. Deze condities worden bijvoorkeur toegepast omdat daarmee de uiterste gevoeligheid uit demethode gehaald wordt (1 tot 100 HPV DNA moleculen per monster).Hierdoor kan op de vraag naar de aanwezigheid of afwezigheid vande biologisch meest belangrijke HPV typen een positief antwoordworden verkregen. Vals negatieve uitslagen kunnen hiermede tothet uiterste worden beperkt. De genoemde condities (3,5 mM Mg2+en 40°C annealing temperatuur) zijn dan ook sterk aan te bevelenals standaard condities bij een massascreening op genitale HPVtypen met de algemene HPV primers volgens de uitvinding.

Met de nieuwe primersets volgens de uitvinding kunnen naastde genitale HPV typen 6, 11, 16, 18, 31 en 33, waarvan reeds desequentie bekend is, ook de HPV typen 13, 30, 45 en 51 waarvande sequentie (nog) onbekend is, en naar alle waarschijnlijkheidook nieuwe HPV typen worden gedetecteerd.

In verband met het grote belang van een screening op HPVgenotypen in cervix uitstrijken is voorts een algemene strategievoor de screening van cervix uitstrijkjes opgezet, die gebaseerdis op het gebruik van HPV general primers volgens de uitvindingin combinatie met de eerder beschreven HPV type-specifieke anti-contaminatie primers. Deze nieuw ontworpen PCR strategie, dievan general primers en HPV genotype-specifieke anticontaminatieprimers gebruik maakt, verloopt als volgt.

Voorbewerking cervix . .uit.atxi ik

Cervix uitstrijken worden in 5 ml fosfaatgebufferde zout¬oplossing (PBS) met 0,05% merthiolaat gebracht. De celsuspensiewordt 10 min. bij 3000 rpm gecentrifugeerd (bijv. in een Hettichcentrifuge). De celpellet wordt 1 keer gewassen in PBS enuiteindelijk geresuspendeerd in 1 ml PBS en tot gebruik bewaardbij -20°C.

Bij experimenten aan 60 uitstrijken, waarbij de resultatenvan een GP-PCR aan ingevroren en ontdooide celsuspensies zijn vergeleken met de resultaten van een GP-PCR aan DNA, dat uit \ dezelfde monsters was geïsoleerd, is gebleken dat de GP-PCR aanmonsters die een vries/dooi behandeling hadden ondergaan evenveel positiviteit opleverde als de GP-PCR aan het geïsoleerdeDNA. Dit heeft grote consequenties. De GP-PCR kan sneller wordenuitgevoerd doordat de voorbehandelingsstappen, samenhangend metDNA extractie, kunnen worden weggelaten. Een nog belangrijkervoordeel is dat de monster op monster contaminatie, die bij DNAisolatie van een grotere serie monsters veelvuldig gesignaleerdwordt, kan worden uitgesloten. Vals positieve resultaten wordendaardoor voorkomen.

De voorbereiding van de monsters voor de PCR bestaat bijvoorkeur uit ontdooien van 1 ml celpellet, goed vortexen tot eenhomogene suspensie is verkregen, pipetteren (liefst met specialepipetten met vervangbare zuigers en pipetpuntjes, zoals het typeMicroman, Gilson, Frankrijk) van 10 μΐ suspensie, opkokengedurende ca. 10 min. in een gesloten vaatje, afcentrifugerenvan condens (bijv. in een Hettich centrifuge) en toevoegen vaneen GP-PCR reactiemengsel.

Uitvoering GP-PCR

Men bereidt een totaal reactiemengsel van 50 μΐ bestaandeuit 10 μΐ celsuspensie; 50 mM KC1; 10 mM Tris HC1 buffer pH 8,3;0,01% (w/v) gelatine; 200 μΜ van elke dNTP; 3,5 mM MgCl2; 50 pmolvan een GP primerset volgens de uitvinding en 1 unit Taq DNApolymerase. Men brengt een laagje paraffine olie aan (1 druppel)en incubeert 5 min. bij 94°C voor de initiële DNA denaturatie.Daarna voert men 40 cycli (in een PCR processor) uit, bestaandeuit 1 min. bij 94°C (denaturatie), 2 min. bij 40°C (annealing), 1,5 min. bij 72°C (polymerisatie). De laatste polymerisatie staplaat men 4 min. langer duren.

Analyse PCR reactieorodukten

Na 40 cycli analyseert men 10 μΐ van het PCR mengsel viaagarose gel elektroforese. Na deze elektroforese worden de DNAfragmenten overgebracht op een nylon membraan (blotting) en meteen algemene HPV probe gehybridiseerd. Zo'n algemene HPV probekan bijv. bestaan uit GP-PCR specifieke amplificatie produktenvan gekloneerde HPV 6, 11, 16, 18, 31 en 33. Deze amplimeren kunnen worden geïsoleerd uit laagsmeltende agarose, samengevoegd \ en gelabeld met bijv. de standaard labeling methode van randomprimer labeling. De membranen worden (overnacht) gehybridiseerdbij Tm-33. Na wassen met 3 x SSC, 0,5% SDS bij 55°C volgt (eenovernacht uitgevoerde) autoradiografie.

De GP-PCR positieve en twijfelachtig positieve (heel zwakkesignalen) monsters worden nu nagescreend met een HPV type-specifieke PCR onder toepassing van anticontaminatie primers omspecifieke gesekwenste HPV genotypen te identificeren. In de dannog overblijvende GP-PCR positieve uitstrijken kunnen HPV typen,waarvan de sequentie (nog) onbekend is, of nieuwe HPV typenvoorkomen die bijv. via dot blot analyse worden bepaald. Dezelaatste dot blot analyse zal in de toekomst steeds minder vaaknodig zijn naarmate meer HPV typen gesekwenst zijn en voor detype-specifieke (TS) PCR in aanmerking komen.

Deze nieuwe strategie laat een screening van uitstrijkentoe met de meest gevoelige HPV detectie methode, waarbij de aancontaminatie te wijten problemen tot een minimum kunnen wordenteruggebracht en een snel en betrouwbaar antwoord kan wordengegeven op de vraag of er al dan niet HPV in een uitstrijkaanwezig is.

De uitvinding zal verder aan de hand van de hiernavolgendevoorbeelden nader worden toegelicht.

VOORBEELDEN

celcultures. weefselmonster.s en HPV clones

Gebruikt werden de humane baarmoederhals kankercellijnenCaSki, Siha, C4-1 en HeLa 229. De eerste twee bevatten HPV type16, de andere twee bevatten HPV type 18 (Boshart et al., 1984;Schwarz et al., 1985; Yee et al., 1985). De cellen werdengekweekt in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium, aangevuldmet 10% foetaal kalfsserum. Na groei tot bijna confluentiewerden cellen geoogst door trypsinisatie, gewassen met fosfaat-

N

gebufferde zoutoplossing, afgedraaid en vervolgens gesuspendeerdin 1 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5.

Weefselmonsters van een laryngeale plaveiselcel hyperplasieen een juveniele papilloma werden na snel invriezen bewaard tothun gebruik in vloeibare stikstof. Hun verdere behandeling en deDNA extractie werden uitgevoerd volgens standaard procedures(Walboomers et al., 1988). Baarmoederhals uitstrijken werdenbehandeld op de wijze zoals beschreven door van den Brule etal., 1989). De aanwezigheid van HPV DNA in deze monsters werdbepaald door Southern blot hybridisatie en PCR met HPV typen 6-,11-, 16-, 18- en 33-specifieke primers, zoals eerder beschreven(van den Brule et al., 1989).

DNAs van verschillende HPV typen, gekloneerd in pBR322 ofin pUC19 (pHPVs) werden als targets gebruikt in een modelsysteemvoor een door general primers gestuurde amplificatie. Naast eenaantal niet-genitale pHPVs werden de gekloneerde genitale HPVtypen 6b, 11, 13, 16, 18, 30, 31, 32, 33, 39, 45 en 51 gebruikt.

Polvmerase -Chain reactie

Met een kleine modificatie werd de PCR methode, beschrevendoor Saiki et al., 1988, toegepast. De PCR werd uitgevoerd aan1 ng DNA van gekloneerde pHPVs of aan 100-500 ng van cellulairDNA. Voorts werden ook verdunningen van verschillende pHPV DNAsin 100 ng humaan placenta DNA of verdund Siha DNA aan de PCRonderworpen om de gevoeligheid van de assay te bepalen. Hetreactiemengsel van 50 μΐ bevatte ook 50 mM KC1, 10 mM Tris-HClpH 8,3, 0,01% (w/v) gelatine, 2Ö0 μΜ van elke dNTP, MgCl2 in een concentratie tussen 1,5 en 10 mM, 1 unit van een thermostabielDNA polymerase (Thermus aquaticus, Cetus) en 50 pmol van elkeprimer van het GP-5/GP-6 primerpaar 5'-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3' (GP 5) en 5'-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3' (GP 6) .

Het mengsel werd bedekt met enkele druppels paraffine olieen 5 min. bij 94°C geïncubeerd om het DNA te denatureren, waarna40 cycli van amplificatie werden uitgevoerd m.b.v. een PCRprocessor (Biomed). Elke cyclus omvatte een denaturerings-stapvan 1 min. bij 94°C, een annealings-stap van 2 min. bij 40°C eneen ketenverlengings-stap van 1,5 min. bij 72°C. Om de volledigelengte van het geamplificeerde DNA te verzekeren werd elkeindividuele ketenverlengings-stap met 1 sec. verlengd en delaatste ketenverlengings-stap werd met nog eens 4 min. verlengd.Om verontreiniging door gekloneerd pHPV DNA of PCR produkten teverhinderen werden verschillende stappen zoals de bereidingenvan de monsters en de amplificatie reacties in streng gescheidenruimten uitgevoerd. Als negatieve controles werden gedestilleerdwater bevattende monsters gebruikt, die geen van alle eengeslaagde amplificatie vertoonden. Van elk van de PCR mengselswerd uiteindelijk in totaal 10 μΐ door agarose gel elektroforesegeanalyseerd.

Southern blot analyse van PCR produkten

Elektroforetisch gescheiden DNA fragmenten werden op nylonmembranen overgebracht (GeneScreen Plus; DuPont) door diffusieblotting in 0,5 M NaOH, 0,6 M NaCl. GP-5/GP-6 gestuurde, HPV-specifieke PCR produkten werden als probes gebruikt na labelingmet 32P volgens de random priming methode. Hybridisatie werduitgevoerd bij 65°C (Tm-23°C, voor hoog-stringente analyse) of55°C (Tm-33°C, voor laag-stringente analyse) in 0,5 M natrium-fosfaat pH 7,4, 7% SDS, 1 mM EDTA gedurende 16 uur. Daarna werdgewassen bij hoge (Tm) resp. lage (Tm-33°C) stringentie in 0,1 xSSC (1 x SSC is 0,15 M NaCl en 0,015 M natriumcitraat), 0,5% SDSbij 65°C, resp. 3 x SSC, 0,5% SDS bij 56°C. Autoradiografie werdgedurende een dag bij -70°C uitgevoerd met Kodak Royal X-Omatfilm en versterkingsschermen.

restrietie-enzymanalvse

Analyse van PCR produkten door behandeling met restrictie-endonuclease werd direct aan een 10 μΐ monster van het reactie-mengsel uitgevoerd, zonder voorafgaand zuiveren en resuspenderenvan het DNA in de aanbevolen restrictie buffer (Carman & Kidd,1989). Er werden 2 eenheden van Rsal (Boehringer) toegevoegd enmen liet dit 2 uur bij 37°C inwerken. De verkregen produktenwerden geanalyseerd op samengestelde gels uit 3% NuSieve agarose(FMC Bioproducts) en 1% type 1 agarose (Sigma) om een goede scheiding van DNA fragmenten met laag molecuulgewicht te \ verkrijgen.

dot blot analy&a

Voor dot blot analyse werden 1 μg pHPV DNA en pBR322 vectorDNA op nylon membranen (GeneScreen Plus; DuPont) aangebracht.

Als probes werden HPV-specifieke amplificatie produkten van 140tot 150 bp gebruikt. De fragmenten werden elektroforetisch inlaagsmeltende agarose (Bio-Rad) gescheiden, uit de gel gesnedenen direct door random primed labelling gelabeld. De hybridisatiewerd onder hoge stringentie uitgevoerd, zoals hierboven werdbeschreven. Daarna werd gewassen bij hoge stringentie (Tm)aflopend tot 0,1 x SSC, 0,5% SDS bij 65°C. Autoradiografie werdgedurende een dag bij -70°C uitgevoerd met versterkingsschermen.

computer analyse en primer synthese

Alle matrix, homologie en restrictie-site analyses werdenuitgevoerd met het Microgenie sequentie analyse programma[GenBank (Release No. 54), Beekman] ontwikkeld door Queen &

Korn, 1984.

De primers werden gesynthetiseerd op een DNA synthesizer(Applied Biosystems 380A) via de methoxy-fosforamidiet methode.

resultaten

Gebaseerd op de bij een matrix vergelijking van HPV typen,waarvan de sequentie bekend is, waargenomen homologie in delenvan de El en LI open leesramen werden twee paren van oligomerenontworpen die als general primer bruikbaar zouden kunnen zijn.

In de onderstaande tabel A wordt de mate van overeenstemming vande primers GP-5 en GP-6 met bepaalde gebieden in het DNA (in hetLI open leesraam) van de verschillende HPV typen getoond.

lafr.el.A

GP-5 51 -T-TTGTTACTGTGGTAGmC-3' aantal mismatches HPV-6b 0 HPV-11 0 HPV-16 . ..........T..T..... 2 \ HPV-18 0 HPV-31 0 HPV-33 0 GP-6 51 -GAMMTMACTGTMATCft-31 aantal mismatches HPV-6b ..........T......... 1 HPV-11 0 HPV-16 0 HPV-18 . ............C...... 1 HPV-31 ____T______T......... 2 HPV-33 ......C........G____ 2

In deze tabel A duiden de punten op identieke basen;mismatches zijn specifiek aangegeven. De nucleotide posities vande eerste nucleotiden van de op GP-5/GP-6 passende sequentieszijn als volgt:

In de onderstaande tabel B wordt de mate van overeenstem¬ming van de primers GP-1 en GP-2 met bepaalde gebieden in het DNA (in het El open leesraam) van de verschillende HPV typengetoond.

Tabel—B

GP-1 5'-TGGTACAATGGGCATATGAT-3' GP-2 5'-AATGGCTTTTGGAATTTACA-3*

Het algemene primerpaar GP-5/GP-6 werd gebruikt in een PCRaan 1 ng DNA van verschillende pHPVs, waarbij matig-stringentecondities (3,5 mM Mg2+) werden gebruikt. De PCR produkten werdengedetecteerd door elektroforese, u.v. belichting en ethidiumbromide kleuring. De resultaten (hier niet getoond) waren, datniet alleen de HPV typen 6b, 11, 16, 18, 31 en 33 met een reedsbekende sequentie, maar ook de HPV typen 13, 30, 32, 45 en 51waarvan de sequentie nog niet bekend is, PCR produkten van zo'n140 tot 150 bp gaven. In het geval van de niet-genitale HPVtypen la, 2a en 8 leidde het primerpaar GP-5/GP-6 niet tot DNAamplificatie, evenmin als bij controle DNA, bestaande uit HinfIfragmenten van pBR322. De PCR produkten waren derhalve HPV-specifiek en niet het gevolg van een kruisreactie met vector-sequenties. In enkele gevallen werd ook geamplificeerd DNA metlager (40 tot 45 bp) en hoger molekuulgewicht waargenomen, nl.in het geval van HPV-18, HPV-30 en HPV-32 DNA. De kleinere DNAfragmenten lijken te zijn ontstaan door ligatie en amplificatievan de primers. De grotere DNA fragmenten waren waarschijnlijkhet resultaat van primer annealing aan verdere target sequentiesbinnen het HPV genoom.

Om het toelaatbare aantal mismatches tussen de primersequenties en het target DNA te bepalen werd de PCR onderverschillend stringente condities uitgevoerd door de Mg2+concentratie te variëren, nl. 1,5, 2,5, 3,5 en 10 mM MgCl2- Deresultaten (hier niet getoond) waren dat 2 en 3 mismatchestussen primer en target DNA geaccepteerd werden. Het primerpaarGP-5/GP-6 reageerde met HPV-16 en HPV-33 onder zowel hoog-stringente als onder laag-stringente condities. Mede aan de handvan een gelijktijdig uitgevoerd onderzoek aan algemene primers voor niet-genitale HPVs werd duidelijk, dat 4 mismatches ook \ toelaatbaar zijn indien laag-stringente condities wordenaangewend. PCR met het primerpaar GP-5/GP-6 aan DNA van hetgenitale HPV-type 30, waarvan de sequentie nog onbekend is, gafaanleiding tot zwakke signalen, die bij lager-stringentecondities sterker werden. Laag-stringente condities (10 mM Mg2+)in de annealing stap leidden echter tevens tot een toename vanmee-geamplificeerde DNA fragmenten.

De gevoeligheid van de GP-gestuurde PCR werd bepaald dooreen onderzoek met verschillende concentraties van pHPV DNA enSiha (HPV-16) DNA, verdund in humaan placenta DNA. De HPV-30 enHPV-33 DNA concentraties varieerden van 1 ng tot 0,01 fg. SihaDNA, verdund in 100 ng humaan placenta DNA, werd gebruikt inhoeveelheden van 10 ng tot 1 pg. Annealing geschiedde ondermatig-stringente condities (3,5 mM Mg2+) . Hybridisatie vanSouthern blots geschiedde onder hoog-stringente condities met GPPCR-geamplificeerde probes, specifiek voor het desbetreffendeHPV type (HPV in het geval van Siha DNA). De resultaten (hierniet getoond) waren dat voor pHPVs, die tot 3 mismatches met deprimers vertoonden, een detectieniveau, zoals vastgesteld nahybridisatie van de PCR produkten met een GP-geamplificeerdehomologe DNA probe, van 0,1 tot 1 fg DNA werd gevonden, datcorrespondeert met ca. 7 tot 70 virale genomen. Voor HPV-30 werdeen detectieniveau tussen 10 fg en 1 pg pHPV DNA vastgesteld,corresponderend met zo’n 700 tot 70 000 virale kopieën. Siha DNAkon reeds bij 10 pg worden gedetecteerd. Aannemende dat Sihacellen 1-10 kopieën van HPV-16 DNA per genoom bevatten en dateen humane diploïde cel ca. 5 pg DNA bevat, kan hieruit worden afgeleid dat 2 tot 20 kopieën van HPV-16 gedetecteerd kondenworden.

De type specificiteit van de PCR werd bepaald door dot blotanalyse. Hiertoe werden met het primerpaar GP-5/GP-6 verkregenPCR produkten van zo'n 140 tot 150 bp geïsoleerd, gelabeld engehybridiseerd onder hoog-stringente condities tegen een panelvan pHPV DNA dots. Uit de (hier niet getoonde) resultaten bleekdat de PCR produkten type-specifiek waren en niet afkomstigwaren van contaminatie met andere HPV typen. Verdere analyse door behandeling met het restrictie-enzym Rsal bevestigde de \ specificiteit van de PCR.

De GP-PCR werd ook onder toepassing van het primerpaarGP-5/GP-6 getest op DNAs van baarmoederhals kankercellijnen,baarmoederhals uitstrijken en laryngeale laesies, die doorSouthern blot analyse en PCR met HPV type-specifieke primers(van den Brule et al., 1989) goed gekarakteriseerd waren. De PCRprodukten werden zowel door elektroforese, u.v. belichting enethidium bromide kleuring, als ook door blotten en hybridisatieonder laag-stringente condities met een geamplificeerd HPV type16-specifiek PCR produkt zichtbaar gemaakt. De resultaten (hierniet getoond) waren dat na agarose gel elektroforese meestalduidelijk meerdere banden konden worden waargenomen en dat eenduidelijk onderscheid in detectieniveau kon worden vastgesteldtussen hoge en lage kopie-aantallen van een bepaald HPV type.

Uit het DNA van de CaSki cellijn, die meer dan 500 kopieën vanHPV-16 per cel bevat, werd een HPV-specifiek PCR produkt gevormddat na elektroforese als een sterke, goed zichtbare bandverscheen. Daarentegen verscheen het HPV produkt van de cellijnSiha met een laag HPV kopie-aantal (1 tot 10 kopieën van HPV-16per cel) als een zwak signaal. Bovendien werden bij gebruik vanSiha DNA als target ook een aantal andere banden verkregen,waarbij het gel-bandenpatroon nauwelijks onderscheiden konworden van dat van humaan placenta DNA of van dat van eenbaarmoederhals uitstrijk die voor een breed spectrum van HPVsnegatief was. Identieke resultaten werden gevonden met de HPV-18bevattende HeLa cellijn (10 tot 50 kopieën van HPV-18 per cel)en C4-1 (1 tot 5 kopieën van HPV-18 per cel), alsmede met een van de baarmoederhals uitstrijken, een laryngeale papilloma (meteen hoge concentratie van HPV-6 DNA) en een hyperplasie (met eenlage concentratie van HPV-6 DNA). Voor baarmoederhals uitstrij¬ken met HPV-33, HPV-11, HPV-16 en HPV-18 DNA werden eveneens PCRprodukten gevonden. Na blotten en laag-stringente hybridisatiemet een m.b.v. GP-5/GP-6 geamplificeerde DNA probe, specifiekvoor HPV-16, konden alle HPV-specifieke fragmenten van 140-150bp worden gedetecteerd zonder dat de verdere banden stoorden.

Mede op grond van hier niet verder beschreven proeven kon samenvattend worden vastgesteld, dat de PCR techniek met als \ primers de general primerparen GP-l/GP-2 en GP-5/GP-6 in staatwas om de gekloneerde HPV typen 6, 11, 13, 16, 18, 30, 31, 32,33, 45 en 51 te amplificeren.

diagnostisch onderzoek

Om de feitelijke bruikbaarheid van de primers en de daaropgebaseerde PCR te testen werden baarmoederhals uitstrijken van196 vrouwen (leeftijd variërend van 16 tot 60 jaar) met eenbreed scala van gynaecologische klachten onderzocht. Eerst werdeen uitstrij.k voor routine cytologisch onderzoek gemaakt. Deuitstrijken werden ingedeeld volgens een licht gemodificeerdePap klassificatie (Vooijs, 1987). Voor HPV detectie werd hetresterende materiaal van de eerste spatel en van een tweedeuitstrijk in 5 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met0,05% merthiolaat gebracht. De uitstrijken werden aan energiekevortexing onderworpen en de suspensie werd 10 min. met 3000 rpmgecentrifugeerd. De cellen werden geresuspendeerd in 1.0 ml PBS,waarvan 0,5 ml voor DNA extractie (Maniatis et al., 1982) en HPVdetectie werd gebruikt.

Snel ingevroren weefsels van 21 invasieve baarmoederhalsplaveiselcelcarcinoma’s werden op rij in plakken gesneden op eencryostaat. De eerste en laatste plakken werden met hematoxyline-eosine gekleurd en histologisch geanalyseerd op de aanwezigheidvan neoplastische cellen. DNA van de overige plakken werd geïso¬leerd volgens standaard procedures (Walboomers et al., 1988).

HPV detectie

De HPV detectie geschiedde aan elk monster volgens drieverschillende PCR procedures, alle gebaseerd op de methode vanSaiki et al., 1988. De hierboven beschreven HPV general primersets GP-l/GP-2 en GP-5/GP-6 werden toegepast in GP-PCRs aanbaarmoederhals uitstrijken en biopsieën. Een mengsel van HPV 6,11, 16, 18, 33 specifieke "anti-contaminatie" primers, welke deplasmide-kloneringsplaatsen flankeren om amplificatie vaneventueel contaminerende gekloneerde HPV typen te voorkomen (zievan den Brule et al., 1989) werd gebruikt voor type-specifiekePCRs (TS-PCR). Voor de onlangs gesekwenste HPV type 31 werdenals specifieke kloneringsplaats-flankerende primers gebruikt deoligonucleotiden 5'-ATGGTGATGTACACAACACC-3' (HPV 31.1) en5'-GTAGTTGCAGGACAACTGAC-3' (HPV 31.2). Alle primers werden opeen Pharmacia LKB Gene Assembler Plus gesynthetiseerd volgens demethoxy-fosforamidiet methode.

De GP-PCRs werden uitgevoerd op de hierboven beschrevenwijze. De HPV target sequenties werden geamplificeerd in 50 μΐreactiemengsel, dat 100-500 ng van het gezuiverde DNA bevatte,evenals 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,01% (w/v) gelatine,200 μΜ van elke dNTP, 3,5 mM MgCl2, 1 unit van een thermostabielDNA polymerase (Thermus aquaticus, Cetus) en 50 pmol van een vande primersets GP-l/GP-2 en GP-5/GP-6. Om een efficiënte enreproduceerbare amplificatie te bevorderen werd een mengsel vande componenten gemaakt voordat het DNA werd toegevoegd.

Zoals hierboven is beschreven werd het mengsel bedekt metenkele druppels paraffine olie (om verdamping tegen te gaan) enwerd 5 min. bij 95°C geïncubeerd om het DNA te denatureren,waarna 40 cycli van amplificatie werden uitgevoerd m.b.v. eenPCR processor (Biomed). Elke cyclus omvatte een denaturerings-stap van 1 min. bij 94°C, een annealings-stap van 2 min. bij40°C en een ketenverlengings-stap van 1,5 min. bij 72°C. Om devolledige lengte van het geamplificeerde DNA te verzekeren werdelke individuele ketenverlengings-stap met 1 sec. verlengd en delaatste ketenverlengings-stap werd met nog eens 4 min. verlengd.Van elk reactiemengsel werd ten slotte 10 μΐ door 1,5% agarosegel elektroforese geanalyseerd.

De TS-PCRs werden op dezelfde wijze uitgevoerd, behalve dat1,5 mM MgCl2, 25 pmol van elke primer en een annealing tempera¬tuur van 55°C werden toegepast.

Southern blot analyse van PCR orodukten

Het DNA werd van de gel overgebracht op een nylon membraan(Biotrace, Gelman Sciences, Ü.S.A.) door diffusie blotting over¬nacht in 0,5 N NaOH, 1,5 M NaCl. Vervolgens werd het membraanmet 2 x SSC verzadigd. De TS-PCR produkten werden geanalyseerd met HPV type-specifieke interne oligonucleotiden zoals \ beschreven door van den Brule et al., 1989. De analyse van deGP-PCR produkten werd uitgevoerd met HPV type-specifieke PCRamplificatie produkten als probe. De GP-PCR specifieke ampli¬ficatie produkten van gekloneerde HPV typen 6, 11, 16, 18 en 33werden elektroforetisch gescheiden in laagsmeltende agarose(BioRad, Ü.S.A.), uit de gel gesneden en direct gelabeld doorrandom primer labeling.

De membranen werden 2 uur bij 65°C geïncubeerd in eenprehybridisatie oplossing (0,5 M natriumfosfaat pH 7,4, 7% SDS, 1 mM EDTA). Hybridisatie werd uitgevoerd bij 55°C onder laag-stringente condities (Tm-33°C) met [a-32P] dCTP random primergelabelde PCR produkten van HPV 6, 11, 16, 18 en 33 voor dedetectie van homologe HPV sequenties op de wijze zoals hierbovenis beschreven. Daarna werd gewassen bij lage stringentie(Tm-33°C) tot 3 x SSC, 0,5% SDS bij 55°C. Verder werd gewassenbij hoge stringentie (Tm) tot 0,1 x SSC, 0,1% SDS bij 65°C om deoverige HPV type-specifieke signalen te vinden. Autoradiografiewerd gedurende een nacht tot 3 dagen uitgevoerd met Kodak RoyalX-Omat film en versterkingsschermen.

dot blot. analyse y.an„-ECR gr,paukten

Voor dot blot analyse van GP-PCR monsters die HPV positiefbleken na laag-stringente hybridisatie maar na stringent wassenniet meer positief waren, werden Biotrace nylon membranengebruikt. Aan 40 μΐ van het. PCR produkt werd 20 μΐ van 0,75 NNaOH toegevoegd. Na incubatie gedurende 5 min. bij 100°C enverdunning met 60 μΐ van 0,25 x SSC, werd 12 μΐ van het monster op het membraan aangebracht. De dot blots werden verzadigd met2 x SSC en op de hierboven beschreven wijze gehybridiseerd onderhoog-stringente condities (Tm-23°C) met random primer gelabeldegekloneerde HPV plasmiden of de afgeleide GP-PCR produkten.Daarna werd gewassen bij hoge stringentie (Tm) tot 0,1 x SSC,0,1% SOS bij 65°C.

resultaten

Genomisch DNA van cytologisch normale en dysplastischecellen van baarmoederhals uitstrijken en van biopsieën van s baarmoederhals carcinoma's werd onderworpen aan een PCR met GPEl (primerpaar GP-l/GP-2), GP LI (primerpaar GP-5/GP-6) en TSprimers. Na elektroforese op een 1,5% agarose gel en ethidiumbromide kleuring (de verschillende verkregen plaatjes wordenhier niet getoond) werden PCR produkten gedetecteerd voor zoweluitstrijken die positief waren voor een van de gesekwenste HPVtypen 6, 11, 16, 18 en 33, als voor uitstrijken die nog niet-gesekwenste HPV genotypen bevatten en voor HPV-negatieveuitstrijken. De niet HPV-specifieke cellulaire of virale PCRprodukten zijn een gevolg van de laag-stringente condities,toegepast om in de primer annealing stap mismatches van 4 basentoe te laten. Om echter HPV-specificiteit te bevestigen en degevoeligheid te vergroten werden alle PCR produkten aan Southernblot analyse onderworpen. Bij laag-stringente hybridisatiecondities met gelabelde GP-PCR produkten, afgeleid van degekloneerde HPV typen 6, 11, 16, 18 en 33, waarvan de sequentiebekend is, gevolgd door laag-stringent wassen, konden zowel degesekwenste als de niet-gesekwenste HPV genotypen wordengedetecteerd, terwijl voor de HPV-negatieve monsters geensignalen meer werden gedetecteerd. Na verder wassen onder hoog-stringente condities bleken alleen nog de PCR produkten van HPV6, 11, 16, 18 en 33 zichtbaar te zijn; de signalen van HPV-specifieke produkten afgeleid van homologe genotypen, die nietin het probe mengsel zaten, bleken te zijn verdwenen.

De bovenstaand beschreven specifieke HPV detectie werdbevestigd door een TS-PCR en door verdere hybridisatie met interne oligonucleotide probes, zoals eerder beschreven door vanden Brule et al., 1989.

Alle GP-PCR positieve monsters, welke niet-gesekwenstegenitale HPV genotypen moesten bevatten op basis van hybridisa¬tie resultaten, werden verder onderzocht door dot blot analyse.Als probes werden gekloneerde HPV typen 1, 2, 8, 13, 30, 31, 32,45 en 51 of hun specifieke GP-PCR produkten toegepast. Enkelevan deze HPV types bleken in de baarmoederhals uitstrijkenaanwezig te zijn.

In tabel C wordt een totaal beeld gegeven van de informatiedie de GP-PCR over ïxet voorkomen van HPV typen in de monstersopleverde.

Tabel,. C

1: resultaten van de GP El-PCR èn de GP Ll-PCR.

2: TS-PCR voor HPV typen 6, 11, 16, 18 en 33.

3: carcinoma in situ, zoals bevestigd door histologie4: biopsieën

Uit deze tabel C blijkt dat de TS-PCR slechts 14% van decytologisch normale uitstrijken als HPV-positief beoordeelde,terwijl de GP-PCR volgens de uitvinding tot 25% kwam. In mildeen zware dysplasie werd de HPV detectie door het gebruik van de GP-PCR volgens de uitvinding van 50% naar 80% resp. van 67% naar88% verhoogd. Het gebruik van GP El-PCR en GP Ll-PCR leidde totvergelijkbare percentages.

In tabel D wordt de verdeling van de verschillende HPVtypen getoond.

Tabel D

d1: dubbele infecties; voor Pap I-II (1): HPV 6 en 11; voor Paplila (3): HPV 6 en 33, HPV 16 en 33, en HPV 11 en 18; voor PapIllb (1) en -carcinoma's (2): telkens HPV 16 en 18.

X: HPV X vertegenwoordigt een nieuw, nog niet gesekwenst HPVgenotype.

In de cytologisch normale uitstrijken (Pap I en II) werdenca. 10% niet-gesekwenste HPV typen aangetroffen. In de abnormaleuitstrijken bedroeg dit percentage tot 30%. In beide groepenkwam HPV 16 het meest voor. De niet-gesekwenste HPV-typen kondenworden geïdentificeerd als HPV 13, HPV 30, HPV 31, HPV 45, HPV51 en bovendien nog onbekende HPV genotypen, hier aangeduid alsHPV X. Carcinoma in situ-verdachte uitstrijken bleken eveneensniet-gesekwenste typen te bevatten (30%). In' baarmoederhalscarcinoma's werden echter alleen HPV 16 en 18 gevonden; in dezerelatief kleine groep waren geen ongesekwenste typen aanwezig.

LITERATUUR

Boshart et al., EMBO j. 3, 1151-1157 (1984)

Carman & Kidd, J. Virol. Meth. 23, 277-290 (1989)

Cole & Danos, J. Mol. Biol. 193, 599-608 (1987)

Cole & Streeck, J. Virol. 58, 991-995 (1986)

Dartmann et al., Virology 151, 124-130 (1986)

Goldsborough et al., Virology 171, 306-311 (1989)

Gregoire et al., J. Clin. Microbiol. 27, 2660-2665 (1989)Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)Manos et al., Cancer Cells 7, 209-214 (1989)

Queen & Korn, Nucl. Ac. Res. 12, 581-599 (1984)

Saiki et al., Science 239, 487-491 (1988)

Schwarz et al., EMBO J. 2, 2341-2348 (1983)

Schwarz et al., Nature, London 314, 111-114 (1985)

Seedorf et al., Virology 145, 181-185 (1985)

Van den Brule et al., J. Med. Virol. 29, 20-27 (1989)

Vooijs, Ned. Tijdschr. Geneeskd. 131, 1662-1663 (1987)Walboomers et al., Amer. J. Path. 131, 587-594 (1988)

Yee et al., Am. J. Path. 119, 361-366 (1985)

Claims (19)

1. Primer voor gebruik in een polymerase chain reactie (PCR)ter amplificatie van DNA van genitale humane papilloma virus(HPV) genotypen, bestaande uit een oligonucleotide dat aan het3'-uiteinde één van de hierna volgende sequenties: 5'-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3' \

51-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3’ 5'-TGGTACAATGGGCATATGAT-3'

51-AATGGCTTTTGGAATTTACA-3' of een sequentie, die voor ten minste 75% met één van deze viersequenties homoloog is, omvat.

2. Primer voor gebruik in een polymerase Chain reactie (PCR)ter amplificatie van DNA van genitale humane papilloma virus(HPV) genotypen, bestaande uit een oligonucleotide dat aan het3'-uiteinde één van de hierna volgende sequenties:

51-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3' 5'-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3' 5’-TGGTACAATGGGCATATGAT-3' 5'-AATGGCTTTTGGAATTTACA-3' of een sequentie, die voor ten minste 90% met één van deze viersequenties homoloog is, omvat.

3. Primer voor gebruik in een polymerase chain reactie (PCR)ter amplificatie van DNA van genitale humane papilloma virus(HPV) genotypen, bestaande uit een oligonucleotide met eenlengte van 20-40 nucleotiden dat aan het 3'-uiteinde één van dehierna volgende sequenties: 5'-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-315'-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3' 5'-TGGTACAATGGGCATATGAT-3' 5'-AATGGCTTTTGGAATTTACA-3'omvat.

4. Primer volgens conclusie 3, bestaande uit één van de hiernavolgende, 20 nucleotiden lange oligonucleotiden: 5'-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3’ (GP5)

51-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3· (GP 6)

51-TGGTACAATGGGCATATGAT-3' (GP1) 5'-AATGGCTTTTGGAATTTACA-3' (GP2).

5·-ACAGGATCCTTTGTTACTGTGGTAGATAC-31 (B-GP5), en

51-ACAGGATCCGAAAAATAAACTGTAAATCA-3' (B-GP 6); 5'-ACAGAATCCTTTGTTACTGTGGTAGATAC-3' (E-GP5), en 5'-ACAGAATCCGAAAAATAAACTGTAAATCA-3' (E-GP6); 5'-ACAAAGCTTTTTGTTACTGTGGTAGATAC-3' (H-GP5), en

51-ACAAAGCTTGAAAAATAAACTGTAAATCA-3' (H-GP 6)/ 5'-ACAGGATCCTGGTACAATGGGCATATGAT-3' (B-GP1), en 5'-ACAGGATCCAATGGCTTTTGGAATTTACA-3' (B-GP2); 5'-ACAGAATCCTGGTACAATGGGCATATGAT-3' (E-GPl), en 5'-ACAGAATCCAATGGCTTTTGGAATTTACA-3' (E-GP2); 5'-ACAAAGCTTTGGTACAATGGGCATATGAT-3' (H-GP1), en 5'-ACAAAGCTTAATGGCTTTTGGAATTTACA-3' (H-GP2).

5·-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3 * (GP 6) hetzij bestaande uit het oligonucleotidenpaar51-TGGTACAATGGGCATATGAT-31 (GP1), en

51-AATGGCTTTTGGAATTTACA-3' (GP2).

5. Primer volgens conclusie 3, bestaande uit een meer dan 20nucleotiden lang oligonucleotide, dat aan het 3'-uiteinde éénvan de hierna volgende sequenties: 5'-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3« 5’-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3' 5'-TGGTACAATGGGCATATGAT-3·

51-AATGGCTTTTGGAATTTACA-3 * en aan het 5'-uiteinde één of meer restrictie-enzym herkennings-sequenties omvat.

6. Primer volgens conclusie 5, bestaande uit één van de hiernavolgende, 29 nucleotiden lange oligonucleotiden: 5'-ACAGGATCCTTTGTTACTGTGGTAGATAC-3' (B-GP5) 5'-ACAGGATCCGAAAAATAAACTGTAAATCA-3' (B-GP 6) 5'-ACAGAATCCTTTGTTACTGTGGTAGATAC-3' (E-GP5) 5'-ACAGAATCCGAAAAATAAACTGTAAATCA-3' (E-GP 6)

51-ACAAAGCTTTTTGTTACTGTGGTAGATAC-3' (H-GP5) 5'-ACAAAGCTTGAAAAATAAACTGTAAATCA-3' (H-GP6) 5'-ACAGGATCCTGGTACAATGGGCATATGAT-3' (B-GP1)

51-ACAGGATCCAATGGCTTTTGGAATTTACA-3' (B-GP2) 5 *-ACAGAATCCTGGTACAATGGGCATATGAT-3' (E-GP1)

51-ACAGAATCCAATGGCTTTTGGAATTTACA-3' (E-GP 2) 5'-ACAAAGCTTTGGTACAATGGGCATATGAT-3' . (H-GP1) 5'-ACAAAGCTTAATGGCTTTTGGAATTTACA-3' (H-GP2).

7. Primerpaar voor gebruik in een polymerase chain reactie(PCR) ter amplificatie van DNA van genitale humane papillomavirus (HPV) genotypen, bestaande uit een eerste oligonucleotide,dat aan het 3'-uiteinde de sequentie 5i-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3’, of een sequentie, die voor ten minste 75% met deze sequentie homoloog is omvat, en een tweede oligonucleotide, dat aan het 3'-uiteinde de sequentie 5'-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3', of een sequentie, die voor ten minste 75% met deze sequentie homoloog is omvat, dan wel bestaande uit een eerste oligonucleotide, dat aan het 3'-uiteinde de sequentie 5'-TGGTACAATGGGCATATGAT-3', of een sequentie, die voor tenminste 75% met deze sequentie homoloog is omvat, en een tweedeoligonucleotide, dat aan het 3'-uiteinde de sequentie5'-AATGGCTTTTGGAATTTACA-3', of een sequentie, die voor tenminste 75% met deze sequentie homoloog is omvat.

8. Primerpaar voor gebruik in een polymerase chain reactie(PCR) ter amplificatie van DNA van genitale humane papillomavirus (HPV) genotypen, bestaande uit een eerste oligonucleotide, dat aan het 3'-uiteinde de sequentie \ 5i-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3’, of een sequentie, die voor ten minste 90% met deze sequentie homoloog is omvat, en een tweede oligonucleotide, dat aan het 3'-uiteinde de sequentie 5'-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3', of een sequentie, die voor ten minste 90% met deze sequentie homoloog is omvat, dan wel bestaande uit een eerste oligonucleotide, dat aan het 3’-uiteinde de sequentie

51-TGGTACAATGGGCATATGAT-31, of een sequentie, die voor tenminste 90% met deze sequentie homoloog is omvat, en een tweedeoligonucleotide, dat aan het 3'-uiteinde de sequentie5'-AATGGCTTTTGGAATTTACA-3', of een sequentie, die voor tenminste 90% met deze sequentie homoloog is omvat.

9. Primerpaar voor gebruik in een polymerase chain reactie(PCR) ter amplificatie van DNA van genitale humane papillomavirus (HPV) genotypen, bestaande uit een eerste, 20-40 nucleotiden lang oligonucleotide, dat aan het3'-uiteinde de sequentie 5’-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3' omvat, eneen tweede, 20-40 nucleotiden lang oligonucleotide, dat aan het3'-uiteinde de sequentie 5'-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3' omvat,dan wel bestaande uit een eerste, 20-40 nucleotiden lang oligonucleotide, dat aan het3'-uiteinde de sequentie 5'-TGGTACAATGGGCATATGAT-3' omvat, eneen tweede, 20-40 nucleotiden lang oligonucleotide, dat aan het3'-uiteinde de sequentie 5'-AATGGCTTTTGGAATTTACA-3* omvat.

10. Primerpaar volgens conclusie 9, bestaande uit hetzij hetoligonucleotidenpaar 5'-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3' (GP 5), en

11. Primerpaar volgens conclusie 9, waarbij elk van beideoligonucleotiden meer dan 20 nucleotiden lang is en aan het 5'-uiteinde één of meer restrictie-enzym herkenningssequentiesomvat.

12. Primerpaar volgens conclusie 11, bestaande uit één van devolgende oligonucleotidenparen:

13. Werkwijze voor het amplificeren van DNA van genitale humane papilloma virus (HPV) genotypen door middel van een polymeraseChain reactie (PCR), waarbij een primerpaar volgens een van deconclusies 7-12 wordt toegepast.

14. Werkwijze voor het onderzoeken van een monster, zoals eenbaarmoederhals uitstrijk, op de aanwezigheid daarin van genitalehumane papilloma virus (HPV) genotypen door het eventueel in hetmonster aanwezige DNA van een genitaal HPV door middel van eenpolymerase chain reactie (PCR) te amplificeren en vervolgens te detecteren, waarbij in de PCR een primerpaar volgens een van deconclusies 7-12 wordt toegepast.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, waarbij tijdens de primerannealing stap een temperatuur van 30-50°C wordt toegepast.

16. Werkwijze volgens conclusie 15, waarbij tijdens de primerannealing stap een temperatuur van 35-45°C, liefst van 38-42°Cwordt toegepast.

17. Werkwijze volgens een van de conclusies 14-16, waarbij eenMg2+ concentratie van 2-10 mM wordt toegepast.

18. Werkwijze volgens conclusie 17, waarbij een magnesiumionen(Mg2+) concentratie van 2,5-5 mM, liefst van 3,0-4,0 mM wordttoegepast.

19. Werkwijze volgens een van de conclusies 14-18, waarbij alsmonster de celfractie van een baarmoederhals uitstrijk wordttoegepast, nadat deze aan een .invries- en ontdooibehandeling isonderworpen.