JPH0310700A - パピローマウイルスの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトパピローマウィルス（以下、ＨＰＶと略
記する）の特定のＤＮＡ領域の検出方法に関する。本発
明はまた、このような方法に使用する検出キットに関す
る。

〔従来の技術〕

従来、ヒト子宮頚がん（Ｃｅｒｖｉｃａｌ　Ｃａｒｃｉ
ｎｏｍａ）の発生原因の一つはＨＰＶであることが示唆
されている［Ｍ、デュルスト（Ｍ、Ｄｉｊｒｓｔ　）ほ
か、プロシーディングズ　オブ　ザ　ナショナルアカデ
ミ−オブ　サイエンシーズ　オブ　ザＵ　　Ｓ　　Ａ　
　　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃ
ｉ、　　Ｕ　　Ｓ　　Ａ）　　、第８０巻、第３８１２
〜３８１５頁（１９８３）。

ＨＰＶには５０種以上のタイプが存在するが、子宮頚が
んに関わっているのは、１６型、１８型が大部分であり
、その他３３型などが一部の例で見出されている。

ＨＰＶの検出方法に関しては、ウィルスの培養系がいま
だ確立されていないこと、ウィルスＤＮＡの形で存続し
、ウィルス粒子の産生が認められないため免疫学的検出
が困難であるなどの理由から、もっばらウィルス遺伝子
自身を検出する方法がとられている。Ｍ、デュルストら
はサザンハイプリダイゼーション法によって子宮頚がん
組織より、約６０％の試料にＨＰ　Ｖ　１６型あるいは
１８型ＤＮＡを検出している。その検出感度は、通常細
胞当り　０．５〜１．０コピーである。なお、子宮頚が
ん組織中のＨＰＶ　　ＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡ中に
挿入された形で存在することが明らかになっている。し
かも、組込まれたＨＰＶ　　ＤＮＡは、通常多くの欠損
がみられ、完全に保存されているのは初期遺伝子産物Ｅ
６及びＥ７の領域のみである例が多く見出されている［
Ｅ、　　シュワルツ（Ｂ、　Ｓｃｈｗａｒｚ　）ほか、
ネーチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ　）　、第３１４巻、第１
１１〜１１４頁（１９８５）　）。

〔発明が解決しようとする課題〕

ＨＰＶ　　ＤＮＡの検出方法として、従来用いられてき
たサインハイブリダイゼーション法では、ＨＰＶ　　Ｄ
ＮＡがｌｌ’ｇ以上ないと検出できないこと、また、元
の組織材料として最低１００ｍｇ程度は必要であること
など検出方法として限界があった。

前がん病変（ＣＩ　Ｎ％Ｃｅｒｖｉｃａｌ　Ｉｎｔｒａ
ｅｐｉｔｈｅ−Ｉｉａｌ　　Ｎｅｏｐｌａｓｉａ）は、
がん（Ｃａｒｃｉｎｏｍａ　）　ヘの進行に伴い、ＣＩ
ＮＩ→ＣＩＮＩＩ→ＣＩＮＩＩ［へと移行する。前がん
病変のバイオブシは極く微量しか得ることができず、従
来の検出方法では検出が困難なケースがある。

近年、Ｐ　ＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　
Ｒｅｃｔｉｏｎ）法が、高感度遺伝子診断方法として開
発された〔メソッズ　イン　エンザイモロジー（Ｍｅｔ
ｈ。

ｄｓ　＋ｎ　Ｂｎｚｙｍｏｌｏｚｙ　）、第１５５巻、
第３３５〜３５０頁（１９８７））。

ＰＣＲ法は、目的とする遺伝子のみを特異的に酵素的に
増幅し、少ない試料から高感度に目的遺伝子を検出する
のに有用な方法である。

ＰＣＲ法によれば、酵素として、例えば耐熱性タック−
ポリメラーゼ（Ｔａｑ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　）を用
い、ＤＮＡの変性（９４℃）の工程、ブライマーＤＮＡ
のアニーリング（５５℃）の工程、ＤＮＡ相補鎖の酵素
的合成（７２℃）の工程より成る温度サイクルを任意の
回数繰返すことで、目的遺伝子のみを指数的に増幅する
ことができる。

例えば温度サイクルを２５回繰返せば、目的ＤＮＡは約
１０万倍に増幅され、微量試料より高感度にＨＰＶ　　
ＤＮＡを検出するには、このＰＣＲ法が最も有効である
。ＰＣＲ法の最高感度として１０−’ｐｇ（７）ＨＰＶ
　　ＤＮＡがあｔＬば検出できると理論的に推算できる
が、この最高感度を得るにはウィルスＤＮＡ中で理想的
な増幅領域を選定することが前提条件となる。

本発明の目的は、子宮頚がん組織及び前がん病変組織よ
りＨＰＶ　　ＤＮＡを検出する際、ＰＣＲ法の最高感度
の得られるＨＰＶ　　ＤＮＡ増幅領域を明らかにし、そ
の検出方法及びそれに用いるキットを提供することにあ
る。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はＨＰＶ　１
６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ３３のＥ６、Ｅ７領域中に示
される特定のＤＮＡ領域より成る群より選択された少な
くとも一つのＤＮＡ領域を一対のオリゴヌクレオチドブ
ライマーを用い増幅させることを特徴とするＨＰＶのう
ち、ＨＰＶ　１６、ＨＰＶ　１８及びＨＰＶ３３の少な
くとも一つの検出方法に関する。

更に、本発明の第２の発明は上記第１の発明の方法を用
いて検出を行うための検出キットであって、特定のＤＮ
Ａ領域を増幅させるためのプライマー対及び増幅された
ＤＮＡを検出するためのプローブを含有していることを
特徴とする。

前記課題を解決する手段として、ヒトゲノムＤＮＡ中に
必ず挿入されているＨＰＶ初期初期遺伝子産物及６Ｅ７
のＤＮＡ領域の範囲で、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ　１８、Ｈ
Ｐ　Ｖ　３３１．：ソレソレ特徴あるＤＮＡ領域を選定
し、それぞれの領域について、ＰＣＲ法を用いたＨＰＶ
　　ＤＮＡ増幅に必要なオリゴヌクレオチドブライマー
ＤＮＡを合成し、続いて実際に感染細胞よりＤＮＡを調
製し、それぞれの領域をＰＣＲ法で増幅し、高い検出感
度を有する領域を選定することが必要である。

本発明者らはこのため鋭意研究を重ね、Ｅ６及びＥ７領
域にそれぞれ１組ずつ、各ＨＰＶに特徴的な増強領域、
ＰＣＲ法に最適の各ブライマーＤＮＡ配列、また増幅さ
れたＤＮＡ領域を効率よく検出するプローブ配列を見出
した。また、このＨＰＶの特定の領域を増幅、検出する
ためのブライマーとプローブを含有するキットを作成し
、本キットを用いることにより、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１
８及びＨＰＶ３３が簡便に検出できることを見出し、本
発明を完成させた。

以下、順を追って本発明を具体的に説明する。

ＨＰＶ１６型、１８型、３３型は既にクローニングされ
ており、その全塩基配列は、ピロロシイ　（ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ　）　、第１４５巻、第１８１〜１８５頁（１９
８５）、ジャーナル　才ブ　モレキュラー　バイオロジ
イ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉ
ｏｌｏｇｙ　）　、第１９３巻、第５９９〜６０８頁（
１９８７）、及びジャーナル　オブ　ピロロシイ（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第５８巻、
第９９１〜９９５頁（１９８６）に記載されている。

ＨＰＶがヒトゲノムＤＮＡ中に挿入される際、大きな欠
損を経て、少なくともＥ６及びＥ７領域を含む領域がゲ
ノム中に残ることは公知である。

このＥ６領域の範囲で領域Ｉの各ＨＰＶ１６、ＨＰＶ　
１８、ＨＰＶ３３に特徴的なりＮＡ領域を選定し、また
、Ｅ７領域の範囲で領域■の各ＨＰＶに特徴的なりＮＡ
領域を選定したく表１）。

それぞれの領域を増幅するた約には、メ″リゴヌクレオ
チドブライマーＤＮＡ、すなわち、増幅領域の５′末端
から約２０塩基のセンス配列及び３′末端から約２０塩
基のアンチセンス配列を有するブライマーＤＮＡ対がウ
ィルスの各タイプについて必要である。このプライマー
対で前述の選定ＤＮＡ領域にアニーリングできるもので
あれば良いが、その−例として表２に示すようなブライ
マーＤＮＡをＤＮＡ合成機により合成することができ、
ＨＰＬＣにて精製することができる。

撃 検出するＨＰＶ　　ＤＮＡ標品については、ＨＰＶをク
ローニングしたプラスミド、ＨＰＶＤＮＡが挿入されて
いることが公知である子宮頚がん細胞株５ｉＨａ及びＨ
ｅＬａ細胞、更に子宮頚がん及び前がん病変の病理試料
等より調製することができる。細胞、組織からのＤＮＡ
の調製は公知の確立された方法を用いればよい。

ＰＣＲ法については、タフクボリメラーゼを含む遺伝子
増幅キット及び自動遺伝子増幅装置がバーキンエルマー
シータス社から市販されており、これらを用い、本発明
のプライマー対を用い、特定のＤＮＡ領域の増幅反応を
行えばよい。

増幅後のＨＰＶ　　ＤＮＡの検出は、例えばアガロース
ゲル電気泳動、及びドツトハイブリダイゼーションを用
いて行うことができる。

ドツトハイブリダイゼーションの際、ＨＰＶ各タイプの
ＤＮＡ配列に特徴的な領域をプローブＤＮＡとして選択
することによりＨＰＶ各タイプを選別できる。

プローブＤＮＡとしては上記の条件を満たせば何でもよ
いが、その−例を示せば表３のようなプローブがある。

これらのプローブＤＮＡは前記プライマーＤＮＡと同様
の方法で合成、精製することができる。該プローブＤＮ
Ａは標識化することにより、高感度な検出が可能となる
。標識化の方法としては公知の方法なら何でも良いが例
えばＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いプローブＤＮ
Ａの５′末端を３２ｐで標識化するアイソトープ標識方
法でも良いし、プローブＤＮＡの酵素標識、蛍光標識、
ビオチン−アビジン系での！Ｓ識、また、ケミプローブ
のようにプローブＤＮＡにスルホン基を導入し、それを
抗体を用いて認識するような方法での標識方法等の非ア
イソトープ標識方法でもよい。

検出感度の検出はＨＰＶ　　ＤＮＡが１０−’ｐｇ含ま
れるように、健常な子宮頚部組織より調製した、ＨＰＶ
を含まないヒトゲノムＤＮＡにて希釈した試料を用い、
前記ＰＣＲ法で増幅後、例えばドツトハイブリダイゼー
ションを用いて行うことができる。

本発明のプライマ一対、プローブを用いれば１０　’−
’ｐｇのＨＰＶ　　ＤＮＡを検出することができ、この
ようにして、ＨＰＶ　　ＤＮＡ配列の中でＰＣＲ法の最
高感度で検出できる有効な検出類＃＆ｌ、ｎが明らかに
なり、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３３の高感度検
出が可能となった。

実際、同一集団でサザンハイプリダイゼーション法の結
果と比較したところ、サザンハイプリダイゼーション法
で検出不可能であった試料からもＨＰＶ　　ＤＮＡを検
出することができ、子宮頚がん組織で全体の８４％、前
がん病変組織（ＣＩＮＩ〜ＣＩＮＩＩｒ）でも７０％の
高率でＨＰＶ　　ＤＮＡを検出し、それぞれのタイピン
グをすることができた。

また、本ＨＰＶの特定ＤＮＡ領域を増幅させるためのプ
ライマ一対、及び増幅されたＤＮＡ領域を検出するだめ
のプローブをそろえてキットとしておくことで、ヒトＨ
ＰＶ　１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ３３のうちの少なく
とも一つの検出、検定を簡便に行うことができる。なお
、キットに用いる試薬は溶液状でも良いし、凍結乾燥物
でも良い。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されない。

実施例Ｉ ＰＣＲ法によるＨＰＶ領域１１■の増幅と検出 （１−１）ヒトゲノムＤＮＡの調製 ヒト子宮頚がんセル５ｉｔｌａ細胞には１〜１０コピー
のＨＰＶ１６ＤＮＡが挿入されている。また、ＩＩ　ｅ
　Ｌ　ａ細胞には１０〜５０コピーのＨＰ　Ｖ　１８Ｄ
ＮＡが挿入されている。それぞれの細胞をＤＭＤ［ダル
ベツコの改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅ−ｃｃｏｓ　Ｍ
ｏｄｉｆｉｅｄ　Ｂａｇｌｅｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、フロ
ー・ラボラトリ−社〕、１０％ＦＢＳ　Ｃウシ胎児血清
（Ｐｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　）、フロー
・ラボラトリ−社）、１００ユニツト／ｒｄ！ストレプ
トマイシン（明治製菓）　　１００ユニット／ｒｎ！、
ペニシリンＧ（萬有製薬）を含む培地で６　ｃｍカルチ
ャーディヨシュ中で培養した。約ｌ０−６セル数になっ
たところで培養を終了し、培地を除去した。

ＴＥバッフｙ　　　Ｃ１０ｍＭ）リス（Ｔｒｉｓ）　−
１１ｃＩ　ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＢＤＴＡ　］、０．Ｌ
Ｍ　ＮａＣ１を含む５ｄの溶液で細胞を洗浄した後、Ｔ
Ｅバッファー〇、５％ＳＤＳを含む５−の溶液を加え、
室温、２０分間放置し、デイツシュより細胞をはがし取
り、ポリスチレン製チューブに回収した。

１００μｇ／−になるようにプロテネースＫを加えたＴ
Ｅバッファー５ｍｌを加え、７０℃、２時間処理した。

次にフェノールとクロロホルムの等量混合液５−を加え
、静かにかくはんし、１２００Ｏｒｐｍ、５分間遠心後
、水層を分離した。この水層に５−のクロロホルムを加
え、静かにかくはんし、同様に遠心して水層を分離した
。

この水層に０．５１ｎｌの３Ｍ酢酸ナトリウム１〇−の
エタノールを加え、充分かくはんし、−７０℃、１５分
間放置後、１２００Ｏｒｐｍ　１０分間遠心して、ゲノ
ムＤＮＡの沈殿を回収した。

沈殿は８０％のエタノールでリンスした後、乾燥させ、
１ｒｎ１．の滅菌水に溶解した。ゲノムＤＮＡは約１０
０μｇ回収できた。

子宮頚がん組織、尖形コンジローマ（Ｃｏｎｄｙｌａｍ
ａ　ａｃｕｍｉｎａｔｕｍ　）組織及び子宮筋腫患者よ
り得た健常な子宮頚部組織は、組織切片１００ｍｇを解
剖はさみで充分細かく切った後、上記と同様に、プロテ
ネースに処理、フェノール−クロロホルム処理を行い、
約１００μｇのゲノムＤＮＡを回収した。

（１２）オリゴヌクレチドブライマーＤＮＡ及びプロー
ブＤＮＡの合成及び精製 ＰＣＲ法により特定組織のＤＮＡ配列を増幅させるには
、その領域の５′末端より約２０塩基のセンス配列及び
３′末端より約２０塩基のアンチセンス配列のオリゴヌ
クレオチドブライマーＤＮＡが必要である。また、ＨＰ
Ｖの各タイプをハイブリダイゼーション法により同定す
るためにオリゴマヌクレオチドプローブＤＮＡが必要で
ある。

表２、表３で示したブライマーＤＮＡ及びプローブＤＮ
Ａをアブライドバイオシステムズ社のＤＮＡ合成機を用
いて合成し、脱保護の後、イオン交換ＨＰＬＣ（Ｔ　Ｓ
　Ｋゲル、ロＢＡＢ−２ＳＷカラム）で精製し、５ｅｐ
−ｐａｋ　Ｃ１８（ウォーターズ社）で脱塩し、各ＤＮ
Ａ約５０μｇを得た。

（１−３）　ＨＰＶ　１６領域■、■のＰＣＲ法による
増幅 ５ｉ）ｌａ、　ＨｅＬａ細胞、ＨＰＶ　１６に感染した
子宮頚がん組織２例、ＨＰＶ６及びＨＰＶＩＩに感染し
た尖形コンジローマ組織２例、ＨＰＶに感染していない
健常な子宮頚部組織２例より、（１−１＞に記載のよう
に調製したゲノムＤＮＡ　１μｇを０．５耐用チユーブ
（バイオビック社）に取り、９４℃、１０分間加熱処理
した後、ＧｅｎｅＡｍｐ”　　Ｋｉｔ　　（パーキン・
エルマー・シータス社）中の１０μβの１０×増幅用バ
ッファーＣ１００＋ｎＭ）　　リス　・ＨＣＩ　　、ｐ
Ｈ８，３，５００ｍＭＫＣｌ　、　　１５　ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｌ２．０．１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン］、Ｌ６ｔｔｌｌ
の１．２５ｍＭ　　ｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ混合液（ｄＡＴＰ、
　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴ１’Ｐ　）、ｌμβの
２０ｐＭｐ１６−１ブライマー　１μβの２０ｐＭｐ１
６−２Ｒブライマー　０．５μｌの５ユニット／μβタ
ック−ポリメラーゼを加え、更に滅菌水を加えて１００
μ！の溶液にした。

この反応液は、上層に１００μｌのミネラルオイル（シ
グマ社）を加えた後、自動遺伝子増幅装置サーマル−サ
イクラ−（パーキンエルマーシータス社）により増幅反
応を行った。

反応条件は９４℃、１分間の変性→５５℃、２分間のブ
ライマーのアニーリング→７２℃、２分間の合成反応の
サイクルを３０サイクル行った。反応後、上層のミネラ
ルオイルを除去した後、反応液のｌ　Ｏ／、ＩＪを取り
、３％ＮｕｓｉｅｖｅＧＴＧアガロース−１％Ｓｅａ−
ｋｅｍアガロース（ＦＭＣ社）ゲル電気泳動を行い、エ
チジウムブロマイドでＤＮＡを染色し、増幅されたＤＮ
Ａをｍ認した。

Ｓ　ｉ　Ｉ（ａ細胞、ＨＰＶ１６感染子宮頚がん組織例
に１４０ｂｐのバンドを確認した。

またＨｅＬａ細胞、尖形コンジローマ例、健常な子宮頚
部からのゲノムからは増幅が認められず、ｐ１６−１及
びｐ１６−２ＲプライマーＤＮＡは、ＨＰＶ１６ＤＮＡ
を特異的に増幅していた。

同様の方法で、ｐ１６−３、ｐ１６−４Ｒのブライマー
を用いて、領域■を増幅し、Ｓ　ｉ　Ｉｔ　ａ細胞、Ｈ
ＰＶ１６感染子宮頚がん組織例に８９ｂｐの増幅ＤＮＡ
のバンドを確Ｓ忍した。

（１−４）　　ドツトハイブリダイゼーションによるＩ
−（ＰＶタイプのｒｉｆ１認 （１−３）で得た反応液を９４℃で１０分間処理し、水
中で急冷してＤＮＡを変性させた。この反応液ｌμｌを
ナイロンメンブラン（シュライへル　ラント　シュエル
）上にスポットし、紫外線トランスイルミネーター（２
５４０ｍ）に１０分間照射させ、ＤＮＡをメンプランに
固定させた。

このメンプランは、ブレハイブリダイゼーションバッフ
ァー（５Ｘデンハーツ！、５ＸＳＳＣ１１００ｕｇ／ｍ
ｆサケ精子ＤＮＡ）１０ｄ中で３７℃、２時間プレハイ
ブリダイゼーションを行った。

次に、３２ｐにて５′末端をラベルしたプローブＤＮＡ
　　ｐＢ１６−Ｉを加え、３７℃、２時間ハイブリダイ
ゼーションを行った。

プローブの３２ｐ−ラベルはメガラベルキット（ＭＥ！
ＧＡＬＡＢＢＬ　Ｋｉｔ　）　（宝酒造）を用いて次の
ように行った。１０　ｐ　　ｍｏｌｅ／μｌのプローブ
ＤＮＡ　１μ！、１μβのＸ　Ｉ　ＯＩＪン酸化バッフ
ァ１０μ　Ｃｉ／μβのＣｒ−”Ｐ〕ＡＴＰ　（アマジ
ャム）５μβ、１０ユニツトのＴ４−ポリヌクレオチド
キナーゼ１μｌを含む反応液に滅菌水２μｌを加えて１
０μ！にし、３７℃、３０分間反応させた。反応後６５
℃、１０分間処理し、この反応液の２μ！（約１０　’
　ｃｐｍ　）をハイブリダイゼーションに用いた。

ハイブリダイゼーション後、メンプランを２ｘＳＳＣ１
０，１％ＳＤＳを含む洗浄液１で室温、１０分間で２回
洗浄し、続いて０．２ＸＳＳＣ。

０．１％ＳＤＳを含む洗浄液２で５５℃、２０分間で２
回洗浄した。メンプランは乾煙させた後、Ｘ線フィルム
（富士フィルム）を入れたカセット内で一７０℃、３時
間感光させ、オートラジオグラフをとった。

この結果、５ｉＨａ細胞、ＨＰＶ１６感染子宮頚がん組
織増幅ＤＮＡはｐＢ１６−１プローブとハイブリダイゼ
ーションしドツトが現われた。

その他のＨｅＬａ細胞、尖形コンジローマ、健常な子宮
ＩＩ　ＲゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションは全く
認められなかった。

また、プローブをｐ８１８−１及びρＢ５３−Ｉに変え
てハイブリダイゼーションを行ったが、全くハイブリダ
イゼーションは認められなかった。この結果は、ブライ
マーｐ１６−１及びｐ１６−２ＲでＨＰＶ　１６が特異
的に増幅され、プローブｐＢ１６−１とのハイブリダイ
ゼーションでＨＰＶ１６が特異的に検出できることを示
すものである。

また、ブライマーｐ１６−３、ｐ１６−４Ｒを用いたＨ
ＰＶ１６領域■増幅標品はプローブｐ８１６−ＩＩと特
異的にハイブリダイゼーシヨンした。

（１−５）　ＨＰＶ　１６領域Ｉ、Ｉｔを用いたＨ　Ｐ
　Ｖ　１６ＤＮＡの検出感度の検定 領域１１■を用いて、ＨＰＶ１６ＤＮＡの検出限界をク
ローン化されたプラスミドを用いたモデル実験系をつく
り検定した。プラスミドとしてＨＰＶ１６ＤＮＡのＥ６
、Ｅ７領域を含むＰｓｔＩ切断断片Ｂ　［１７７６ｂｐ
、ジャーナル　才ブ　ピロロシイ　第５８巻、第９７９
〜９８２頁（１９ＥＩ６）　’］をベクターｐ　Ｓ　Ｖ
　２　ｎｅｏ　（５，６ｋｂ）のＰｓｔｌサイトに挿入
したプラスミドをｐ１６ＰｓｔｌＢと名付けて用いた。

ヒトの全ゲノムＤＮＡの鎖長を３Ｘ１０’ｂＰとして、
ｐ１６ＰｓｔｌＢ　　１０：ｌビー／ゲノムＤＮＡとな
るようにｐ１６ＰｓｔｌＢを健常な子宮頚部から（１−
１）で得たゲノムＤＮＡにて希釈した。すなわち２４５
ｐｇのｐ１６ＰｓｔｌＢを１０μｇの健常なゲノムＤＮ
Ａで希釈した。これを健常なゲノムＤＮＡで１０倍希釈
し、ｐ１６Ｐｓｔ　　ＩＢ　１０〜１０−’：Ｉビー／
ゲノムＤＮＡのモデルテンブレー）ＤＮＡを調製した。

この場合１０−６コビー／ゲノムＤＮＡの１μｇはＨＰ
Ｖ　　ＤＮＡ１分子分、約１０−ＢＰｇに相当する。

各モデルテンブレー）ＤＮＡＩＩｇを用いて（１−３）
に示した方法で領域Ｉを増幅させた。更に（１−４）に
示した方法でドツトハイブリダイゼーションを行った。

この結果１０−６コピー／ゲノムＤＮＡまでドツトが検
出された。また、領域■についても同様の感度を得た。

すなわち領域Ｉ、■を用いることで、試料中の１分子Ｈ
ＰＶ　　ＤＮＡ　（１０−”ｐｇ）を検出することがで
き、ＰＣＲ法の最高感度の検出をすることができた。

（１−６）　ＨＰＶ　１８、ＨＰＶ３３（７）領域Ｉ、
ＩＩ　ノ増幅と検出 ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３３の領域１．ＩＩの増幅と検出を
行った。

テンブレー）ＤＮＡとして、ＨＰＶ　１８のＥ６、Ｅ７
領域を含むＤＮＡ　（７，９ｋｂ）を大腸菌プラスミド
ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ１部位に挿入したプラスミドｐ
ＨＰＶ１８［ジ　エンボ　ジャーナル（Ｔｈｅ　ＢＭＢ
ＯＪ　）　、第３巻、第１１５１〜１１５７頁（１９８
４）］　、ＨＰＶ　３３（７）Ｅ　６、Ｅ７領域を含む
ＤＮＡ　（７，９ｋｂ）を大腸菌プラスミドｐｌｉｎｋ
３２２のＢｇ１１１部位に挿入したプラスミドｐＨＰＶ
３３［ジャーナル　オブ　ピロロシイ、第５８巻、第９
９１〜９９５頁（１９８６）］　、ＨＰ　Ｖ１６のＥ６
、Ｅ７領域を含むＤＮＡ　（７，９ｋｂ）を前記プラス
ミドｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ１部位に挿入したプラスミ
ドｐＨＰＶ１６　［プロシーディングズ　オブ　ザ　ナ
ショナル　アカデミーオブ　サイエンシーズ　才ブ　ザ
　ｔＪｓＡ。

第８０巻、第３８１２〜３８１５頁（１９８３）］それ
ぞれ１　ｎｇ。

及び（１−１）で調製した５ｉｔｌａ細胞、ＨｅＬａ細
胞のゲノムＤＮＡそれぞれ１μｇを用いた。

（１−２）で得たブライマーＤＮＡ　　ｐ１８−１とｐ
１８−２Ｒ及びｐ３１１とｐ３３〜２Ｒをそれぞれ含む
反応系で（１−３）に示した方法で増幅を行った。更に
（１−４）に示した方法でドツトハイブリダイゼーショ
ンを行い、プローブＤＮＡとして、（１−２）で得たｐ
Ｂｌｇ−ＩＳｐＢ３３−■を用いた。

ｐ１８−１とｐ１８−２Ｒをブライマーとした増幅では
ｐＨＰＶ　１８及びＨｅＬａ細胞の増幅ＤＮＡが、プロ
ーブｐ８１８−１とハイブリダイズし、ドツトが現われ
た。

また、ｐ３３−１とｐ　３３−、２　Ｒをブライマーと
し増幅ではｐＨＰＶ３３のみがプローブｐＢ３３−■と
ハイブリダイズしドツトが現われた。この結果、領域■
においてそれぞれのウィルスタイプのブライマーＤＮＡ
を用いて各ウィルスタイプのＤＮＡが特異的に増幅され
、各プローブＤＮＡで検出されることが明らかになった
。

同様に各テンブレー）ＤＮＡを、（１−２）で得たブラ
イマーＤＮＡ　　ｐ１８−３とｐ１８−４Ｒ及びｐ３３
−３とｐ３３−４Ｒをそれぞれ含む反応系で増幅を行い
、プローブＤＮＡとじて（１−２＞で得たｐｓｉｓ−ｎ
、ｐＢ３３−Ｉ［を用いてＨＰＶ　１８、ＨＰＶ３３の
領域■の検出を行った。その結果領域Ｈにおいてもそれ
ぞれのウィルスタイプのブライマーＤＮＡで各ウィルス
タイプのＤＮＡが増幅され、各プローブＤＮＡで検出さ
れた。

（１−５）と同様の方法で各テンブレー）ＤＮＡプラス
ミドを健常な子宮頚部から得たゲノムで希釈後、各プラ
イマー対、各プローブで増幅、検出を行い、（１−５）
と同様ＨＰＶ　　ＤＮＡ１０−６コビー／ゲノムＤＮＡ
の最高感度を得た。

すなわち試料中のＨＰＶ　　ＤＮＡ　　１分子約１０−
”ｐｇを検出することができた。

以上の結果、ＨＰＶ領域■、■はＨＰＶ１６、ＨＰＶ１
８及びＨＰＶ３３の各ウィルスタイプの検出に有効であ
り、各領域に対応するプライマー対、プローブを用いる
ことによりＨＰ　Ｖ　１６、ＨＰＶ１８、及びＨＰＶ３
３が高感度で検出された。

実施例２ ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰ　Ｖ　３３堆幅・検出キ
ットの作成 試料中（７）ＨＰＶ１６、ＨＰ　Ｖ　１８、ＨＰ　Ｖ　
３３のＤＮＡの増幅・検出するだめのキットを作成した
。

ＤＮＡ増幅用ブライマーとしてｐ　１６−１、ｐ　１６
−２Ｒ，ｐ　１８−１、ｐ１８−２ＲＳｐ３３−１、ｐ
３３−２Ｒが各４μＭ溶液となるようにＴＥバッファー
１００μｌに溶解し、ＨＰＶブライマー液（Ａ剤）とし
た。

ＤＮＡ検出用プローブとして、ｐＢｌ６−１、ｐＢｌ８
−ＩＳｐＢ３３−１各２μｇをＴＥバッファー２０μｌ
にそれぞれ溶解し、ＨＰ　Ｖ　１６プローブ液（Ｂ剤”
Ｉ　　ＨＰＶ１８プローブ液（Ｃ剤）　　ＨＰＶ３３プ
ローブ液（Ｄ剤）とした。Ａ剤、Ｂ剤、Ｃ剤、Ｄ剤を一
組とし、ＨＰＶ増幅検出キットとした（表４）。

表４　　　ＨＰＶ増幅・検出キット 実施例３　子宮頚がん及び前がん病変組織におけるＨＰ
Ｖ　　ＤＮＡの検出 ４３例の子宮頚がん摘出組織約１００ｍｇ及び２７例の
前がん病変（ＣＩＮ）バイオブシ約１０１より（１−１
）の方法によりゲノムＤＮＡをそれぞれ約１００μｇ１
約１０μｇ得た。

これらのゲノムＤＮＡ　１μｓを９４℃、１０分間熱変
性させた後、Ｇｅｎｅ　Ａｍｐに１を中の１０μβの×
１０バッファー１６ｔｔｌの１．２５ｍＭ　ｄＮＴｐ　
混合１．０．５μ２の５ユニツト／μ！タツクポリメラ
ーゼ及び実施例２記載のキラ）Ａ剤５μｌを加え、滅菌
水を加えて１００μｌの反応液を調製しｔこ。（１−３
）の方法により、ＨＰ　Ｖ　１６．１８．３３の領域Ｉ
を１本のチューブ内で増幅させた。

増幅後、ＤＮＡを熱変性させ、各１μ！の反応液を３枚
のナイロンメンプランにスポットし、同じメンプランを
３枚準備し、（１−４＞の方法により、ドツトハイブリ
ダイゼーションを行った。

すなわち、実施例２記載のＢ剤、Ｃ剤、Ｄ剤各ｌμｌを
用い、（１−４）の方法により、３２Ｐラベルしたプロ
ーブＤＮＡ、ｐＢｌ　６−１、ｐＢｌ　８−１．　ｐＢ
３３−Ｉの３種を準備し、３枚のメンプランにそれぞれ
のプローブＤＮＡを加え、ハイブリダイゼーションさせ
、ＨＰＶの各タイプを同定した。

表５に示すように子宮頚がん組織４３例より全体で３６
例（８４％）にＨＰＶ　　ＤＮＡを検出した。

ＣＩＮ ＨＰＶ１６ ＰＶ１８ ＰＶ３３ 全　　体 また、下記表６に示すように、前がん病変組織２７例よ
り全体で１９例（７０％）にＨＰＶＤＮＡを検出するこ
とができた。

すなわちＣｒＮＩ　　Ｓ中子５例、ＣｌＮｌｌ９例中７
例、ＣＩＮＩＩ［１０例中子例！、：　ＨＰ　ＶＤＮＡ
が検出でき、ＣＩＮＩ〜■ずべての段階で検出可能であ
った。

領域■に関しても同様の結果が得られ、領域Ｉ、ＩＩが
実際の病理試料からの検出にも有効であった。

ＣＩＮＩ　　　　５／８　　　０／８　　　２／８　　
　５／８ＣＩＮｎ　　　　？　／　９　　　２　／　９
　　　１　／　９　　　７　／　９ＣＩＮＩＩｒ　　　
　７／１０　　　４／１０　　　１／１０　　　７／１
０〔発明の効果〕 以上詳細に説明したように、本発明によりＰＣＲ法を用
いたＨＰＶ　　ＤＮＡの高感度検出に有効な領域１１■
が明らかになり、子宮頚がん組織中及び前がん病変組織
中のＨＰＶゲノムの高感度検出方法及びキットが提供さ
れた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記式〔１〕〜〔６］で表される特定のＤＮＡ領域
   よりなる群から選択された少なくとも一つのＤＮＡ領域
   を、一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅
   させることを特徴とするヒトパピローマウイルスＨＰＶ
   １６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ３３のうちの少なくとも一
   つの検出方法。 領域 I ▲数式、化学式、表等があります▼〔１〕 ５′▲数式、化学式、表等があります▼〔２〕 ５′▲数式、化学式、表等があります▼〔３〕 領域II ５′▲数式、化学式、表等があります▼〔４〕 ５′▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼〔５〕 ５′▲数式、化学式、表等があります▼〔６〕 ２、請求項１記載のプライマー対が、下記式〔７〕〜〔
   １２〕で表されるプライマー対よりなる群から選択した
   プライマー対である請求項１記載の検出方法。 ５′▲数式、化学式、表等があります▼〔７〕 ５′▲数式、化学式、表等があります▼ＨＰＶ１８領域
   I ５′▲数式、化学式、表等があります▼〔８〕 ５′▲数式、化学式、表等があります▼ ５′▲数式、化学式、表等があります▼〔９〕 ５′▲数式、化学式、表等があります▼ＨＰＶ１６領域
   II ５′▲数式、化学式、表等があります▼〔１０〕 ５′▲数式、化学式、表等があります▼ＨＰＶ１８領域
   II ５′▲数式、化学式、表等があります▼〔１１〕 ５′−ＧＡＧＧＡＴＧ＾＾ＧＧＣ ＴＴＧＧＡＣＣＧ−３′　ｐ３３−３ ＨＰＶ３３領域・ ５　′−ＧＴＧＴ丁＾ＣＡＡＧＴＧ 〔１２〕 ↑ＧＡＣ＾＾Ｃ−３′　ｐ３３−４Ｒ ３、請求項１記載の方法を用いて検出を行うための検出
   キットであって、特定のＤＮＡ領域を増幅させるための
   プライマー対、及び増幅されたＤＮＡを検出するための
   プローブを含有していることを特徴とするヒトパピロー
   マウイルス検出キット。