JP2791685B2 - パピローマウイルスの検出方法 - Google Patents
パピローマウイルスの検出方法Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
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- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトパピローマウイルス（以下、HPVと略
記する）の特定のDNA領域の検出方法に関する。本発明
はまた、このような方法に使用する検出キットに関す
る。
記する）の特定のDNA領域の検出方法に関する。本発明
はまた、このような方法に使用する検出キットに関す
る。
従来、ヒト子宮頚がん（Cervical Carcinoma）の発生
原因の一つはHPVであることが示唆されている〔M.デュ
ルスト（M.Drst）ほか、プロシーディングズ オブ
ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ
オブ ザ USA（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、第80巻、
第3812〜3815頁（1983）。
原因の一つはHPVであることが示唆されている〔M.デュ
ルスト（M.Drst）ほか、プロシーディングズ オブ
ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ
オブ ザ USA（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、第80巻、
第3812〜3815頁（1983）。
HPVには50種以上のタイプが存在するが、子宮頚がん
に関わっているのは、16型、18型が大部分であり、その
他33型などが一部の例で見出されている。
に関わっているのは、16型、18型が大部分であり、その
他33型などが一部の例で見出されている。
HPVの検出方法に関しては、ウイルスの培養系がいま
だ確立されていないこと、ウイルスDNAの形で存続し、
ウイルス粒子の産生が認められないため免疫学的検出が
困難であるなどの理由から、もっぱらウイルス遺伝子自
身を検出する方法がとられている。M.デュルストらはサ
ザンハイブリダイゼーション法によって子宮頚がん組織
より、約60％の試料にHPV16型あるいは18型DNAを検出し
ている。その検出感度は、通常細胞当り0.5〜1.0コピー
である。なお、子宮頚がん組織中のHPV DNAは、ヒトゲ
ノムDNA中に挿入された形で存在することが明らかにな
っている。しかも、組込まれたHPV DNAは、通常多くの
欠損がみられ、完全に保存されているのは初期遺伝子E6
及びE7の領域のみである例が多く見出されている〔E.シ
ュワルツ（E.Schwarz）ほか、ネーチャー（Nature）、
第314巻、第111〜114頁（1985）〕。
だ確立されていないこと、ウイルスDNAの形で存続し、
ウイルス粒子の産生が認められないため免疫学的検出が
困難であるなどの理由から、もっぱらウイルス遺伝子自
身を検出する方法がとられている。M.デュルストらはサ
ザンハイブリダイゼーション法によって子宮頚がん組織
より、約60％の試料にHPV16型あるいは18型DNAを検出し
ている。その検出感度は、通常細胞当り0.5〜1.0コピー
である。なお、子宮頚がん組織中のHPV DNAは、ヒトゲ
ノムDNA中に挿入された形で存在することが明らかにな
っている。しかも、組込まれたHPV DNAは、通常多くの
欠損がみられ、完全に保存されているのは初期遺伝子E6
及びE7の領域のみである例が多く見出されている〔E.シ
ュワルツ（E.Schwarz）ほか、ネーチャー（Nature）、
第314巻、第111〜114頁（1985）〕。
HPV DNAの検出方法として、従来用いられてきたサザ
ンハイブリダイゼーション法では、HPV DNAが1pg以上
ないと検出できないこと、また、元の組織材料として最
低100mg程度は必要であることなど検出方法として限界
があった。
ンハイブリダイゼーション法では、HPV DNAが1pg以上
ないと検出できないこと、また、元の組織材料として最
低100mg程度は必要であることなど検出方法として限界
があった。
前がん病変（CIN、Cervical Intraepithelial Neopla
sia）は、がん（Carcinoma）への進行に伴い、CIN I→C
IN II→CIN IIIへと移行する。前がん病変のバイオプシ
は極く微量しか得ることができず、従来の検出方法では
検出が困難なケースがある。
sia）は、がん（Carcinoma）への進行に伴い、CIN I→C
IN II→CIN IIIへと移行する。前がん病変のバイオプシ
は極く微量しか得ることができず、従来の検出方法では
検出が困難なケースがある。
近年、PCR（Polymerase Chain Rection）法が、高感
度遺伝子診断方法として開発された〔メソッズ イン
エンザイモロジー（Methods in Enzymolozy）、第155
巻、第335〜350頁（1987）〕。
度遺伝子診断方法として開発された〔メソッズ イン
エンザイモロジー（Methods in Enzymolozy）、第155
巻、第335〜350頁（1987）〕。
PCR法は、目的とする遺伝子のみを特異的に酵素的に
増幅し、少ない試料から高感度に目的遺伝子を検出する
のに有用な方法である。
増幅し、少ない試料から高感度に目的遺伝子を検出する
のに有用な方法である。
PCR法によれば、酵素として、例えば耐熱性タック−
ポリメラーゼ（Taq−polymerase）を用い、DNAの変性
（94℃）の工程、プライマーDNAのアニーリング（55
℃）の工程、DNA相補鎖の酵素的合成（72℃）の工程よ
り成る温度サイクルを任意の回数繰返すことで、目的遺
伝子のみを指数的に増幅することができる。
ポリメラーゼ（Taq−polymerase）を用い、DNAの変性
（94℃）の工程、プライマーDNAのアニーリング（55
℃）の工程、DNA相補鎖の酵素的合成（72℃）の工程よ
り成る温度サイクルを任意の回数繰返すことで、目的遺
伝子のみを指数的に増幅することができる。
例えば温度サイクルを25回繰返せば、目的DNAは約10
万倍に増幅され、微量試料より高感度にHPV DNAを検出
するには、このPCR法が最も有効である。PCR法の最高感
度として10-6pgのHPV DNAがあれば検出できると理論的
に推算できるが、この最高感度を得るにはウイルスDNA
中で理想的な増幅領域を選定することが前提条件とな
る。
万倍に増幅され、微量試料より高感度にHPV DNAを検出
するには、このPCR法が最も有効である。PCR法の最高感
度として10-6pgのHPV DNAがあれば検出できると理論的
に推算できるが、この最高感度を得るにはウイルスDNA
中で理想的な増幅領域を選定することが前提条件とな
る。
本発明の目的は、子宮頚がん組織及び前がん病変組織
よりHPV DNAを検出する際、PCR法の最高感度の得られ
るHPV DNA増幅領域を明らかにし、その検出方法及びそ
れに用いるキットを提供することにある。
よりHPV DNAを検出する際、PCR法の最高感度の得られ
るHPV DNA増幅領域を明らかにし、その検出方法及びそ
れに用いるキットを提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はHPV16、H
PV18及びHPV33のE6、E7領域中に示される特定のDNA領域
より成る群より選択された少なくとも一つのDNA領域に
アニーリングできる一対のオリゴヌクレオチドプライマ
ー対を用いて、該少なくとも一つのDNA領域、あるいは
その一部であって下記式〔13〕〜〔18〕で表される塩基
配列から選択される少なくとも一つの塩基配列を含有す
るDNA領域を増幅させることを特徴とするヒトパピロー
マウイルスHPV16、HPV18、HPV33のうちの少なくとも一
つの検出方法に関する。
PV18及びHPV33のE6、E7領域中に示される特定のDNA領域
より成る群より選択された少なくとも一つのDNA領域に
アニーリングできる一対のオリゴヌクレオチドプライマ
ー対を用いて、該少なくとも一つのDNA領域、あるいは
その一部であって下記式〔13〕〜〔18〕で表される塩基
配列から選択される少なくとも一つの塩基配列を含有す
るDNA領域を増幅させることを特徴とするヒトパピロー
マウイルスHPV16、HPV18、HPV33のうちの少なくとも一
つの検出方法に関する。
更に、本発明の第２の発明は上記第１の発明の方法を
用いて検出を行うための検出キットであって、第１の発
明のオリゴヌクレオチドプライマー対、及び／又は増幅
されたDNAを検出するためのタイプ特徴的プローブを含
有していることを特徴とする。
用いて検出を行うための検出キットであって、第１の発
明のオリゴヌクレオチドプライマー対、及び／又は増幅
されたDNAを検出するためのタイプ特徴的プローブを含
有していることを特徴とする。
前記課題を解決する手段として、ヒトゲノムDNA中に
必ず挿入されているHPV初期遺伝子E6及びE7のDNA領域の
範囲で、HPV16、HPV18、HPV33にそれぞれ特徴あるDNA領
域を選定し、それぞれの領域について、PCR法を用いたH
PV DNA増幅に必要なオリゴヌクレオチドプライマーDNA
を合成し、続いて実際に感染細胞よりDNAを調製し、そ
れぞれの領域をPCR法で増幅し、高い検出感度を有する
領域を選定することが必要である。
必ず挿入されているHPV初期遺伝子E6及びE7のDNA領域の
範囲で、HPV16、HPV18、HPV33にそれぞれ特徴あるDNA領
域を選定し、それぞれの領域について、PCR法を用いたH
PV DNA増幅に必要なオリゴヌクレオチドプライマーDNA
を合成し、続いて実際に感染細胞よりDNAを調製し、そ
れぞれの領域をPCR法で増幅し、高い検出感度を有する
領域を選定することが必要である。
本発明者らはこのため鋭意研究を重ね、E6及びE7領域
にそれぞれ１組ずつ、各HPVに特徴的な増強領域、PCR法
に最適の各プライマーDNA配列、また増幅されたDNA領域
を効率よく検出するプローブ配列を見出した。また、こ
のHPVの特定の領域を増幅、検出するためのプライマー
とプローブを含有するキットを作成し、本キットを用い
ることにより、HPV16、HPV18及びHPV33が簡便に検出で
きることを見出し、本発明を完成させた。
にそれぞれ１組ずつ、各HPVに特徴的な増強領域、PCR法
に最適の各プライマーDNA配列、また増幅されたDNA領域
を効率よく検出するプローブ配列を見出した。また、こ
のHPVの特定の領域を増幅、検出するためのプライマー
とプローブを含有するキットを作成し、本キットを用い
ることにより、HPV16、HPV18及びHPV33が簡便に検出で
きることを見出し、本発明を完成させた。
以下、順を追って本発明を具体的に説明する。HPV16
型、18型、33型は既にクローニングされており、その全
塩基配列は、ビロロジイ（Virology）、第145巻、第181
〜185頁（1985）、ジャーナル オブ モレキュラー
バイオロジイ（Journal of Molecular Biology）、第19
3巻、第599〜608頁（1987）、及びジャーナル オブ
ビロロジイ（Journal of Virology）、第58巻、第991〜
995頁（1986）に記載されている。
型、18型、33型は既にクローニングされており、その全
塩基配列は、ビロロジイ（Virology）、第145巻、第181
〜185頁（1985）、ジャーナル オブ モレキュラー
バイオロジイ（Journal of Molecular Biology）、第19
3巻、第599〜608頁（1987）、及びジャーナル オブ
ビロロジイ（Journal of Virology）、第58巻、第991〜
995頁（1986）に記載されている。
HPVがヒトゲノムDNA中に挿入される際、大きな欠損を
経て、少なくともE6及びE7領域を含む領域がゲノム中に
残ることは公知である。
経て、少なくともE6及びE7領域を含む領域がゲノム中に
残ることは公知である。
このE6領域の範囲で領域１の各HPV16、HPV18、HPV33
に特徴的なDNA領域を選定し、また、E7領域の範囲で領
域IIの各HPVに特徴的なDNA領域を選定した（表１）。
に特徴的なDNA領域を選定し、また、E7領域の範囲で領
域IIの各HPVに特徴的なDNA領域を選定した（表１）。
それぞれの領域を増幅するためには、オリゴヌクレオ
チドプライマーDNA、すなわち、増幅領域の５′末端か
ら約20塩基のセンス配列及び３′末端から約20塩基のア
ンチセンス配列を有するプライマーDNA対がウイルスの
各タイプについて必要である。このプライマー対で前述
の選定DNA領域にアニーリングできるものであれば良い
が、その一例として表２に示すようなプライマーDNAをD
NA合成機により合成することができ、HPLCにて精製する
ことができる。
チドプライマーDNA、すなわち、増幅領域の５′末端か
ら約20塩基のセンス配列及び３′末端から約20塩基のア
ンチセンス配列を有するプライマーDNA対がウイルスの
各タイプについて必要である。このプライマー対で前述
の選定DNA領域にアニーリングできるものであれば良い
が、その一例として表２に示すようなプライマーDNAをD
NA合成機により合成することができ、HPLCにて精製する
ことができる。
検出するHPV DNA標品については、HPVをクローニン
グしたプラスミド、HPV DNAが挿入されていることが公
知である子宮頚がん細胞株SiHa及びHeLa細胞、更に子宮
頚がん及び前がん病変の病理試料等より調製することが
できる。細胞、組織からのDNAの調製は公知の確立され
た方法を用いればよい。
グしたプラスミド、HPV DNAが挿入されていることが公
知である子宮頚がん細胞株SiHa及びHeLa細胞、更に子宮
頚がん及び前がん病変の病理試料等より調製することが
できる。細胞、組織からのDNAの調製は公知の確立され
た方法を用いればよい。
PCR法については、タックポリメラーゼを含む遺伝子
増幅キット及び自動遺伝子増幅装置がパーキンエルマー
社から市販されており、これらを用い、本発明のプライ
マー対を用い、特定のDNA領域の増幅反応を行えばよ
い。
増幅キット及び自動遺伝子増幅装置がパーキンエルマー
社から市販されており、これらを用い、本発明のプライ
マー対を用い、特定のDNA領域の増幅反応を行えばよ
い。
増幅後のHPV DNAの検出は、例えばアガロースゲル電
気泳動、及びドットハイブリダイゼーションを用いて行
うことができる。
気泳動、及びドットハイブリダイゼーションを用いて行
うことができる。
ドットハイブリダイゼーションの際、HPV各タイプのD
NA配列に特徴的な領域をプローブDNAとして選択するこ
とによりHPV各タイプを選別できる。
NA配列に特徴的な領域をプローブDNAとして選択するこ
とによりHPV各タイプを選別できる。
プローブDNAとしては上記の条件を満たせば何でもよ
いが、その一例を示せば表３のようなプローブがある。
いが、その一例を示せば表３のようなプローブがある。
これらのプローブDNAは前記プライマーDNAと同様の方
法で合成、精製することができる。該プローブDNAは標
識化することにより、高感度な検出が可能となる。標識
化の方法としては公知の方法なら何でも良いが例えばT4
ポリヌクレオチドキナーゼを用いプローブDNAの５′末
端を32Pで標識化するアイソトープ標識方法でも良い
し、プローブDNAの酵素標識、蛍光標識、ビオチン−ア
ビジン系での標識、また、ケミキプローブのようにプロ
ーブDNAにスルホン基を導入し、それを抗体を用いて認
識するような方法での標識方法等の非アイソトープ標識
方法でもよい。
法で合成、精製することができる。該プローブDNAは標
識化することにより、高感度な検出が可能となる。標識
化の方法としては公知の方法なら何でも良いが例えばT4
ポリヌクレオチドキナーゼを用いプローブDNAの５′末
端を32Pで標識化するアイソトープ標識方法でも良い
し、プローブDNAの酵素標識、蛍光標識、ビオチン−ア
ビジン系での標識、また、ケミキプローブのようにプロ
ーブDNAにスルホン基を導入し、それを抗体を用いて認
識するような方法での標識方法等の非アイソトープ標識
方法でもよい。
検出感度の検定はHPV DNAが10-6pg含まれるように、
健常な子宮頚部組織より調製した、HPVを含まないヒト
ゲノムDNAにて希釈した試料を用い、前記PCR法で増幅
後、例えばドットハイブリダイゼーションを用いて行う
ことができる。
健常な子宮頚部組織より調製した、HPVを含まないヒト
ゲノムDNAにて希釈した試料を用い、前記PCR法で増幅
後、例えばドットハイブリダイゼーションを用いて行う
ことができる。
本発明のプライマー対、プローブを用いれば10-6pgの
HPV DNAを検出することができ、このようにして、HPV
DNA配列の中でPCR法の最高感度で検出できる有効な検
出領域Ｉ、IIが明らかになり、HPV16、HPV18、HPV33の
高感度検出が可能となった。
HPV DNAを検出することができ、このようにして、HPV
DNA配列の中でPCR法の最高感度で検出できる有効な検
出領域Ｉ、IIが明らかになり、HPV16、HPV18、HPV33の
高感度検出が可能となった。
実際、同一集団でサザンハイブリダイゼーション法の
結果と比較したところ、サザンハイブリダイゼーション
法で検出不可能であった試料からもHPV DNAを検出する
ことができ、子宮頚がん組織で全体の84％、前がん病変
組織（CIN I〜CIN III）でも70％の高率でHPV DNAを検
出し、それぞれのタイピングをすることができた。
結果と比較したところ、サザンハイブリダイゼーション
法で検出不可能であった試料からもHPV DNAを検出する
ことができ、子宮頚がん組織で全体の84％、前がん病変
組織（CIN I〜CIN III）でも70％の高率でHPV DNAを検
出し、それぞれのタイピングをすることができた。
また、本HPVの特定DNA領域を増幅させるためのプライ
マー対、及び増幅されたDNA領域を検出するためのプロ
ーブをそろえてキットしておくことで、ヒトHPV16、HPV
18及びHPV33のうちの少なくとも一つの検出、検定を簡
便に行うことができる。なお、キットに用いる試薬は溶
液状でも良いし、凍結乾燥物でも良い。
マー対、及び増幅されたDNA領域を検出するためのプロ
ーブをそろえてキットしておくことで、ヒトHPV16、HPV
18及びHPV33のうちの少なくとも一つの検出、検定を簡
便に行うことができる。なお、キットに用いる試薬は溶
液状でも良いし、凍結乾燥物でも良い。
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されない。
が、本発明はこれら実施例に限定されない。
実施例１ PCR法によるHPV領域Ｉ、IIの増幅と検出 （１−１）ヒトゲノムDNAの調製 ヒト子宮頚がん細胞株SiHa細胞には１〜10コピーのHP
V16DNAが挿入されている。また、HeLa細胞には10〜50コ
ピーのHPV18DNAが挿入されている。それぞれの細胞をDM
D〔ダルベッコの改変イーグル培地（Dulbecco's Modifi
ed Eagle's Medium）、フロー・ラボラトリー社〕、10
％FBS〔ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum）、フロー
・ラボラトリー社〕、100ユニット/mlストレプトマイシ
ン（明治製菓）、100ユニット/mlペニシリンＧ（萬有製
薬）を含む培地で6cmカルチャーディッシュ中で培養し
た。約106細胞数になったところで培養を終了し、培地
を除去した。TEバッファー〔10mMトリス（Tris）−HCl
pH8.0、1mM EDTA〕、0.1M NaClを含む5mlの溶液で細胞
を洗浄した後、TEバッファー、0.5％SDSを含む5mlの溶
液を加え、室温、20分間放置し、ディッシュより細胞を
はがし取り、ポリスチレン製チューブに回収した。100
μg/mlになるようにプロテネースＫを加えたTEバッファ
ー5mlを加え、70℃、２時間処理した。
V16DNAが挿入されている。また、HeLa細胞には10〜50コ
ピーのHPV18DNAが挿入されている。それぞれの細胞をDM
D〔ダルベッコの改変イーグル培地（Dulbecco's Modifi
ed Eagle's Medium）、フロー・ラボラトリー社〕、10
％FBS〔ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum）、フロー
・ラボラトリー社〕、100ユニット/mlストレプトマイシ
ン（明治製菓）、100ユニット/mlペニシリンＧ（萬有製
薬）を含む培地で6cmカルチャーディッシュ中で培養し
た。約106細胞数になったところで培養を終了し、培地
を除去した。TEバッファー〔10mMトリス（Tris）−HCl
pH8.0、1mM EDTA〕、0.1M NaClを含む5mlの溶液で細胞
を洗浄した後、TEバッファー、0.5％SDSを含む5mlの溶
液を加え、室温、20分間放置し、ディッシュより細胞を
はがし取り、ポリスチレン製チューブに回収した。100
μg/mlになるようにプロテネースＫを加えたTEバッファ
ー5mlを加え、70℃、２時間処理した。
次にフェノールとクロロホルムの等量混合液5mlを加
え、静かにかくはんし、12000rpm、５分間遠心後、水層
を分離した。この水層に5mlのクロロホルムを加え、静
かにかくはんし、同様に遠心して水層を分離した。
え、静かにかくはんし、12000rpm、５分間遠心後、水層
を分離した。この水層に5mlのクロロホルムを加え、静
かにかくはんし、同様に遠心して水層を分離した。
この水層に0.5mlの3M酢酸ナトリウム10mlのエタノー
ルを加え、充分かくはんし、−70℃、15分間放置後、12
000rpm10分間遠心して、ゲノムDNAの沈殿を回収した。
ルを加え、充分かくはんし、−70℃、15分間放置後、12
000rpm10分間遠心して、ゲノムDNAの沈殿を回収した。
沈殿は80％のエタノールでリンスした後、乾燥させ、
1mlの滅菌水に溶解した。ゲノムDNAは約100μｇ回収で
きた。
1mlの滅菌水に溶解した。ゲノムDNAは約100μｇ回収で
きた。
子宮頚がん組織、尖形コンジローマ（Condyloma acum
inatum）組織及び子宮筋腫患者より得た健常な子宮頚部
組織は、組織切片100mgを解剖はさみで充分細かく切っ
た後、上記と同様に、プロテネースＫ処理、フェノール
−クロロホルム処理を行い、約100μｇのゲノムDNAを回
収した。
inatum）組織及び子宮筋腫患者より得た健常な子宮頚部
組織は、組織切片100mgを解剖はさみで充分細かく切っ
た後、上記と同様に、プロテネースＫ処理、フェノール
−クロロホルム処理を行い、約100μｇのゲノムDNAを回
収した。
（１−２）オリゴヌクレチドプライマーDNA及びプロー
ブDNAの合成及び精製 PCR法により特定組織のDNA配列を増幅させるには、そ
の領域の５′末端より約20塩基のセンス配列及び３′末
端より約20塩基のアンチセンス配列のオリゴヌクレオチ
ドプライマーDNAが必要である。また、HPVの各タイプを
ハイブリダイゼーション法により同定するためにオリゴ
マヌクレオチドプローブDNAが必要である。
ブDNAの合成及び精製 PCR法により特定組織のDNA配列を増幅させるには、そ
の領域の５′末端より約20塩基のセンス配列及び３′末
端より約20塩基のアンチセンス配列のオリゴヌクレオチ
ドプライマーDNAが必要である。また、HPVの各タイプを
ハイブリダイゼーション法により同定するためにオリゴ
マヌクレオチドプローブDNAが必要である。
表２、表３で示したプライマーDNA及びプローブDNAを
アプライドバイオシステムズ社のDNA合成機を用いて合
成し、脱保護の後、イオン交換HPLC（TSKゲル、DEAE−2
SWカラム）で精製し、Sep− pak C18（ウォーターズ
社）で脱塩し、各DNA約50μｇを得た。
アプライドバイオシステムズ社のDNA合成機を用いて合
成し、脱保護の後、イオン交換HPLC（TSKゲル、DEAE−2
SWカラム）で精製し、Sep− pak C18（ウォーターズ
社）で脱塩し、各DNA約50μｇを得た。
（１−３）HPV16領域Ｉ、IIのPCR法による増幅 SiHa、HeLa細胞、HPV16に感染した子宮頚がん組織２
例、HPV6及びHPV11に感染した尖形コンジローマ組織２
例、HPVに感染していない健常な子宮頚部組織２例よ
り、（１−１）に記載のように調製したゲノムDNA1μｇ
を0.5ml用チューブ（バイオビック社）に取り、94℃、1
0分間加熱処理した。6ene AmpTM Kit（パーキン・エル
マー社）中の10μの10×増幅用バッファー〔100mMト
リス・HCl、pH8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.1％（W/
V）ゼラチン〕、16μの1.25mM dNTP混合液（dATP、d
GTP、dCTP、dTTP）、１μの20μＭ p16−１プライマ
ー、１μの20μＭ p16−2Rプライマー、0.5μの５
ユニット／μタック−ポリメラーゼを加え、更に滅菌
水を加えて100μの溶液にした。
例、HPV6及びHPV11に感染した尖形コンジローマ組織２
例、HPVに感染していない健常な子宮頚部組織２例よ
り、（１−１）に記載のように調製したゲノムDNA1μｇ
を0.5ml用チューブ（バイオビック社）に取り、94℃、1
0分間加熱処理した。6ene AmpTM Kit（パーキン・エル
マー社）中の10μの10×増幅用バッファー〔100mMト
リス・HCl、pH8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.1％（W/
V）ゼラチン〕、16μの1.25mM dNTP混合液（dATP、d
GTP、dCTP、dTTP）、１μの20μＭ p16−１プライマ
ー、１μの20μＭ p16−2Rプライマー、0.5μの５
ユニット／μタック−ポリメラーゼを加え、更に滅菌
水を加えて100μの溶液にした。
この反応液は、上層に100μのミネラルオイル（シ
グマ社）を加えた後、自動遺伝子増幅装置サーマル−サ
イクラー（パーキンエルマー社）により増幅反応を行っ
た。
グマ社）を加えた後、自動遺伝子増幅装置サーマル−サ
イクラー（パーキンエルマー社）により増幅反応を行っ
た。
反応条件は94℃、１分間の変性→55℃、２分間のプラ
イマーのアニーリング→72℃、２分間の合成反応のサイ
クルを30サイクル行った。反応後、上層のミネラルオイ
ルを除去した後、反応液の10μを取り、３％ Nusieve
GTGアガロース−１％ Sea−kemアガロース（FMC社）ゲ
ル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドでDNAを染色
し、増幅されたDNAを確認した。
イマーのアニーリング→72℃、２分間の合成反応のサイ
クルを30サイクル行った。反応後、上層のミネラルオイ
ルを除去した後、反応液の10μを取り、３％ Nusieve
GTGアガロース−１％ Sea−kemアガロース（FMC社）ゲ
ル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドでDNAを染色
し、増幅されたDNAを確認した。
SiHa細胞、HPV16感染子宮頚がん組織例に140bpのバン
トを確認した。
トを確認した。
またHeLa細胞、尖形コンジローマ例、健常な子宮頚部
からのゲノムからは増幅が認められず、p16−１及びp16
−2RプライマーDNAは、HPV16DNAを特異的に増幅してい
た。
からのゲノムからは増幅が認められず、p16−１及びp16
−2RプライマーDNAは、HPV16DNAを特異的に増幅してい
た。
同様の方法で、p16−３、p16−4Rのプライマーを用い
て、領域IIを増幅し、SiHa細胞、HPV16感染子宮頚がん
組織例に89bpの増幅DNAのバンドを確認した。
て、領域IIを増幅し、SiHa細胞、HPV16感染子宮頚がん
組織例に89bpの増幅DNAのバンドを確認した。
（１−４）ドットハイブリダイゼーションによるHPVタ
イプの確認 （１−３）で得た反応液を94℃で10分間処理し、氷中
で急冷してDNAを変性させた。この反応液１μをナイ
ロンメンブラン（シュライヘル ウント シュエル）上
にスポットし、紫外線トランスイルミネーター（254n
m）に10分間照射させ、DNAをメンブランに固定させた。
イプの確認 （１−３）で得た反応液を94℃で10分間処理し、氷中
で急冷してDNAを変性させた。この反応液１μをナイ
ロンメンブラン（シュライヘル ウント シュエル）上
にスポットし、紫外線トランスイルミネーター（254n
m）に10分間照射させ、DNAをメンブランに固定させた。
このメンブランは、プレハイブリダイゼーションバッ
ファー（５×デンハーツ液、５×SSC、100μg/mlサケ精
子DNA）10ml中で37℃、２時間プレハイブリダイゼーシ
ョンを行った。
ファー（５×デンハーツ液、５×SSC、100μg/mlサケ精
子DNA）10ml中で37℃、２時間プレハイブリダイゼーシ
ョンを行った。
次に、32Pにて５′末端をラベルしたプローブDNA pB
16−Ｉを加え、37℃、２時間ハイブリダイゼーションを
行った。
16−Ｉを加え、37℃、２時間ハイブリダイゼーションを
行った。
プローブの32P−ラベルはメガラベルキット（MEGALAB
EL Kit）（宝酒造）を用いて次のように行った。10p mo
le/μのプローブDNA １μ、１μの×10リン酸化
バッファー、10μ Ci/μの〔γ−32P〕ATP（アマシャ
ム）５μ、10ユニットのT4−ポリヌクレオチドキナー
ゼ１μを含む反応液に滅菌水２μを加えて10μに
し、37℃、30分間反応させた。反応後65℃、10分間処理
し、この反応液の２μ（約108cpm）をハイブリダイゼ
ーションに用いた。
EL Kit）（宝酒造）を用いて次のように行った。10p mo
le/μのプローブDNA １μ、１μの×10リン酸化
バッファー、10μ Ci/μの〔γ−32P〕ATP（アマシャ
ム）５μ、10ユニットのT4−ポリヌクレオチドキナー
ゼ１μを含む反応液に滅菌水２μを加えて10μに
し、37℃、30分間反応させた。反応後65℃、10分間処理
し、この反応液の２μ（約108cpm）をハイブリダイゼ
ーションに用いた。
ハイブリダイゼーション後、メンブランを２×SSC、
0.1％SDSを含む洗浄液１で室温、10分間で２回洗浄し、
続いて0.2×SSC、0.1％SDSを含む洗浄液２で55℃、20分
間で２回洗浄した。メンブランは乾燥させた後、Ｘ線フ
ィルム（富士フィルム）を入れたカセット内で−70℃、
３時間感光させ、オートラジオグラフをとった。
0.1％SDSを含む洗浄液１で室温、10分間で２回洗浄し、
続いて0.2×SSC、0.1％SDSを含む洗浄液２で55℃、20分
間で２回洗浄した。メンブランは乾燥させた後、Ｘ線フ
ィルム（富士フィルム）を入れたカセット内で−70℃、
３時間感光させ、オートラジオグラフをとった。
この結果、SiHa細胞、HPV16感染子宮頚がん組織増幅D
NAはpB16−Ｉプローブとハイブリダイゼーションしドッ
トが現われた。その他のHeLa細胞、尖形コンジローマ、
健常な子宮頚部ゲノムDNAのハイブリダイゼーションは
全く認められなかった。
NAはpB16−Ｉプローブとハイブリダイゼーションしドッ
トが現われた。その他のHeLa細胞、尖形コンジローマ、
健常な子宮頚部ゲノムDNAのハイブリダイゼーションは
全く認められなかった。
また、プローブをpB18−Ｉ及びpB33−Ｉに変えてハイ
ブリダイゼーションを行ったが、全くハイブリダイゼー
ションは認められなかった。この結果は、プライマーp1
6−１及びp16−2RでHPV16が特異的に増幅され、プロー
ブpB16−ＩとのハイブリダイゼーションでHPV16が特異
的に検出できることを示すものである。
ブリダイゼーションを行ったが、全くハイブリダイゼー
ションは認められなかった。この結果は、プライマーp1
6−１及びp16−2RでHPV16が特異的に増幅され、プロー
ブpB16−ＩとのハイブリダイゼーションでHPV16が特異
的に検出できることを示すものである。
また、プライマーp16−３、p16−4Rを用いたHPV16領
域II増幅標品はプローブpB16−IIと特異的にハイブリダ
イゼーションした。
域II増幅標品はプローブpB16−IIと特異的にハイブリダ
イゼーションした。
（１−５）HPV16領域Ｉ、IIを用いたHPV16 DNAの検出
感度の検定 領域Ｉ、IIを用いて、HPV16DNAの検出限界をクローン
化されたプラスミドを用いたモデル実験系をつくり検定
した。プラスミドとしてHPV16DNAのE6、E7領域を含むPs
t I切断断片Ｂ〔1776bp、ジャーナル オブ ビロロジ
イ 第58巻、第979〜982頁（1986）〕をベクターpSV2ne
o（5.6kb）のPst Iサイトに挿入したプラスミドをp16Ps
t I Bと名付けて用いた。
感度の検定 領域Ｉ、IIを用いて、HPV16DNAの検出限界をクローン
化されたプラスミドを用いたモデル実験系をつくり検定
した。プラスミドとしてHPV16DNAのE6、E7領域を含むPs
t I切断断片Ｂ〔1776bp、ジャーナル オブ ビロロジ
イ 第58巻、第979〜982頁（1986）〕をベクターpSV2ne
o（5.6kb）のPst Iサイトに挿入したプラスミドをp16Ps
t I Bと名付けて用いた。
ヒトの全ゲノムDNAの鎖長を３×109bpとして、p16Pst
I B 10コピー／ゲノムDNAとなるようにp16Pst I Bを
健常な子宮頚部から（１−１）で得たゲノムDNAにて希
釈した。すなわち245pgのp16Pst I Bを10μｇの健常な
ゲノムDNAで希釈した。これを健常なゲノムDNAで10倍希
釈し、p16Pst I B10〜10-6コピー／ゲノムDNAのモデル
テンプレートDNAを調製した。この場合10-6コピー／ゲ
ノムDNAの１μｇはHPV DNA1分子分、約10-6pgに相当す
る。各モデルテンプレートDNA1μｇを用いて（１−３）
に示した方法で領域Ｉを増幅させた。更に（１−４）に
示した方法でドットハイブリダイゼーションを行った。
この結果10-6コピー／ゲノムDNAまでドット検出され
た。また、領域IIについても同様の感度を得た。
I B 10コピー／ゲノムDNAとなるようにp16Pst I Bを
健常な子宮頚部から（１−１）で得たゲノムDNAにて希
釈した。すなわち245pgのp16Pst I Bを10μｇの健常な
ゲノムDNAで希釈した。これを健常なゲノムDNAで10倍希
釈し、p16Pst I B10〜10-6コピー／ゲノムDNAのモデル
テンプレートDNAを調製した。この場合10-6コピー／ゲ
ノムDNAの１μｇはHPV DNA1分子分、約10-6pgに相当す
る。各モデルテンプレートDNA1μｇを用いて（１−３）
に示した方法で領域Ｉを増幅させた。更に（１−４）に
示した方法でドットハイブリダイゼーションを行った。
この結果10-6コピー／ゲノムDNAまでドット検出され
た。また、領域IIについても同様の感度を得た。
すなわち領域Ｉ、IIを用いることで、試料中の１分子
HPV DNA（10-6pg）を検出することができ、PCR法の最
高感度の検出をすることができた。
HPV DNA（10-6pg）を検出することができ、PCR法の最
高感度の検出をすることができた。
（１−６）HPV18、HPV33の領域Ｉ、IIの増幅と検出 HPV18、HPV33の領域Ｉ、IIの増幅と検出を行った。
テンプレートDNAとして、HPV18のE6、E7領域を含むDN
A（7.9kb）を大腸菌プラスミドpBR322のEcoR I部位に挿
入したプラスミドpHPV18〔ジ エンボ ジャーナル（Th
e EMBO J）、第３巻、第1151〜1157頁（1984）〕、HPV3
3のE6、E7領域を含むDNA（7.9kb）を大腸菌プラスミドp
link322のBgl II部位に挿入したプラスミドpHPV33〔ジ
ャーナル オブ ビロロジイ、第58巻、第991〜995頁
（1986）〕、HPV16のE6、E7領域を含むDNA（7.9kb）を
前記プラスミドpBR322のEcoR I部位に挿入したプラスミ
ドpHPV16〔プロシーディングズ オブ ザ ナショナル
アカデミーオブ サイエンシーズ オブ ザ USA、
第80巻、第3812〜3815頁（1983）〕それぞれ1ng、及び
（１−１）で調製したSiHa細胞、HeLa細胞のゲノムDNA
それぞれ１μｇを用いた。
A（7.9kb）を大腸菌プラスミドpBR322のEcoR I部位に挿
入したプラスミドpHPV18〔ジ エンボ ジャーナル（Th
e EMBO J）、第３巻、第1151〜1157頁（1984）〕、HPV3
3のE6、E7領域を含むDNA（7.9kb）を大腸菌プラスミドp
link322のBgl II部位に挿入したプラスミドpHPV33〔ジ
ャーナル オブ ビロロジイ、第58巻、第991〜995頁
（1986）〕、HPV16のE6、E7領域を含むDNA（7.9kb）を
前記プラスミドpBR322のEcoR I部位に挿入したプラスミ
ドpHPV16〔プロシーディングズ オブ ザ ナショナル
アカデミーオブ サイエンシーズ オブ ザ USA、
第80巻、第3812〜3815頁（1983）〕それぞれ1ng、及び
（１−１）で調製したSiHa細胞、HeLa細胞のゲノムDNA
それぞれ１μｇを用いた。
（１−２）で得たプライマーDNA p18−１とp18−2R
及びp33−１とp33−2Rをそれぞれ含む反応系で（１−
３）に示した方法で増幅を行った。更に（１−４）に示
した方法でドットハイブリダイゼーションを行い、プロ
ーブDNAとして、（１−２）で得たpB18−Ｉ、pB33−Ｉ
を用いた。
及びp33−１とp33−2Rをそれぞれ含む反応系で（１−
３）に示した方法で増幅を行った。更に（１−４）に示
した方法でドットハイブリダイゼーションを行い、プロ
ーブDNAとして、（１−２）で得たpB18−Ｉ、pB33−Ｉ
を用いた。
p18−１とp18−2Rをプライマーとした増幅ではpHPV18
及びHeLa細胞の増幅DNAが、プローブpB18−Ｉとハイブ
リダイズし、ドットが現われた。
及びHeLa細胞の増幅DNAが、プローブpB18−Ｉとハイブ
リダイズし、ドットが現われた。
また、p33−１とp33−2Rをプライマーとし増幅ではpH
PV33のみがプローブpB33−Ｉとハイブリダイズしドット
が現われた。この結果、領域Ｉにおいてそれぞれのウイ
ルスタイプのプライマーDNAを用いて各ウイルスタイプ
のDNAが特異的に増幅され、各プローブDNAで検出される
ことが明らかになった。
PV33のみがプローブpB33−Ｉとハイブリダイズしドット
が現われた。この結果、領域Ｉにおいてそれぞれのウイ
ルスタイプのプライマーDNAを用いて各ウイルスタイプ
のDNAが特異的に増幅され、各プローブDNAで検出される
ことが明らかになった。
同様に各テンプレートDNAを、（１−２）で得たプラ
イマーDNA p18−３とp18−4R及びp33−３とp33−4Rを
それぞれ含む反応系で増幅を行い、プローブDNAとして
（１−２）で得たpB18−II、pB33−IIを用いてHPV18、H
PV33の領域IIの検出を行った。その結果領域IIにおいて
もそれぞれのウイルスタイプのプライマーDNAで各ウイ
ルスタイプのDNAが増幅され、各プローブDNAで検出され
た。
イマーDNA p18−３とp18−4R及びp33−３とp33−4Rを
それぞれ含む反応系で増幅を行い、プローブDNAとして
（１−２）で得たpB18−II、pB33−IIを用いてHPV18、H
PV33の領域IIの検出を行った。その結果領域IIにおいて
もそれぞれのウイルスタイプのプライマーDNAで各ウイ
ルスタイプのDNAが増幅され、各プローブDNAで検出され
た。
（１−５）と同様の方法で各テンプレートDNAプラス
ミドを健常な子宮頚部から得たゲノムで希釈後、各プラ
イマー対、各プローブで増幅、検出を行い、（１−５）
と同様HPV DNA 10-6コピー／ゲノムDNAの最高感度を
得た。すなわち試料中のHPV DNA １分子約10-6pgを検
出することができた。
ミドを健常な子宮頚部から得たゲノムで希釈後、各プラ
イマー対、各プローブで増幅、検出を行い、（１−５）
と同様HPV DNA 10-6コピー／ゲノムDNAの最高感度を
得た。すなわち試料中のHPV DNA １分子約10-6pgを検
出することができた。
以上の結果、HPV領域Ｉ、IIはHPV16、HPV18及びHPV33
の各ウイルスタイプの検出に有効であり、各領域に対応
するプライマー対、プローブを用いることによりHPV1
6、HPV18、及びHPV33が高感度で検出された。
の各ウイルスタイプの検出に有効であり、各領域に対応
するプライマー対、プローブを用いることによりHPV1
6、HPV18、及びHPV33が高感度で検出された。
実施例２ HPV16、HPV18、HPV33増幅・検出キットの作成 試料中のHPV16、HPV18、HPV33のDNAの増幅・検出する
ためのキットを作成した。
ためのキットを作成した。
DNA増幅用プライマーとしてp16−１、p16−2R、p18−
１、p18−2R、p33−１、p33−2Rが各４μＭ溶液となる
ようにTEバッファー100μに溶解し、HPVプライマー液
（Ａ剤）とした。
１、p18−2R、p33−１、p33−2Rが各４μＭ溶液となる
ようにTEバッファー100μに溶解し、HPVプライマー液
（Ａ剤）とした。
DNA検出用プローブとして、pB16−Ｉ、pB18−Ｉ、pB3
3−Ｉ各２μｇをTEバッファー20μにそれぞれ溶解
し、HPV16プローブ液（Ｂ剤）、HPV18プローブ液（Ｃ
剤）、HPV33プローブ液（Ｄ剤）とした。Ａ剤、Ｂ剤、
Ｃ剤、Ｄ剤を一組とし、HPV増幅検出キットとした（表
４）。
3−Ｉ各２μｇをTEバッファー20μにそれぞれ溶解
し、HPV16プローブ液（Ｂ剤）、HPV18プローブ液（Ｃ
剤）、HPV33プローブ液（Ｄ剤）とした。Ａ剤、Ｂ剤、
Ｃ剤、Ｄ剤を一組とし、HPV増幅検出キットとした（表
４）。
実施例３ 子宮頚がん及び前がん病変組織におけるHPV
DNAの検出 43例の子宮頚がん摘出組織約100mg及び27例の前がん
病変（CIN）バイオプシ約10mgより（１−１）の方法に
よりゲノムDNAをそれぞれ約100μｇ、約10μｇ得た。
DNAの検出 43例の子宮頚がん摘出組織約100mg及び27例の前がん
病変（CIN）バイオプシ約10mgより（１−１）の方法に
よりゲノムDNAをそれぞれ約100μｇ、約10μｇ得た。
これらのゲノムDNA1μｇを94℃、10分間熱変性させた
後、Gene Amp Kit中の10μの×10バッファー、16μ
の1.25mM dNTP混合液、0.5μの５ユニット／μタッ
クポリメラーゼ及び実施例２記載のキットＡ剤５μを
加え、滅菌水を加えて100μの反応液を調製した。
（１−３）の方法により、HPV16、18、33の領域Ｉを１
本のチューブ内で増幅させた。
後、Gene Amp Kit中の10μの×10バッファー、16μ
の1.25mM dNTP混合液、0.5μの５ユニット／μタッ
クポリメラーゼ及び実施例２記載のキットＡ剤５μを
加え、滅菌水を加えて100μの反応液を調製した。
（１−３）の方法により、HPV16、18、33の領域Ｉを１
本のチューブ内で増幅させた。
増幅後、DNAを熱変性させ、各１μの反応液を３枚
のナイロンメンブランにスポットし、同じメンブランを
３枚準備し、（１−４）の方法により、ドットハイブリ
ダイゼーションを行った。
のナイロンメンブランにスポットし、同じメンブランを
３枚準備し、（１−４）の方法により、ドットハイブリ
ダイゼーションを行った。
すなわち、実施例２記載のＢ剤、Ｃ剤、Ｄ剤各１μ
を用い、（１−４）の方法により、32Pラベルしたプロ
ーブDNA、pB16−Ｉ、pB18−Ｉ、pB33−Ｉの３種を準備
し、３枚のメンブランにそれぞれのプローブDNAを加
え、ハイブリダイゼーションさせ、HPVの各タイプを同
定した。
を用い、（１−４）の方法により、32Pラベルしたプロ
ーブDNA、pB16−Ｉ、pB18−Ｉ、pB33−Ｉの３種を準備
し、３枚のメンブランにそれぞれのプローブDNAを加
え、ハイブリダイゼーションさせ、HPVの各タイプを同
定した。
表５に示すように子宮頚がん組織43例より全体で36例
（84％）にHPV DNAを検出した。
（84％）にHPV DNAを検出した。
また、下記表６に示すように、前がん病変組織27例よ
り全体で19例（70％）にHPV DNAを検出することができ
た。
り全体で19例（70％）にHPV DNAを検出することができ
た。
すなわちCIN I ８例中５例、CIN II ９例中７例、C
IN III 10例中７例にHPV DNAが検出でき、CIN I〜III
すべての段階で検出可能であった。
IN III 10例中７例にHPV DNAが検出でき、CIN I〜III
すべての段階で検出可能であった。
領域IIに関しても同様の結果が得られ、領域Ｉ、IIが
実際の病理試料からの検出にも有効であった。
実際の病理試料からの検出にも有効であった。
〔発明の効果〕 以上詳細に説明したように、本発明によりPCR法を用
いたHPV DNAの高感度検出に有効な領域Ｉ、IIが明らか
になり、子宮頚がん組織中及び前がん病変組織中のHPV
ゲノムの高感度検出方法及びキットが提供された。
いたHPV DNAの高感度検出に有効な領域Ｉ、IIが明らか
になり、子宮頚がん組織中及び前がん病変組織中のHPV
ゲノムの高感度検出方法及びキットが提供された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/70 C12N 15/30 - 15/51 G01N 33/53 - 33/60 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ)
Claims (3)
- 【請求項１】下記式〔１〕〜〔６〕で表される特定のDN
A領域からなる群から選択された少なくとも一つのDNA領
域にアニーリングできる一対のオリゴヌクレオチドプラ
イマー対を用いて、下記式〔１〕〜〔６〕で表される特
定のDNA領域よりなる群から選択された少なくとも一つ
のDNA領域、あるいはその一部であって下記式〔13〕〜
〔18〕で表される塩基配列から選択される少なくとも一
つの塩基配列を含有するDNA領域を増幅させることを特
徴とするヒトパピローマウイルスHPV16、HPV18、HPV33
のうちの少なくとも一つの検出方法。 - 【請求項２】請求項１記載のプライマー対が、下記式
〔７〕〜〔12〕で表されるプライマー対よりなる群から
選択したプライマー対である請求項１記載の検出方法。 - 【請求項３】請求項１記載の方法を用いて検出を行うた
めの検出キットであって、請求項１記載のオリゴヌクレ
オチドプライマー対、及び／又は増幅されたDNAを検出
するためのタイプ特徴的プローブを含有していることを
特徴とするヒトパピローマウイルス検出キット。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1144230A JP2791685B2 (ja) | 1989-06-08 | 1989-06-08 | パピローマウイルスの検出方法 |
| EP90306185A EP0402132B1 (en) | 1989-06-08 | 1990-06-07 | Method for the detection of human papilloma-virus |
| DE1990615261 DE69015261T2 (de) | 1989-06-08 | 1990-06-07 | Verfahren zum Nachweis des humanen Papillomvirus. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1144230A JP2791685B2 (ja) | 1989-06-08 | 1989-06-08 | パピローマウイルスの検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0310700A JPH0310700A (ja) | 1991-01-18 |
| JP2791685B2 true JP2791685B2 (ja) | 1998-08-27 |
Family
ID=15357271
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1144230A Expired - Lifetime JP2791685B2 (ja) | 1989-06-08 | 1989-06-08 | パピローマウイルスの検出方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0402132B1 (ja) |
| JP (1) | JP2791685B2 (ja) |
| DE (1) | DE69015261T2 (ja) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3907721A1 (de) * | 1989-03-10 | 1990-09-20 | Behringwerke Ag | Immunogene regionen auf dem e7-protein des humanen papillomvierus typ 16 |
| US5580970A (en) * | 1989-12-01 | 1996-12-03 | Amoco Corporation | Detection of HPV transcripts |
| JPH05501650A (ja) * | 1989-12-01 | 1993-04-02 | バイシス・インコーポレーテツド | Ｈｐｖ転写物の検出 |
| GB9015845D0 (en) * | 1990-07-19 | 1990-09-05 | Emery Vincent C | Diagnostic method |
| CA2052413C (en) * | 1990-09-28 | 2004-07-13 | Jeffrey L. Joseph | Nucleotides sequences useful as type-specific probes, pcr primers and lcr probes for the amplifications and detection of human papilloma virus, and related kits and methods |
| IT1244462B (it) * | 1990-12-06 | 1994-07-15 | Sclavo Spa | Oligonucleotidi sintetici utili per la diagnosi di infezione da tipi diversi di virus del gruppo papilloma e loro utilizzazione |
| IL97226A0 (en) * | 1991-02-13 | 1992-05-25 | Orgenics Ltd | Detection of high and low risk human papillomavirus by enzymatic amplification of dna |
| FR2679254B1 (fr) * | 1991-07-17 | 1993-11-19 | Clonatec | Sondes oligonucleotidiques pour le typage et la detection des papillomavirus humains. |
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