JPH0458888A - ヒトパピローマウィルス遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチド及びそれを用いた検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒトパピローマウィルス遺伝子を検出するため
のオリゴヌクレオチド及びそれを用いたヒトパピローマ
ウィルス遺伝子の検出方法に関する。更に詳しくは、ヒ
トパピローマウィルス１６型、１８型、３３型の遺伝子
をそれぞれ特異的に検出する型特異的な検出と型別をこ
えて検出できるユニバーサルな検出に関するものである
。

〔従来の技術〕

ヒトパピローマウィルス（ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌＬｏ
ｍａｖｉｒｕｓ：　ＨＰＶ）は、皮膚や粘膜上皮に貌の
ような増殖性病変を起こすウィルスとして知られている
。

ＨＰＶの起こす病変は、一般に良性であるが、ときに悪
性化する場合がある。ＨＰＶの感染標的細胞は、培養の
難しい上皮系の細胞であり、しかも分化細胞でのみ増殖
するという特徴があるため、培養細胞を用いたＨＰＶの
増殖系は確立されていない。そのため、ウィルス粒子そ
のものを用いてＨＰＶについて研究することができない
のが実情である。

しかし、近年の遺伝子工学の進歩によりＨＰＶの遺伝子
を病変部より直接クローン化し、解析することができる
ようになった。その結果、ＨＰＶには、多数の種類（型
）があり、現在ではすでに約６０種が同定されるに至っ
ている。さらに１６型、１８型、３１型、３３型、３５
型、５２型等の特定の型のＨＰＶの遺伝子が子宮頚癌、
咽頭癌、皮膚癌、食道癌等のある種の癌で検出されるこ
とが明らかになり、これらの癌の発生とＨＰＶ感染の関
係かにわかに注目されるようになった。特に子宮頚癌で
は、高頻度にＨＰＶの遺伝子が検出されている。なかで
も、ＨＰＶの１６型、１８型、３１型、３３型、３５型
等は国際的な疫学調査結果では子宮頚癌の約７０％にお
いて発見されているとの報告があり、日本でも上記の型
のＨＰＶＯ高頻度な感染が確認されている。更に日本に
おいては５２型の感染を重視する報告もなされている（
ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４８．７１６４−
７１７２．１９８８）　ｏ従って、ＨＰＶ感染の有無の
判断が臨床における診断上重要視されているが、前記の
ように、ウィルス粒子としてＨＰＶを増殖することが技
術的に困難なため、ＨＰＶに対する型特異的な抗血清に
よる免疫組織染色や血清抗体価を測定する診断法は未だ
確立されていてない。

そのため、ＨＰＶの感染有無の判定は遺伝子診断によら
ざるを得ないのが実情である。一般に、遺伝子診断法と
してはサインプロット法、インサイツハイプリダイゼー
ション法、Ｐ　ＣＲ法（Ｐｏｌｙｏ＋ｅｒａｓｅ　Ｃｈ
ａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ法）等が知られているが、特
に高感度なＰＣＲ法は手術やバイオプシーで得た検体の
他、子宮頚部スワップのような微量の検体からでもＨＰ
Ｖの遺伝子を検出しろるため、臨床診断での広汎な応用
が期待されている。

ＨＰＶ遺伝子の塩基配列は、いくつかの型について既に
報告があり、例えば１６型についてはＶ＋ｒｏｌｏｇｙ
、　１４５．１８１−１８５．１９８５．１８型につい
てはＪｏＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、、　１９３．５９９−６０
８．１９８７．３３型についてはＪ、　Ｖｉｒｏｌ、、
　５８．９９１−９９５．１９８６等において記載され
ている。これらに基づき、ＨＰＶ遺伝子のＰＣＲ法によ
る検出には、現に種々の試みがなされており、いくつか
の報告もなされている。

ＨＰＶのｒｅａｄｉｎｇ　ｆｌａｍｅ　　はＥ６、Ｅｌ
、Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５領域及びＬ２、Ｌ１領域に分
けられるが、型特異的な検出に用いられるプライマー以
下、型特異的プライマーと略す）としては、いずれもＨ
ＰＶのＥ６領域からプライマーを作製したものが報告さ
れており、例えば１６型、１８型をそれぞれ型特異的に
検出したもの（Ｊ、　ＢＸＩｌｏＭｅｄ、、　１６７、
２２５−２３０．１９８８）、１１型、１６型、１８型
をそれぞれ型特異的に検出したもの（ＢＭＪ、　２９８
、１４−１８．１９８８）及び１６型、１８型、３３型
をそれぞれ型特異的に検出したもの（Ｊｐｎ、　Ｊ、Ｃ
ａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　８１．　１−５．　１９９０
）が挙げられる。

また型別をこえて広く検出しうるプライマー（以下、ユ
ニバーサルプライマーと略す）を用いての検出としては
、ＨＰＶのＥ１領域からプライマーを作製したもの（Ｊ
、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　２７゜２６
６０−２６６５．１９８９）及びＬ１領域からプライマ
ーを作製したもの（ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ、　７．
２０９−２１４．１９８９、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒ
ｏｌ、、　７１．１７３−１８１．１９９０）が挙げら
れる。即ち、前者のＪ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｌ、　２７２２６０−２６６５．１９８９では、Ｅ
１領域からユニバーサルプライマーを作製し、６型、１
１型、１６型、１８型、３３型の各型が検出されること
が示されている。しかし、Ｅ１領域はＨＰＶの宿主細胞
ＤＮＡへの組み込みの際に、よく破壊されている領域で
あることが知られており、ユニバーサルプライマーの場
所としてはあまり望ましくないと考えられる。一方、Ｌ
ｌ領域を用いたＣａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ。

７、２０９−２１４．１９８９では、塩基配列の異なる
５゛側プライマ一８種と３′側ブライマ一１６種を混合
させて使うことにより、６型、１１型、１６型、１８型
、３３型の各型が一度で検出されることが示されている
。また、同様にＬ１領域を用いたＪ。

Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、、　７１．　１７３−１８１．１
９９０では、２組のプライマーが用意されており、１組
は６ｂ型、１１型、１３型、１６型、１８型、３０型、
３１型、３２型、３３型の冬型を、他の１組はｌ型と８
型を増幅することが示されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

前記のように、ＨＰＶ遺伝子の検出方法としてＰＣＲに
より増幅させたＨＰＶの遺伝子断片を検出する方法は、
種々試みられている。しかし、増幅に際しては目的とす
る遺伝子のどの部分を用いてもよいというものではなく
、増幅が容易な部分とそうでない部分や、特異的な増幅
をするものと非特異的な増幅をするものなどがあり、プ
ライマーに用いるオリゴヌクレオチドの違いによって検
出感度に大きな差が生じてくるものである。特に微量に
しか存在しない検体から高感度にＨＰＶ遺伝子を検出す
るには、ＨＰＶ遺伝子を特異的にかつ大量に増幅できる
部位を見出すことが重要である。

また、ＰＣＲのプライマーは検出しようとする遺伝子の
既知の塩基配列に基づいて合成するため、その部位に変
異や欠失が起こると、たとえ遺伝子そのものは存在して
いても検出できなくなる偽陰性の可能性がでてくる。こ
のような可能性をできるだけ抑えるため、プライマーを
作製するに当たっては、塩基配列の変異や欠失の起こり
にくい領域を選ぶ必要がある。また、プライマーは特定
の領域から選んだ一組だけでなく全く異なる領域からも
一組選んでおくと、さらに偽陰性の可能性を減らすこと
ができる。ＨＰＶの場合、癌細胞ではウィルスのゲノム
はほとんどの例で、宿主細胞のＤＮＡに組み込まれた状
態で存在していることが知られているが、組み込みのた
めに主にＥｌやＥ２領域に切断や欠失が起こることが知
られている。

このような観点から、前記の公知のプライマーについて
評価すると、まず型特異的プライマーでは、いずれもＨ
ＰＶのＥ６領域からプライマーを作製したものであり、
この領域から得たものは一応の検出感度と特異性が示さ
れている。しかし、特に前記のＪ、　Ｂｘｐ、　Ｍｅｄ
、、　１６７、２２５−２３０．１９８８やＪｐｎ、　
Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　８１．１−５．１９
９０では、５′側のプライマーとして共通のプライマー
が使用されているため、型特異的であるにもかかわらす
１Ｇ型と１８型で相互にかなりの交差増幅が生じ、型判
定には型特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーシ
ョンを行なう必要があるという問題点がある。

このような問題点を改善し、また上記のような理由、即
ち変異や欠失の起こりにくい領域からプライマーを作製
すること、更に偽陰性の可能性を減らすために２組のプ
ライマーを用意する必要があるという点からも、Ｅ６以
外の領域から選んだプライマーを用いたＨＰＶの高感度
検出法の開発が要請されているのが実情である。

そのためには（１）子宮頚癌細胞などで強く発現されて
おり、（２）ＨＰＶによる癌の発生や進展に最も重要な
役割を果たしていると考えられ、（３）変異や欠失など
も起こりにくい、Ｅ７領域からプライマーを作製するこ
とが最も望ましいと考えられる。

一方、ＨＰＶには現在までに約６０種が同定されており
、未知の型も多数存在することが推定されている。従っ
て、前記の型特異的な検出では、型が異なればＨＰＶ遺
伝子を検圧することはできない。即ち、どの型のＨＰＶ
感染かを判断するには、前記の型特異的な検出が必要で
あるが、ＨＰＶ感染自体の有無を判定するには、型特異
的な検出では全ての型について検査をすることが必要と
なり、現実的な方法ではない。従って、迅速に臨床検査
の結果を得るためには、一つの検査で型をこえてＨＰＶ
の遺伝子を検出することが必要である。

ユニバーサルな検出は、このような観点から試みられて
いるものであり、できるだけ異なる多くの型のＨＰＶ遺
伝子の検出が可能なプライマーの作製が要請されている
。

前記の公知のユニバーサルな検出では子宮頚癌との因果
関係が予測される１６型、１８型、３３型などを含め、
各種の型のＨＰＶ遺伝子の検出が可能であるものの、特
に、日本での子宮頚癌との因果関係が指摘されている５
２型の遺伝子も検出されるか否かは不明である。従って
、臨床検査上、特に重要なあるいは重要と思われる種々
の型の遺伝子はできるだけ幅広く検出できることが重要
であり、このような検出方法の確立が急務とされている
のが実情である。

前記の公知のユニバーサルな検出では、様々な型の間で
ホモロジーの高いＥｌあるいはＬｌの領域からプライマ
ーを作製している。しかし、Ｅ１領域は前記の如く、Ｈ
ＰＶのゲノムが宿主細胞のＤＮＡに組み込まれるときに
よく切断や欠失などの変化を受けるところであるので、
プライマーの場所としては望ましくないと考えられる。

またＬ１領域からユニバーサルプライマーを作製してい
る例では、−例は様々なＨＰＶＯ型を広く検出するため
に複数のプライマーを混合して用いるという方法を用い
ており、また他の例ではプライマーを２組用意すること
により検出可能な範囲を広げるという方法を用いている
。このような公知のＬ１ユニバーサルプライマーでは、
経済性や検査の簡便性の観点からすれば、まだまだ改善
の余地があり、−組のプライマーで同様に広い検出範囲
を持つＬ１ユニバーサルプライマーの確立が要請される
次第である。

このようにＨＰＶ感染の有無の診断並びに型別診断の方
法の確立は、医療上急務とされており、当該技術分野で
は、型特異的な検出とユニバーサルな検出に有用なプラ
イマーの作製が強く要請され、これまで種々の試みがな
されているが、前記の如く種々の報告はあるものの、未
だ十分に満足できるものとは言えない。

従って、本発明の目的は、ＨＰＶの型特異的な検出及び
ユニバーサルな検出に有用なプライマーとして利用でき
る新規なオリゴヌクレオチドを提供することにある。

本発明の他の目的は、そのようなオリゴヌクレオチドを
プライマーとして用いるＨＰＶ遺伝子の検出方法を提供
することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記目的を達成すべく種々研究を重ねた
結果、ＨＰＶ遺伝子のある特定部分に相補的なオリゴヌ
クレオチドが有用なプライマーとして使用できることを
見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った
。

即ち、本発明は、 （１）ＨＰＶ１６型遺伝子の検出用プライマーとして、
下記の（ａ）配列もしくは（ａｏ）配列からなるオリゴ
ヌクレオチド、又は（ａ）配列もしくは（ａｏ）配列の
うち、それぞれ少なくとも連続した１６塩基以上を一部
に有する１６〜３６個の塩基からなる（ａ）配列断片又
は（ａｏ）配列断片であるオリゴヌクレオチド、 （ａ）配列＋　５’−ＡＧＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧ
ＧＡＴＧ＾−３“（ａｏ）配列＝５°−ＧＧＴＴＴＣＴ
ＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＧ−３及びこれら２つのプラ
イマーによる鎖長反応及び鎖長反応生成物の鋳型からの
分離操作を繰り返すことにより特定のヌクレオチド断片
を増幅し、次いで増幅された該ヌクレオチド断片を検出
することを特徴とするＨＰＶ１６型遺伝子の検出方法に
関し、 （２）ＨＰＶ１８型遺伝子の検出用プライマーとして、
下記の（ｂ）配列もしくは（ｂｏ）配列からなるオリゴ
ヌクレオチド、又は（ｂ）配列もしくは（ｂｏ）配列の
うち、それぞれ少なくとも連続した１６塩基以上を一部
に有する１６〜３６個の塩基からなる（ｂ）配列断片又
は（ｂｏ）配列断片であるオリゴヌクレオチド、 （ｂ）配列：　５’−ＧＡＧ［：［：ＣＣＡＡＡＡＴＧ
ＡＡＡＴＴＣＣ−３“（ｂｏ）配列：　５’−ＣＡＡＡ
ＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＴＴＣＡＧＡ−３′及びこれら２
つのプライマーによる鎖長反応及び鎖長反応生成物の鋳
型からの分離操作を繰り返すことにより特定のヌクレオ
チド断片を増幅し、次いで増幅された該ヌクレオチド断
片を検出することを特徴とするＨＰＶ１８型遺伝子の検
出方法に関し、 （３）ＨＰＶ３３型遺伝子の検出用プライマーとして、
下記の（ｃ）配列もしくは（ｃｏ）配列からなるオリゴ
ヌクレオチド、又は（ｃ）配列もしくはくＣｏ）配列の
うち、それぞれ少なくとも連続した１６塩基以上を一部
に有する１６〜３６個の塩基からなる（ｃ）配列断片又
は（ｃｏ）配列断片であるオリゴヌクレオチド、 （ｃ）　　配’７１Ｊ　：　　５’　−ＡＧＧＡＣＡＣ
八八ＧＣＣ八へへＧＴＴへ＾−３゜（ｃｏ）配列：　５
’−ＡＧＴＴＧＣＴＧＴＡＴＧＧＴＴＣＧＴＡＧ−３゜
及びこれら２つのプライマーによる鎖長反応及び鎖長反
応生成物の鋳型からの分離操作を繰り返すことにより特
定のヌクレオチド断片を増幅し、次いで増幅された該ヌ
クレオチド断片を検出することを特徴とするＨＰＶ３３
型遺伝子の検出方法に関し、 （４）ＨＰＶＯ型別をこえたユニバーサル検出系のプラ
イマーとして、下記の（ｄ）配列もしくは（ｄ′）配列
からなるオリゴヌクレオチド、又は（ｄ）配列もしくは
（ｄ”）配列のうち、それぞれ少なくとも連続して１６
塩基以上を一部に有する１６〜３５個の塩基からなる（
ｄ）配列断片又は（ｄ′）配列断片であるオリゴヌクレ
オチド、（ｄ　）　配列：　５’　−ＧＡＡＴＡＴＧＡ
ＴＴＴＡＣＡＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＡ−３’（ｄ′）
配列：　５’−ＧＡＡＡＡＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＡＡＡ
Ｔ−３゜及びこれら２つのプライマーによる鎖長反応及
び鎖長反応生成物の鋳型からの分離操作を繰り返すこと
により特定のヌクレオチド断片を増幅し、次いで増幅さ
れた該ヌクレオチド断片を検出することを特徴とする型
別をこえたＨＰＶ遺伝子の検出方法に関するものである
。

本発明の各プライマーとしてのオリゴヌクレオチドは、
ＨＰＶ遺伝子に含まれる特定の塩基配列と相補的でかつ
パイプリダイズするに充分な長さのオリゴヌクレオチド
である。通常、特異性、検出感度等からみて、少なくと
も１６塩基以上、好ましくは１８〜２５塩基程度のオリ
ゴヌクレオチドがよい。例えば、ＨＰＶ１６型遺伝子の
検出用プライマーとしては、（ａ）配列からなるオリゴ
ヌクレオチドを一方のプライマーとしくａ′）配列から
なるオリゴヌクレオチドを他方のプライマーとして用い
られる。

また、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば（ａ）配
列において、少なくとも１６塩基以上を一部に有する１
６〜３６個の塩基からなる（ａ）配列断片であるオリゴ
ヌクレオチドも一方のプライマーとして使用することが
でき、同様に（ａ′）配列において、少なくとも１６塩
基以上を一部に有する１６〜３６個の塩基からなる（ａ
′）配列断片であるオリゴヌクレオチドも他方のプライ
マーとして使用できる。

本発明における２つのプライマーとしては、前記のよう
な組合せの他、例えば、（ａ）配列からなるオリゴヌク
レオチドと（ａ゛）配列断片であるオリゴヌクレオチド
、（ａ）配列断片であるオリゴヌクレオチドと（ａ゛）
配列からなるオリゴヌクレオチドの組合せであってもよ
い。

ＨＰＶ　１　ｇ型、３３型及びユニバーサルのプライマ
ーとしては前記のそれぞれ、（ｂ）配列と（ｂ’）配列
、（ｃ）配列と（ｃｏ）配列、（ｄ）配列と（ｄ”）配
列についても、ＨＰＶ１６型の場合と同様の種々の組合
せで用いることができる。

本発明のプライマーとしてのオリゴヌクレオチドは１６
型、１８型及び３３型については、それぞれＥ７領域か
ら、またユニバーサルプライマーについては１６型のＬ
１領域から作製したものである。

本発明の型特異的プライマーは、それぞれ１６型、１８
型、３３型のＨＰＶの検出用に用いられ、本発明のユニ
バーサルプライマーは、少なくとも１型、６ｂ型、１１
型、１６型、１８型、３３型、５２型の各型を検出する
ことができる。

本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて
ＰＣＲを行なった場合、増幅される塩基配列の長さは、
通常２００〜２６０塩基であり、例えば、（ａ）配列と
（ａ”）配列を用いた場合には２１１塩基、（ｂ）配列
と（ｂ′）配列を用いた場合には２４３塩基、（ｃ）配
列と（Ｇ′）配列を用いた場合には２３９塩基、（ｄ）
配列と（ｄｏ）配列を用いた場合には２５２塩基となる
。具体的な増幅領域は、例えば次のようなものが挙げら
れる。

（イ）ＨＰＶ１６型（（ａ）配列−（ａ′）配列）での
増幅領域 ＡＧＣＴＣ八ＧＡＧへ　ＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧ　　ＡＡ
八へＡＧＡＴＧＧ　　ＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣ
ＡＧＡＡＣＣＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＣＡＴＴＡＣＡＡＴ
　　ＡＴＴＧＴＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＣＡＡ　　Ｇ
ＴＧＴＧＡＣＴＣＴ　　ＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴ　　ＴＧ
ＴＧＣＧＴ八Ｃ八＾ＡＧへＡへＡＣＡＣＧＴＡＧＡＣＡ
ＴＴＣＧＴＡＣＴＴＴＧＧＡ　ＡＧＡＣＣＴＧＴＴＡＡ
ＴＧＧＧ［”ＡＣＡ［：　ＴＡＧＧＡＡＴＴＧＴ　ＧＴ
ＧＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＡＣＣ （ロ）ＨＰＶ１８型（ での増幅領域 ＧＡＧＣＣＣＣＡＡＡＡＴＧ八Ａ八 ＣＡＣへＡへＣＡＡＴ　　ＴＡＡＧＣＧＡＣＴＣＴＡＧ
ＡＴＧＧＡＧＴ　ＴＡＡＴＣＡＴＣＡＡＣＧ八八ＣＣ八
ＣＡＡ　　Ｃへへ［：へＣ八へＡＡＴＧＴＧ＾八へ［’
ＣＡ　ＧＡＡＴＴＧＡＧＣＴＡＣＧＡＣＣＴＴＣＧ　Ａ
ＧＣＡＴＴＣＣＡＧＧＴＣ［：ＴＴＴＧ （ハ）ＨＰＶ３３型（ での増幅領域 ＡＧＧ　ＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡ ＡＧＡＴＴＴＡＴＡＴ　　［：［：ＴＧＡ八ＣへＡＡ［
：ＡＡＴＴＡＡＧＴＧ　　ＡＣ八へＣＴＣ八へ＾ＧＧＣ
ＣＡＧＡＴＧＧ　　Ａ［：ＡＡＧＣＡＣＡΔＣＡＴＴＧ
ＴＡＡＣＣＴＧＴＴＧＴＣＡＣ八ＴＴＡＴＧＴＧへＣＡ
　　ＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＴ （ニ）ユニバーサル（ （ｂ）配列−（ｂ′）配列） ＴＴＣＣＧＧＴＴＧＡ　ＣＣＴＴＣＴＡＴＧＴＡＧＡＧ
Ｇ八八ＧＡＡ　　ＡＡＣＧＡＴＧへへＡＣＡＴＴＴＡＣ
ＣＡＧ　　ＣＣＣＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＴＧＴＧＴＡＴ
　　ＧＴＧＴＴＧＴＡＡＧＡＧＴＡＧＴＡＧＡＡ　ＡＧ
ＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧ八へＣＡＣ
ＣＣＴ（ｃ）配列＝（ｃｏ）配列） ＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧ　ＡＡＴＡＴＧＴＴＴＴＣＴＧＡ
Ｃ［：ＴＡＴＡ　ＣＴＧＣＴＡＴＧＡＧＴＧ八ＧＧＡＴ
ＧＡＡ　　Ｇへ［：ＴＴＧＧＡＣＣＣＣＡＧＣＣＡＣＡ
Ｇ　　ＣＴＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＴＧＴＡＡＣＡＣＣＡ
［ｌ：ＡＧＴＴＣＧＴＡＡＧＴＧＡＣＣＴＡ　　ＣＧＡ
ＡＣＣＡＴＡＣ（ｄ）配列−（ｄｏ）配列） での増幅領域 Ｇ八人ＴＡＴＧＡＴＴ　　ＴＡＣＡＧＴＴＴＡＴ　　Ｔ
ＴＴＴＣ八八ＣＴへへ　ＴＧＣΔΔ八八ＴＡへへＣＴＴ
ＡＡ［’ＴＧＣＡＧＡＣＧＴＴ八ＴＧ　　ＡへＡＴＡＣ
ＡＴ八ＣＡＴＴへＴＡＴＧＡＡＴＴＣＣＡＣＴＡＴＴ　
　ＴＴＧＧＡＧＧＡＣＴ　　ＧＧＡΔＴＴＴＴＧＧ　　
ＴＣＴＡＣ八ＡＣＣへＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧ　　ＧＣＡ
ＣＡＣＴＡＧＡ　　ＡＧＡＴＡＣＴＴＡＴ　　ＡＧＧＴ
ＴＴＧＴＡＡＣＣＣＡＧＧＣＡＡＴ　　ＴＧＣＴＴＧＴ
ＣＡＡ　　八ＡＡＣΔＴＡＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣ
ＴＡ八八Ｇ八八ＧＡＴ　　ＧへへＣへへＣＴＴ八　ΔΔ
八へへＴＡＣＡＣＴＴＴＴＴＧＧＧＡ八ＧＴＡＡＡＴＴ
へＡＡ　　ＡＧＧＡ＾＾八ＧＴＴ　へＴＴＣ本発明のオ
リゴヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成方法により容易
に作製することができる。例えば、ＭｉｌｌｉＧｅｎ／
Ｂｉｏｓｅａｒｃｈのβ−１ｉｎｋベーターシ了ノエチ
ル７オスフォアミダイト試薬を用い、Ｂｉｏｓｅａｒｃ
ｈ社のＤＮＡ合成機Ｃｙｃｌｏｎｅ等を用いて合成する
ことができる。

合成したオリゴヌクレオチドは逆相カラム（ｃ１８）を
用いたＨＰＬＣ，ＤＮＡ吸着性カラムあるいはポリ了り
リル了ミドゲル電気泳動等を用いた公知の方法により精
製し、プライマーとして用いられる。

検体は、通常、生殖器（特に婦人科）腫瘍、皮膚の痣や
腫瘍、喉頭腫瘍などのバイオプシーや手術検体、婦人科
集団検診での子宮頚部擦過診検体等が用いられる。これ
らの検体からのＤＮＡ抽出法としては、手術やバイオプ
シーにより得た新鮮、凍結あるいはホルマリンなどで固
定した組織片からＤＮＡを抽出する場合はデタージェン
トで溶解し、蛋白分解酵素やＲＮＡ分解酵素で処理し、
フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱で
ＤＮＡを回収する方法や塩酸グアニジンで溶解して直接
エタノール沈澱でＤＮＡを回収する方法を用いる。また
子宮頚部スワップのような少量の検体からＤＮＡを分離
する場合は１０分間はど煮沸するだけの処理でも充分で
ある。

このようにしてＨＰＶ遺伝子を単離することができる。

次いで、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て用いてＰＣＲにより、特定のヌクレオチド断片を増幅
する。ＰＣＲは一般に次のような工程でなされる。ＨＰ
Ｖｌ　６型遺伝子の検出を例にして説明すると、検体中
の標的ＤＮＡ　（ＨＰＶｌ６型）に対し、（ａ）配列か
らなるオリゴヌクレオチドまたは（ａ）配列断片である
オリゴヌクレオチドを一方のプライマーとしてハイブリ
ダイズ（アニーリング工程）させて鎖長反応を行なう（
イクステンション工程）。これにより得られた２重鎮ヌ
クレオチドを１本鎖に分離しくディナチュレーション工
程）、その相補鎖を他方のプライマーの鋳型として機能
させる。他方のプライマーとしては、（ａｏ）配列から
なるオリゴヌクレオチドまたは（ａｏ）配列断片である
オリゴヌクレオチドを用い、これら２つのプライマーに
よる鎖長反応生成物の鋳型から分離操作を繰り返すこと
により特定のヌクレオチド断片を増幅させる。プライマ
ーによる鎖長反応は、通常、公知の耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼが用いられ、例えば、ＴａＫａＲａ社製のものが
用いられる。鎖長反応生成物の鋳型からの分離操作は種
々の公知の方法により行なわれるが、熱変性により行な
うのが好ましい。

アッセイに用いる検体中の標的ＤＮＡ量は、通常０．５
μｇ程度を標準とするが、それ以下の量、例えば０．０
５μｇ程度でも問題はない。プライマーの量はアッセイ
当たり、通常１〜１００　　ｐｉｃｏｍｏｌｅ、好まし
くは１０〜１００　　ｐｉｃｏｍｏｌｅを用いる。ＰＣ
Ｈの条件は型特異的プライマーの場合は、ディナチュレ
ーション工程は通常９０〜９５℃で１〜５分、アニーリ
ング工程が通常５０〜６０℃で１〜５分、好ましくは５
５〜６０℃で１〜２分、イクステンション工程が通常７
０〜７５℃で１〜１０分の条件であり、これらの工程を
１サイクルとしたＰＣＲを通常２５〜５０サイクル、好
ましくは３０〜４０サイクル行なう。またユニバーサル
プライマーの場合は、プライマーと塩基配列のホモロジ
ーの低いＨＰＶでも検出し得るようにアニーリングの条
件を緩く設定している。即ち、ディナチュレーション工
程が通常９０〜９５℃で１〜５分、アニーリング工程が
通常２５〜４０℃で１〜５分、好ましくは３０〜３２℃
で１〜２分、イクステンション工程力（通常７０〜７５
℃で１〜１０分であり、通常２５〜５０サイクル、好ま
しくは３０〜４０サイクル行なう。また全サイクルが終
わったあとで反応液をｉ、ｏｏｏから１０．０００倍は
どに希釈して再び同じプライマーを用いてＰＣＲを行な
う（２段階ＰＣＲ）ことにより、増幅の程度を更に高め
ることができる。

増幅されたＨＰＶ遺伝子断片の検出方法としては、ポリ
アクリルアミドゲルあるいはアガロースゲルを用いた電
気泳動によりサイズで分離することにより、増幅された
遺伝子断片の存在を確認することができる。また、電気
泳動ゲルのままでエチジウムブロマイド染色し、紫外線
照射により検出することができる。更にゲルからサイン
プロット法により膜上に移し取り、ラベルしたプローブ
とハイブリダイゼーションさせることにより、検出感度
と特異性を高めることができる。また、予めラベルされ
たプライマーを用いてＰＣＲを行なうことにより、標的
ＤＮＡはラベルされた状態で増幅されるのでそれをゲル
のままあるいはサインプロット法で膜に移し取って検出
することができる。プライマーやプローブのラベル法と
しては、放射性アイソトープ、蛍光色素、ビオチン化等
の方法が挙げられる。

〔作用・効果〕

本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる
ＰＣＲにより、短時間の間に微量の検体から極めて高感
度にＨＰＶの遺伝子を検出することができる。対象疾患
としては子宮頚癌、Ｂｏｗｅｎ病、コンジローマ、その
他の婦人科疾患、圧贅、皮膚癌、その他の皮膚科疾患、
口腔内焦、咽頭癌、喉頭癌、喉頭乳頭腫、食道癌、気管
麦焦等が考えられる。特に子宮頚癌の場合、手術検体や
診断のために取られたバイオプシー検体からＨＰＶを検
出できるほか、子宮頚癌の集団検診のために行なってい
る子宮頚部スワップのような検体からのＨＰＶの検出に
も応用できる。

１６型、１８型あるいは３３型に特異的な型特異的ＰＣ
Ｒの場合は、これらの癌関連性の高いＨＰＶの特異的検
出が行なえる。特に、本発明の型特異的プライマーは、
前記の如くプライマーの作製に最も適したと考えられる
Ｅ７領域から作製したものであり、増幅感度と特異性が
高いので、ゲル電気泳動とエチジウムブロマイド染色の
レベルで充分な検出と型判定が可能である。従って、検
査は簡便かつ迅速である。また、型特異的プローブを用
いたハイブリダイゼーションにより検出感度と型判定の
正確さを高めることができる。

また、本発明のユニバーサルプライマーによるＰＣＲの
場合は、子宮頚癌との因果関係が予測される１６型、１
８型、３３型の他に、日本においては更に問題とされて
いる５２型を含めて、広範囲に各種のＨＰＶが検出でき
るため様々の臨床材料でＨＰＶ感染の有無を判定したり
、また新しい型のＨＰＶの検出や分離に役立つ。また、
前記の如く本発明のユニバーサルプライマーは、−組の
プライマーで広範囲な検出が可能であり、経済性や検査
の簡便性の観点からも従来からの公知のユニバーサルプ
ライマーにはない顕著な有用性を示すものである。

〔実施例〕

以下に実施例により本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれら実施例により何等限定されるものではない。

実施例−１（プライマーの作製） ＨＰＶ　１６型、１８型、３３型のＥ７領域からそれぞ
れ（ａ）配列及び（ａｏ）配列、（ｂ）配列及び（ｂ′
）配列、（ｃ）配列及び（ｃ′）配列を選び、それと同
じ配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成した。化
学合成には、ＭｉｌｌｉＧｅ口／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社
（７）β−１ｉｎｋベータシＴノエチルフオスフオアミ
ダイト試薬を用い、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社のＤＮＡ合成
機Ｃｙｃｌｏｎｅにより合成した。

合成したオリゴヌクレオチドは逆相カラム（ｃ１８）を
用いたＨＰＬＣにより精製してプライマーを作製した。

またＨＰＶ１６型のＬ１領域がら（ｄ）配列及び（ｄ゛
）配列を選び、同様にしてプライマーを作製した。

（ａ）配列：　５”−ＡＧＣＴＣＡＧ八ＧＧＡＧＧへＧ
ＧＡＴＧＡ−３’（ａｏ）配列：　５’−ＧＧＴＴＴＣ
ＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＧ−３’（ｂ）配列：５′
−ＧＡＧＣＣＣＣＡＡＡＡＴＧＡＡＡＴＴＣＣ−３゜（
ｂ′）配列＝５”−ＣＡＡＡＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＴＴ
ＣＡＧ八−３゛（ｃ）配列：　５’−ＡＧＧＡＣＡＣＡ
ＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡ＾−３゛（ｃｏ）配列：　５’
−ＡＧＴＴＧＣＴＧＴＡＴＧＧＴＴＣＧＴＡＧ−３’（
ｄ）配列：　５’−ＧＡＡＴＡＴＧＡＴＴＴＡＣＡＧＴ
ＴＴＡＴＴＴＴＴＣＡ−３゜（ｄ′）配列＝５”−ＧＡ
ＡＡＡＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＡＡＡＴ−３′実施例−２
（プローブの作製） 実施例−１で作製したそれぞれの２つのプライマーを用
いたＰＣＲにより、予想される増幅領域の一部で、かつ
プライマーと重複しない塩基配列をプローブとするため
１６型に対してはＡ配列、１８型に対してはＢ配列、３
３型に対してはＣ配列、ユニバーサルにはり、　Ｅ及び
Ｆ配列の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを作製し
た。プローブの化学合成と精製は実施例−１のプライマ
ーの場合と同様に行なった。

Ａ配夕１　：　　５’　−ＴＧＴＧＣＧＴＡ［ｌ：ＡＡ
ＡＧＣＡ［ＡＣＡＣ−３’Ｂ配列：　５’−ＴＡＡＴＣ
ＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧ−３゜Ｃ配列：　５’
−ＣＣＧＧＣＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＣ−３“Ｄ
配列：　５’−ＴＴＡＡＣＴＧＣＡＧＡＣＧＴＴＡＴＧ
−３′Ｅ配列＝５”−ＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＣＣＣＴ
ＴＡＴＧ−３’Ｆ配列：５”−ＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡ
ＣＣＣＡＴＡＴＧ−３実施例−３ 検体としてクローン化されたＨＰＶ−ＤＮＡ及び各種の
細胞株を標準検体として用い、実施例−１で作製したプ
ライマーを用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲの条件は１
６型、１８型、３３型ではディナチュレーション工程を
９４℃、１分、アニーリング工程を６０℃、２分、エク
ステンション工程を７２℃、２分とし、３５サイクル行
なった。

ユニバーサルＰＣＲではアニーリング工程を３２℃、２
分とした以外は型特異的ＰＣＲと同様に行なった。ＰＣ
Ｒにより増幅された遺伝子断片の検出は、電気泳動ゲル
をエチジウムプロミド染色し、紫外線照射によ′り検出
した。さらに、実施例＝２で作製したプローブを用いて
、サザンブロットハイブリダイゼーション法により、増
幅バンドが陽性であることを確認した。

即ち、常法に従いゲルよりＤＮＡをトランスファーメン
ブレンに移行させ、プレハイブリダイゼーションで未吸
着部分をブロックした後、３２ｐでラベルしたプローブ
を用いてハイブリダイゼーションを行なった。フィルタ
ーメンブレンはよく洗浄し、遊離のプローブをよく除い
た後、オートラジオグラフィーでプローブの結合（ハイ
ブリダイズ）したバンドを検出した。

プローブの３２ｐラベルは３゛エンドラベル法により行
なった。

ハイブリダイゼーションとウォッシュの条件は以下の通
りである。

プローブ　　ハイブリダイゼーション　　洗浄−による
ＰＣＲではそれぞれ特異的なＨＰＶを含む検体で増幅バ
ンド陽性であり、ユニバーサルＰＣＲではＨＰＶを含む
全ての検体で増幅バンド陽性である。

表１　型特異的ＰＣＲ及びユニバーサルＰＣＲを用いた
標準検体（クローン化ＨＰＶ−ＤＮＡと細胞株ＤＮＡ）
の検出結果 １６型　　　　　３７℃、−晩　　　５０℃１８型　　
　　　３５℃、−晩　　　４０℃３３型　　　　　４７
℃、−晩　　　５５℃ユニバーサル　　　３２℃、−晩
　　　３２℃これらの条件は、各塩基配列から推定した
Ｔ。

値（ｍｅｌｔｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　
ｄｕｐｌｅｘ　ＤＮＡ）をもとに実験結果に基づいて最
適条件を選んだものである。

その結果を表１に示したが、型特異的プライマーＰＶ−
Ｉ ＨＰＶ−６ｂ ＨＰＶ−１１ １（ＰＶ−１６ １型 ６ｂ型 １１型 １６型 ＋ ＨＰＶ ３１／３３／３５ ３１／３３／３５型 （ミクスチャー） ＋ ＨＰＶ−５２ ［：ａＳｋ　ｉ細胞ＤＮＡ ５ｉＨａ細胞ＤＮＡ ＨｅＬａ細胞０ＮＡ Ｃ３３Ａ細胞ＤＮＡ ５２型 １６型 １６型 １８型 陰性 ＋ 十 ＋ 実施例−４ 検体として子宮頚癌２５例の臨床検体を用いて実施例−
３と同様にして型特異的ＰＣＲ及びユニバーサルＰＣＲ
を行い、エチジウムブロマイド染色により増幅バンドの
有無を判定した。さらに、型特異的プローブあるいはユ
ニバーサルプローブを用いたハイブリダイゼーションを
行なって、エチジウムブロマイド染色の結果を確認した
。

その結果を表２に示したが、型特異的ＰＣＲでは１６型
が１１例（４４％）に、Ｉ８型が３例（１２％）に、３
３型が１例（４％）に検出された（総計１５／２５．６
０％）。これらの陽性検体は１Ｇ型の１例（検体１６）
を除き、すべてユニバーサルＰＣＲでも陽性であった。

検体１Ｂではユニバーサルプライマーを作製したＬ１領
域が変異か欠損している可能性がある。ユニバーサルＰ
ＣＲでは、その他に５例の陽性検体が見出された（総計
１９／２５．７６％）。これらの検体では前記の３種の
型以外のＨＰＶが感染しているものと考えられる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記の（ａ）配列もしくは（ａ’）配列からなる
   オリゴヌクレオチド、又は（ａ）配列もしくは（ａ’）
   配列のうち、それぞれ少なくとも連続した１６塩基以上
   を一部に有する１６〜３６個の塩基からなる（ａ）配列
   断片又は（ａ’）配列断片であるオリゴヌクレオチド。 （ａ）配列：５’−ＡＧＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧ
   ＡＴＧＡ−３’（ａ’）配列：５’−ＧＧＴＴＴＣＴＧ
   ＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＧ−３’（２）下記の（ｂ）配
   列もしくは（ｂ’）配列からなるオリゴヌクレオチド、
   又は（ｂ）配列もしくは（ｂ’）配列のうち、それぞれ
   少なくとも連続した１６塩基以上を一部に有する１６〜
   ３６個の塩基からなる（ｂ）配列断片又は（ｂ’）配列
   断片であるオリゴヌクレオチド。 （ｂ）配列：５’−ＧＡＧＣＣＣＣＡＡＡＡＴＧＡＡＡ
   ＴＴＣＣ−３’（ｂ’）配列：５’−ＣＡＡＡＧＧＡＣ
   ＡＧＧＧＴＧＴＴＣＡＧＡ−３’（３）下記の（ｃ）配
   列もしくは（ｃ’）配列からなるオリゴヌクレオチド、
   又は（ｃ）配列もしくは（ｃ’）配列のうち、それぞれ
   少なくとも連続した１６塩基以上を一部に有する１６〜
   ３６個の塩基からなる（ｃ）配列断片又は（ｃ’）配列
   断片であるオリゴヌクレオチド。 （ｃ）配列：５’−ＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧ
   ＴＴＡＡ−３’（ｃ’）配列：５’−ＡＧＴＴＧＣＴＧ
   ＴＡＴＧＧＴＴＣＧＴＡＧ−３’（４）下記の（ｄ）配
   列もしくは（ｄ’）配列からなるオリゴヌクレオチド、
   又は（ｄ）配列もしくは（ｄ’）配列のうち、それぞれ
   少なくとも連続して１６塩基以上を一部に有する１６〜
   ３５個の塩基からなる（ｄ）配列断片又は（ｄ’）配列
   断片であるオリゴヌクレオチド。 （ｄ）配列：５’−ＧＡＡＴＡＴＧＡＴＴＴＡＣＡＧＴ
   ＴＴＡＴＴＴＴＴＣＡ−３’（ｄ’）配列：５’−ＧＡ
   ＡＡＡＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＡＡＡＴ−３’（５）請求
   項（１）記載の（ａ）配列からなるオリゴヌクレオチド
   または（ａ）配列断片であるオリゴヌクレオチドを一方
   のプライマーとし、かつ請求項（１）記載の（ａ’）配
   列からなるオリゴヌクレオチドまたは（ａ’）配列断片
   であるオリゴヌクレオチドを他方のプライマーとして、
   これら２つのプライマーによる鎖長反応及び鎖長反応生
   成物の鋳型からの分離操作を繰り返すことにより特定の
   ヌクレオチド断片を増幅し、次いで増幅された該ヌクレ
   オチド断片を検出することを特徴とするヒトパピローマ
   ウィルス１６型遺伝子の検出方法。 （６）請求項（２）記載の（ｂ）配列からなるオリゴヌ
   クレオチドまたは（ｂ）配列断片であるオリゴヌクレオ
   チドを一方のプライマーとし、かつ請求項（２）記載の
   （ｂ’）配列からなるオリゴヌクレオチドまたは（ｂ’
   ）配列断片であるオリゴヌクレオチドを他方のプライマ
   ーとして、これら２つのプライマーによる鎖長反応及び
   鎖長反応生成物の鋳型からの分離操作を繰り返すことに
   より特定のヌクレオチド断片を増幅し、次いで増幅され
   た該ヌクレオチド断片を検出することを特徴とするヒト
   パピローマウィルス１８型遺伝子の検出方法。 （７）請求項（３）記載の（ｃ）配列からなるオリゴヌ
   クレオチドまたは（ｃ）配列断片であるオリゴヌクレオ
   チドを一方のプライマーとし、かつ請求項（３）記載の
   （ｃ’）配列からなるオリゴヌクレオチドまたは（ｃ’
   ）配列断片であるオリゴヌクレオチドを他方のプライマ
   ーとして、これら２つのプライマーによる鎖長反応及び
   鎖長反応生成物の鋳型からの分離操作を繰り返すことに
   より特定のヌクレオチド断片を増幅し、次いで増幅され
   た該ヌクレオチド断片を検出することを特徴とするヒト
   パピローマウィルス３３型遺伝子の検出方法。 （８）請求項（４）記載の（ｄ）配列からなるオリゴヌ
   クレオチドまたは（ｄ）配列断片であるオリゴヌクレオ
   チドを一方のプライマーとし、かつ請求項（４）記載の
   （ｄ’）配列からなるオリゴヌクレオチドまたは（ｄ’
   ）配列断片であるオリゴヌクレオチドを他方のプライマ
   ーとして、これら２つのプライマーによる鎖長反応及び
   鎖長反応生成物の鋳型からの分離操作を繰り返すことに
   より特定のヌクレオチド断片を増幅し、次いで増幅され
   た該ヌクレオチド断片を検出することを特徴とするヒト
   パピローマウィルス遺伝子の検出方法。