KR20070105992A - 생물학적 시료에서 사람 유두종 바이러스를 검출하기 위한시스템, 방법 및 조성물 - Google Patents

생물학적 시료에서 사람 유두종 바이러스를 검출하기 위한시스템, 방법 및 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20070105992A
KR20070105992A KR1020077018326A KR20077018326A KR20070105992A KR 20070105992 A KR20070105992 A KR 20070105992A KR 1020077018326 A KR1020077018326 A KR 1020077018326A KR 20077018326 A KR20077018326 A KR 20077018326A KR 20070105992 A KR20070105992 A KR 20070105992A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
hpv
dna
sequence
amplification
Prior art date
Application number
KR1020077018326A
Other languages
English (en)
Inventor
데이비드 엠. 커닛
마이클 디. 케인
Original Assignee
더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미시건
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미시건 filed Critical 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미시건
Publication of KR20070105992A publication Critical patent/KR20070105992A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6879—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for sex determination

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 암 및 형성이상의 검출, 치료 및/또는 처분을 목적으로 포유동물 체액 및 경부 찰과표본을 비롯한 생물학적 시료(이에 국한되지 않는다)에 존재하는 사람 유두종바이러스(HPV)를 단일 카피 수준까지 검출, 동정 및 정량하는 시스템, 방법 및 조성물(이에 국한되지 않는다)을 포함한다.
유두종바이러스, 단일 카피 수준, 암, 형성이상, 체액, 찰과표본

Description

생물학적 시료에서 사람 유두종 바이러스를 검출하기 위한 시스템, 방법 및 조성물{SYSTEMS, METHODS, AND COMPOSITIONS FOR DETECTION OF HUMAN PAPILLOMA VIRUS IN BIOLOGICAL SAMPLES}
관련 출원에 대한 참조설명
본 출원은 본원에 전문이 참고인용된 2005년 1월 14일자 미국 가특허출원 번호 60/644,374를 기초로 하는 우선권을 주장한다.
보조금 정보
본 발명의 기초가 되는 연구는 미시간 라이프 사이언시스 코리도(MEDC-410), 미시간 트리테크놀로지 코리도, NIH(R21 DK69877, R21 DO070237, CA 104830 및 CA94328), NIH 헤드/넥 캔서 SPORE(1 P50 CA97248) 및 MDRTC 셀 앤드 몰레큘러 바이올로지 코어(DK20572)의 보조금을 지원 받아 수행된 것이다. 따라서, 정부는 본 발명의 일부 권리를 가질 수 있다.
발명의 분야
본 발명은 생물학적 시료에 존재하는 미생물 인자의 검출 및 처분 분야에 관한 것이다.
최근 연구들은 사람 유두종바이러스("HPV")가 상당한 비율의 경부암, 두경부 암, 항문암 및 주혈흡충증 관련 방광암과 관련이 있음을 보여주고 있다. 경부암 및 항문암은 거의 일정하게 HPV 감염과 관련이 있는 암이다. 최근 보고된 공개 보고서에 따르면, 두경부암에 HPV DNA의 총체적인 유병력은 35%인 것으로 밝혀져 있다. 더 최근에 일부 연구자들은 정량적 PCR("QPCR")을 이용하여 253개의 종양 시료를 이용한 대형 연구에서 상기 발견을 확인한 결과, 표본의 25%에서 HPV DNA가 검출되었다. 또한, HPV는 항문 형성장애 및 항문암과도 관련이 있다. 다른 연구자들이 발견한 바에 따르면, 주혈흡충증이 원인인 방광암의 거의 50%가 동일계내 하이브리드화에서 HPV DNA를 보유했다.
HPV 타입 16 및 18은 그 존재가 전암 환부 및 암종과 관련이 있기 때문에 '고위험' 바이러스형에 속한다. 이에 반해, '저위험' 타입으로서 가장 일반적인 HPV 타입 6과 11은 보통 양성 환부와 관련이 있다. HPV의 종양발생 가능성은 주로 2가지 바이러스 종양단백질, E6과 E7에 기인한다. HPV 타입 간의 종양발생 가능성의 차이는 E6 단백질과 E7 단백질의 타입 특이적 차이 때문이다. 종양발생성 HPV 균주의 E6 단백질은 유비퀴틴 의존적 경로를 통해 p53 단백질과 상호작용하여 그 분해를 촉진하는 것으로 밝혀져 있다. 이와 마찬가지로, E7 종양단백질은 망막모세포종(Rb) 단백질과 복합체를 형성하여 Rb 단백질을 불활성화시킬 수 있다. p53과 Rb는 둘 다 그 산물이 세포 주기를 조절하고 DNA 수복 과정을 지휘하며, 프로그램된 세포사멸 또는 아폽토시스와 관련이 있는 중요한 종양 억제인자 유전자이다. 이러한 종양 억제인자 단백질의 HPV에 의한 파괴는 세포 무한증식화 및 돌연변이성 변화의 전파를 유도한다.
혈청 DNA에서 암 세포의 비정상적 게놈을 조사하는 기술은 유망한 암의 분자 검사로서 연구되었다. 일부 연구자들은 TaqMan 정량적 PCR법이 일부 두경부암 및 경부암 환자 유래의 혈청에서 HPV DNA를 검출할 수 있음을 발견했지만, 대다수의 검체에서 상기 기술로 혈청과 다른 생물학적 위치에서 HPV DNA를 임상적 도구로서 유용한 충분한 함량으로 검출할 수 없었다.
현재 문제점의 예로서, 현행 HPV 검사법, 다이진(Digene) 검사법[1]의 표준 처치법이 갖고 있는 문제점에는 다음과 같은 것이 있다:
1. 다이진 검사는 공지된 병원성 타입 외에 다른 HPV 타입과 비특이적으로 교차반응한다[2]. 따라서, 다이진 검사에서는 거짓 양성 결과를 피할 수 없다.
2. 다이진 검사에서는 적어도 수천개의 HPV 분자가 양성으로 판독될 것을 필요로 한다[1]. 이러한 조건은 이보다 적은 수의 분자가 존재하는 혈청 및/또는 혈액의 선별을 불가능하게 한다.
3. 다이진 검사는 경부 ThinPrep에서 발견되는 HPV 타입을 밝혀내지 못한다. 이것은 시그널의 원인이 되는 HPV 타입이 확인되지 않으면 비병원성 타입의 HPV가 거짓 양성 결과를 초래할 수 있는 바, 중요해지고 있다.
이러한 문제점은 물론 다른 문제점과 당해 기술의 단점에 비추어 볼 때, 현재 이용할 수 있는 방법으로는 검출할 수 없는 수준의 생물학적 시료 중의 각각의 HPV 종을 검출 및 동정하는 시스템, 방법 및 조성물의 요구는 여전한 상태이다.
발명의 개요
본 발명은 생물학적 시료, 예컨대 포유동물 체액 및 경부 찰과표본 등에 존 재하는 HPV를 암 및 형성이상의 검출, 치료 및/또는 처치 목적으로 단일 카피 수준까지 검출, 동정 및 정량 분석하기 위한 시스템, 방법 및 조성물(이에 국한되지 않는다)을 포함한다. 일부 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 각 HPV 서열을 동정하고, HPV DNA의 검출 감도를 증가시키며, 혈청 및/말초 혈액 HPV-DNA와 몇몇 종양 타입 간의 더욱 빈번한 연관성에 대한 증거를 제공하는 더욱 민감한 질량분광법 기술을 포함한다. 따라서, 본 발명은 HPV와 연관이 있는 증례에서 잔여 종양 또는 형성이상의 마커로서의 HPV DNA를 말초 혈액과 혈청에서 선별할 수 있게 하는 시스템, 방법 및 조성물을 포함한다.
본 발명의 다른 목적은 이하 도면과 상세한 설명을 검토한 후 당업자라면 잘 알 수 있을 것이다.
본 발명은 이제 첨부되는 도면을 참조로 하여 예시적 방식으로 설명될 것이다:
도 1은 본 발명에 따른 단일 반응에서, 13가지 다른 HPV 타입을 선별한 질량분광법 결과이다.
도 2는 본 발명의 일부 양태에 따른 단계의 일반적인 흐름도이며, 이에 국한되는 것은 아니다.
도 3A 내지 도 3D는 종양(3A), Pap 양성 표본(3B), HC2 양성 표본(3C) 및 Pap 음성 표본(3D)의 HPV 역가를 나타낸 것이다.
본 발명은 일부 양태로서, 종양 또는 형성이상 조직 유래의 암 또는 형성이상과 연관이 있는 1종 이상의 병원성 HPV를 동시에 분석 및 측정하는 시스템, 방법 및 조성물을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명을 사용하면, 이러한 분석과 측정은 HPV 카피수 100개 이하까지 수행할 수 있으며, 이것은 1000 내지 5000개 카피를 필요로 하는 현재 미국식품의약청("FDA")이 인정하는 HPV 검출용 검사보다 더욱 민감한 것이다. 또한, 본 발명은 주어진 각 HPV 서열에 대한 조사를 통해 민감도를 확장하여 1aM까지 검출할 수 있게 한다(일부 양태에서는 5마이크로리터 PCR 부피에 담긴 각 분자가 사용된다). 이와 같이 증가된 민감도는 여타 생물학적 시료 중에서도 혈액 및 혈청 중의 병리학적 HPV를 검출할 수 있게 한다.
또한, 본 발명은 다수 프로브의 조합을 조사하고 정량적이지 않은 특정한 현행 방법[1]으로 수행될 수 없는, 주어진 종양과 연관 있는 HPV 타입의 세부 사항을 상세히 밝혀내고, 민감하고 특이적이며 정량적인, 시스템, 방법 및 조성물을 포함한다.
일부 양태에 따르면, 이에 국한되는 것은 아니지만, HPV 타입(들)이 본 발명에 따라 일단 측정되면, 본 발명은 포유동물의 체액을 비롯한(이에 국한되지 않는다) 생물학적 시료에 존재하는 단일 카피 수준의 HPV를 검출하기 위한 민감하고 특이적인 선별을 지원한다. 이와 같은 민감하고 특이적인 단일 카피 수준의 선별은 지금까지는 가능하지 않았다. 이로써, 혈청 및/또는 혈액 중의 HPV의 존재가 정상 검체에서 나타나지 않은 형성이상 또는 암과 고유한 연관이 있다는, 지금까지 확인된 바 없는 자연 상태를 밝힐 수 있다. 이러한 선별 시, 참고문헌[4]에서 관찰된 바와 같은 거짓 양성의 결여는 형성이상 또는 암을 측정하기에 편리하게 한다.
바람직한 일부 양태에 따르면, 이에 국한되지는 않지만, 본 발명은 한번의 검사로 생물학적 시료에 존재하는 병원성 HPV의 종류와 양을 측정하는 시스템, 방법 및 조성물을 포함한다. 일부 양태에 따르면, 본 발명은 질량분광분석 시스템을 이용하여 고위험 또는 중간위험도의 HPV 타입 1종 이상에 대해 작제한 프로브를 포함한다. 이와 같은 고위험 또는 중간위험도의 HPV 타입은 경부 찰과표본 중의 HPV를 분석하는 FDA 승인을 받은 현행 검사법인 Digene ThinPrep 검사법[1]을 이용한 동정에 따라 선택될 수 있다. 본 발명의 일부 양태에서는 다이진 검사의 13가지 HPV 종류 외에, 경부 및 항문 발암을 유발하는 고위험성일 수 있는 다른 6종의 HPV를 이용한다[5,6]. 측정은, 현재 수천개의 HPV 분자가 양성이어야 하는 다이진 방법[1]보다 훨씬 민감한 정도인 최소 100aM(약 300개 분자) 수준까지 실시될 수 있다. 또한, 본 발명은 HPV 종류(들)가 종양 또는 형성이상에 존재하는지, 또는 더 나아가 종양에서 직접 유래된 물질(예, 경부 ThinPrep)에 존재하는지 여부를 측정할 수 있게 한다. 마지막으로, 본 발명의 일부 양태는 오로지 정성적인 기존 검사법에 비해, 정량적 분석인 시스템, 방법 및 조성물을 포함하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 정량적 측정을 본 발명에 따른 HPV 타입의 측정과 연계시키면, 상당한 임상적 유용성을 나타낼 수 있으며[6], 이에 따른 임상적 엄중도는 다른 해부학적 위치에 존재하는 HPV 카피수에 의해 반영될 수 있다.
일부 양태에 따르면, 종양 또는 세포 추출물에 존재하는 1종 이상의 병원성 HPV 타입의 존재는 민감하고 특이적인 질량분광분석법에 의해 검출되며, 이에 국한되는 것은 아니다([8-10]; 도 1). 일반적으로, 본 발명의 질량분광분석법은 HPV에서 발견되는 짧은 뉴클레오타이드 단편의 PCR에 의한 증폭; 프라이머와 뉴클레오타이드의 분해; 및 적당한 디데옥시뉴클레오타이드를 이용한 "네스티드(nested)" 질량분광분석용 프라이머의 확장을 수반한다. 그 결과, 주어진 HPV 주형이 제1 PCR 반응물에 존재하는 경우에만, 질량분광분석 확장 서열에 단일 디데옥시뉴클레오타이드가 혼입하게 된다.
일부 양태에 따르면, 선별은 각 시료가 1종 이상의 HPV 타입, 예컨대 주어진 HPV 타입에 대해 양성인 경우에 특징적인 시그널을 나타내는 구별할 수 있는 프로브를 보유한 19개의 HPV 타입에 대해 독립적으로 검사되는 방식으로 조성되어 있다. 따라서, 처음 선별된 핵심 13종(도 1; HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 및 68[1]) 및 잠재적 병원성인[5] HPV 타입 23, 26, 53, 66, 73 및 82를 나타내는 총 19종의 HPV 타입을 선별할 수 있다.
또한, 일부 양태는 전체 사람 게놈 DNA의 단일 카피 단편의 프로브(예컨대, erbB-2 유전자 인트론의 단일 카피 단편에 대한 프로브, 이에 국한되지 않는다)를 포함한다. 적어도 100 아토몰(aM = 10-18M) 수준 이상의 매우 민감한 선별 외에, 본 발명은 주어진 종양 또는 형성이상과 연관 있는 HPV 타입의 측정을 허용한다. 또한, HPV 서열의 카피수의 측정도 수행되어, 유용한 예후 데이터를 제공할 수도 있다[7].
일부 양태에 따르면, 전술한 1차 선별이 양성이면, 체액 중의 HPV의 존재는 1차 선별에서 양성이었던 HPV 타입에 대한 프로브만을 이용하여 더욱 더 민감한 질량분광분석으로 검출한다. 이것은 주어진 종양 또는 형성이상에 존재하는 HPV의 타입을 상세히 밝혀내는 종래 선별방법을 이용하여 수행할 수 있다. 이러한 기술은 혈액 및/또는 혈청을 검사하여 종양의 재발을 선별할 수 있는 가능성을 제공한다.
혈청 및/또는 혈액에 존재하는 단일 카피 수준의 HPV의 민감한 검출은 종래 진가를 인정받지 못한 예상 외의 결과를 제공한다:
1. 본 발명에 따르면, 경부 형성이상은 혈청 및/또는 혈액을 선별하여 검출할 수 있다. 이것은 상당한 비율의 정상 증례에 비정상적 결과를 유도하는 부정확성을 산출하는 TaqMan 기반 기술을 이용하는 것을 제외하고는 지금까지 입증된 바 없는 것이다. 이에 반해, 본 발명은 혈청 및/또는 혈액에 존재하는 HPV가 경부 형성이상 증례의 높은 비율과 연관이 있다는 종래 진가를 인정받지 못한 예상외의 결과를 보여준다. 비교해보면, 정상 대조군 및 성공적으로 치료된 경부 형성이상 시료는 혈청 및 혈액에 상기 HPV가 존재하지 않는다. 본 발명 이전에, 혈청과 혈액의 각각의 유익성인 인정받지 못했었다. 이것은 혈청과 혈액의 독특한 발병 기전 때문인 것으로 생각된다. 즉, 혈청 중의 HPV는 세포 용해로부터 나타나고, 이에 반해 혈액 중의 HPV는 순수 종양 세포의 순환 또는 종양 세포의 식세포작용(불완전 분해)에 의해 나타난다
2. 본 발명에 따르면, 예상치 않게도 주혈흡충증 관련 방광암이 HPV와 일정한 연관이 있음이 밝혀졌다. 종래에는 이러함 암의 1/2만이 HPV로부터 초래되는 것으로 생각했다[11]. 또한, 본 발명에 따른 단일 카피 수준의 더욱 민감한 분석으로의 확장은 혈청(26/27개 증례) 및 소변 침전물(15개/24개)이 진단에 유용하다는 것을 밝혀냈다. 혈청 HPV가 27개 증례 중에서 26개 증례에서 양성일지라도, 혈액의 HPV는 존재하지 않았다.
3. 본 발명을 사용하면, 또한 혈액과 혈청의 분석이 HPV가 원인인 두경부암의 진단 및 치료법의 모니터링에 유용하다는 것이 밝혀졌다. 종래에는, 종양에 높은 수준의 HPV가 존재하여, 이 분석을 종종 가능하게 하였지만, 낮은 수준의 검출 불가능성은 혈청을 조사하는 대부분의 증례에서 음성인 것처럼[3], 혈액과 혈청의 분석을 사용할 수 없게 했다. 이에 반해, 본 발명에 따른 검출은 종양의 상당한 비율이 혈청 및/또는 혈액에서 검출될 수 있는 HPV와 연관이 있음을 보여주었다. 이러한 특성은 다양한 병원성 HPV 타입으로 확대되었고, 이러한 선별이 임상적으로 무의미한 HPV 타입에 의해 분석이 방해받지 않는 바, 임상적 가치가 있다는 증거이다.
4. 본 발명을 사용하면, 검사된 모든 정상 대조군, 예컨대 조사받은 총 40명의 정상인의 소변 침전물, 총 27명의 정상 혈청 시료, 총 20명의 정상 혈액 시료 및 총 9명의 태반이 음성인 것으로 나타났다.
일부 양태에 따르면, 본 발명은 단일 분자 수준까지 검출할 수 있을 정도로 충분히 민감하고 특이적인 2단계 선별 방법을 포함한다. 제1 단계는 총 19가지 병원성 HPV 타입 1세트로 종양성 또는 형성이상 세포를 선별하는 것을 수반한다. HPV의 타입을 일단 알게되면, 총 19개의 서열을 동시에 사용해야 하는 경우보다 더 큰 민감도를 보유한 상기 타입을 사용하여 관련 체액을 선별할 수 있다. 결과적으로, 이러한 체액의 선별은 민감도와 특이성이 증가된 것으로서, 향상된 임상적 유용성을 갖는다. 이러한 선별에서, 혈청 및 혈액은 독립적으로 정보를 제공하게 되어, 이러한 유체에 HPV를 초래하는 다른 발병기전을 반영한다. 혈청에 HPV의 존재는 HPV를 운반하는 비정상적 세포의 용해로부터 생긴 것이다. 혈액에 HPV의 존재는 완전히 분해되지 않은 HPV 서열이 검출되는 비정상적 세포의 식세포작용 및/또는 순환성 종양 세포의 존재로부터 생긴 것이다. 따라서, 유용한 정보는 혈액 및 혈청의 독립적인 질문에서 얻어진다. 본 발명은 모든 체액(예, 소변, 뇌척수액, 땀, 가래, 눈물 등)에까지 확대되는 시스템, 방법 및 조성물을 포함한다.
이하 본 발명의 일부 양태에 대한 실시예는 여기에 기술된 양태들에만 본 발명을 국한시킴이 없이 제공한 것이다.
일부 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 정성적 및 정량적 유전자 발현 분석을 위한 매트릭스 원조를 받은 레이저 탈착 이온화 - 비행 시간("MALDI-TOF") 질량 분광분석법("MS")의 사용과 함께, 경쟁적 PCR, 프라이머 확장 반응 및 MALDI-TOF MS의 관점을 포함하며(일반적으로 도 2 참조), 이에 국한되는 것은 아니다. 생물학적 시료로부터 분리된 HPV DNA를 함유할 것으로 생각되는 시료에, 당해 서열 중 대략 중간에 존재하는 하나의 단일 염기를 제외하고 당해 HPV의 DNA 서열 일부와 동일하거나 거의 일치하는 서열을 가진 약 100nt 길이의 합성 올리고뉴클레오타이드(경쟁인자)를 첨가한다. 일부 양태에 따르면, 경쟁인자는 공지된 농도로 첨가 한다. 경쟁인자와 당해 DNA는 순방향 및 역방향 프라이머의 존재 하에 PCR로 함께 증폭시킨다. 과량의 dNTP와 프라이머는 PCR 후 당업자에게 공지된 방법, 일 예로서 효소 분해 및 적당한 세척(이에 국한되지 않는다)을 통해 제거한다. 그다음, 확장 프라이머와 다른 ddNTP의 조합(예, G와 C)을 이용하여 염기 확장 반응을 수행한다. 확장 프라이머는 상기 돌연변이 부위 바로 다음에 하이브리드화하고, 2개의 ddNTP 염기 중 적어도 하나를 경쟁인자와 상기 DNA에 각각 다르게 첨가하여 다른 분자량의 2개의 올리고뉴클레오타이드 산물을 수득한다. 약 5,000 내지 약 8,500 돌턴(Da)의 전형적인 분자량 윈도우 중에서, MALDI-TOF MS는 약 20 Da이 넘게 차이가 나는 2개의 올리고뉴클레오타이드를 쉽게 구별한다. 본 발명에 따르면, 이러한 차등 확장 산물이 정성적으로 동정되고, 이들의 농도는 MALDI-TOF MS로부터 비율 대비로(일 예로서, 첨가된 경쟁인자 서열의 농도가 공지된 경우) 정량분석될 수 있다. 일부 양태에 따르면, 이하에 추가 설명되는 바와 같은 염기 확장 프라이머의 5' 말단에 필요하다면 스페이서 분자를 부착시켜, 원하는 분자량의 범위를 달성하기도 하며, 이에 국한되지는 않는다.
시료로부터 DNA의 제조 및 정량. 종양, 혈청, 말초 혈액 및 소변 침전물 시료를 각 암환자로부터 종양 생검 시에 분리했다. 혈청 및/또는 말초 혈액은 HPV에 노출되지 않은 대조용 정상인, 주혈흡충증 환자(공지된 방광암 보유 여부에 관계없이), 종양을 수술로 제거한 후의 주혈흡충증 관련 방광암 환자, 두경부암 환자 및 경부암 또는 항문암이나 경부 형성이상 환자로부터 분리했다. 소변 침전물은 주혈흡충증 관련 방광암 보유 검체 및 방광 종양이 없는 대조용 검체로부터 분리했다. 소변 침전물은 소변을 Beckman J2-21M 원심분리기에서 약 8,000rpm으로 약 10분 동안 원심분리한 후 분리된 펠릿이다. 태반은 정상적인 출산 후 수득했다. 조직, 말초 혈액 및 소변 침전물의 DNA는 ZR Genomic DNA I 키트(Zymo Research Corp, Orange, CA)를 이용하여 분리했다. 혈청 DNA는 ZR Serum DNA 분리 키트를 이용하여 혈청 약 0.3 내지 5ml로부터 분리했다.
경부의 시료는 ThinPrep PreservCyt 용액(Digene Corporation, Gaithersburg, MD)에 수집했다. 환자의 결과를 보고한 후, 표본에서 환자의 식별자를 떼어내고, 분취량을 준비하여 질량분광 PCR 법으로 검사했다. DNA는 ThinPrep 용액 약 5ml를 ZR Serum DNA 분리 키트 유래의 Zymo 비드 약 10㎕와 함께 회전시켜 분리했다. 비드는 시료에 첨가하고, 약 4배 부피의 Genomic Lysis Buffer(Zymo Research Corporation)을 첨가했다. 이 혼합물을 약 4℃에서 하룻밤 동안 회전시켰다. DNA는 비드로부터 제조업자의 지시에 따라 준비했다. 최종 현탁액은 소량(약 20㎕)의 용출 완충액에 첨가했다. 이러한 시료를 Digene HC2 및 Roche 분석(역방향 라인 블롯팅 포함)을 위해, 제조업자의 지시[1,12]에 따라 처리했다. 그 다음, 시료는 무작위적으로 본 발명에 따른 질량분광분석에 사용했다.
주어진 시료에 존재하는 DNA의 함량을 측정하기 위해, 본 발명자들은 erbB-2 유전자 중의 고유 인트론 분석용으로, Bio-Rad iCycler을 이용하는 TaqMan 형광 QPCR[13]을 수행했다. 프라이머 5'-ACCTTCTCTTGACCTTTCAGAATATGT-3'(SEQ ID NO. 129) 및 5'-AGAGAGTCTTGGCCCTTTCCA-3'(SEQ ID NO. 129)와 함께 TaqMan 프로브 5'-AGAGGGCCCTCTGCCTGCTGC-3'(SEQ ID NO. 130)을 사용했다. erbB-2 프로브 1형광 유닛 당 실험적 유도값 7.7 x 103의 반수체 게놈 당량을 이용했다.
축퇴성 TaqMan HPV DNA 프로브의 작제. 축퇴성 HPV DNA PCR 프로브는 바이러스의 L1 영역에서 작제했다[13]. GP5+ 및 GP6+ 프라이머는 de Roda Husman et al.[15]로부터 입수했다. MY18 및 MY1019 프라이머는 Nelson et al.[16]으로부터 입수했다. 축퇴성 TaqMan[13] 세트를 작제하기 위해, 서열을 조합하여 2개의 외측 프라이머(GP5+ 및 GP6+에 기초한 것)와 프로브(MY18 및 MY1019에 기초한 것)를 보유한 TaqMan 세트를 수득했다. 융점(Tm)은 퀴아젠의 올리고 계산기(http://www.operon.com/oliqos/toolkit.php?)를 이용하여 수득했다.
프라이머 1(GP5+ 유사체): GP5+ 유사체는 이하에 기술되는 4개의 프라이머를 각각 동량씩 혼합하여 작제했다:
GCACAGGGACATAATAAT (SEQ ID NO. 131) Tm=53.8℃
GCACAGGGTCATAATAAT (SEQ ID NO. 132) Tm=53.8℃
GCCCAGGGACATAAT (SEQ ID NO. 133) Tm=53.8℃
GCCCAGGGTCATAAT (SEQ ID NO. 134) Tm=53.8℃.
프라이머 2 (GP6+ 유사체): GAATATGATTTACAGTTTATTTTTC (SEQ ID NO. 135) Tm=53.1℃.
프로브: MY1019 최종 프로브는 MY1019 유사체 1과 MY1019 유사체 2를 같은 용량으로 혼합하여 작제했다. 최종 프로브는 같은 함량의 MY18 유사체와 MY1019 최 종 유사체로부터 작제했다.
MY18 유사체:
CTGTTGTTGATACTACACGCAGTAC (SEQ ID NO. 136) Tm=62.8℃
MY1019 최종 유사체는 다음 유사체 1과 2의 1/1 혼합물로부터 작제했다:
MY1019 유사체 1: GTGGTAGATACCACACGCAGTA (SEQ ID NO.137) Tm=63.4℃
MY1019 유사체 2: GTGGTAGATACCACTCGCAGTA (SEQ ID NO.138) Tm=63.4℃
프라이머와 프로브는 Biosearch에 의뢰하여 합성했다. 프로브에는 5'-말단에 플루오르 6-FAM을, 3'-말단에 Black Hole Quencher 1의 표지를 달았다. 축퇴성 프라이머-프로브 수집물은 HPV-16 또는 HPV-18 서열을 각각 보유하는 플라스미드(미국모식균배양수집소)를 이용하여 검사했다. 축퇴성 프로브를 이용하여 어느 한 플라스미드로 동등한 증폭을 수행했다.
축퇴성 TaqMan 프로브의 PCR 증폭. 정상적인 모든 혈청은 정상적인 게놈 DNA를 적은 함량으로 함유하는 바[16], 혈청 DNA는 TaqMan erbB-2 게놈 DNA 프로브에 의해 모든 시료로부터 제조된다는 것을 입증했다[13]. 유사한 방식으로, 사용된 다른 모든 시료부터 DNA가 분리된다는 것도 확인했다. 약 95℃에서 약 5분 동안 변성시킨 후, 약 95℃에서 약 15초간의 변성과 약 60℃에서 약 30초간의 어닐링으로 이루어진 2단계 프로그램을 40회 동안 반복하여 erbB-2를 증폭시켰다. 약 95℃에서 약 5분 동안 변성시킨 후, 최적화 후 Perkin-Elmer 모델 7700을 이용한 HPV DNA의 QPCR 증폭에 사용한 조건은 약 52℃에서 약 60초(어닐링 및 확장용) 및 약 95℃에 서 약 15초간의 변성으로 이루어진 2단계 프로그램으로, 40회 반복했다. 또한, 이 2단계 프로그램은 질량분광-PCR 방법의 최종 증폭 단계에서 사용된 55회 반복과 일치시키기 위해 다수의 시료에 대해 약 55회 수행했다. 정상적인 어닐링 및 확장 온도보다 낮은 약 52℃는 축퇴성 프로브의 사용을 고려한 것이다. 축퇴성 HPV DNA 프로브를 이용한 TaqMan 반응에서, 각 값은 4회 반복한 값이다. 시료는 Perkin Elmer 모델 7700 기를 이용하여 TaqMan 방법[13]으로 분석했다. DNA 서열분석은 유니버시티 오브 미시간 코어 서열분석실에서 수행했다.
HC2 방법의 적용. HC2 반응은 13가지 고위험 HPV 타입의 DNA에 상보적인 RNA 프로브를 포함한다. HPV DNA와 임의의 상보적 RNA 프로브 사이의 하이브리드화는 RNA:DNA 하이브리드를 표적으로 하는 포획 항체(capture antibody)를 이용하여 검출한다[1]. 1차 검사에서 상대적 발광단위(RLU) 컷오프 비가 ≥10인 표본은 양성으로 간주했다. RLU 컷오브 비가 <약 0.8인 표본은 음성으로 간주했다. RLU 컷오프 비가 약 0.8 내지 9.99 범위인 표본은 다시 검사했다. 반복된 RLU 컷오프 비가 ≥1 이면, 이 시료는 양성인 것으로 간주했다. 양성으로서 반복되지 않는 모호한 표본은 본 연구에서 제외시켰다. 시료는 2그룹(HC2(+) 및 HC2(-))으로 나누고, 익명의 과량 ThinPrep 물질을 MassARRAY 기술로 조사했다.
다른 HPV 타입 분석. 앞서 설명한 바와 같이, 선택한 시료의 HPV 타입은 역방향 라인 블롯 분석의 로쉬 방법[12]으로 추론했다. 또는, HPV의 L1 영역에 축퇴성 프라이머를 이용하여 이 축퇴성 프라이머에 의해 증폭될 수 있는 최다 HPV 서열을 검출했다. HPV52(HPV52는 본 발명자들의 검사에 따르면 축퇴성 프라이머와의 분 기성이 프라이머 결합을 허용하기에는 지나치게 컸다)를 제외한 13종의 병원성 HPV 타입을 모두 조사했다.
사람 게놈 DNA의 측정. 주어진 시료의 DNA 함량을 측정하기 위해 erbB-2 유전자 중의 고유 인트론 분석용으로, Bio-Rad iCycler을 이용하는 TaqMan 형광 QPCR[13]을 수행했다. 프라이머 5'-ACCTTCTCTTGACCTTTCAGAATATGT-3' (SEQ ID NO. 139) 및 5'-AGAGAGTCTTGGCCCTTTCCA-3' (SEQ ID NO. 140)와 TaqMan 프로브 5'-AGAGGGCCCTCTGCCTGCTGC-3' (SEQ ID NO. 141)를 사용했다. erbB-2 프로브 1형광 유닛당 7.7 x 103의 반수체 게놈 당량이 유도되었다. 또한, 이 인트론의 프로브를 22개 프로브의 혼합물에 첨가하여 질량분광기로 분석하고(표 1), iCycler로는 더 이상 별도의 분석을 수행하지 않았다.
분석용 PCR의 정량적 질량 분광법. 일부 양태(이에 국한되는 것은 아니다)에 따르면, 본 발명은 몇몇 초기 분자 정도의 소수 분자를 검출하기 위해, 매트릭스에 적재된 실리콘 칩 어레이 상의 산물을 실시간 경쟁적 PCR(rcPCR), 프라이머 확장 및 MALDI-TOF MS 분리로 처리하는 다단계 공정을 포함한다[8]. 경쟁적 뉴클레오타이드 주형(일 예로서, 약 100nt)은 합성 동안 도입되는 경쟁인자 중의 단일 염기 돌연변이를 제외하고는 PCR용 HPV 표적 서열에 일치하도록 합성했다. 단일 염기 변화는 그 다음 SNP 유전자형별[10]에서 이용되는 유사한 방식으로, 프라이머 확장 반응을 수행하고, MALDI-TOF MS에서 질량(돌턴)별로 산물을 분할하여 HPV 표적 대립유전자로부터 구별할 수 있다. 바람직하게는(이에 국한되지는 않는다), PCR 반응 에 경쟁적 주형을 공지량으로 첨가하고, 이어서 적정하여 표적 DNA 함량 측정용 표준 곡선을 작도할 수 있다. 표적 대립유전자와 경쟁적 주형 대립유전자의 피크 면적이 동일하면, 두 분자의 농도는 대략 1:1 비율인 것으로서, 반응물 중에 표적 DNA의 함량을 나타낸다. 질량 분광분석은 매우 특이적인 방법으로서, 본 예시적 양태에 따르면 주어진 프라이머 확장 산물은 약 20돌턴까지의 분리능으로 식별되었다. 따라서, 임의의 불순 산물이 거짓 양성 시그널을 만들기 위해서는 그러한 특정 크기이어야 한다. 내부 표준물질(경쟁적 주형)의 존재는 PCR에 필요한 효소가 작용성인지, 시료가 PCR 억제제 없이 정제되었는지를 확인시켜준다.
DNA의 실시간 경쟁적 PCR 및 질량분광분석을 이용한 HPV 타입 및 함량의 측정. 일부 양태에 따르면(이에 국한되는 것은 아니다), 13중체(13-plex) HPV 검정은 먼저 Primer3 소프트웨어(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3 www.cgi)를 이용하여 다양한 HPV 균주의 E6 영역으로부터 PCR 및 확장 프라이머 서열을 유도해 내어 설계했다. 그 다음, 이러한 서열들을, MassARRAY assay designer software v3.0(Sequenom,Inc., San Diego, CA)[8]에 사용하기 위한 입력 서열 경계를 정의하는데 사용했다. 이러한 방식으로, 본 발명자들은 고위험 HPV의 13가지 다른 타입을 각각 구별할 수 있었다(도 1)[1]. 순방향 및 역방향 프라이머, 확장 프라이머 및 경쟁인자 서열은 표 2에 개시했다. 또한, 일부 양태는 이러한 목적용으로 제작된, 우리의 면밀한 검토를 거친 다른 소프트웨어를 이용한 더욱 집중적인 선별 방법도 포함한다. 이러한 소프트웨어를 사용하여, 본 발명자들은 최초 13종의 HPV, 추가 6종의 HPV, 주어진 분취량에 존재하는 사람 DNA 함량의 정량분석용 게놈 DNA 단일 카피 프로브, 나이세리아 고노로에(Neisseria gonorrhoea) 및 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)용 프로브를 포함하는 22개의 서열 타입으로 이루어진 프로브를 작제했다(예, 표 1A 내지 표 1C). 최초 PCR 반응의 온도는 약 60℃이며, 제2 프라이머 확장 반응의 온도는 약 58℃이다,
PCR의 다중체화된 rcPCR 질량분광분석용 조건은 이전에 설명된 바 있다[18, 19]. 반응은 처음에는 96웰 마스터 평판을 만들어 수행했고, 이로부터 MultiMek 로봇을 이용하여 384 웰 반응 평판을 설립했다. 각 HPV 균주에 대한 소정의 경쟁인자를 4개 웰에는 0aM(아토몰= 10-18M), 다른 4개 웰에는 1aM씩 첨가했다. 그 다음, 주어진 HPV 서열에 대해 양성인 반응을, 각 양성 HPV마다 정량분석했다. 반응의 정량분석에는 경쟁인자 10aM, 100aM 및 1fM(펨토몰=10-15M)을 사용했다. 반응물이 적정하기에 지나치게 양성이면, 표본을 1/100로 희석하여 재적정했다.
MassARRAY는 균일한 검정법이 아니기 때문이, 반응의 조성에 주의를 기울여야 한다. 본 발명자들은 2개의 로봇(1차 PCR 전과 후에)을 이용하여 반응을 조성하고 오염을 최소화했다. 정상 시료가 음성임을 보여주는 모든 평판의 관례적인 통제는 상기 오염 방지 기술이 효과적이라는 것을 입증했다. 여기서 기록된 모든 값은 적어도 8개의 독립된 데이터 점의 분석을 나타낸다.
대조용 시료. 본 발명자들은 조직, 혈청, 말초 혈액 및 소변 침전물의 일련의 대조군을 조사했다. 조직 대조군은 정상 태반 유래의 DNA 시료였다. 혈청 및 말초 혈액 대조군은 HPV에 노출되지 않은 것으로 알려진 익명의 검체의 혈청 및 말초 혈액에서 분리한 DNA 시료이다. 소변 침전물 대조군은 정상 지원자 유래의 DNA 시료이다. 여기에 보고된 모든 증례마다, TaqMan에 의한 erbB-2 대조용 프로브와의 반응은 양성이었고, 이는 QPCR 품질의 DNA가 존재한다는 것을 입증했다. 대조용 시료는 일반적으로 총 4개의 웰에서 축퇴성 HPV DNA 프로브에 대해 음성이었고, 드물게 1/4웰에서 양성이었다. 따라서, 본 발명자들은 ≥3/4웰에서 반응한 시료만을 양성인 것으로 간주하여 보존했다.
상기 정의를 Perkin-Elmer 모델 7700에서 분석되는 시료에 사용하면, 축퇴성 HPV DNA 프로브는 0/40개 정상 소변 침전물, 0/27 정상 혈청 시료, 0/20 정상 말초혈액 시료 및 0/9 태반(정상 조직 시료의 대조군)과의 반응성을 나타냈다. 또한, 질량 분광-PCR 시스템을 이용한 더욱 더 민감한 분석에서도 상기 어떠한 정상 시료에도 HPV DNA가 존재하지 않는다는 것을 보여주었다.
고도로 보존적인 역방향 프라이머(GP6+ 유사체)를 DNA 서열분석의 개시 프라이머로서 사용하는 경우, 디데옥시 서열분석을 통해 HPV DNA 타입을 결정할 수 있었다. 본 발명자들은 다음과 같은 사항을 관찰했다:
축퇴성 프로브는 모든 대조용 조직에서 음성이어서 적당하며;
주혈흡충증 관련 방광암(표 3), 두경부암(표 4) 및 경부암(표 5)에서는 HPV DNA의 존재를 확인했다. 이것은 이러한 연관성을 암시하는 많은 문헌들과 일치한다.
또 다른 예로서(이에 국한되지 않는다), 본 발명의 가능한 양태에 따르면, 제1 단계로서, 종양 또는 경부 ThinPreps를 본 발명의 질량분광분석을 이용하여 13 종의 병원성 타입 중 하나를 선별하여[1], 단일 반응 중에서 13가지 다른 타입의 병원성 HPV 중 어느 한 타입을 개별적으로 동정했다. 세포의 형질전환을 위해 HPV에 존재해야만 하는 HPV의 E6 영역 유래의 서열을 유도해 내었다. 종양원성 HPV 균주의 E6 단백질은 p53 단백질과 상호작용하고 유비퀴틴 의존적 경로를 통해 그 분해를 촉진한다[20]. 서열은 사람 암에서 병원성이고(http://hpv-web.lanl.gov/) 적어도 하나의 기존 방법인 다이진 선별[1; 표 2]에 따라 공지된 13종의 HPV 타입 각각의 E6 영역으로부터 유도해 냈다.
일부 양태에 따르면(이에 국한되지 않는다), PCR의 최적 온도를 변경시킬 수 있는 프라이머 크기의 지나친 변동 없이 양호한 분자량 간격을 얻기 위해 서열을 조정한다. 본 발명자들은 이 방법을, 표 1A 내지 1C에 상세히 기술한 바와 같은 22개 프로브를 이용한 더욱 개량된 선별 방법에 사용했다. 일부 양태에 따르면, "와일드 카드(wild card)" 염기 데옥시이노신이 데옥시구아노신, 데옥시아데닌 또는 데옥시티미딘 대신에 사용되는 15개 이하의 인접 염기가 사용된다. 이 개념은 사람 게놈 크기와 관련하여 유도된 것으로서, 16개 이상의 염기에 의한 과돌연변이의 수(약 416)은 사람 게놈 크기보다 크기 때문이다. 이러한 양태를 이용하여, 본 발명자들은 내부 데옥시이노신의 치환이 PCR 조건 또는 PCR 분석의 성능에 어떠한 영향도 미치지 않는다는 것을 발견했다. 22개 표적 서열을 위해 사용한 프라이머는 표 1에 정리했다. 따라서, 이러한 양태에서는, 사람 게놈 중의 주어진 서열과 관련이 있을 수도 있는 >15 뉴클레오타이드의 서열 스트레치(서열의 이 길이는 사람 게놈 에서 독특하게 표시되어야 하는 길이이다)는 사용하지 않았다. 따라서, 일부 양태에서는 사용된 인접 서열이 사람 게놈에서 독특하게 표시되기에는 너무 작다.
또한, 일부 양태에 따르면(이에 국한되지 않는다), 원하는 분자량 간격이 필요하다면 스페이서 분자를, 이용된 질량 분광분석 시도에 사용된 내부 프라이머인 MassEXTEND 프라이머(예, 표 1B 및 표 1D)의 5' 말단에 부착시킴으로써 달성되었다. 이것은 PCR 조건에 영향을 미칠 수 있는 프라이머 길이에 주요한 변화를 일으킴이 없이 상기 프라이머 서열의 원하는 간격을 달성하여, PCR을 최적화하는 균일한 조건에서 모든 프라이머 세트에 최적의 PCR 조건을 유지시킨다. 종합해보면, 데옥시이노신 및 변경인자를 이용하는 상기 시도들은, 일부 양태들에서 사용된 바와 같이, 상기 시도를 위해 조정된 프라이머 세트를 산출한다.
일부 양태에 따르면, 서열은 19종의 다른 HPV 타입마다 비확장 프라이머, 야생형 유전자 및 내부 경쟁인자에 해당하는 서열들 사이에 약 20nt 미만의 분자량 중첩은 없도록 선택했다. 또한, 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 및 나이세리아 고노로에(Neisseria gonorrhoea)를 위한 프로브도 추가하여, 마지막에 이 기술로 19종의 HPV 타입, 분석되는 게놈 DNA의 양을 판독하는 표준, 및 클라미디아 또는 고노로에에 의한 감염의 결정인자를 검출 및 정량분석할 수 있었다. 종합해 보면, 이 시스템은 3 x 22 = 66개의 다른 피크를 각각 구별할 수 있을 것이다(질량분광분석으로 구별되는 피크들은 미확장 프라이머; 미확장 프라이머 + 야생형 유전자 서열(미확장 프라이머 + 유전자의 다른 뉴클레오타이드에 따라 C 또는 G); 및 미확장 프라이머 + 내부 경쟁인자 서열(미확장 프라이머 + 경쟁인자의 다른 뉴클레오타이드에 따라 G 또는 C)였다). 이러한 차이는 두 분자량 사이에 약 20돌턴의 차이를 구별하는 질량분광분석 기반 방법의 능력에 기초한다.
도 1은 다이진 검사에서 선별되는 13종의 병원성 HPV 타입[1](HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 68)에 대한 본 발명에 따른 질량분광분석 선별의 프로필 결과를 도시한 것이다. 13종의 다른 고위험 HPV 타입(HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 및 68[3]) 각각에 대한 MassEXTEND 프라이머[16]의 분자량에 해당하는 13종의 다른 피크를 볼 수 있다. 피크가 없는 라인은 MassEXTEND 경쟁인자와 유전자 산물이 위치할 수 있는 곳을 나타낸다(가능한 총 3 x 13 = 39개의 비중첩 피크를 나타낸다; 간단히 나타내기 위해 13개의 미확장 피크만을 도시했다).
도 1은 다양한 HPV DNA 서열을 검출 및 구별하는 본 발명의 능력을 예시한 것이다. 일부 양태에서는 각각 약 100nt HPV E6 서열, 게놈 DNA 표준물, 클라미디아 트라코마티스 및 나이세리아 고노로에를 위해 적당한 세트의 외부 프라이머와 적당한 비확장 프라이머 MassExtend 서열(약 20nt)을 사용했다. 각각 약 100nt 서열에 해당하는 올리고뉴클레오타이드에 하나의 염기를 변화시켜(G 대신 C, 또는 C 대신 G) 합성했다. 합성은 예를 들어 상용화된 올리고뉴클레오타이드 합성기(예컨대, Integrated DNA Technologies(IDT)에서 제공하는 서비스)를 이용하여 수행했다. 약 100nt 길이의 올리고뉴클레오타이드는 각각 19종의 다른 HPV 타입, 게놈 DNA 표준 서열, 클라미디아 트라코마티스 서열 및 나이세리아 고노로에를 위한 내부 경쟁인자 서열에 해당하는 서열을 이용하여 합성했다. 22개의 각 서열을 위해, 상기 약 100nt 길이의 올리고뉴클레오타이드의 우측 및 좌측 말단에 해당하는 약 20nt 프라이머(여기서 태그를 첨가하여 도 1에 도시된 질량분광 프로필에 방해되지 않게 했다)를 합성했다. 마지막으로, 하나의 뉴클레오타이드 차이를 이용해 C 또는 G에 직접 접해있는 서열(이 경우에 내부 경쟁인자는 각각 G 또는 C를 포함하게 되어, 내부 경쟁인자 서열과 야생형 유전자 서열을 구별하는 것이 가능했다)을 포함하는 질량 분광분석 확장 프라이머를 합성했다.
일부 양태에 따르면, 야생형 유전자 서열과 내부 경쟁인자 서열에 대한 프라이머 서열은 동일하다. 야생형 유전자 서열과 내부 경쟁인자 서열 사이의 유일한 차이는 비확장 프라이머 서열에 인접한 하나의 뉴클레오타이드이다. 이러한 서열의 동일성으로 인해, 야생형 유전자 서열과 내부 경쟁인자 서열은 동일한 효율로 증폭한다. 결과적으로, 내부 경쟁인자의 공지량의 증폭은 본 발명에서 증폭되는 야생형 유전자 서열의 함량을 정량분석하는데 사용될 수 있다.
일부 양태에 따르면(이에 국한되지는 않는다), 미확장 프라이머, 미확장 프라이머 + 구아노신 및 비확장 프라이머 + 시토신( 3 x 22개 프라이머 = 총 66개 프라이머)은 모두 약 5000 내지 약 8500 돌턴 사이의 분자량 간격 안에 위치해야 하고, 최소 약 20 돌턴 거리씩 이격되어 있어야 한다. 이와 동시에, 프라이머의 길이는 그 프라이머들이 같은 온도에서 모두 증폭을 수행할 수 있도록 좁은 온도 범위 내에서 주형으로서 결합하고 기능해야 하는 조건을 충족시키는 것이어야 한다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 본 발명자들은 다양한 불활성 스페이서 분자를 비확장 프라이머의 5' 말단에 부착시키는 새로운 전략을 개발했다.
일부 양태를 위해(이에 국한됨이 없이), 1차 PCR 증폭에 사용한 증폭 프라이머는 표 1A에 제시했다. PCR 매개 확장에 사용된 프라이머는 표 1B에 제시했다. 경쟁인자의 서열은 표 1C에 제시했다. 사용한 스페이서는 표 1D에 상세히 설명했다. HPV 타입 16, 18, 23, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 및 82에 대한 프라이머 서열을 제시했다. 또한, 본 발명은 유전자 erbB-2의 인트론을 이용한 총 게놈 DNA 유입량의 측정, 및 2가지 부인과적 개입 감염(클라미디아 트라코마티스 및 나이세리아 고노로에)도 포함한다. 프라이머 서열은 검사한 결과, 작동성인 것으로 밝혀졌다. 결과적으로, 본 발명은 19종의 HPV 타입의 동시 선별, 총 게놈 DNA의 측정 및 클라미디아 트라코마티스 및 나이세리아 고노로에 감염 검사를 포함한다.
이러한 양태의 방법론은 균일하게 본 명세서에 기술된 본 발명의 다른 관점과 함께 종양발생 등으로 인해(이에 국한되지 않는다) 혈청 및/또는 혈액에 존재하는 HPV의 종류 및 함량을 측정하는데 사용될 수 있다. 혈청 및/또는 혈액을 선별하는 기술은 최상의 HPV 프로브를 선별할 때 가장 민감하기 때문에, 종양 및/또는 ThinPreps의 선별은 HPV의 존재 여부 및 존재한다면 HPV의 타입을 측정하는데 사용될 수 있다. 이러한 HPV의 타입은 그 다음 혈액 및/또는 혈청을 최대 효율로 선별하는데 사용되고; 여러 HPV 타입이 존재한다면, 각 타입이 개별적으로 선별될 수 있다. 이러한 본 발명의 양태의 성공은 혈청 및/또는 혈액에서보다 높은 농도로 종양 또는 ThinPreps에 존재하는 HPV 이용에 의한 것이다. HPV 타입이 결정되면, 혈청 및/또는 혈액은 그 다음 종양에서 발견되는 HPV 타입에 대해 최대 민감도로 선 별될 수 있다.
앞에서 논한 바와 같이, 다이진 검사는 경부 ThinPrep에서 발현되는 HPV 타입을 밝혀내지 못한다. 이것은, 일부 양태에서 혈청 및/또는 혈액에 적용되는 본 발명이 13종의 병원성 HPV 타입 모두에 대한 일반적인 선별보다, 공지된 단 하나의 병원성 HPV 타입만이 선별될 때 가장 민감한 바, 중요해진다. 종종 암 및 형성이상 증례의 혈청 및 혈액에 존재하는 HPV DNA가 너무 적으면, 사용자는 민감도를 증가시키기 위해 한번에 단 하나의 HPV 프로브로, 특히 본 발명의 민감한 질량 분광분석을 이용하여 상기 선별을 수행하는 것이 바람직할 수 있다[3].
본 발명의 일부 바람직한 양태는 다음을 통해 다이진 반응의 단점을 해결하지만, 이에 국한되는 것은 아니다:
1. 질량 분광분석 선별의 다중능을 적용하여;
2. 각 HPV 타입 특이적 반응 산물의 분자량이 약 ±20 돌턴까지 정확하고, 이에 따라 주어진 HPV 타입의 서열에 특이적이기 때문에 관련 HPV 서열들 유래의 교차반응 없이 정확한 진단을 통해; 실제로, 본 발명의 질량분광분석 검사는 다른 HPV 바이러스와의 교차 반응 없이 다이진 선별에 의해 검출할 수 있는 13종의 병원성 HPV 타입을 각각 구별한다(도 1);
3. 본 발명의 질량분광분석은 각 분자의 수준(이 수준에서는 예상 푸아송 편차를 볼 수 있다)까지 양성이다; 및
4. 본 발명의 질량 분광분석 반응은 경부 ThinPrep에 존재하는 HPV 타입을 구별한다. 혈청 및/또는 혈액을 선별하는 기술은 최상의 HPV 프로브를 선별할 때 가장 민감한 것이기 때문에, 종양 및/또는 ThinPrep의 선별은 HPV 존재 여부, 및 존재한다면 HPV 종류를 측정하는데 사용된다. 이러한 특정 타입의 HPV는 그 다음 혈액 및/또는 혈청을 최대 효율로 선별하는데 사용된다. 이러한 선별의 성공은 혈청 및/또는 혈액보다 높은 농도로 경부 찰과표본의 ThinPrep 또는 종양에 있는 HPV의 존재를 이용한다. HPV 타입이 ThinPrep 또는 종양에서 일단 측정되면, 그 다음 혈청 및/또는 혈액은 종양에서 발견되는 HPV 타입에 대해 최대 민감도로 선별될 수 있다.
일부 바람직한 양태에 따르면(이에 국한되는 것은 아니다), 본 발명의 제2 기(2기)로서, HPV 타입이 일단 동정되면, 1기에서 측정된 제시된 HPV 타입으로 체액(예컨대, 혈청 및 혈액) 또는 재발성 종양 또는 반복 ThinPrep을 선별한다. 이러한 연구는 HPV의 타입 및 지속성이, 일 예로서(이에 국한됨이 없이) 예후적 용도가 있는 것인지를 측정하고, 그 장애에 대해 이전에 치료받은 적이 있는 개체에 잔류 종양이 존재하는지를 측정하기 위해 장기적으로 수행될 수 있다. 본 발명이 아니라면, 이러한 연구는 혈청 및/또는 혈액 중의 HPV 분석이 TaqMan 기술로 수행할 때에도 충분히 민감하거나 특이적이지 않았기 때문에[3], 불가능한 것이었다. 이에 반해, 본 발명을 이용한 현행 연구는 본 발명의 민감하고 특이적인 질량 분광분석 기술로 혈청 및 혈액 연구의 실현가능성을 입증한다.
다른 예로서(이에 국한되는 것은 아니다), 질량 분광분석 시스템을 포함하는 일부 양태에 따르면, HPV 16 DNA는 총 24가지 주혈흡충증 관련 방광암에서 검출되었고, 이로부터 DNA를 준비했다(표 3의 오른쪽). 이러한 시료 중 하나를 제외한 모 든 시료에서는 정합성 혈청이 또한 양성이었다. 종양 DNA를 입수할 없는 다른 3 증례에서도, 혈청은 HPV 16 DNA 양성이었다. HPV 16 DNA는 주혈흡충증 관련 방광암 증례의 전부는 아니지만 대부분에서 수득한 소변 침전물에서 검출된다. 이러한 데이터는 주혈흡충증 관련 방광암에서 HPV 16 감염을 연루시킨다. 비교용으로, 실시간 TaqMan QPCR(표 3의 왼쪽)은 일부 양태의 질량 분광분석(표 3의 오른쪽)만큼 민감하지 않았다. 이러한 증례 유래의 혈액(연막)은 검출할 수 있는 HPV DNA를 함유하고 있지 않았다(데이터는 미제시).
관련 예에서는 HPV DNA의 존재가 단순히 주혈흡충증으로 인한 것이 아니라는 것을 보여주었다. 주혈흡충증이 존재하는 10가지 증례를 조사했고, 임상적으로는 입증할 수 없는 방광암이 약간 의심되었다. 그 증례 중 8가지에서는 HPV 16 또는 HPV 18 DNA가 혈청 중에서 발견되지 않았고, 증례 중 2가지에서는 HPV 16 DNA가 발견되었다. 이것은, HPV DNA가 주혈흡충증 자체와 연관이 있는 것이 아니라, 방광암을 보유한 주혈흡충증 증례에서 종양 발생과 연관이 있음을 증명하는 것이다. 또한, 임상 데이터가 결정적이지 않고 암시적인 불확실한 증례의 진단을 도울 수 있는 본 발명의 용도를 예시하는 것이다.
또한, 혈청 HPV 16 DNA는 종양 제거후 빠르게 사라지는 것으로 관찰되었다. 주혈흡충증이 있는 검체 7명의 혈청을, 암성 방광을 수술로 제거한 후 2주 이내에 조사했다. 7명의 증례 모두, HPV 16 DNA가 혈청에서 검출되지 않았다. 수술전 혈청을 입수할 수 없었지만, HPV 16에 대한 종양들의 일정한 양성 성질은 HPV가 존재했을 가능성이 있고, 수술로 제거되었을 것임을 시사한다.
또한, HPV DNA가 두경부암의 진단 시에 수득한 정합 종양, 혈액 및 혈청 시료에서 존재하는지의 여부를 조사했다. 각 시료마다, 원발성 종양 부위가 주어진다. 또한 TaqMan 형광 QPCR 분석을 시도했지만, 혈액 및 혈청에서 HPV DNA는 검출되지 않았고, 이는 TaqMan 기술이 임상적으로 유용할 정도로 충분히 민감하지 않다는 다른 연구진의 발견(3, 21]과 일치하는 것이었다. 이에 반해, 본 발명에 따른 질량분광분석은 표 4에 정리한 데이터를 산출했다. HPV 16 DNA의 존재를 증명하는 판독값은 진하게 표시했다.
종양, 혈청 및 혈액은 두경부암 증례 환자로부터 분리했다(모든 검체마다 각 시료를 모두 입수할 수는 없었다; 시료가 없는 것은 빈 공간으로 두었다). 이와 같이 수득한 종양, 혈액 및 혈청 시료에 대하여 HPV 16 DNA의 질량분광분석 측정을 수행했고, 이 시료들에서 HPV 18 DNA 프로브에 의해 양성인 것은 없었다(이 때, 본 발명자들이 DNA 서열분석을 수행한 다른 두경부 종양 시료에서는 HPV 18 DNA 양성이었다). HPV DNA의 존재를 증명하는 비정상적 판독값은 진하게 표시했다. 아토몰(aM) = 10-18M; 펨토몰(fM) = 10-15M.
두경부관의 전위부(예, 혀, 편도선)의 종양은 HPV 양성이고 후위부(예, 후두, 성문상 영역)의 종양은 음성이라는 강한 편견이 있다. 이것은 종래 보고[22-29]와 일치했다. 본 발명자들은 HPV 16 DNA와 HPV 18 DNA에 대해 음성인 단 3가지 구강 종양(16가지 중에서)을 발견했다(이러한 음성 구강 종양은 다른 HPV 타입에 대해서는 양성일 수 있다). 10가지(하인두 종양) 중에서 1가지 종양만이 구강 후위 부 종양이고 HPV 16 양성이었다. 종양이 양성이고 혈액 및 혈청이 모두 분석될 수 있는 9가지 시료 중에는, HPV DNA가 혈청에서만, 혈액에서만 또는 혈청과 혈액에서 모두 식별되는 HPV DNA에 대해 종양이 양성인 증례가 있었다.
경부암은 거의 일정하게 HPV와 연관성이 있다[16,22]. 경부 종양 및 형성이상에서 13가지 고위험 사람 유두종바이러스(HPV) 서열에 대한 본 발명에 따른 질량분광분석을 이용할 때, 다음과 같은 결과를 발견했다:
1. 사실상 모든 종양은 13가지 병원성 HPV 타입 중 하나의 증거를 보유했고, 병원성 HPV 타입의 함량은 지속적으로 0으로 감소했다. 비병원성 HPV는 형성이상에서는 관찰되었으나, 종양에서는 거의 관찰되지 않아서, HPV 타입의 제한된 그룹이 경부 종양발생에 책임이 있다는 개념을 지지했다. 질량 분광분석이 몇 안되는 바이러스의 수준까지 검출할 수 있는 고유의 능력은 다른 방법으로는 실현이 불가능한 극소량 수준의 병리학적 HPV 타입을 검출할 수 있게 한다.
2. 경부 종양에서, HPV 역가는 형성이상에서 관찰되는 최고 값보다 여러 배 낮은, 통상 반수체 종양 게놈 당 1HPV 분자 미만이었다. 이것은 '힛앤런(hit and run)' 모델에서 일정하여, HPV 감염이 형성이상의 성장에 필수적이지만, 종양발생에는 충분하지 않았다.
3. 사실상 모든 병리학적 비정상(CIN 1 또는 2) 경부 형성이상은 13가지 병원성 HPV 타입 중 하나를 나타냈다. 또한, 병원성 HPV의 다수의 타입이 종종 다른 역가로 관찰되었다. 이러한 병원성 HPV에 의한 다중 감염은 종양보다 병리학적으로 비정상인 형성이상에서 더욱 일반적이었다(17% vs. 72%). 또한, 다른 방법론을 사 용하여, 형성이상에서 높은 역가로 존재하는 다른 HPV 타입도 검출했다. 하지만, 이러한 타입들은 종양에서는 검출되지 않았고, 이것은 종양발생이 본 발명의 질량 분광분석에 의해 분석되는 HPV 타입의 제한된 세트로부터 초래된다는 것을 증명한다.
4. 현재 임상적으로 사용되는 다이진 HC2 방법에 의한 다른 HPV 타입의 검출은 본 발명의 검사에서 산출되는 거짓 양성을 초래한다. 질량분광분석은 이러한 문제점을 경감시킨다.
경부 질환을 검출하는 현행 방법은 2가지 주요 기술에 의존하고 있다: 1. G.N. 파파니콜라(Papanicolaou) 박사가 개발한 'Pap' 도말표본(smear)[30] 검사[30]인, 탈락 경부 세포의 세포학적 이상의 검출; 및 2. HPV 감염의 검출[1]. 세포학의 주요 단점은 문제가 되는 관찰자간 신뢰성, 제한적인 민감도(≤85%) 및 고도로 숙련된 검사 수행자에 대한 의존성이다[30,31]. 실제, Pap 도말표본 검사의 민감도는 반복적 선별에 의해서만 임상 목적에 적당한 것으로 간주된다. 결과적으로, 개체가 정규적인 후속 정밀검사를 받지 않고, 경부 이상을 보유한 모든 개체를 검출하기 위해 세포학적 Pap 검사를 반복 사용하지 못하면, 선별된 개체 중의 경부암 빈도를 증가시킬 것이다.
세포학적 방법에 대한 대안은 사실상 모든 경부 암종의 필연적인 원인인 HPV의 직접 검출을 수행하는 것이다[1,5,32]. HPV는 현재 타입 특이적 하이브리드화 프로브의 조합을 이용하여 경부암과 연관된 고위험 HPV 13 타입을 측퇴성 올리고뉴클레오타이드를 이용한 PCR로 검출하는 FDA 승인을 받은 HC2 test™(Digene Corporation, Gaithersburg, MD)[1], 또는 존재하는 HPV의 형태를 검출한 뒤 타입을 분석하는 Roche에 의한 일련의 진단 검사법[35]으로 검출한다. 이러한 방법들의 주요 단점은 제한된 감도, 특이성 및 정량적 능력이다. 민감도는 약 102 내지 103 분자가 이러한 검사법에 의해 검출되어야 하는 바 제한적이다[1,13]. 특이성은 고위험이 아닌 HPV 균주와의 HC2의 교차반응으로 인해 제한적이며, 약 10%가 고위험이 아닌 HPV 균주와 교차반응한다[2][2,36]. 또한, HC2 검사는 정확한 정량분석을 수행하기도 쉽지 않다. HC2에 의한 정량적 차별은 총 세포 함량에 대한 표준화가 어렵기 때문에 제한적이며, 이 검사의 가변성이 제한적이고, 복수의 HPV 서열이 존재할 때 관찰되는 시그널을 나타내는 HPV 타입(들)을 정량분석하는 것이 불가능하다. 이러한 제한들을 다루기 위해 Roche의 일련의 기술을 사용하려면, 검사를 수행하기가 더 어렵게 하는 검사의 다수 종류를 수행해야만 한다. 이러한 어려움으로 인해, 정량분석은 복잡하여 거의 실시되지 않는다.
이에 반해, 본 발명자들은 경부 형성이상을 모니터하기 위해 질량분광분석을 기반으로 한 시도를 포함하여, 경부 HPV의 식별 및 정량분석이 궁극적으로 혈액 및 혈청 검사와 연계될 수 있는 본 발명을 개시한다. 본 연구의 일부로서, 본 발명자들은 FDA 승인된 HC2 방법에서 고위험 균주로 검출한 바와 같은 13가지 HPV 타입(HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39,45, 51, 52, 56, 58, 59 및 68)을 사용했다[1]. 프라이머 서열 및 분자량, 경쟁인자 서열은 표 2에 제시했다.
일부 양태의 질량분광분석을 이용하여, 본 발명자들은 13가지 HPV 타입에 대 한 프로브를 가지고 조사했을 때, 35개의 혈액 대조용 시료에서 HPV가 확실하게 존재하지 않는 것을 발견했다. 이것은 이러한 고도로 민감한 기술이 거짓 양성의 배경을 나타내지 않는다는 것을 증명한다. 본 연구의 데이터로부터 여러 가지 사실이판명되었다: 첫째, 본 발명자들은 13가지 병원성 HPV 타입을 각각 고유하게 보유하는 시료를 관찰했고, 따라서 질량분광분석 시 HPV 타입 간의 교차 반응은 없다. 2이러한 사실을 지지하듯이, 복수의 타입이 존재할 때에도 다른 HPV 타입과 일치하는 HPV 타입은 발견되지 않았다. 둘째, 질량 분광분석은 최저 수준에서 관찰된 푸아송 편차를 통해 확인할 수 있듯이, 개별적 분자 수준의 민감도를 달성한다. 셋째, 이러한 13가지 타입에 의한 다중 HPV 감염은 종양(17% = 13/78)에서보다 HC2 양성 환부(32% = 36/113)에서보다 CIN I/II를 보유한 형성이상(72% = 70/97)에서 더 일반적이다. 넷째, 세포당 바이러스 역가는 종양에서보다 형성이상에서 더 높다(종양에서의 값은 반수체 게놈 당량당 HPV <1 카피으로 일정하지만(도 3A), 그 값은 Pap 양성 형성이상에서 동등한 반수체 게놈당 HPV 약 103 카피(도 3B) 및 HC2 양성 형성이상에서 동등한 반수체 게놈 당 HPV 104 카피(도 3C)) 범위이다). 즉, 한 시료에서 가장 풍부한 HPV 서열의 중앙값은 HC2 양성 시료에서는 약 8.4 x 100, CIN I/II 시료에서는 약 3.0 x 10-1, 종양에서는 약 2.9 x 10-2이었다. 즉, 중앙 HPV 역가는 형성이상에서보다 종양에서 1 내지 2등급 낮았다. 비교용으로, 정상 Pap 도말표본을 이용하여 형성 유래의 대부분의 시료는 HPV를 보유하지 않거나 낮은 역가의 HPV만을 보유했다(도 3D). 다섯째, 13가지 병원성 HPV 타입 중 하나는 사실상 모든 경부 종양에서 존재했다(81/82; 표 5). 모든 증례에서, 병원성 HPV의 함량은 반수체 게놈당 0카피 까지 지속적인 변동을 나타냈다.
본 발명은 오로지 질량분광분석이 최저 역가의 HPV 타입을 검출하기에 충분히 민감한 경우일 때의 종양 시료를 포함한다. 본 발명자들은 다른 덜 민감한 기술로는 불가능했던 HPV의 극소량(최하 약 1aM = 개별적 분자)을 질량분광분석으로 검출했다. 사실상 모든 종양이 13가지 병원성 HPV 타입 중 하나를 운반한다는 발견은 재료 및 방법(표 5) 편에서 기술한 바와 같은 축퇴성 프라이머로 프라이밍된 DNA 서열분석을 통해 확인했다. DNA 서열분석에 이용할 수 있는 분자의 불충분한 수로 인한 DNA 서열분석의 실패를 제외하고는 본 발명자들은 연관된 HPV 타입이 13가지 고위험 HPV 타입 중 하나라는 질량분광분석 결과를 일정하게 확인했다.
질량분광분석으로 검출한 HPV 타입과 축퇴성 DNA 서열분석으로 검출한 타입 간에는 높은 일치성이 있었다. 두 기술이 다른 표적이어서 달라지기 때문에 예상될 수 있는 몇몇 불일치도 있었다. HPV31에 대해 겨우 약 2aM의 질량분광분석 결과를 나타내는 증례에서, DNA 서열분석은 13가지 병원성 HPV 타입에서 관찰되지 않은 타입인 HPV 73을 검출했다(하지만, 본 발명자들의 신규 선별방법에서는 19 HPV 타입에 속한다). 즉, 이 종양은 DNA 서열분석의 검출 능력 이하인 병원성 HPV 31과 함께 두 HPV 타입을 보유했다. 질량분광분석과 DNA 서열분석 겨로가 사이에는 3가지 다른 불일치 증례가 나타났지만, 각 증례마다 13가지 병원성 타입의 그룹에 속하는 HPV 타입만이 DNA 분석에 의해 동정되었다.
병리학적 경부 형성이상에 대한 질량분광분석, 역방향 라이 블롯팅 및 축퇴성 DNA 서열분석. 본 발명자들은 경부 상피내 종양 CIN I 또는 CIN II에서 형성이상 단계인 것으로 판정된 병리학적 비정상 시료에 대하여 역방향 라인 블롯팅[12]과 함께 질량분광분석의 결과를 비교했다. 49개의시료에서, 질량분광분석 기술이 약 40aM 이상의 농도인 13가지 병원성 HPV 타입 중 하나의 존재를 확인했을 때, 질량 분광분석과 역방향 라인 블롯팅 사이의 결과는 완전히 일치했다(데이터는 제시안됨). 하지만, 적은 HPV의 양에서는 이러한 일치성이 깨졌다(표 6). 질량분광분석은 <약 40aM 양에서도 13가지 병원성 HPV 타입 중 하나를 일정하게 검출했지만, 이 때 DNA 서열분석과 역방향 라인 블롯 방법은 13가지 고병원성 HPV 타입 중 어떠한 타입이나 다른 HPV 타입도 검출하지 못했다(표 6). 본 발명자들은 이러한 결과를, 역방향 라인 블롯팅에 의해 관찰된 HPV 타이빙나 다른 비병원성 HPV 타입을 보여준 축퇴성 DNA 서열분석으로 확인했다(역방향 라인 블롯팅 및 DNA 서열분석에 의해 검출된 HPV 타입의 스펙트럼은 겨우 부분적으로 중복되어, 이러한 두 기술이 다른 답을 나타내는 이유를 설명하지만, 두 기술을 이용하여 13가지 병원성 HPV 타입을 모두 조사할 것이다(축퇴성 서열분석법에 의해 잘 증폭하지 않는 HPV 52를 제외하고)). 다른 덜 민감한 방법에 의해 평가될 수 있는 저 역가의 결과는 대조용 혈액 시료(HPV 부재) 또는 Pap 음성 시료(대부분의 시료에서 HPV 부재(도 3D))와 다르다는 점이 특이하다. 이것은 이전에 유의적이었나, 현재는 사라진 HPV 감염의 소멸 흔적을 나타낼 가능성이 있는 종래 평가되지 못한 저역가의 병원성 HPV의 유의성을 강하게 입증하는 것이다. 이것은 대부분의 HPV 감염이 약 6개월 내지 2년 후에 소멸 된다는 관찰과 일치한다. 종합해보면, 이것은 환부를 적출하기 위해 설계한 다수의 수술 절차를 방지할 수 있고, 장기적 수행이 가능하다면 자기제어적일 수 있는 장기적인 역가 수득의 중요성을 나타낸다.
HC2 양성 형성이상에 대한 질량분광분석, 역방향 라인 블롯팅 및 축퇴성 DNA 서열분석. 병리학적으로 비정상적인 경부 형성이상 시료에서, 질량분광분석은 역방향 라인 블롯팅, 축퇴성 DNA 서열분석 또는 HC2보다 더욱 민감한다. 식별되는 병원성 HPV 타입이 적어도 약 50카피가 존재하는 경우에는 질량분광분석과 역방향 라인 블롯 방법 간에 일치성이 높았고, 식별되는 병원성 HPV 타입이 적어도 약 500카피가 존재하는 경우에는 질량분광분석과 축퇴성 NDA 서열분석 방법 사이에 일치성이 높았으며, 식별되는 병원성 HPV 타입이 적어도 약 5000카피가 존재하는 경우에는 HC2와 질량분광분석 사이에 일치성이 높았다. 3 기술 모두간의 양호한 일치성은 약 5000 카피보다 많은 질량분광분석에 의해 분석되는 HC2 양성 시료 125개중 98개의 상기 증례들에서 관찰되었다(표 7). 병원성 HPV 역가가 <약 5000 카피인 HC2(+) 증례 125개 중 나머지 27개에서는 역방향 라인 블롯팅 및/또는 축퇴성 DNA 서열분석 방법에서 본 발명의 질량분광분석에 의해 검출되는 13가지 고병원성 타입외에 다른 HPV 타입이 검출되었다(표 8). 이것은 HC2에 의해 동정된 형성이상의 유의적인 비율이 거짓양성일 가능성이 있기 때문이다[2,36].
DNA 서열분석에 의해 HPV가 검출되지 않는 시료는 단일 HPV 타입으로부터 DNA 서열을 수득하는 것을 방해하는 다수 HPV 타입을 유사 농도로 함유하는 시료, 축퇴성 프라이머로 증폭시키기에는 프라이머와 너무 많이 다른 HPV 타입을함유하는 시료 및/또는 증폭을 일으키기에 충분한 HPV를 함유하지 않는 시료를 포함할 수 있다.
경부 종양이 검출가능한 HPV 16 DNA를 보유한 18가지 증례 중에서 17 증례에서, 본 발명자들은 혈청 및/또는 혈액이 검출성 HPV 16 DNA를 보유하고 있음을 발견했다. HPV 16 DNA 및 HPV 18 DNA에 대해 음성인 종양을 보유한 3가지 증례에서는 모두 혈청 및/또는 혈액에서 HPV 16 DNA 및 HPV 18 DNA가 검출되지 않았다. 두경부암에서 관찰되듯이, 혈액 및 혈청 결과는 많은 경부암 증례에서와 달랐다. 종양 양성인 18개의 시료 중에서, 8개는 혈청과 혈액에서 모두 양성이고, 5개는 혈액이 아닌 혈청에서만 양성이었고, 4개는 혈청이 아닌 혈액에서만 양성이며, 1개는 혈청과 혈액에서 모두 음성이었다.
다음으로, 경부 형성이상을 보유한 여성 유래의 혈청 및 혈액 시료를 본 발명에 따라 조사했다. 이들 여성에서는 혈청 또는 혈액에서 축퇴성 프로브를 이용한 TaqMan 분석으로 검출할 수 있는 HPV DNA는 전혀 없었다. 이에 반해, 일부 양태를 구성하는 질량분광분석에서는 경부암(표 9) 또는 악성 형성이상(표 10)을 보유한 개체의 아군에서 수득한 혈청 및/또는 혈액에서 소량의 HPV 16 DNA를 검출했다. 악성 경부 형성이상을 보유한 5가지 증례 중 4가지에서는 HPV 16 DNA가 양성이었다. 또한, HPV 16 DNA는 중요성이 불확실한 비정상적 편평세포를 보유한 1 개체 및 음문 상피내 종양 1기 및 양성 경부 형성이상의 진단을 받은 다른 검체 유래의 혈청에서도 검출되었다. HPV 16 DNA는 활성 환부를 보유하지 않은 개체의 혈청 또는 혈액에서는 관찰되지 않았다. 또한, 혈청 또는 혈액에서의 HPV 16 DNA에 대한 질량분 광분석 검사는 이전에 동일계내 악성 형성이상 또는 암을 성공적으로 제거한 후에는 항상 음성이었다(증례 4,5,6,15,16,17,22,24,27,44). 이러한 증례들에서 형성이상을 제거한 후의 시료는 입수할 수 없었다. 혈청이나 혈액에 HPV DNA가 없는 악성 경부 형성이상을 보유한 한 검체(증례 1)는 이 때 우리가 사용한 HPV 16 또는 HPV 18 프로브외에 다른 HPV 타입을 보유했을 수도 있다.
이어서, 이러한 발견을 확대하여 경부 형성이상을 보유한 개체의 혈액 및/또는 혈청에서 16 또는 18외의 다른 HPV 타입을 식별할 수 있는지를 확인했다. 표 11에 제시한 바와 같이, 경부 형성이상에 HPV가 존재할 때, 상당한 비율의 혈액 및/또는 혈청 시료에서도 HPV 양성이었다. 이것은, HPV 타입이 16 또는 18외의 다른 타입인 몇몇 증례도 있었다. 이것은 개별적 분자의 수준까지 검출할 수 있는 고도로 민감한 기술로 혈액 및/또는 혈청을 모니터링하는 것의 가능한 임상적 유용성을 분명히 나타낸다.
이상, 본 발명의 일부 양태를 포함하는 민감하고, 특이적이며 정량적인 질량 분광분석 검정의 유용성을 예시했으며, 이는 가능한 양태의 범위를 제한하는 것은 아니다. 본 연구는 HPV가 존재하지 않거나 병원성이 적거나 병원성이 아닌 다른 타입의 HPV가 존재할 수 있는 많은 종양 및 형성이상에서 소량의 병원성 HPV가 존재하고, 형성이상에서보다 종양에서 HPV 존재량이 더 적다는 중요한 관점을 증명한다. 특히, 거의 모든 종양에서 그 함량이 지속적으로 0까지 감소하는 병원성 HPV의 발견은 제한된 세트의 병원성 HPV 타입이 존재하며 다른 HPV 타입이 종양을 유발할 위험도는 매우 낮다는 가설을 지지한다. 마지막으로, 이러한 민감한 기술의 적용을 통해서만, 혈액 및/또는 혈청 내의 극히 낮은 HPV 역가가 평가될 수 있다. 이러한 발견은 형성이상 또는 암을 보유한 사람에서만 나타나고, 형성이상 제거 후에는 사라지는 바, 이러한 환부를 검출하고(하거나) 이 환부를 제거하는 기술의 치료적 유효성을 모니터하는 우수한 방법을 보여줄 것이다.
본 발명의 일부 양태에 따르면(이에 국한됨이 없이), 이러한 HPV 수준에서 통찰력을 얻기 위한 기술적 개발은 풍부하지 않은 HPV서열을 고도로 민감하고 특이적인 방식으로 검출하는 능력을 포함한다. 따라서, 본 발명은 처음으로 개별적 HPV 카피를 진단하는데 필요한 민감도 및 특이성을 달성하는 능력 및 유용성을 포함한다. 즉, 본 발명은 이전에는 평가될 수 없었던 사건, 예컨대 경부 형성이상이 혈액 및/또는 혈청에서 검출할 수 있는 HPV와 연관이 있는 반면 정상 상태가 혈액 및/또는 혈청에서 검출할 수 있는 HPV와 연관이 없다는 발견 등의 검출을 가능하게 하고, 이러한 민감도 및 특이성 수준을 달성하는 시스템, 조성물 및/또는 방법을 포함한다. 이로써, 혈청 HPV가 검출되어야 하는 경우에, 거짓 양성[4]과 거짓 음성(본 발명자들의 미공개 결과마다)을 빈번하게 산출하는 부적당한 TaqMan 기술을 사용할 필요가 없다.
본 발명의 또 다른 장점은 민감하고 특이적일 뿐만 아니라 정량적이어서, 종양 부하량을 측정할 수 있고, 더 크거나 더욱 공격적인 종양은 경부 시료(총 DNA에 대해 표준화 후)[7], 혈청 및/또는 혈액에서 높은 수준으로 반영되는 높은 HPV 부하량과 연관지을 수 있다는 점이다. 또한, 혈청 및/또는 혈액에 영향이 미쳤는지를 측정하여 임상적 유익을 얻을 수 있다. 예를 들어, 혈행 전파를 겪은 종양에서는 혈액 내에 증가된 존재와 연관이 있을 수 있고, 증가된 용해를 겪은 종양에서는 혈청내 증가된 존재와 연관이 있을 수 있다. 종합해보면, 질량분광분석 기술은 완전한 특이성을 제공하는 동시에 더욱 민감하다. 이러한 유용성은 이러한 종양의 발생 위험이 있는 집단의 구성원들 및 종래 종양 진단을 받고 현재 관찰 하에 있는 개체에도 확대될 수 있을 것이다.
본 발명의 바람직한 양태는 환자 유래의 생물학적 시료, 예컨대, 비제한적으로 혈액, 혈청 및 소변 시료와 이들 중 2 이상의 조합물을 수득하고; 이들 시료 중의 HPV 게놈의 카피 수를, 현행 승인된 검사법, 예컨대 다이진 검사법 이하의 검출 민감도를 보유하는 본 명세서에 기술된 바와 같은 기술(이에 국한되지 않는다)에 따라 검출하고; 공지된 부피 또는 다른 농도 측도의 시료에 존재하는 HPV 게놈의 카피수를 계산하되, 시료 내 단일 카피 수준 정도의 낮은 HPV의 존재가 본 발명에 의해 교시된 바와 같은 환자에서 암을 나타내는 시스템, 방법 및 조성물을 포함한다. 일 예로서, 이에 국한된이 없이, 다이진 검사는 혈청 시료당 5000개 카피 이하를 검출하지 못하지만, 본 발명은 단일 카피 수준까지의 검출능을 나타낸다.
본 발명은 종래에는 가능하지 않았던 본 명세서에 기술된 관찰들을 가능하게 한 매우 민감한 수준의 검출을 수행하는 시스템, 조성물 및/또는 방법을 포함한다. 따라서, 본 발명은 체액 중의 소량의 HPV가 암 또는 형성이상과 연관이 있고, 이후 종양 또는 형성이상의 절제에 의해 제거될 수 있다는 발견을 포함한다. 사실상, 경부 형성이상이 혈청과 혈액에 검출할 수 있는 이상을 초래하지만, 정상 대조군의 혈청과 혈액은 음성이라는 발견은 전적으로 신규한 것이다. 본 발명에 따르면, 두 경부암 및 경부암 모두에 혈액이 유용하다는 결정은, 종래 발명들은 민감도가 거짓 음성을 방지하기에 충분하지 않고(않거나) 특이성이 거짓 양성을 방지하기에 충분히 크지 않은 기술로 혈액의 선별을 이용해 왔기 때문에, 역시 신규하다. 본 발명의 더욱 민감하고 특이적인 질량분광분석 시스템을 이용하면, 제한적인 측정가능한 혈청 HPV 수준과 연관이 있는 주혈흡충증 관련 방광암, 경부암 및 두경부암의 높은 비율에서 HPV를 검출할 수 있다.
본 발명은 소변 침전물, 혈청 및/또는 혈액의 매우 민감하고 특이적 분석이 이제 단일 카피 수준(구소수에 대한 푸아송 분포 유래의 불확실성에 의해 부과되는 불가피한 한계에도 불구하고; 이것은 다중 분석을 수행하여 회피할 수 있다)까지 검출하는 충분히 민감하고 특이적인 분석 방법을 이용할 때 암이나 형성이상에서 HPV가 양성인 것을 보여줄 수 있다는 발견을 포함한다. 더욱이, 혈청 및/또는 혈액 중의HPV는 경부 형성이상의 증례에서 검출될 수 있고; 이후 형성이상이 절제되면 HPV는 사라진다. 이를 종합해보면, 본 발명은 형성이상이나 암의 치료를 받고 있는 검체 또는 위험이 있는 검체에서 HPV 관련암이 존재하는지의 여부를 측정할 수 있게 해준다.
모든 참고문헌은 본 명세서에서 충분히 설명될지라도 전문을 참고인용했다.
이상의 바람직하고 대안적인 양태를 참고로 하여 본 발명을 구체적으로 제시하고 설명하였지만, 당업자는 본 명세서에 기술된 본 발명의 양태들에 대한 다양한 대안이 다음 청구의 범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범주 및 취지 안에서 본 발명을 수행하는데 이용될 수 있음을 잘 알고 있을 것이다. 또한, 본 발명의 명세 서는 본 명세서에 기술된 모든 신규하고 자명하지 않은 구성요소들의 조합을 포함하고, 청구의 범위는 본 출원 또는 이후 출원에서 이들 구성요소들의 임의의 신규하고 자명하지 않은 조합에 제공될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 전술한 양태들은 예시적이며, 하나의 특징이나 요소가 본 출원 또는 이후 출원에서 청구될 수 있는 가능한 모든 조합에 필수적인 것은 아니다. 청구의 범위에서 해당물의 "하나" 또는 "1차" 요소로 표현하는 경우, 이러한 청구의 범위는 이러한 요소들 하나 이상을 포함하는 것으로 이해해야 하며, 이러한 요소들 2 이상이 필요하거나 이를 배제하는 것은 아니다. 다음 청구의 범위는 본 발명의 범위를 한정하고, 이들 청구의 범위에 제시된 시스템, 방법 및 조성물 및 이들의 등가물이 본 발명에 포함되는 것으로 간주되어야 한다.
Figure 112007057908673-PCT00001
Figure 112007057908673-PCT00002
Figure 112007057908673-PCT00003
Figure 112007057908673-PCT00004
Figure 112007057908673-PCT00005
Figure 112007057908673-PCT00006
Figure 112007057908673-PCT00007
Figure 112007057908673-PCT00008
Figure 112007057908673-PCT00009
Figure 112007057908673-PCT00010
Figure 112007057908673-PCT00011
Figure 112007057908673-PCT00012
Figure 112007057908673-PCT00014
Figure 112007057908673-PCT00015
Figure 112007057908673-PCT00016
Figure 112007057908673-PCT00017
Figure 112007057908673-PCT00018
Figure 112007057908673-PCT00019
Figure 112007057908673-PCT00020
Figure 112007057908673-PCT00021
Figure 112007057908673-PCT00022
Figure 112007057908673-PCT00023
Figure 112007057908673-PCT00024
Figure 112007057908673-PCT00025
참고문헌
1. OBISO, R. AND A. LORINCZ, DIGENE CORPORATION. PHARMACOGENOMICS, 2004. 5(1): P. 129-32.
2. POLJAK, M., ET AL., HYBRID CAPTURE Il HPV TEST DETECTS ATLEAST 15 HUMAN PAPILLOMAVIRUS GENOTYPES NOT INCLUDED IN ITS CURRENT HIGH- RISK PROBE COCKTAIL J CLIN VIROL, 2002. 25 SUPPL 3: P. S89-97.
3. CAPONE, R.B., ET AL., DETECTION AND QUANTITATION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS (HPV) DNA IN THE SERA OF PATIENTS WITH HPV- ASSOCIATED HEAD AND NECK SQUAMOUS CELL CARCINOMA. CLIN CANCER RES, 2000. 6(11): P. 4171-5.
4. YANG, H.J., ET AL., QUANTIFICATION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS DNA IN THE PLASMA OF PATIENTS WITH CERVICAL CANCER. INT J GYNECOL CANCER, 2004. 14(5): P. 903-10.
5. MUNOZ, N., ET AL., EPIDEMIOLOGIC CLASSIFICATION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPES ASSOCIATED WITH CERVICAL CANCER. N ENGL J MED, 2003. 348(6): P. 518-27.
6. CHIN-HONG, P.V., ET AL., AGE-RELATED PREVALENCE OFANAL CANCER PRECURSORS IN HOMOSEXUAL MEN: THE EXPLORE STUDY. J NATL CANCER INST, 2005. 97(12): P. 896-905.
7. MOBERG, M., I. GUSTAVSSON, AND U. GYLLENSTEN, TYPE-SPECIFIC ASSOCIATIONS OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS LOAD WITH RISK OF DEVELOPING CERVICAL CARCINOMA IN SITU. INT J CANCER, 2004. 112(5): P. 854-9.
8. DING, C. AND CR. CANTOR, A HIGH-THROUGHPUT GENE EXPRESSION ANALYSIS TECHNIQUE USING COMPETITIVE PCR AND MATRIX-ASSISTED LASER DESORPTION IONIZATION TIME-OF-FLIGHT MS. PROC NATL ACAD SCI U S A, 2003. 100(6): P. 3059-64.
9. DING, C. AND CR. CANTOR, QUANTITATIVE ANALYSIS OF NUCLEIC ACIDS-THE LASTFEW YEARS OF PROGRESS. J BIOCHEM MOL BIOL, 2004. 37(1): P. 1-10.
10. TANG, K., ET AL., MINING DISEASE SUSCEPTIBILITY GENES THROUGH SNP ANALYSES AND EXPRESSION PROFILING USING MALDI-TOF MASS SPECTROMETRY. J PROTEOME RES, 2004. 3(2): P. 218-27.
11. KHALED, H.M., ET AL., HUMAN PAPILLOMA VIRUS INFECTION AND OVEREXPRESSION OF P53 PROTEIN IN BILHARZIAL BLADDER CANCER. TUMORI, 2001. 87(4): P. 256-61.
12. GRAVITT, P.E., ET AL., GENOTYPING OF 27 HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPES BY USING L1 CONSENSUS PCR PRODUCTS BYA SINGLE-HYBRIDIZATION, REVERSE LINE BLOT DETECTION METHOD. J CLIN MICROBIOL, 1998. 36(10): P. 3020-7.
13. HEID CA, S.J., LIVAK KJ, AND WILLIAMS PM., REAL TIME QUANTITATIVE PCR, IN GENOME RESEARCH. 1996. P. 986-994.
14. THOMPSON, G.H. AND A. ROMAN, EXPRESSION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 6 E1, E2, L1 AND L2 OPEN READING FRAMES IN ESCHERICHIA COLI. GENE, 1987. 56(2-3): P. 289-95.
15. DE RODA HUSMAN, A.M., ET AL., THE USE OF GENERAL PRIMERS GP5 AND GP6 ELONGATED AT THEIR 3' ENDS WITH ADJACENT HIGHLY CONSERVED SEQUENCES IMPROVES HUMAN PAPILLOMAVIRUS DETECTION BYPCR. J GEN VIROL, 1995. 76 (PT 4): P. 1057-62.
16. NELSON, J.H., ET AL., A NOVEL AND RAPID PCR-BASED METHOD FOR GENOTYPING HUMAN PAPILLOMAVIRUSES IN CLINICAL SAMPLES. J CLIN MICROBIOL, 2000. 38(2): P. 688-95.
17. STROUN, M., ET AL., ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF DNA FROM THE PLASMA OF CANCER PATIENTS. EUR J CANCER CLIN ONCOL, 1987. 23(6): P. 707- 12.
18. YANG, H., ET AL., SENSITIVE DETECTION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS IN CERVICAL, HEAD/NECK, AND SCHISTOSOMIASIS-ASSOCIATED BLADDER MALIGNANCIES. PROC NATL ACAD SCI U S A, 2005. 102(21): P. 7683-8.
19. ELVIDGE, G.P., ET AL., DEVELOPMENT AND EVALUATION OF REAL COMPETITIVE PCR FOR HIGH-THROUGHPUT QUANTITATIVE APPLICATIONS. ANAL BIOCHEM, 2005. 339(2): P. 231-41.
20. SCHEFFNER1 M., ET AL., THE E6 ONCOPROTEIN ENCODED BY HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPES 16 AND 18 PROMOTES THE DEGRADATION OF P53. CELL, 1990. 63(6): P. 1129-36.
21. HA, P.K., ET AL., REAL-TIME QUANTITATIVE PCR DEMONSTRATES LOW PREVALENCE OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 16 IN PREMALI G NANT AND MALIGNANTLESIONS OF THE ORAL CAVITY. CLIN CANCER RES, 2002. 8(5): P. 1203-9.
22. CHANG, J.Y., M.C. LIN, AND CP. CHIANG, HIGH-RISK HUMAN PAPILLOMAVIRUSES MAY HAVEAN IMPORTANT ROLE IN NON-ORAL HABITS- ASSOCIATED ORAL SQUAMOUS CELL CARCINOMAS IN TAIWAN. AM J CLIN PATHOL, 2003. 120(6): P. 909-16.
23. NEVILLE, B.W. AND T.A. DAY, ORAL CANCER AND PRECANCEROUS LESIONS. CA CANCER J CLIN, 2002. 52(4): P. 195-215.
24. HERRERO, R., ET AL., HUMAN PAPILLOMAVIRUS AND ORAL CANCER: THE INTERNATIONAL AGENCYFOR RESEARCH ON CANCER MULTICENTER STUDY. J NATL CANCER INST, 2003. 95(23): P. 1772-83.
25. MCKAIG, R.G., R.S. BARIC, AND AF. OLSHAN, HUMAN PAPILLOMAVIRUS AND HEAD AND NECK CANCER: EPIDEMIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY. HEAD NECK, 1998. 20(3): P. 250-65.
26. SCHWARTZ, S.R., ET AL., HUMAN PAPILLOMAVIRUS INFECTION AND SURVIVAL IN ORAL SQUAMOUS CELL CANCER: A POPULATION-BASED STUDY. OTOLARYNGOL HEAD NECK SURG, 2001. 125(1): P. 1-9.
27. KOCH, W.M., ET AL., HEAD AND NECK CANCER IN NONSMOKERS: A DISTINCT CLINICAL AND MOLECULAR ENTITY. LARYNGOSCOPE, 1999. 109(10): P. 1544-51.
28. GILLISON, M.L., ET AL., EVIDENCE FOR A CAUSAL ASSOCIATION BETWEEN HUMAN PAPILLOMAVIRUS AND A SUBSET OF HEAD AND NECK CANCERS. J NATL CANCER INST, 2000. 92(9): P. 709-20.
29. SCHWARTZ, S.M., ET AL., ORAL CANCER RISK IN RELATION TO SEXUAL HISTORYAND EVIDENCE OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS INFECTION. J NATL CANCER INST, 1998. 90(21 ): P. 1626-36.
30. SEYBOLT1 G.F. AND G.N. PAPANICOLAU, [EXFOLIATIVE CYTOLOGY: ITS VALUE IN THE DIAGNOSIS OF CANCER.]. ARCH MED CUBA, 1953. 4(6): P. 579-86.
31. ROCK, C.L., ET AL., PREVENTION OF CERVIX CANCER. CRIT REV ONCOL HEMATOL, 2000. 33(3): P. 169-85.
32. BOSCH , F.X. , ET AL. , PREVALENCE OF HUMAN PAPILLOMA VIRUS IN CERVICAL CANCER: A WORLDWIDE PERSPECTIVE. INTERNATIONAL BIOLOGICAL STUDY ON CERVICAL CANCER (IBSCC) STUDY GROUP. J NATL CANCER INST, 1995. 87(11 ): P. 796-802.
33. JACOBS, M.V., ET AL., GROUP-SPECIFIC DIFFERENTIATION BETWEEN HIGH- AND LOW-RISK HUMAN PAPILLOMAVIRUS GENOTYPES BY GENERAL PRIMER- MEDIATED PCR AND TWO COCKTAILS OF OLIGONUCLEOTIDE PROBES. J CLIN MICROBIOL, 1995. 33(4): P. 901-5.
34. WALBOOMERS, J. M., ET AL., HUMAN PAPILLOMAVIRUS IS A NECESSARY CAUSE OF INVASIVE CERVICAL CANCER WORLDWIDE. J PATHOL, 1999. 189(1): P. 12-9.
35. VAN HAM, M.A., ET AL., COMPARISON OF TWO COMMERCIAL ASSAYS FOR DETECTION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS (HPV) IN CERVICAL SCRAPE SPECIMENS: VALIDATION OF THE ROCHE AMPLICOR HPV TESTAS A MEANS TO SCREEN FOR HPV GENOTYPES ASSOCIATED WITHA HIGHER RISK OF CERVICAL DISORDERS. J CLIN MICROBIOL, 2005. 43(6): P. 2662-7.
36. CASTLE, P.E., ET AL., RESTRICTED CROSS-REACTIVITY OF HYBRID CAPTURE 2 WITH NONONCOGENIC HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPES. CANCER EPIDEMIOL BIOMARKERS PREV, 2002. 11 (11 ): P. 1394-9.
37. NAM, J. M., S.I. STOEVA, AND CA. MIRKIN, BIO-BAR-CODE-BASED DNA DETECTION WITH PCR-LIKE SENSITIVITY. J AM CHEM SOC, 2004. 126(19): P. 5932-3.
38. NAM, J. M., CS. THAXTON, AND CA. MIRKIN, NANOPARTICLE-BASED BIO-BAR CODES FOR THE ULTRASENSITIVE DETECTION OF PROTEINS. SCIENCE, 2003. 301(5641): P. 1884-6.

Claims (50)

  1. 포유동물의 생물학적 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
    추출된 DNA의 적어도 일부를, 공지된 HPV 타입의 DNA 서열의 폴리뉴클레오타이드와 거의 상동성인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 상기 HPV DNA 서열에 존재하지 않는 뉴클레오타이드 치환을 보유하는 적어도 하나의 경쟁인자 서열의 존재 하에 PCR로 1차 증폭을 수행하는 단계;
    상기 공지된 HPV 타입을 위한 적어도 하나의 확장 프라이머(extension primer)와 적어도 2개의 다른 디데옥시뉴클레오타이드의 존재 하에 PCR로 2차 증폭을 수행하는 단계; 및
    상기 공지된 HPV 타입을 위한 임의의 증폭된 확장 프라이머의 수준을 질량분광분석으로 측정하는 단계를 포함하여, 포유동물의 생물학적 시료에 존재하는 HPV DNA를 검출, 동정 및/또는 정량분석하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 포유동물의 생물학적 시료가 체액 또는 조직 시료인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 측정하는 단계가 약 200아토몰 이하 농도인 임의의 증폭된 확장 프라이머를 검출하는 것을 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 1차 증폭이, 각각 다른 공지 HPV타입의 DNA 서열의 폴리뉴 클레오타이드에 거의 상동성인 폴리뉴클레오타이드를 포함하며 각각의 HPV DNA 서열에 존재하지 않는 뉴클레오타이드 치환을 보유하는 복수의 경쟁인자 서열 타입의 존재를 포함하고, 2차 증폭이 각각 다른 공지 HPV 타입을 위한 복수의 외부 프라이머 타입의 존재를 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 복수의 공지 HPV 타입이 HPV 타입 16, 18, 23, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 및 82 중 2개 이상을 포함하는, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 복수의 공지 HPV 타입이 적어도 HPV 타입 16, 18, 23, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 및 82를 포함하는, 방법.
  7. 제4항에 있어서, 추가로
    추출된 DNA의 적어도 일부를, 나이세리아 고노로에(Neisseria gonorrhoea) 또는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)의 DNA 서열의 폴리뉴클레오타이드와 거의 상동성인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 상기 나이세리아 고노로에 또는 클라미디아 트라코마티스 DNA 서열에 존재하지 않는 뉴클레오타이드 치환을 보유하는 적어도 하나의 경쟁인자 서열의 존재 하에 PCR로 1차 증폭을 수행하는 단계;
    상기 나이세리아 고노로에 또는 클라미디아 트라코마티스를 위한 적어도 하나의 확장 프라이머와 적어도 2개의 다른 디데옥시뉴클레오타이드의 존재 하에 PCR로 2차 증폭을 수행하는 단계; 및
    상기 나이세리아 고노로에 또는 클라미디아 트라코마티스를 위한 임의의 증폭된 확장 프라이머의 수준을 질량분광분석으로 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 1차 증폭이, 유전자 erbB-2의 DNA 서열의 폴리뉴클레오타이드에 거의 상동성인 폴리뉴클레오타이드를 포함하며 상기 유전자 erbB-2에 존재하지 않는 뉴클레오타이드 치환을 보유하는 적어도 하나의 경쟁인자 서열의 존재를 포함하는, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 측정하는 단계 후에, 포유동물의 경부암, 경부 형성이상, 경부 상피내 종양, 항문암, 항문 상피내 종양, 두경부암, 주혈흡충증 관련 방광암, 또는 유두종을 진단, 모니터 또는 평가하는 추가 단계를 포함하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 경쟁인자 서열이 SEQ ID No. 67, SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 69, SEQ ID No. 70, SEQ ID No. 71, SEQ ID No. 72, SEQ ID No. 73, SEQ ID No. 74, SEQ ID No. 75, SEQ ID No. 76, SEQ ID No. 77, SEQ ID No. 78, SEQ ID No. 79, SEQ ID No. 80, SEQ ID No. 81 , SEQ ID No. 82, SEQ ID No. 83, SEQ ID No. 84 및 SEQ ID No. 85로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 추가로 SEQ ID No. 86, 87 및 88로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 경쟁인자 서열을 포함하는, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 1차 증폭이 SEQ ID NO. 1과 SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 2와 SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 3과 SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 4와 SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 5와 SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 6과 SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 7과 SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 8과 SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 9와 SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 10과 SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 11과 SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 12와 SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 13과 SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 14와 SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 15와 SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 16과 SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO. 17과 SEQ ID NO. 39, SEQ ID NO. 18과 SEQ ID NO. 40, 및 SEQ ID NO. 19와 SEQ ID NO. 41로 이루어진 공지 HPV 타입을 위한 적어도 하나의 순방향 및 역방향 프라이머 서열의 정합 세트를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 1차 증폭이 SEQ ID No. 20과 SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 21과 SEQ ID No. 43, 및 SEQ ID No. 22와 SEQ ID No. 44로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 순방향 및 역방향 프라이머 서열의 정합 세트를 포함하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 확장 프라이머가 SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56, SEQ ID NO. 57, SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62, 및 SEQ ID NO. 63으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 2차 증폭이 추가로 SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65, 및 SEQ ID NO. 66으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 확장 프라이머를 포함하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 1차 증폭이 상기 공지된 HPV 타입에 관한 적어도 하나의 순방향 및 역방향 프라이머 서열의 정합 세트를 포함하고, 이러한 각 서열이 적어도 하나의 이노신 염기를 포함하는 것인, 방법.
  17. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 확장 프라이머가 적어도 하나의 이노신 염기를 포함하는, 방법.
  18. 포유동물 체액의 무세포성 분획으로부터 DNA를 추출하는 단계;
    추출된 DNA의 적어도 일부를, 공지된 HPV 타입의 DNA 서열의 폴리뉴클레오타 이드와 거의 상동성인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 상기 HPV DNA 서열에 존재하지 않는 뉴클레오타이드 치환을 보유하는 적어도 하나의 경쟁인자 서열의 존재 하에 PCR로 1차 증폭을 수행하는 단계;
    상기 공지된 HPV 타입을 위한 적어도 하나의 확장 프라이머(extension primer)와 적어도 2개의 다른 디데옥시뉴클레오타이드의 존재 하에 PCR로 2차 증폭을 수행하는 단계; 및
    상기 공지된 HPV 타입을 위한 임의의 증폭된 확장 프라이머의 수준을 질량분광분석으로 측정하는 단계를 포함하여, 포유동물 체액의 무세포성 분획에 존재하는 HPV DNA를 검출, 동정 및/또는 정량분석하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 체액이 혈액 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액, 땀, 침, 가래 또는 눈물인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 측정하는 단계가 약 200아토몰 이하 농도인 임의의 증폭된 확장 프라이머를 검출하는 것을 포함하는, 방법.
  21. 제18항에 있어서, 1차 증폭이, 각각 다른 공지 HPV타입의 DNA 서열의 폴리뉴클레오타이드에 거의 상동성인 폴리뉴클레오타이드를 포함하며 각각의 HPV DNA 서열에 존재하지 않는 뉴클레오타이드 치환을 보유하는 복수의 경쟁인자 서열 타입의 존재를 포함하고, 2차 증폭이 각각 다른 공지 HPV 타입을 위한 복수의 외부 프라이 머 타입의 존재를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 복수의 공지 HPV 타입이 HPV 타입 16, 18, 23, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 및 82 중 2개 이상을 포함하는, 방법.
  23. 제21항에 있어서, 복수의 공지 HPV 타입이 적어도 HPV 타입 16, 18, 23, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 및 82를 포함하는, 방법.
  24. 제21항에 있어서, 추가로
    나이세리아 고노로에(Neisseria gonorrhoea) 또는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)의 DNA 서열의 폴리뉴클레오타이드와 거의 상동성인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 상기 나이세리아 고노로에 또는 클라미디아 트라코마티스 DNA 서열에 존재하지 않는 뉴클레오타이드 치환을 보유하는 적어도 하나의 경쟁인자 서열의 존재 하에 PCR로 1차 증폭을 수행하는 단계;
    상기 나이세리아 고노로에 또는 클라미디아 트라코마티스를 위한 적어도 하나의 확장 프라이머와 적어도 2개의 다른 디데옥시뉴클레오타이드의 존재 하에 PCR로 2차 증폭을 수행하는 단계; 및
    상기 나이세리아 고노로에 또는 클라미디아 트라코마티스를 위한 임의의 증 폭된 확장 프라이머의 수준을 질량분광분석으로 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  25. 제18항에 있어서, 1차 증폭이, 유전자 erbB-2의 DNA 서열의 폴리뉴클레오타이드에 거의 상동성인 폴리뉴클레오타이드를 포함하며 상기 유전자 erbB-2에 존재하지 않는 뉴클레오타이드 치환을 보유하는 적어도 하나의 경쟁인자 서열의 존재를 포함하는, 방법.
  26. 제18항에 있어서, 측정하는 단계 후에, 포유동물의 경부암, 경부 형성이상, 경부 상피내 종양, 항문암, 항문 상피내 종양, 두경부암, 주혈흡충증 관련 방광암, 또는 유두종을 진단, 모니터 또는 평가하는 추가 단계를 포함하는, 방법.
  27. 제18항에 있어서, 적어도 하나의 경쟁인자 서열이 SEQ ID No. 67, SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 69, SEQ ID No. 70, SEQ ID No. 71, SEQ ID No. 72, SEQ ID No. 73, SEQ ID No. 74, SEQ ID No. 75, SEQ ID No. 76, SEQ ID No. 77, SEQ ID No. 78, SEQ ID No. 79, SEQ ID No. 80, SEQ ID No. 81 , SEQ ID No. 82, SEQ ID No. 83, SEQ ID No. 84 및 SEQ ID No. 85로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 추가로 SEQ ID No. 86, 87 및 88로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 경쟁인자 서열을 포함하는, 방법.
  29. 제18항에 있어서, 1차 증폭이 SEQ ID NO. 1과 SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 2와 SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 3과 SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 4와 SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 5와 SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 6과 SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 7과 SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 8과 SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 9와 SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 10과 SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 11과 SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 12와 SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 13과 SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 14와 SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 15와 SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 16과 SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO. 17과 SEQ ID NO. 39, SEQ ID NO. 18과 SEQ ID NO. 40, 및 SEQ ID NO. 19와 SEQ ID NO. 41로 이루어진 공지 HPV 타입에 관한 적어도 하나의 순방향 및 역방향 프라이머 서열의 정합 세트를 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 1차 증폭이 SEQ ID No. 20과 SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 21과 SEQ ID No. 43, 및 SEQ ID No. 22와 SEQ ID No. 44로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 순방향 및 역방향 프라이머 서열의 정합 세트를 포함하는 방법.
  31. 제18항에 있어서, 적어도 하나의 확장 프라이머가 SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56, SEQ ID NO. 57, SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62, 및 SEQ ID NO. 63으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 2차 증폭이 추가로 SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65, 및 SEQ ID NO. 66으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 확장 프라이머를 포함하는 방법.
  33. 제18항에 있어서, 1차 증폭이 상기 공지된 HPV 타입에 관한 적어도 하나의 순방향 및 역방향 프라이머 서열의 정합 세트를 포함하고, 이러한 각 서열이 적어도 하나의 이노신 염기를 포함하는 것인, 방법.
  34. 제18항에 있어서, 적어도 하나의 확장 프라이머가 적어도 하나의 이노신 염기를 포함하는, 방법.
  35. 포유동물의 생물학적 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
    추출된 DNA의 적어도 일부를, 공지된 HPV 타입의 DNA 서열의 폴리뉴클레오타이드와 거의 상동성인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 상기 HPV DNA 서열에 존재하지 않는 뉴클레오타이드 치환을 보유하는 적어도 하나의 경쟁인자 서열의 존재 하에 PCR로 1차 증폭을 수행하는 단계;
    상기 공지된 HPV 타입을 위한 적어도 하나의 확장 프라이머(extension primer)와 적어도 2개의 다른 디데옥시뉴클레오타이드의 존재 하에 PCR로 2차 증폭을 수행하는 단계; 및
    상기 공지된 HPV 타입을 위한 임의의 증폭된 확장 프라이머의 수준을 질량분광분석으로 측정하는 단계를 포함하되, 상기 1차 증폭이 적어도 하나의 경쟁인자 서열과 거의 정합성인 공지 HPV 타입을 위한 적어도 하나의 순방향 및 역방향 프라이머 서열의 정합 세트를 포함하고, 적어도 하나의 확장 프라이머가 상기 같은 공지 HPV 타입에 관한 것인, 포유동물의 생물학적 시료에 존재하는 HPV DNA를 검출, 동정 및/또는 정량분석하는 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    적어도 하나의 경쟁인자 서열이 SEQ ID No. 67, SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 69, SEQ ID No. 70, SEQ ID No. 71, SEQ ID No. 72, SEQ ID No. 73, SEQ ID No. 74, SEQ ID No. 75, SEQ ID No. 76, SEQ ID No. 77, SEQ ID No. 78, SEQ ID No. 79, SEQ ID No. 80, SEQ ID No. 81, SEQ ID No. 82, SEQ ID No. 83, SEQ ID No. 84, 및 SEQ ID No. 85로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    적어도 하나의 순방향 및 역방향 프라이머 서열의 정합 세트가 SEQ ID NO. 1과 SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 2와 SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 3과 SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 4와 SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 5와 SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 6과 SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 7과 SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 8과 SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 9와 SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 10과 SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 11과 SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 12와 SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 13과 SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 14와 SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 15와 SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 16과 SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO. 17과 SEQ ID NO. 39, SEQ ID NO. 18과 SEQ ID NO. 40, 및 SEQ ID NO. 19와 SEQ ID NO. 41로 이루어진 그룹 중에서 선택되며;
    적어도 하나의 확장 프라이머가 SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56, SEQ ID NO. 57, SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62 및 SEQ ID NO. 63으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
  37. 제35항에 있어서, 1차 증폭이 상기 공지된 HPV 타입에 관한 적어도 하나의 순방향 및 역방향 프라이머 서열의 정합 세트를 포함하고, 이러한 각 서열이 적어도 하나의 이노신 염기를 포함하는 것인, 방법.
  38. 제35항에 있어서, 적어도 하나의 확장 프라이머가 적어도 하나의 이노신 염기를 포함하는, 방법.
  39. 제35항에 있어서, 측정하는 단계가 약 200아토몰 이하 농도인 임의의 증폭된 확장 프라이머를 검출하는 것을 포함하는, 방법.
  40. 제35항에 있어서, 측정하는 단계 후에, 포유동물의 경부암, 경부 형성이상, 경부 상피내 종양, 항문암, 항문 상피내 종양, 두경부암, 주혈흡충증 관련 방광암, 또는 유두종을 진단, 모니터 또는 평가하는 추가 단계를 포함하는, 방법.
  41. 제35항에 있어서, 1차 증폭이, 각각 다른 공지 HPV타입의 DNA 서열의 폴리뉴클레오타이드에 거의 상동성인 폴리뉴클레오타이드를 포함하며 각각의 HPV DNA 서열에 존재하지 않는 뉴클레오타이드 치환을 보유하는 복수의 경쟁인자 서열 타입의 존재를 포함하고, 2차 증폭이 각각 다른 공지 HPV 타입을 위한 복수의 외부 프라이머 타입의 존재를 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 복수의 공지 HPV 타입이 HPV 타입 16, 18, 23, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 및 82 중 2개 이상을 포함하는, 방법.
  43. 제41항에 있어서, 복수의 공지 HPV 타입이 적어도 HPV 타입 16, 18, 23, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 및 82를 포함하는, 방법.
  44. 제41항에 있어서, 추가로
    추출된 DNA의 적어도 일부를, 나이세리아 고노로에(Neisseria gonorrhoea) 또는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)의 DNA 서열의 폴리뉴클레오타이드와 거의 상동성인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 상기 나이세리아 고노로에 또는 클라미디아 트라코마티스 DNA 서열에 존재하지 않는 뉴클레오타이드 치환을 보유하는 적어도 하나의 경쟁인자 서열의 존재 하에 PCR로 1차 증폭을 수행하는 단계;
    상기 나이세리아 고노로에 또는 클라미디아 트라코마티스를 위한 적어도 하나의 확장 프라이머와 적어도 2개의 다른 디데옥시뉴클레오타이드의 존재 하에 PCR로 2차 증폭을 수행하는 단계; 및
    상기 나이세리아 고노로에 또는 클라미디아 트라코마티스를 위한 임의의 증폭된 확장 프라이머의 수준을 질량분광분석으로 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  45. 제35항에 있어서, 1차 증폭이, 유전자 erbB-2의 DNA 서열의 폴리뉴클레오타이드에 거의 상동성인 폴리뉴클레오타이드를 포함하며 상기 유전자 erbB-2에 존재하지 않는 뉴클레오타이드 치환을 보유하는 적어도 하나의 경쟁인자 서열의 존재하에 추출된 DNA를 포함하는, 방법.
  46. 제35항에 있어서,
    1차 증폭이 SEQ ID No. 86, 87 및 88로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 경쟁인자 서열, 및 SEQ ID No. 20과 SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 21과 SEQ ID No. 43, 및 SEQ ID No. 22와 SEQ ID No. 44로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 순방향 및 역방향 프라이머 서열의 정합 세트를 포함하며;
    2차 증폭이 SEQ ID NO. 64, 65 및 66으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 확장 프라이머를 포함하는 방법.
  47. 생물학적 시료 중의 미생물 DNA를 검출, 동정 및/또는 정량분석하기 위한, SEQ ID No. 67, SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 69, SEQ ID No. 70, SEQ ID No. 71, SEQ ID No. 72, SEQ ID No. 73, SEQ ID No. 74, SEQ ID No. 75, SEQ ID No. 76, SEQ ID No. 77, SEQ ID No. 78, SEQ ID No. 79, SEQ ID No. 80, SEQ ID No. 81, SEQ ID No. 82, SEQ ID No. 83, SEQ ID No. 84, SEQ ID No. 85, SEQ ID No. 86, SEQ ID No. 87, 및 SEQ ID No. 88로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 경쟁인자 서열을 포함하는 합성 폴리뉴클레오타이드.
  48. 생물학적 시료 중의 미생물 DNA를 검출, 동정 및/또는 정량분석하기 위한 순방향 및 역방향 프라이머가 SEQ ID NO. 1과 SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 2와 SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 3과 SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 4와 SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 5와 SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 6과 SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 7과 SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 8과 SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 9와 SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 10과 SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 11과 SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 12와 SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 13과 SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 14와 SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 15와 SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 16과 SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO. 17과 SEQ ID NO. 39, SEQ ID NO. 18과 SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 19와 SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 20과 SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 21과 SEQ ID NO. 43 및 SEQ ID NO. 22와 SEQ ID NO. 44로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인 합성 폴리뉴클레오타이드의 쌍.
  49. 생물학적 시료 중의 미생물 DNA를 검출, 동정 및/또는 정량분석하기 위한 확장 프라이머가 SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56, SEQ ID NO. 57, SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65, 및 SEQ ID NO. 66으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 포함하는, 합성 폴리뉴클레오타이드.
  50. 제47항, 제48항 및 제49항 중 어느 한 항에 기재된 합성 폴리뉴클레오타이드 1종 이상과 용기를 포함하는 생물학적 시료 중의 미생물 DNA를 검출하기 위한 키트.
KR1020077018326A 2005-01-14 2006-01-16 생물학적 시료에서 사람 유두종 바이러스를 검출하기 위한시스템, 방법 및 조성물 KR20070105992A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US64437405P 2005-01-14 2005-01-14
US60/644,374 2005-01-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20070105992A true KR20070105992A (ko) 2007-10-31

Family

ID=36677991

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020077018326A KR20070105992A (ko) 2005-01-14 2006-01-16 생물학적 시료에서 사람 유두종 바이러스를 검출하기 위한시스템, 방법 및 조성물

Country Status (11)

Country Link
US (1) US8076081B2 (ko)
EP (1) EP1838865A4 (ko)
JP (1) JP2008526248A (ko)
KR (1) KR20070105992A (ko)
CN (1) CN101151379A (ko)
AU (1) AU2006205638A1 (ko)
CA (1) CA2594771A1 (ko)
IL (1) IL184587A0 (ko)
MX (1) MX2007008553A (ko)
WO (1) WO2006075245A2 (ko)
ZA (1) ZA200705790B (ko)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1038022E (pt) * 1997-12-12 2005-11-30 Digene Corp Avaliacao de doencas relacionadas com o virus papiloma humano
US7601497B2 (en) 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
US7439016B1 (en) * 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
KR20070105992A (ko) 2005-01-14 2007-10-31 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미시건 생물학적 시료에서 사람 유두종 바이러스를 검출하기 위한시스템, 방법 및 조성물
US20090258339A1 (en) * 2005-01-14 2009-10-15 The Regents Of The University Of Michigan Systems, methods and compositions for detection of human papilloma virus in biological samples
GB0601302D0 (en) * 2006-01-23 2006-03-01 Semikhodskii Andrei Diagnostic methods and apparatus
WO2007148762A1 (ja) * 2006-06-22 2007-12-27 Masahiko Kuroda ヒトパピローマウイルス（ｈｐｖ）の検出方法、それに用いるプライマーセットおよび検出キット
CA2663029C (en) * 2006-09-14 2016-07-19 Ibis Biosciences, Inc. Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens
WO2009035177A1 (en) * 2007-09-14 2009-03-19 Seegene, Inc. Genotyping of human papilloma viruses by multiplex amplification and size differentiation
WO2009129505A2 (en) * 2008-04-17 2009-10-22 Qiagen Gaithersburg, Inc. Compositions, methods, and kits using synthetic probes for determining the presence of a target nucleic acid
JP5550060B2 (ja) * 2008-10-03 2014-07-16 独立行政法人産業技術総合研究所 そうか病病原菌種のｐｃｒ定量用試薬キット
US8877436B2 (en) * 2008-10-27 2014-11-04 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay on an automated platform
JP6108661B2 (ja) * 2009-01-28 2017-04-05 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド 配列特異的な大量試料調製方法およびアッセイ法
CA2760542A1 (en) * 2009-05-01 2010-11-04 Qiagen Gaithersburg, Inc. A non-target amplification method for detection of rna splice-forms in a sample
WO2010129941A1 (en) * 2009-05-08 2010-11-11 Becton, Dickinson And Company Correlation of hpv e6 and e7 expression with progression of cervical disease
US20110053143A1 (en) * 2009-09-03 2011-03-03 Qiagen Gaithersburg Inc. Methods and kits for determining viral load in clinical samples
WO2011032124A1 (en) 2009-09-14 2011-03-17 Qiagen Gaithersburg, Inc. Compositions and methods for recovery of nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytology media
AU2011210748A1 (en) 2010-01-29 2012-08-09 Qiagen Gaithersburg, Inc. Method of determining and confirming the presence of HPV in a sample
EP2528932B1 (en) * 2010-01-29 2016-11-30 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids
US9422593B2 (en) 2010-05-19 2016-08-23 Qiagen Gaithresburg, Inc Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids
US9376727B2 (en) 2010-05-25 2016-06-28 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and associated strategically truncated probes
EP2678442B1 (en) 2011-02-24 2019-01-16 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Materials and methods for detection of hpv nucleic acid
CN103882148B (zh) * 2012-12-21 2019-01-04 中国科学院上海生命科学研究院 多级pcr检测hpv的方法和试剂盒
US20150376725A1 (en) * 2013-09-04 2015-12-31 Trovagene, Inc. HPV Detection in Urine
KR20190104164A (ko) 2013-09-26 2019-09-06 파이브3 제노믹스, 엘엘씨 바이러스-연관 종양을 위한 시스템, 방법, 및 조성물
CN111020023A (zh) * 2019-09-11 2020-04-17 浙江中创生物医药有限公司 基因拷贝数定量分析
CN111180071B (zh) * 2019-12-31 2022-02-08 四川大学 高危型hpv型别和宫颈癌前病变阶段关系的计算方法及装置

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07508891A (ja) 1993-05-06 1995-10-05 デイド、インターナショナル、インコーポレイテッド ヒト乳頭種ウイルス検出アッセイ
US6368834B1 (en) * 1999-04-06 2002-04-09 Genome Technologies, Llc PCR genome walking with synthetic primer
CN1720060B (zh) * 2002-10-03 2011-12-14 惠氏控股公司 人乳头瘤病毒多肽和免疫原性组合物
KR20070105992A (ko) 2005-01-14 2007-10-31 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미시건 생물학적 시료에서 사람 유두종 바이러스를 검출하기 위한시스템, 방법 및 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006075245A2 (en) 2006-07-20
WO2006075245A3 (en) 2007-11-15
EP1838865A2 (en) 2007-10-03
CA2594771A1 (en) 2006-07-20
CN101151379A (zh) 2008-03-26
ZA200705790B (en) 2008-09-25
JP2008526248A (ja) 2008-07-24
MX2007008553A (es) 2007-09-25
AU2006205638A1 (en) 2006-07-20
EP1838865A4 (en) 2008-09-03
IL184587A0 (en) 2007-10-31
US20060160188A1 (en) 2006-07-20
US8076081B2 (en) 2011-12-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20070105992A (ko) 생물학적 시료에서 사람 유두종 바이러스를 검출하기 위한시스템, 방법 및 조성물
JP5204132B2 (ja) ヒトパピローマウイルスｍＲＮＡを検出するための方法
EP2352845B1 (en) Diagnostic transcript and splice patterns of hpv16 in different cervical lesions
Szuhai et al. A novel strategy for human papillomavirus detection and genotyping with SybrGreen and molecular beacon polymerase chain reaction
CN105087827B (zh) 16种型别hpv病毒的检测引物、探针及试剂盒
Perrons et al. Detection and genotyping of human papillomavirus DNA by SPF10 and MY09/11 primers in cervical cells taken from women attending a colposcopy clinic
JP2005500856A (ja) 多重フルオロフォアを使用する蛍光多重ｈｐｖｐｃｒアッセイ
Correnti et al. Human papillomavirus in ameloblastoma
Shen-Gunther et al. HPV molecular assays: defining analytical and clinical performance characteristics for cervical cytology specimens
CN114450421A (zh) 用于人乳头瘤病毒和性传播感染检测、鉴定和定量的方法和组合物
McNicol et al. Expression of human papillomavirus type 16 E6-E7 open reading frame varies quantitatively in biopsy tissue from different grades of cervical intraepithelial neoplasia
JP4851090B2 (ja) ヒト・パピローマウイルスを定量的且つ定性的に測定するための方法及びキット
CN112391495A (zh) 一种高危人乳头瘤病毒分型检测方法与试剂盒
WO2010033619A2 (en) Systems, methods, and compositions for detection of human papilloma virus in biological samples
TW201712122A (zh) Ｈｐｖ檢測方法
JP3600616B2 (ja) ヒトパピローマウイルスを検出するためのプライマーセット、検出方法および検出用ｄｎａアレイ
Zhang et al. A novel fluorescence polarization based assay for 14 human papillomavirus genotypes in clinical samples
Silva et al. Human papillomavirus detection and genotyping in squamous cell carcinomas of the larynx
WO2005100610A2 (en) Virus detection method, primers therefor and screening kit
CN112266982A (zh) 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv45的探针及其试剂盒
Feng et al. Human Papillomavirus and its role in cervical carcinoma
Antonishyn The utility of HPV typing and relative quantification of HPV-16 transcripts for monitoring HPV vaccine efficacy and improving colposcopy triage of women with abnormal cervical cytology.
Mzibri Recent Advances in Human Papillomavirus Detection and Genotyping
AU2002311464A1 (en) Virus detection method,primers therefor and screening kit

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E601 Decision to refuse application