MX2007008553A - Sistemas, metodos y composiciones para deteccion del virus de papiloma humano en muestras biologicas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion comprende, sin limitacion, sistemas, metodos y composiciones para la deteccion, identificacion y cuantificacion hasta el nivel de copia individual, del virus del papiloma humano (VPH) en muestra biologicas, incluyendo mas no limitandose a, fluidos corporales de mamiferos y raspado de cervix para propositos de deteccion, tratamiento y/o manejo de cancer y displasia.

Description

SISTEMAS. MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA DETECCIÓN DEL VIRUS DE PAPILOMA HUMANO EN MUESTRAS BIOLÓGICAS REFERENCIA RECIPROCA A LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama prioridad con base en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos No. 60/644,374, presentada en enero 14 de 2005, la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia.

INFORMACIÓN SOBRE LA CONCESIÓN El trabajo que sustenta la invención, fue apoyado en parte por concesiones del Michigan Life Sciences Corridor (MEDC-410), the Michigan Tri-Technology Corridor, NIH (R21 DK69877, R21 DK070237, CA104830 y CA94328), el NIH Head/Neck Cáncer SPORE (1 P50 CA97248), y el MDRTC Cell and Molecular Biology Core (DK20572). El gobierno puede tener ciertos derechos en la invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de detección y manejo de agentes microbianos en muestras biológicas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Estudios recientes indican que el virus del papiloma humano ("HPV") está asociado con una fracción significante de cáncer cervical, de cabeza y cuello, anal y de vejiga asociado con esquistosomiasis. Los cánceres cervical y anal están asociados casi uniformemente por infección por el HPV. Una revisión reciente de reportes publicados, encontró que la frecuencia general de ADN del HPV en tumores de cabeza y cuello es de 35%. Más recientemente, algunos investigadores han usado PCR cuantitativa ("QPCR") para confirmar estos hallazgos en un gran estudio de 253 muestras de tumores, en donde detectaron ADN del HPV en 25% de las muestras. El HPV está asociado también con displasias y cánceres anales. Otros investigadores han encontrado por hibridación in situ que casi 50% de los cánceres de vejiga causados por esquistosomiasis tuvieron ADN del HPV. Los tipos de HPV 16 y 18 están entre los tipos virales de "alto riesgo", puesto que su presencia está asociada con carcinomas y lesiones preneoplásicas. En contraste, los tipos de "bajo riesgo", más comúnmente los tipos de HPV 6 y 11 , están asociados típicamente con lesiones benignas. El potencial oncogénico del HPV se debe principalmente a dos oncoproteínas virales, E6 y E7. Diferencias en el potencial oncogénico entre los tipos de HPV, se han atribuido a diferencias específicas de tipo en las proteínas E6 y E7. Se ha mostrado que la proteína E6 de las cepas del HPV oncogénicas interactúa con la proteína p53, y promueve su degradación por medio de una vía dependiente de ubiquitina. La oncoproteína E7 puede, asimismo, combinarse con la proteína de retinoblastoma (Rb), e inactivarla. Tanto p53 como Rb son genes supresores de tumores importantes cuyos productos regulan el ciclo celular, orquestan procesos de reparación del ADN, y están implicadas en la muerte celular programada o apoptosis. La disolución de estas proteínas supresoras de tumores por el HPV, lleva a la propagación de cambios mutacionales e inmortalización de las células. La técnica para examinar ADN del suero para genomas anormales de células cancerosas, se ha estudiado como una prueba molecular potencial para el cáncer. Aunque algunos investigadores encontraron que el método de PCR cuantitativa TaqMan pudo detectar ADN del HPV en el suero de algunos pacientes con cánceres de cabeza y cuello y cervical, el ADN del HPV no fue detectable por medio de esta técnica en el suero y otros sitios biológicos en cantidades suficientes para ser útil en la mayoría de los sujetos como una herramienta clínica. Como ejemplos de limitaciones comunes, problemas con el estándar de cuidado común para la prueba del HPV, la prueba de Digene [1], incluyen: 1. La prueba de Digene reacciona en forma cruzada no específicamente con tipos de HPV diferentes de los tipos patogénicos conocidos [2]. De esta manera, existen falsos positivos inevitables con la prueba de Digene; 2. La prueba de Digene requiere que por lo menos varios miles de moléculas del HPV sean leídas como positivas [1]. Este requisito previene la selección de suero y/o sangre en donde está presente un número de moléculas más pequeño; y 3. La prueba de Digene no revela qué tipo de HPV se encuentra en la ThinPrep de cerviz. Esto llega a ser importante, ya que los tipos no patogénicos del HPV pueden dar resultados falsos positivos sí no se identifican los tipos de HPV responsables de una señal. En vista de estas y otras limitaciones y deficiencias en la técnica, persiste una necesidad no cubierta por sistemas, métodos y composiciones para la detección e identificación de especies de HPV individuales en muestras biológicas a niveles no detectables por los métodos disponibles comúnmente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención comprende, sin limitación, sistemas, métodos y composiciones para la detección, identificación y cuantificación, hacia abajo hasta el nivel de una sola copia, del HPV en muestras biológicas que incluyen, sin limitación, fluidos corporales y raspados de cerviz de mamífero para propósitos de detección, tratamiento y/o manejo de cáncer y displasia. En algunas modalidades preferidas, la invención comprende tecnología de espectroscopia de masa más sensible que permite identificar secuencias del HPV individuales, incrementa la sensibilidad de detección de ADN del HPV, y provee evidencia de una asociación más frecuente del ADN del HPV en suero y/o sangre periférica con varios tipos de tumores. De esta manera, la invención comprende sistemas, métodos y composiciones que permiten la selección de sangre periférica y suero para ADN del HPV como un marcador de tumor residual o displasia en casos asociados con el HPV. Otros aspectos de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica después de que se revisen los dibujos y la descripción detallada siguiente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La presente invención se describirá ahora, a manera de ejemplo, con relación a los dibujos acompañantes, en los cuales: La figura 1 representa los resultados de la espectroscopia de masa de una selección para trece (13) diferentes tipos de HPV en una reacción individual de conformidad con la invención. La figura 2 es un diagrama de flujo generalizado de pasos de conformidad con algunas modalidades de la invención, sin limitación. Las figuras 3A-D muestran títulos del HPV en tumores (3A), muestras positivas para Pap (3B), muestras positivas para HC2 (3C), y muestras negativas para Pap (3D), respectivamente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Sin limitación, en algunas modalidades, la presente invención comprende sistemas, métodos y composiciones para analizar y determinar simultáneamente cuáles de uno o más tipos de HPV patogénicos están asociados con cáncer o displasia de tejido displásico o tumoral. Mediante el uso de la invención, este análisis y determinación puede hacerse hacia abajo hasta el número de 100 o menos copias del HPV, que es más sensible que las pruebas aprobadas actualmente por la U.S. Food and Drug Administration ("FDA") para la detección del HPV, que requieren de 1000 a 5000 copias [1]. La invención extiende además la sensibilidad buscando una secuencia del HPV individual determinada que permita la detección hacia abajo hasta 1 aM (moléculas individuales en los volúmenes de PCR de 5 microlitros usados en algunas modalidades). Esta sensibilidad incrementada permite la detección de HPV patológico en la sangre y el suero, entre otras muestras biológicas. Además, la invención comprende sistemas, métodos y composiciones para elaborar detalles de los tipos de HPV asociados con un tumor determinado, y es sensible, específica y cuantitativa, lo cual no puede hacerse con ciertos métodos usados actualmente [1], que examinan una combinación de numerosas sondas, y no son cuantitativos. En algunas modalidades, sin limitación, una vez que los tipos de HPV se determinan de conformidad con la invención, la invención sustenta también seleccionar sensiblemente y específicamente para la detección de ese HPV al nivel de una sola copia en muestras biológicas que incluyen, sin limitación, fluidos corporales de mamífero. Dicha selección sensible y específica al nivel de una sola copia, no ha sido posible hasta ahora. Revela un estado de naturaleza no establecido previamente, por el cual la presencia del HPV en suero y/o sangre está asociada únicamente con displasia o cáncer no visto en sujetos normales. La falta de falsos positivos como se observa en la referencia [4], en dicha selección, la hace muy conveniente para la determinación de displasia o cáncer. En algunas modalidades preferidas, sin limitación, la invención comprende sistemas, métodos y composiciones para determinar el tipo y la cantidad de HPV patogénico que está presente en una muestra biológica en una prueba individual. En algunas modalidades, la invención comprende sondas construidas usando un sistema de prueba espectroscópica de masa para uno o más tipos de HPV de alto riesgo o de riesgo intermedio. Dichos tipos de HPV de alto riesgo o de riesgo intermedio pueden seleccionarse de acuerdo a la identificación usando la prueba de ThinPrep de Digene [1], una prueba común aprobada por la FDA para el análisis del HPV en raspados cervicales. Algunas modalidades de la invención añaden a los 13 tipos de HPV de la prueba de Digene, otros 6 tipos de HPV que pueden ser de alto riesgo porque causan carcinogénesis cervical y anal [5, 6]. Esta determinación puede llevarse a cabo hacia abajo hasta el nivel de por lo menos las 100 aM (aproximadamente 300 moléculas), un orden de magnitud más sensible que el método de Digene común que requiere que varios miles de moléculas del HPV sean positivas [1]. Además, la presente invención permite determinar qué tipos de HPV están presentes en un tumor o displasia, o por extensión, en materiales derivados directamente de tumores (por ejemplo, ThinPreps cervicales). Por último, algunas modalidades de la invención comprenden, sin limitación, sistemas, métodos y composiciones para análisis cuantitativo, en comparación con las pruebas existentes que son sólo cualitativas. El acoplamiento de esta determinación cuantitativa con la comprobación del tipo de HPV de conformidad con la presente invención, puede tener utilidad clínica significante [6], por el cual la severidad clínica puede reflejarse por el número de copias del HPV en diferentes sitios anatómicos. De conformidad con algunas modalidades, sin limitación, la presencia de uno o más tipos de HPV patogénico en extractos celulares o tumorales, se detecta por medio de una prueba espectroscópica de masa sensible y específica ([8-10]; figura 1 ). En general, la prueba espectroscópica de masa de la invención implica la amplificación por PCR de un corto fragmento de nucleótidos presente en el HPV; digestión de iniciadores y nucleótidos; y extensión de un iniciador "anidado" de prueba espectroscópica de masa, con didesoxinucleótídos adecuados. Esto resulta en la incorporación de un didesoxinucleótido individual a la secuencia de extensión de la prueba espectroscópica de masa sólo si el molde de HPV determinado está presente a partir de la primera reacción de PCR. De conformidad con algunas modalidades, la selección se estructura en una forma en donde cada muestra se pone a prueba independientemente para uno o más tipos de HPV patogénicos, sólo a manera de ejemplo, 19 tipos de HPV patogénicos, con sondas distinguibles que dan una señal característica si son positivas para un tipo de HPV determinado. Permite seleccionar para un total de 19 tipos de HPV, que representan los 13 tipos centrales seleccionados para los tipos originales (figura 1 ; HPV 16, 18, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 56, 58, 59 y 68 [1]), más los tipos de HPV 23, 26, 53, 66, 73 y 82 que son potencialmente patogénicos [5]. Algunas modalidades incluyen también una sonda para un fragmento de una sola copia de ADN genómico total de humano (por ejemplo, y sin limitación, una sonda para un fragmento de una sola copia de un intrón del gen erB-2). Además de selección altamente sensible por lo menos hacia abajo hasta el nivel de 100 attomolar (aM = 10"18 M), la presente invención permite la determinación del tipo de HPV asociado con un tumor o displasia determinado. Además, se logra la determinación del número de copias de la secuencia del HPV, lo cual puede conferir también datos de pronóstico útiles [7]- En algunas modalidades, sí esta primera selección descrita anteriormente es positiva, la presencia del HPV en fluidos corporales se detecta por medio de una prueba espectroscópica de masa aún más sensible, usando sólo la sonda para el tipo de HPV que fue positiva en la primera selección. Esto se hace posible por el uso de la selección previa que detalla el tipo de HPV presente en un tumor o dísplasia determinado. Esta técnica da la posibilidad de selección para recurrencia de un tumor, poniendo a prueba sangre y/o suero. La detección sensible del HPV en el suero y/o sangre al nivel de una sola copia, resulta en los resultados inesperados y previamente no apreciados: 1. De conformidad con la invención, puede detectarse displasia cervical seleccionando suero y/o sangre. Esto no se ha demostrado antes, salvo usando una técnica basada en TaqMan que produce imprecisión que lleva a una fracción sustancial de casos normales que dan resultados anormales [4]. En contraste, la presente invención muestra el resultado inesperado y previamente no apreciado de que una alta fracción de casos de displasia cervical está asociada con el HPV en suero y/o sangre. En comparación, controles normales y muestras de displasia cervical tratadas exitosamente, están libres de este HPV en suero y sangre. Antes de la presente invención, no se apreció la falta de información separada del suero y sangre. Esto surge presumiblemente de la patogénesis distinta de estos eventos; el HPV en el suero surge de lisis celular, mientras que el HPV en la sangre resulta de la circulación de células tumorales intactas o fagocitosis (con digestión incompleta) de células tumorales; 2. De conformidad con la invención, se ha mostrado inesperadamente que el cáncer de vejiga asociado con esquistosomiasis está asociado uniformemente con el HPV. Previamente, se pensó que sólo la mitad de estos cánceres resultaba del HPV [11]. La extensión al análisis más sensible de la invención al nivel de una sola copia, reveló también que el suero (26 de 27 casos) y el sedimento de la orina (15 de 24 casos) son útiles para el diagnóstico. El HPV en sangre no estuvo presente aún cuando el HPV del suero fue positivo en 26 de 27 casos; 3. Mediante el uso de la presente invención, se muestra también que el análisis de la sangre y el suero es útil para diagnosticar y para monitorear la terapia de los cánceres de cabeza y cuello causados por el HPV. Previamente, aunque altos niveles de HPV existieron con frecuencia en tumores que hacían que este análisis fuera feasible, la imposibilidad de detectar menores niveles hace que el análisis de sangre y suero sea teórico, ya que la mayoría de los casos que investigaban el suero fueron negativos [3]. En contraste, la detección de conformidad con la presente invención mostró que una fracción significante de tumores estuvo asociada con el HPV que pudo detectarse en suero y/o sangre. Esto extendido a una variedad de tipos de HPV patogénicos, evidencia que esta selección tiene valor clínico, ya que tipos de HPV clínicamente insignificantes no interfieren con el análisis; y 4. Mediante el uso de la invención, se mostró que todos los controles normales puestos a prueba fueron negativos, incluyendo los 40 sedimentos normales de orina, las 27 muestras normales de suero, las 20 muestras normales de sangre y las 9 placentas que se examinaron. En algunas modalidades, sin limitación, la invención comprende un método de selección de dos (2) etapas que es sensible y bastante específico para detectar hacia abajo hasta el nivel de una sola molécula. La primera etapa implica seleccionar las células tumorales o displásicas con una batería de los 19 tipos de HPV patogénicos. Una vez que se conoce el tipo de HPV, ese tipo puede usarse para seleccionar fluidos corporales relevantes con mayor sensibilidad que si las 19 secuencias se usaran simultáneamente. Como resultado, la selección de fluidos corporales es de sensibilidad y especificidad incrementada para tener utilidad clínica mejorada. En dicha selección, el suero y la sangre llegan a ser informativos independientemente, reflejando la patogénesis diferente que da el HPV en estos fluidos. La presencia del HPV en suero resulta de lisís de células anormales que poseen HPV. La presencia del HPV en sangre resulta de la presencia de células tumorales circulantes y/o fagocitosis de células anormales con detección de secuencias de HPV que no son completamente digeridas. De esta manera, se obtiene información útil de la consulta independiente del suero y la sangre. La invención comprende sistemas, métodos y composiciones que se extienden a todos los fluidos corporales (por ejemplo, orina, fluido cerebroespinal, sudor, esputo, lágrimas, etc.).

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos de algunas modalidades de la invención, se proveen sin que limiten la invención a sólo aquellas modalidades descritas en la presente.

De conformidad con algunas modalidades preferidas, sin limitación, la invención comprende el uso de espectrometría de masa ("MS") de tiempo de vuelo - ionización con desorción láser asistida por matriz ("MALDI-TOF") para el análisis cualitativo y cuantitativo de la expresión génica, en combinación con aspectos de PCR competitiva, reacción de extensión del ¡niciador y MS MALDI-TOF (véase en general la figura 2). Una muestra que se piensa contiene ADN del HPV aislado de una muestra biológica, es inutilizada con un oligonucleótido sintético de aproximadamente 100 nucleótidos de longitud (el competidor) con una secuencia idéntica a, o que coincide sustancialmente con, una porción de la secuencia de ADN de un HPV de interés, salvo por una base individual casi a la mitad de la secuencia de interés. En algunas modalidades, el competidor se añade en una concentración conocida. El competidor y el ADN de interés son coamplificados por PCR en presencia de iniciadores delantero e inverso. El exceso de dNTPs y los iniciadores se remueven por medios conocidos por los expertos en la técnica después de la PCR, sólo como un ejemplo y sin limitación, digestión enzimática y lavado adecuado. Entonces, una reacción de extensión de base se lleva a cabo con un ¡niciador de extensión y una combinación de diferentes ddNTPs (sólo como un ejemplo, G y C). El iniciador de extensión híbrida después a la derecha con el sitio de mutación, y por lo menos una de dos bases de ddNTP se añade diferencialmente para el competidor y el ADN, dando dos productos de oligonucleótidos con diferentes pesos moleculares. En una ventana típica de peso molecular de aproximadamente 5,000 a aproximadamente 8,500 Daltons (Da), la MS MALDI-TOF distingue fácilmente dos oligonucleótídos, si difieren por más de aproximadamente 20 Da. De conformidad con la invención, estos productos de extensión diferenciales se identifican cualitativamente, y pueden cuantificarse sus concentraciones en relación a su relación de MS MALDI-TOF, sólo como un ejemplo, cuando se conoce la concentración de la secuencia añadida del competidor. En algunas modalidades, sin limitación, se logra además espaciamiento de peso molecular deseable uniendo, según se desee, moléculas espadadoras en el extremo 5' de los iniciadores de extensión de base, como se describe además en la presente.

Preparación y cuantificación de ADN de las muestras. Se aislaron muestras de tumor, suero, sangre periférica y sedimento de la orina, al momento de la biopsia del tumor de personas individuales con cáncer. Se aislaron suero y/o sangre periférica de controles normales no expuestos al HPV, de individuos con esquistosomíasis (con o sin cáncer de vejiga conocido), de individuos con cáncer de vejiga asociado con esquistosomiasis después de la remoción quirúrgica del tumor, de individuos con cáncer de cabeza y cuello, y de individuos con cáncer cervical o anal o displasia cervical. Se aisló sedimento de la orina de sujetos con cáncer de vejiga asociado con esquistosomiasis, y de sujetos control sin tumores de vejiga. El sedimento de la orina fue la pella aislada después de la centrifugación de la orina por aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 8,000 rpm en una centrífuga Beckman J2-21 M. Se obtuvieron placentas después de partos normales. Se aisló ADN de tejido, sangre periférica y sedimento de la orina, usando el equipo de ADN I genómico ZR (Zymo Research Corp, Orange, CA). Se aisló ADN de aproximadamente 0.3 a 5 ml de suero usando un equipo de aislamiento de ADN de suero ZR. Se colectaron muestras cervicales en solución para ThinPrep PreservCyt (Digene Corporation, Gaithersburg, MD). Después del reporte de los resultados de los pacientes, las muestras fueron separadas de los identificadores de los pacientes, y se prepararon alícuotas y se pusieron a prueba por medio del método de PCR espectroscópica de masa. Se aisló el ADN de aproximadamente 5 ml de la solución de ThinPrep por rotación con aproximadamente 10 µl de perlas de Zymo del equipo de aislamiento de ADN de suero ZR. Las perlas se añadieron a la muestra, y se añadió aproximadamente 4 veces el volumen de regulador de pH de lisis genómico (Zymo Research Corporation). La mezcla se revolvió durante la noche a aproximadamente 4°C. Se preparó ADN de las perlas de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La suspensión final estaba en un pequeño volumen (aproximadamente 20 µl) de regulador de pH de elución. Se prepararon muestras para análisis de HC2 de Dígene y de Roche (incluyendo blotting en línea inversa), de acuerdo a las instrucciones del fabricante [1 , 12]. Se proveyeron entonces muestras ocultamente para análisis espectroscópico de masa de conformidad con la invención.

Para determinar la cantidad de ADN en una muestra determinada, se usó QPCR fluorescente TaqMan [13] en el iCycler de Bio-Rad para un intrón único en el gen erbB-2. Se usaron los iniciadores 5'-ACCTTCTCTTGACCTTTCAGAATATGT-3' (SEQ ID NO. 129) y 5'-AGAGAGTCTTGGCCCTTTCCA-3' (SEQ ID NO. 129), con la sonda TaqMan d'-AGAGGGCCCTCTGCCTGCTGC-S' (SEQ ID NO. 130). Se usó el valor derivado empíricamente de 7.7 x 103 equivalentes de genoma haploide/unidad fluorescente de sonda de erbB-2).

Construcción de una sonda degenerada TaqMan de ADN del HPV. Se construyó una sonda degenerada de PCR de ADN del HPV en la región L1 del virus [13]. Los iniciadores GP5+ y GP6+ fueron de de Roda Husman et al. [15]. Los iniciadores MY18 y MY1019 fueron de Nelson et al. [16]. Para construir una serie de TaqMan degenerada [13], se combinaron las secuencias para dar una serie de TaqMan con los 2 iniciadores exteriores (basados en GP5+ y GP6+) y una sonda (basada en MY18 y MY1019). Se derivaron temperaturas de fusión (Tm), usando el calculador oligo de Qiagen (http://www.operon.com/oliqos/toolkit.php?).

Iniciador 1 (análogo GP5+): Se construyó el análogo GP5+, combinando una cantidad igual de cada uno de los 4 iniciadores enlistados a continuación: GCACAGGGACATAATAAT (SEQ ID NO. 131 ) Tm = 53.8°C GCACAGGGTCATAATAAT (SEQ ID NO. 132) Tm = 53.8°C GCCCAGGGACATAAT (SEQ ID NO. 133) Tm = 53.8°C GCCCAGGGTCATAAT (SEQ ID NO. 134) Tm = 53.8°C.

Iniciador 2 (análogo GP6+): GAATATGATTTACAGTTTATTTTTC (SEQ ID NO. 135) Tm = 53.1 °C.

Sonda: Se construyó la sonda final MY1019, mezclando un volumen igual de análogo 1 de MY1019 y análogo 2 de MY1019. La sonda final se construyó de una cantidad igual del análogo MY18 y el análogo final MY1019.

Análogo MY18: CTGTTGTTGATACTACACGCAGTAC (SEQ ID NO. 136) Tm = 62.8°C. Se construyó el análogo final MY1019, a partir de una mezcla 1/1 de: Análogo 1 de MY1019: GTGGTAGATACCACACGCAGTA (SEQ ID NO. 137) Tm = 63.4°C.

Análogo 2 de MY1019: GTGGTAGATACCACTCGCAGTA (SEQ ID NO. 138) Tm = 63.4°C. Los iniciadores y sondas fueron sintetizados por Biosearch a solicitud por los inventores. La sonda fue marcada con el fluorita 6-FAM en el extremo 5', y el producto retardados 1 Black Hole en el extremo 3'. Se puso a prueba la colección de sonda degenerada-iniciador en plásmidos que poseían las secuencias del HPV-16 o HPV-18 (American Type Culture Collection), respectivamente. Mediante el uso de la sonda degenerada, se obtuvo amplificación equivalente con cualquier plásmido.

Amplificación por PCR de la sonda degenerada TaqMan. Puesto que todos los sueros normales contienen pequeñas cantidades de ADN genómico normal [16], se verificó que se preparara ADN de suero de todas las muestras con una sonda de ADN genómico de erbB-2 TaqMan [13]. En forma similar, se confirmó que se aislara ADN de todas las demás muestras usadas. Después de desnaturalización a aproximadamente 95°C por aproximadamente 5 minutos, se usó un programa de desnaturalización de dos pasos a aproximadamente 95°C por aproximadamente 15 segundos y unión a aproximadamente 60°C por aproximadamente 30 segundos, para amplificar erbB-2 por 40 ciclos. Después de desnaturalización a aproximadamente 95°C por aproximadamente 5 minutos, las condiciones que se usaron para amplificación por QPCR para ADN del HPV en una máquina Perkin-Elmer modelo 7700 después de optimización, fueron un programa de dos pasos de aproximadamente 52°C por aproximadamente 60 segundos (para unión y extensión), y desnaturalización a aproximadamente 95°C por aproximadamente 15 segundos por 40 ciclos. También se llevó a cabo esto por aproximadamente 55 ciclos para muchas muestras para igualar los 55 ciclos usados en el último paso de amplificación del método de PCR-espectroscopía de masa. La temperatura de extensión y unión menor de lo normal a aproximadamente 52°C, reflejó el uso de una sonda degenerada. Para la reacción TaqMan con la sonda degenerada de ADN del HPV, cada valor se repitió por cuadruplicado. Se analizaron muestras por el método TaqMan [13] en una máquina Perkin Elmer modelo 7700. La secuenciación del ADN fue hecha por la University of Michigan Core sequencing facility.

Aplicación del método HC2. La reacción HC2 incluye sondas de ARN complementarias al ADN de cada uno de los 13 tipos de alto riesgo de HPV. Se detecta hibridación entre el ADN del HPV y cualquiera de las sondas de ARN complementarias, usando anticuerpos de captura con híbridos de ARN:ADN objetivo [1]. Se consideraron como positivas muestras con relaciones de limitación de unidades de luz relativa (RLU) > 10 en la prueba inicial. Se consideraron como negativas muestras con relaciones de limitación de RLU menores de aproximadamente 0.8. Las muestras con relaciones de limitación de RLU de aproximadamente 0.8 a 9.99 se pusieron a prueba de nuevo. Si la relación de limitación de RLU de repetición era > 1 , se consideraba a la muestra como positiva. Las muestras ambiguas que no se repitieron como positivas no se incluyeron en este estudio. Las muestras se dividieron en 2 grupos (HC2 (+) y HC2 (-); el material anonimizado y el exceso de material ThinPrep se estudió por medio de la técnica MassARRAY.

Análisis alternativos del tipo de HPV. Como se indicó, se derivó el tipo de HPV de muestras seleccionadas, por el método de análisis por blottíng en línea inversa de Roche [12]. En forma alternativa, se usaron iniciadores degenerados en la región L1 del HPV para detectar la secuencia de HPV más abundante que pudiera ser amplificada por estos iniciadores degenerados [15, 17]. Esto funcionó para el total de 13 tipos patogénicos de HPV, salvo HPV52 (en donde en la prueba la divergencia entre HPV52 y los iniciadores degenerados, era demasiado grande para permitir la unión de iniciador).

Medición del ADN genómico humano. Para determinar la cantidad de ADN en una muestra determinada, se usó la QPCR fluorescente TaqMan [12] en el iCycler de Bio-Rad para un intrón único en el gen erbB-2. Los iniciadores fueron d'-ACCTTCTCTTGACCTTTCAGAATATGT-S' (SEQ ID NO. 139) y 5'-AGAGAGTCTTGGCCCTTTCCA-3' (SEQ ID NO. 140), y la sonda TaqMan fue 5'-AGAGGGCCCTCTGCCTGCTGC-3' (SEQ ID NO. 141 ). Se derivó un valor de 1.1 x 103 equivalentes de genoma haploide/unidad fluorescente de sonda de erbB-2. Se incorporó también una sonda para este intrón en una mezcla de 22 sondas que se analizaron por medio del espectrómetro de masa (cuadros 1A-1 D), y dejan de requerir análisis separado en el iCycler.

Método espectroscópico de masa cuantitativo para análisis por PCR. De conformidad con algunas modalidades, sin limitación, la invención comprende un procedimiento de pasos múltiples de PCR competitiva en tiempo real (rcPCR), extensión del iniciador y separación de productos por MS MALDI-TOF sobre una disposición de chips de silicio cargados de matriz para detectar tan poco como varias moléculas iniciales [8]. Un molde de nucleótidos competitivo (sólo como un ejemplo, aproximadamente 100 nucleótidos) se sintetiza para hacer coincidir una secuencia objetivo de HPV para PCR, salvo por una mutación de una sola base en el competidor, la cual se introduce durante la síntesis. El cambio de una sola base puede discriminarse entonces a partir del alelo objetivo de HPV, usando una reacción de extensión del iniciador con resolución del producto en masa (en Daltons) en la MS MALDI-TOF como se hizo análogamente para la genotipificación de SNP [10]. De preferencia, pero no exclusivamente, el molde competitivo se añade a la reacción de PCR en cantidades conocidas, y puede titularse por lo tanto para crear una curva estándar para la determinación de las cantidades de ADN objetivo. Cuando las áreas máximas del alelo objetivo y el alelo molde competitivo son iguales, las concentraciones de las dos moléculas están a una relación de aproximadamente 1 :1 , que representa la cantidad de ADN objetivo en la reacción. El análisis espectroscópico de masa es muy específico ya que, en este ejemplo de modalidad, se discernió un producto de extensión del ¡niciador determinado hacia abajo hasta una resolución de aproximadamente 20 Daltons. Cualquier producto contaminante tendría que ser por lo tanto de este tamaño específico para crear una señal de falso positivo. La presencia del estándar interno (molde competitivo) sirve también para confirmar que las enzimas requeridas para la PCR estuvieron funcionando, y que la muestra fue purificada libre de inhibidores de PCR.

Determinación del tipo y la cantidad de HPV con PCR competitiva en tiempo real y análisis espectroscópico de masa del ADN. De conformidad con algunas modalidades, sin limitación, se diseñó una prueba de HPV 13-plex derivando primero secuencias de iniciador de extensión y PCR con software Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cqi-bin/primer3/primer3 www.cqi) a partir de la región E6 de varias cepas de HPV. Estas secuencias se usaron entonces para definir límites de secuencia de entrada para su uso con el software del diseñador de prueba MassARRAY v3.0. (Sequenom, Inc., San Diego, CA) [8]. De esta forma, pudo distinguirse cada uno de los 13 tipos discretos de HPV de alto riesgo (figura 1 ) [1]. Las secuencias del ¡niciador delantero e inverso, ¡niciador de extensión y competidor, se describen en el cuadro 2. Algunas modalidades comprenden también una selección más intensiva usando diferente software que se elaboró para estar adaptado para este propósito. Mediante el uso de este software, se construyó una sonda formada de 22 tipos de secuencia que incluye los 13 tipos de HPV originales, 6 tipos adicionales de HPV, una sonda de una sola copia de ADN genómico que permite la cuantificación de la cantidad de ADN humano en una alícuota determinada, y sondas para Neisseria gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis (véase, por ejemplo, los cuadros 1A-1 C). La temperatura para la primera reacción de PCR es de aproximadamente 60°C, y la temperatura para la segunda reacción de extensión del ¡niciador es de aproximadamente 58°C. Se han descrito previamente [18, 19] condiciones para el análisis espectroscópico de masa-rcPCR en multiplex de PCR. Se iniciaron reacciones creando una placa maestra de 96 cavidades a partir de la cual se estableció una placa de reacción de 384 cavidades usando un robot MultiMek. Hubo 4 cavidades a 0 aM (attomolar = 10'18 M) de un competidor determinado, y 4 cavidades a 1 aM de un competidor determinado para cada cepa de HPV. Las reacciones que fueron positivas para una secuencia de HPV determinada, se cuantificaron entonces para cada uno de los HPVs positivos. Se cuantificó la reacción usando 10 aM, 100 aM y 1 fM (femtomolar = 10"15 M) de competidor. Si una reacción era aún demasiado positiva para ser titulada, la muestra se diluía entonces a 1/100, y se volvía a titular. Debido a que MassARRAY no es una prueba homogénea, debe ponerse atención para establecer la reacción. Se usaron dos robots (antes y después de la PCR inicial) para establecer las reacciones y reducir al mínimo la contaminación. El control de rutina en cada placa que muestra que las muestras normales fueron negativas, confirmó que estas técnicas que previenen la contaminación fueron efectivas. Todos los valores reportados en la presente representan el análisis de por lo menos 8 puntos de datos independientes.

Muestras control. Se examinó una serie de controles para tejido, suero, sangre periférica y sedimento de la orina. Los controles de tejido fueron muestras de ADN de placentas normales. Los controles de suero y sangre periférica fueron muestras de ADN que se aislaron de sueros y sangre periférica de sujetos anónimos no conocidos por estar expuestos al HPV. Los controles del sedimento de la orina fueron muestras de ADN de voluntarios normales. En todos los casos reportados en la presente, la reacción con una sonda control de erbB-2 por TaqMan fue positiva, confirmando que estaba presente ADN de calidad para QPCR. Las muestras control fueron usualmente negativas para la sonda degenerada de ADN del HPV en las 4 cavidades, y rara vez fueron positivas en 1 de 4 cavidades. De esta manera, sólo se consideraron conservativamente como positivas, muestras que reaccionaran en > 3/4 cavidades. Mediante el uso de la definición anterior en muestras analizadas en la máquina Perkin-Elmer modelo 7700, la sonda degenerada de ADN del HPV reaccionó con 0 de 40 sedimentos normales de orina, 0 de 27 muestras normales de suero, 0 de 20 muestras normales de sangre periférica y 0 de 9 placentas (control para muestras normales de tejido). Además, un análisis aún más sensible con el sistema de PCR-espectroscopía de masa, mostró también que no estuvo presente ADN del HPV en ninguna de estas muestras normales. Mediante el uso del iniciador inverso altamente conservado (análogo GP6+) como el iniciador de iniciación para la secuenciación del ADN, pudo determinarse entonces el tipo de ADN del HPV por secuenciación didesoxi. Se observó lo siguiente: La sonda degenerada era adecuadamente negativa en todos los tejidos control; y Se vio evidencia de ADN del HPV en cánceres de vejiga asociados con esquistosomiasis (cuadro 3), cánceres de cabeza y cuello (cuadro 4) y cánceres cervicales (cuadro 5). Eso está de acuerdo con un gran cuerpo de literatura que sugiere dicho envolvimiento. Sólo a manera de ejemplos adicionales, sin que sean limitadas las modalidades posibles de la invención, en una primera etapa, se seleccionaron ThinPreps cervicales o de tumores para uno de los 13 tipos patogénicos [1], usando la prueba espectroscópica de masa de la invención para identificar por separado alguno de los 13 tipos diferentes de HPV patogénico en una sola reacción. Se derivaron secuencias de la región E6 del HPV que deben estar presentes para que el HPV transforme una célula. La proteína E6 de las cepas del HPV oncogénicas interactúa con la proteína p53 y promueve su degradación por medio de una vía dependiente de ubíquitina [20]. Se derivaron secuencias de la región E6 de cada uno de los 13 tipos de HPV que son patogénicos para cáncer humano (http://hpy-web.lanl.gov/), y se conocen de acuerdo a por lo menos un método existente, la selección de Digene [1 ; cuadro 2]. En algunas modalidades, sin limitación, las secuencias se ajustan para obtener buen espaciamiento de peso molecular sin variación indebida de tamaño del iniciador que pudiera alterar las temperaturas óptimas para la PCR. Se usó esta metodología para la selección más avanzada con 22 sondas, como se detalla en los cuadros 1A-1C. En algunas modalidades, se usan no más de 15 bases contiguas, con sustitución de la base "comodín" desoxiinosina por desoxiguanosina, desoxiadenina o desoxitimidina. Este concepto se deriva en relación al tamaño del genoma humano, de modo que el número de permutaciones producidas por 16 o más bases (aproximadamente 416) es mayor que el tamaño del genoma humano. Mediante el uso de dichas modalidades, se encontró que la sustitución de una desoxiinosina interna no tuvo efecto sobre las condiciones de PCR o el desempeño de la prueba de PCR. Los iniciadores que se usaron para las 22 secuencias objetivo se enlistan en los cuadros 1A-1 D. De esta manera, en estas modalidades, no se usó un tramo de secuencia mayor de 15 nucleótidos, que de otra manera se ha relacionado con la secuencia determinada en el genoma humano (debe ser una secuencia de esta longitud para que esté representada únicamente en el genoma humano). De esta manera, en algunas modalidades, las secuencias contiguas usadas son demasiado pequeñas para estar representadas únicamente en el genoma humano. Además, en algunas modalidades, sin limitación, se logró también el espaciamiento de peso molecular deseable uniendo, según se deseara, moléculas espaciadoras en el extremo 5' de iniciadores MassEXTEND (véase, por ejemplo, los cuadros 1 B y 1 D), los iniciadores internos usados para el procedimiento usado de prueba espectroscópica de masa [8]. Esto logra el espaciamiento deseable de las secuencias de iniciador sin que se hagan cambios importantes en la longitud del iniciador que afectarían la condición de PCR, manteniendo de esta manera condiciones de PCR óptimas para todas las series de iniciadores en condiciones uniformes para optimizar la PCR. Considerados en conjunto, los procedimientos del uso de desoxiinosina y modificadores, dan una serie de iniciadores adaptados para este procedimiento, como se usan en algunas modalidades. En algunas modalidades, las secuencias se eligieron de modo que no hubiera traslape de peso molecular menor de aproximadamente 20 nucleótidos entre las secuencias que corresponden al iniciador no extendido, el gen de tipo silvestre y el competidor interno para cada uno de los 19 tipos diferentes de HPV. Se añadieron también sondas para Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae, de modo que al final esta técnica puede detectar y cuantificar 19 tipos de HPV, un estándar que indica cuánto ADN genómico está siendo analizado, y un determinante para infección por Chlamydia o Neisseria gonorrhoeae. En conjunto, dicho sistema discriminará cada uno de los 3 x 22 = 66 picos diferentes (los picos distinguidos por espectroscopia de masa fueron iniciador no extendido; iniciador no extendido + secuencia del gen de tipo silvestre (iniciador no extendido + cualquiera de una C o G, dependiendo del siguiente nucleótido del gen); e ¡niciador no extendido más secuencia del competidor interno (iniciador no extendido más cualquiera de una G o C, dependiendo del siguiente nucleótido del competidor). Esta distinciones se basaron en la capacidad del método basado en espectrometría de masa, para distinguir una separación de aproximadamente 20 daltons entre 2 pesos moleculares. La figura 1 describe los resultados del perfil de una selección por prueba espectroscópica de masa de conformidad con la invención, para los 13 tipos de HPV patogénicos que se seleccionan para la prueba de Digene [1] (HPV 16, HPV 18, HPV 31 , HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51 , HPV 52, HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 68). Se muestran los 13 picos diferentes que corresponden a los pesos moleculares del iniciador MassEXTEND [16] para cada uno de los 13 tipos de HPV distintos de alto riesgo (HPV 16, 18, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 56, 58, 59 y 68 [3]). Las líneas sin picos denotan en dónde los competidores MassEXTEND y los productos génicos mapearían (representando un total potencial de 3 x 13 = 39 picos no traslapantes; por simplicidad, sólo se muestran los 13 picos no extendidos). La figura 1 ilustra la capacidad de la invención para detectar y distinguir una variedad de secuencias de ADN del HPV. En algunas modalidades, se usó una serie adecuada de iniciadores externos y una secuencia MassExtend de iniciador no extendido adecuada (de aproximadamente 20 nucleótídos) para cada secuencia de E6 del HPV de aproximadamente 100 nucleótídos, para el estándar de ADN genómico, para Chlamydia trachomatis y para Neisseria gonorrhoeae. Se sintetizó un oligonucleótido que corresponde a cada una de las secuencias de aproximadamente 100 nucleótidos, con una base cambiada (una C por una G, o una G por una C). La síntesis se hizo, por ejemplo, usando un sintetizador de oligonucleótidos disponible comercialmente (por ejemplo, el servicio otorgado por Integrated DNA Technologies (IDT)). Se sintetizaron oligonucleótidos de aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, usando secuencias que corresponden a la secuencia del competidor interno para cada uno de los 19 tipos de HPV diferentes, el estándar de ADN genómico, Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae. Para cada una de las 22 secuencias, se sintetizaron iniciadores de aproximadamente 20 nucleótidos (a los cuales se añadieron marcadores para eliminar la interferencia con el perfil espectroscópico de masa mostrado en la figura 1 ), que corresponden a los extremos derecho e izquierdo de estos oligonucleótidos de aproximadamente 100 nucleótidos de longitud. Por último, se sintetizó un iniciador de extensión para prueba espectroscópica de masa que comprende una secuencia que colinda directamente con una C o G (en cuyo caso el competidor interno resultó en la incorporación de una G o C, respectivamente, que fue posible distinguir la secuencia del gen de tipo silvestre de la secuencia del competidor interno) usando esta diferencia de nucleótidos. En algunas modalidades, las secuencias del iniciador son idénticas para las secuencias del gen de tipo silvestre y el competidor interno. La única diferencia entre la secuencia del gen de tipo silvestre y el competidor interno, es el único nucleótido adyacente a la secuencia del iniciador no extendido. Dada esta identidad de secuencia, tanto la secuencia del gen de tipo silvestre como el competidor interno amplifican con la misma eficiencia.

Como resultado, puede usarse en la invención la amplificación de una cantidad conocida del competidor interno para cuantificar la cantidad de la secuencia del gen de tipo silvestre que se amplifica. En algunas modalidades, sin limitación, los iniciadores no extendidos, iniciadores no extendidos + guanosina y los iniciadores no extendidos + citosina (3 x 22 iniciadores = 66 iniciadores en total), deben ajustarse en un espacio de peso molecular entre aproximadamente 5000 y aproximadamente 8500 daltons, y deben estar separados por una distancia mínima de aproximadamente 20 daltons. Al mismo tiempo, la longitud de los iniciadores se constriñe por el requisito de que se unen y funcionan como moldes dentro de una pequeña escala de temperatura, de modo que todas darán amplificación a la misma temperatura. Para lograr estos propósitos, se desarrolló la estrategia novedosa de unir varias moléculas espaciadoras inertes al extremo 5' del iniciador no extendido. Para algunas modalidades, sin limitación, los iniciadores de amplificación usados para la primera amplificación por PCR se dan en el cuadro 1A. Los iniciadores usados para la extensión mediada por PCR se dan en el cuadro 1 B. Las secuencias de los competidores se dan en el cuadro 1C. Los espaciadores usados se detallan en el cuadro 1 D. Se dan las secuencias del iniciador para los tipos de HPV 16, 18, 23, 26, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 y 82. Se incluye también una medida de la entrada total de ADN genómico usando un intrón del gen erbB-2, y sondas para 2 infecciones de importancia ginecológica (Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae). Las secuencias del iniciador se han puesto a prueba, y se encuentra que son operacionales. Como resultado, la invención comprende seleccionar simultáneamente para 19 tipos de HPV, una medida del ADN genómico total, y pruebas para infección por Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae. La metodología de esta modalidad puede usarse inconsútilmente con otros aspectos de la invención descritos en la presente, para determinar el tipo y la cantidad de HPV presente en suero y/o sangre incluyendo, pero no limitado a, debido a tumorigénesis. Puesto que la técnica de selección de suero y/o sangre es máximamente sensible cuando se selecciona la sonda de elección de HPV, la selección del tumor y/o ThínPreps puede usarse para determinar si el HPV está presente, y si es así, qué tipo de HPV. Ese tipo de HPV se usa entonces para seleccionar sangre y/o suero con eficiencia máxima; si varios tipos de HPV están presentes, cada tipo puede seleccionarse individualmente. El éxito de esta modalidad de la invención usa la presencia de HPV en tumor o ThinPreps a concentraciones mayores que en suero y/o sangre. Una vez que se determina el tipo de HPV, el suero y/o la sangre puede seleccionarse entonces con sensibilidad máxima para el tipo de HPV presente en el tumor. Como se discutió anteriormente, la prueba de Digene no revela qué tipo de HPV se encuentra en la ThinPrep de cerviz. Esto llega a ser importante, ya que la invención como se aplica a suero y/o sangre en algunas modalidades, es más sensible cuando sólo se selecciona para un tipo de HPV patogénico individual conocido, más que una selección general para los 13 tipos de HPV patogénicos. Dado que existe con frecuencia muy poco ADN del HPV presente en suero y sangre de casos de cáncer y displasia, el usuario puede preferir hacer esta selección con sólo una sonda de HPV al momento de incrementar la sensibilidad, incluso con el análisis por prueba espectroscópica de masa sensible de la invención [3]. Sin limitación, algunas modalidades preferidas de la invención consignan deficiencias de la reacción de Digene: 1. Comprendiendo una aplicación de las capacidades múltiples de la selección por prueba espectroscópica de masa; 2. Ocurre diagnóstico preciso sin reacción cruzada a partir de secuencias de HPV relacionadas debido a que el peso molecular de cada producto de reacción específico del tipo de HPV es preciso a ± aproximadamente 20 daltons, de modo que es específico para la secuencia de un tipo de HPV determinado. De hecho, la prueba espectroscópica de masa de la invención distingue cada uno de los 13 tipos de HPV patogénicos detectables por la selección de Digene, sin reacción cruzada con otros virus del papiloma humano (figura 1 ); 3. La prueba espectroscópica de masa de la invención es positiva hacia abajo hasta el nivel de moléculas individuales (a cuyo nivel puede verse variación poissoniana esperada); y 4. La reacción de la prueba espectroscópica de masa de la invención distingue qué tipo de HPV está presente en la ThínPrep de cerviz.

Puesto que la técnica de selección de suero y/o sangre es máximamente sensible cuando se selecciona la sonda de HPV de elección, la selección de tumor y/o ThinPreps se usa para determinar si el HPV está presente, y si es así, qué tipo de HPV. Ese tipo de HPV específico se usa entonces para seleccionar sangre y/o suero con eficiencia máxima. El éxito de esta selección usa la presencia del HPV en ThinPreps de raspados de cerviz o en tumores a concentraciones mayores que en suero y/o sangre. Una vez que se determina el tipo de HPV en la ThinPrep o el tumor, el suero y/o la sangre puede seleccionarse entonces con sensibilidad máxima para el tipo de HPV presente en el tumor. En algunas modalidades preferidas, sin limitación, en una segunda etapa (etapa 2) de la invención, una vez que se identifica un tipo de HPV, se seleccionan fluidos corporales (tales como suero y sangre) o tumor recurrente o ThinPreps de repetición, con el tipo de HPV indicado determinado en la etapa 1. Estos estudios pueden llevarse a cabo longitudinalmente para determinar si el tipo y la persistencia del HPV tienen usos de pronóstico, sólo como un ejemplo y sin limitación, para determinar si está presente tumor residual en un individuo previamente tratado por el trastorno. Sin la invención, dichas investigaciones no fueron posibles debido a que los análisis del HPV en suero y/o sangre no fueron suficientemente sensibles o específicos [3], aún cuando los análisis se llevaron a cabo con la tecnología TaqMan. En contraste, los estudios actuales que usan la invención demuestran la viabilidad de los estudios de suero y sangre con la técnica de prueba espectroscópica de masa específica y sensible de la invención. Como otro ejemplo, sin limitación, en algunas modalidades que comprenden el sistema de prueba espectroscópíca de masa, se detectó ADN del HPV 16 en los 24 tumores de vejiga asociados con esquistosomiasis a partir de los cuales se preparó ADN (lado derecho del cuadro 3). En todas estas muestras, salvo una, los sueros de comparación fueron también positivos. En otros 3 casos para los cuales no estuvo disponible ADN del tumor, los sueros fueron positivos para ADN del HPV 16. Se detectó ADN del HPV 16 en el sedimento de la orina de la mayoría, pero no todos los casos, de cáncer de vejiga asociado con esquistosomiasis. Estos datos implican a la infección por el HPV 16 en cánceres de vejiga asociados con esquistosomiasis. Por comparación, la QPRC TaqMan en tiempo real no fue tan sensible (lado izquierdo del cuadro 3) como el análisis por prueba espectroscópica de masa de algunas modalidades (lado derecho del cuadro 3). La sangre (cubierta amarilla) de estos casos fue uniformemente negativa por QPCR en tiempo real y prueba espectroscópíca de masa (datos no mostrados). Las lecturas anormales que documentan la presencia de ADN del HPV están en negritas. Attomolar (aM) = 10"18 M; femtomolar (fM) = 10"15 M; con los volúmenes de 5 µl que se usaron para la PCR, 1 aM corresponde a aproximadamente 3 moléculas. La comparación de los resultados de la prueba espectroscópica de masa de la invención (lado derecho del cuadro 3) con datos de hibridación in situ previos [10] y datos de TaqMan para un estándar de 40 ciclos (lado izquierdo del cuadro 3), muestra que la invención es más sensible que la hibridación in situ o la QPCR TaqMan. La falta de reproducibilidad de los datos del lado izquierdo del cuadro 3 (datos no mostrados), indica que la técnica TaqMan está operando en los límites de su sensibilidad, y que no es precisa. Además, la técnica TaqMan no distingue cuantitativamente entre tumores, suero y sedimento de la orina. Se intentaron también RT-QPCR TaqMan por 55 cíelos para reflejar el método de prueba espectroscópica de masa de algunas modalidades. No se observó mejora alguna entre la señal y el ruido, subrayando las limitaciones de la técnica TaqMan. En contraste, los valores en el lado derecho del cuadro 3 que se derivan de la invención, son consistentes con el hallazgo esperado de que los tumores son más sensibles que el suero y/o el sedimento de la orina. En este ejemplo, se mantuvieron especificidad y sensibilidad en una modalidad de prueba espectroscópica de masa de la invención. Mediante el uso de la invención, se detectó ADN del HPV 16 en todos los tumores de vejiga asociados con esquistosomiasis que se examinaron (24 de 24), en casi todos los sueros (26 de 27) de estos casos, y en una mayoría (15 de 24) de sedimentos de la orina de estos casos. La sangre de estos casos no contuvo ADN del HPV detectable (datos no mostrados). En ejemplos relacionados, se mostró que la presencia de ADN del HPV no se debe simplemente a esquistosomiasis. Se examinaron 10 casos en donde existió esquistosomiasis, y hubo alguna cuestión del cáncer ce vejiga que no pudo demostrarse clínicamente. En 8 de los casos, no hubo ADN del HPV 16 o HPV 18 presente en el suero; en 2 de los casos, se encontró ADN del HPV 16. Esto demuestra que el ADN del HPV no está asociado con esquistosomiasis per se, sino más bien con el desarrollo de tumores en casos de esquistosomiasis con cáncer de vejiga. Ilustra también el uso de la invención para facilitar el diagnóstico en casos equívocos, en donde los datos clínicos son sugestivos pero no concluyentes. Se mostró también que el ADN del HPV 16 en suero desaparece rápidamente después de la remoción del tumor. Los sueros de 7 sujetos con esquistosomiasis se examinaron dentro de 2 semanas después de la remoción quirúrgica de una vejiga cancerosa. En los 7 casos, no se detectó ADN del HPV 16 en el suero. Aunque no estaban disponibles sueros antes de la cirugía, la naturaleza positiva uniforme de los tumores para el HPV 16 (cuadro 3) indica que el HPV estaba probablemente presente, y que fue erradicado entonces por medio de cirugía. Se investigó también sí estaba presente ADN del HPV en muestras comparadas de tumor, sangre y suero obtenidas al momento del diagnóstico de cáncer de cabeza y cuello. Para cada muestra, se da el sitio del tumor primario. Se intentó también análisis con QPCR fluorescente TaqMan, pero no detectó ADN del HPV en suero y sangre, de acuerdo con el hallazgo por otros de que la técnica TaqMan no es suficientemente sensible para ser clínicamente útil [3, 21]. En contraste, el análisis por prueba espectroscópica de masa de conformidad con la invención dio los datos resumidos en el cuadro 4. Las lecturas que documentan la presencia de ADN del HPV 16 están en negritas. Se aislaron tumor, suero y sangre de casos de cánceres de cabeza y cuello (no todos los tipos de muestra están disponibles para todos los sujetos; la falta de una muestra se denota por medio de un espacio en blanco). Se hizo la determinación del ADN del HPV 16 por medio de prueba espectroscópica de masa en estas muestras de tumor, sangre y suero; ninguna de estas muestras fue positiva con la sonda de ADN del HPV 18, aunque otra muestra de tumor de cabeza y cuello en la cual se hizo la secuenciación del ADN, fue positiva para ADN del HPV 18. Las lecturas anormales que documentan la presencia de ADN del HPV están en negritas. Attomolar (aM) = 10"18 M; femtomolar (fM) = 10~15 M. Hubo una fuerte propensión para que los tumores en las partes anteriores del tracto de la cabeza y cuello (por ejemplo, lengua, amígdala) sean positivos para el HPV, y para que los tumores en las partes posteriores (por ejemplo, laringe, región supraglótica) sean negativos. Esto es consistente con reportes previos [22-29]. Se vieron sólo 3 tumores orales (de 16) que fueron negativos para ADN del HPV 16 y ADN del HPV 18 (los tumores orales negativos podrían ser positivos aún para otros tipos de HPV). Se vio sólo 1 tumor de 10 (el tumor hipofaríngeo) que fue posterior a la cavidad oral, y fue positivo para el HPV 16. A partir de las 9 muestras en donde el tumor fue positivo y pudieron analizarse el suero y la sangre, hubo casos en donde el tumor fue positivo para ADN del HPV 16 en el cual el ADN del HPV se discernió sólo en el suero, sólo en la sangre o en el suero y la sangre. El cáncer cervical está asociado casi uniformemente con el HPV [16, 22]. Mediante el uso de una prueba espectroscópica de masa de conformidad con la invención para las 13 secuencias del virus del papiloma humano (HPV) de alto riesgo en displasias y tumores cervicales, se vio que: 1. Virtualmente todos los tumores tuvieron evidencia de uno de los 13 tipos de HPV patogénicos, disminuyendo continuamente hasta cero la cantidad del tipo de HPV patogénico. Se observó HPV no patogénico en displasias, pero estuvo esencialmente ausente en tumores, apoyando el concepto de que un grupo restringido de tipos de HPV es responsable de la carcinogénesis cervical. La capacidad única de la prueba espectroscópica de masa para detectar hacia abajo hasta el nivel de pocos virus, permitió detectar tipos de HPV patológicos incluso a niveles minúsculos no feasibles por otros métodos; 2. En tumores cervicales, los títulos del HPV fueron habitualmente menores de 1 molécula de HPV/genoma haploide del tumor, varios órdenes de magnitud menores que en los valores más altos vistos en las displasias. Esto es consistente con un modelo de "pega y corre", por el cual la infección por el HPV es necesaria para el crecimiento de las displasias, pero no suficiente para la oncogénesis; 3. Virtualmente, todas las displasias cervicales patológicamente normales (CIN 1 o 2) exhibieron uno de los 13 tipos de HPV patogénico. Se vieron con frecuencia tipos múltiples de HPV patogénico a diferentes títulos. Estas infecciones múltiples con HPV patogénico fueron más comunes en las displasias patológicamente anormales que en los tumores (72% contra 17%). Además, mediante el uso de otras metodologías, se detectaron con frecuencia otros tipos de HPV presentes a títulos mayores en las displasias. Sin embargo, no se detectaron estos tipos en tumores, demostrando que la tumorigénesis resulta de una serie restringida de tipos de HPV que son cubiertos por la prueba espectroscópica de masa; y 4. La detección de otros tipos de HPV por medio del método HC2 de Digene comúnmente usado clínicamente, es responsable de los falsos positivos que resultan de esta prueba. La prueba espectroscópica de masa mitiga este problema. Los métodos comunes para detectar enfermedad cervical, dependen de dos tecnologías principales: 1. Detección de anormalidades citológicas de células cervicales exfoliadas, el frotis de 'Pap' desarrollado por el Dr. G. N. Papanicolaou [30]; y 2. Detección de infección por el HPV [1 ]. Los principales inconvenientes de la citología, son la confiabilidad problemática entre los observadores, sensibilidad limitada (<85%) y la dependencia de individuos altamente entrenados para realizar las pruebas [30, 31]. Por supuesto, es sólo mediante una selección repetitiva que la sensibilidad de los frotis Pap se considera como adecuada para propósitos clínicos. Por consiguiente, la pérdida de individuos para el seguimiento regular y la incapacidad de usos incluso repetidos de la prueba de Pap citológica para detectar a todos los individuos con anormalidades cervicales, contribuyen a la incidencia de cáncer cervical en poblaciones seleccionadas. Una alternativa a los métodos citológicos, es lograr la detección directa del HPV, una causa necesaria de virtualmente todos los carcinomas cervicales [1 , 5, 32]. El HPV es detectado comúnmente por medio de la prueba HC2™ aprobada por la FDA (Digene Corporation, Gaithersburg, MD) [1], que usa un coctel de sondas de hibridación específicas de tipo que detectan 13 tipos de HPV de alto riesgo asociados con PCR para malignidades cervicales, usando oligonucleótídos degenerados [15, 33, 34] o una serie de pruebas de diagnóstico por Roche [35] que detectan y tipifican entonces la forma de HPV que está presente [1]. Los inconvenientes principales para estos métodos, son sensibilidad, especificidad y capacidades cuantitativas limitadas. La sensibilidad es limitada, ya que se requiere que aproximadamente 102-103 moléculas sean detectadas por medio de estas pruebas [1 , 13]. La especificidad es limitada, debido a la reacción cruzada de HC2 con cepas del HPV no de alto riesgo, aproximadamente 10% del tiempo debido a la reacción cruzada con cepas del HPV no de alto riesgo [2] [2, 36]. Además, la prueba HC2 no permite fácil autorización para cuantificación precisa. La diferenciación cuantitativa por HC2 es limitada, ya que la normalización para el contenido celular total se hace raramente, la variabilidad de la prueba es limitada, y no es posible cuantíficar qué tipos de HPV son responsables de una señal observada cuando están presentes secuencias del HPV múltiples. El uso de la serie de técnicas de Roche para abordar estas limitaciones, requiere tipos de pruebas múltiples que hacen que el reconocimiento sea más difícil de lograr. Debido a estas dificultades, la cuantificación es intrincada, y rara vez se realiza. En contraste, se describe una invención que comprende un procedimiento basado en prueba espectroscópica de masa para monitorear displasia cervical, por el cual la discriminación y cuantificación específica del tipo de HPV cervical puede acoplarse finalmente a la prueba de sangre y suero. En algunos de los trabajos, se usaron los mismos 13 tipos de HPV detectados en el método HC2 aprobado por la FDA para cepas de alto riesgo (HPV 16, 18, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 56, 58, 59 y 68) [1]. Los pesos moleculares y las secuencias del iniciador, y las secuencias del competidor, se dan en el cuadro 2. Mediante el uso de la prueba espectroscópica de masa de algunas modalidades, se vio una ausencia completa adecuada del HPV en 35 muestras control de sangre cuando se investigó con sondas para trece (13) tipos de HPV (datos no mostrados). Esto demuestra que esta técnica altamente sensible no genera un antecedente de falsos positivos. Varios puntos emergerán de los datos obtenidos: primero, se observaron muestras, cada una con únicamente los 13 tipos de HPV patogénicos, de modo que no existe reacción cruzada entre los tipos de HPV en la prueba espectroscópica de masa. Apoyando este punto, no hubo tipo de HPV consistente presente con otro tipo de HPV cuando estuvieron presentes tipos múltiples. Segundo, la prueba espectroscópica de masa logra sensibilidad al nivel de moléculas individuales, confirmada por variación poissoniana observada a estos niveles más bajos. Tercero, la infección por HPV múltiple con estos 13 tipos, es más común en displasias con CIN l/ll (72% = 70 de 97) que en lesiones positivas para HC2 (32% = 36 de 113) que en tumores (17% = 13 de 78). Cuarto, los títulos virales por célula son mayores en las displasias que en los tumores (los valores para los tumores indican uniformemente menos de una copia de HPV por equivalente de genoma haploide (figura 3A), mientras que los valores varían a través de aproximadamente 103 copias de HPV por equivalente de genoma haploide en displasias positivas para Pap (figura 3B) y 104 copias de HPV por equivalente de genoma haploíde en dísplasias positivas para HC2 (figura 3C)). De esta manera, los valores medios de la secuencia de HPV más abundante para una muestra, fueron aproximadamente 8.4 x 10° para las muestras positivas para HC2, aproximadamente 3.0 x 10"1 para las muestras de CIN l/ll, y aproximadamente 2.9 x 10"2 para los tumores. De esta manera, los títulos de HPV medios son uno a dos órdenes de magnitud menores en los tumores que en las displasias. Por comparación, la mayoría de las muestras de mujeres con frotis de Pap normales no tuvieron HPV, o sólo tuvieron bajos títulos de HPV (figura 3D). Quinto, uno de los 13 tipos de HPV patogénicos estuvo presente en virtualmente todos los tumores cervicales (81 de 82; cuadro 5). En todos los casos, las cantidades de HPV patogénico variaron continuamente hacía abajo hasta cero copías/genoma haploide. Esto incluyó las muestras de tumor para las cuales sólo la prueba espectroscópica de masa fue suficientemente sensible para detectar los tipos de HPV a los títulos más bajos. Se detectaron cantidades muy bajas (hacia abajo hasta aproximadamente 1 aM = moléculas individuales) de HPV por medio de prueba espectroscópica de masa, que no fue posible detectarlas con otras técnicas menos sensibles. El hallazgo de que virtualmente todos los tumores tenían uno de los 13 tipos de HPV patogénicos, se confirmó por medio de secuenciación de ADN iniciada con un iniciador degenerado como se describe en la sección de materiales y métodos (cuadro 5). Salvo por fallas de la secuenciación de ADN debidas a un número insuficiente de moléculas disponibles para la secuenciación del ADN, se confirmaron habitualmente los resultados de la prueba espectroscópica de masa, de que los tipos de HPV asociados fueron uno de los 13 tipos de HPV de alto riesgo. Hubo concordancia excelente entre los tipos de HPV detectados por medio de la prueba espectroscópica de masa y los tipos detectados por la secuenciación degenerada del ADN. Hubo unos cuantos desacuerdos que pueden esperarse, puesto que las dos técnicas tienen objetivos diferentes y de esta manera divergen. En un caso con un resultado de prueba espectroscópica de masa de sólo aproximadamente 2 aM para el HPV 31 , la secuenciación del ADN detectó el HPV 73, un tipo no visto en los 13 tipos de HPV patogénicos (pero el cual está en la selección más nueva para los 19 tipos de HPV). De esta manera, este tumor tuvo ambos tipos de HPV, con el HPV 31 patogénico abajo de la capacidad de detección de la secuenciación de ADN. Hubo otros tres casos de discordancia entre la prueba espectroscópica de masa y los resultados de la secuenciación del ADN, pero en cada caso sólo los tipos de HPV que pertenecen al grupo de los 13 tipos patogénicos, fueron identificados por medio de la secuenciación del ADN.

Prueba espectroscópica de masa, blotting en línea inversa y secuenciación de ADN degenerada en displasias cervicales patológicas. Se compararon los resultados de la prueba espectroscópica de masa con el blotting en línea inversa [12] para muestras patológicamente anormales que se determinó tienen displasia representada en neoplasia intraepitelial cervical CIN I o CIN II. Para 49 muestras, cuando la técnica de prueba espectroscópica de masa demostró la presencia de uno de los 13 tipos de HPV patogénicos a una concentración de por lo menos aproximadamente 40 aM, hubo acuerdo completo entre la prueba espectroscópica de masa y el blotting en línea inversa (datos no mostrados). Sin embargo, a menores cantidades de HPV, esta concordancia desapareció (cuadro 6). El análisis por prueba espectroscópica de masa detectó consistentemente uno de los 13 tipos de HPV patogénicos a cantidades menores de aproximadamente 40 aM, en donde la secuenciación del ADN y el método de blotting en línea inversa fallaron para detectar alguno de los 13 tipos de HPV altamente patogénicos, o para detectar otro tipo de HPV (cuadro 6). Se confirmó este resultado por secuenciación de ADN degenerada que mostró el tipo de HPV visto por medio de blottíng en línea inversa o un tipo de HPV no patogénico diferente (el espectro de tipos de HPV detectados por blotting en línea inversa y secuenciación del ADN sólo se traslapa parcialmente, explicando por qué estas dos técnicas pueden dar respuestas diferentes; sin embargo, ambas técnicas funcionarán para los 13 tipos de HPV patogénicos (salvo para el HPV 52 que no se amplifica bien usando el método de secuencíación degenerada). Nótese que este resultado de bajos títulos que no puede apreciarse por medio de otros métodos menos sensibles, difiere de las muestras de sangre control (sin HPV presente) o muestras negativas para Pap (sin HPV presente en la vasta mayoría de las muestras (figura 3D)). Esto arguye fuertemente para la significancia de estos bajos títulos previamente no apreciados de HPV patogénico que probablemente representan las trazas esfumadas de una infección por HPV que fue previamente significante, pero que está ahora moribunda. Esto es consistente con la observación de que la mayoría de las infecciones por HPV son depuradas después de 6 meses a 2 años. En conjunto, esto apoya la importancia de obtener títulos longitudinales que pueden prevenir muchos procedimientos quirúrgicos diseñados para extirpar lesiones que habrían sido autolimitadas, si fuera posible seguirlas longitudinalmente.

Prueba espectroscópica de masa, blotting en línea inversa y secuenciación de ADN degenerada en displasias positivas para HC2. Como con las muestras de displasia cervical patológicamente anormales, la prueba espectroscópica de masa es más sensible que las pruebas de blotting en línea inversa, secuenciación de ADN degenerada o HC2. Hubo acuerdo excelente entre la prueba espectroscópica de masa y el método de blotting en línea inversa, cuando hubo por lo menos aproximadamente 50 copias de un tipo de HPV patogénico discernido, entre la prueba espectroscópica de masa y el método de secuenciación de ADN degenerada cuando hubo por lo menos aproximadamente 500 copias de un tipo de HPV patogénico discernido, y entre HC2 y la prueba espectroscópica de masa cuando hubo por lo menos aproximadamente 5000 copias de un tipo de HPV patogénico discernido. Se observó buen acuerdo entre las tres técnicas en estos casos entre 98 de 125 muestras positivas para HC2 analizadas por medio de prueba espectroscópica de masa, con más de aproximadamente 5000 copias (cuadro 7). En los 27 de 125 casos positivos para HC2 restantes, con títulos de HPV patogénico menores de aproximadamente 5000 copias, el blotting en línea inversa y/o los métodos de secuenciación de ADN degenerada detectaron tipos de HPV diferentes de los 13 tipos altamente patogénicos detectados por medio de la prueba espectroscópica de masa (cuadro 8). Es probable que estos contengan la fracción significante de displasías identificadas por medio de HC2 que son falsos positivos [2, 36]. Las muestras sin HPV detectado por secuenciación de ADN, pudieron consistir de muestras que contenían tipos múltiples de HPV con concentraciones similares que previenen la obtención de una secuencia de ADN de un tipo de HPV individual, muestras que contienen tipos de HPV que divergen demasiado de los iniciadores para amplificar con los iniciadores degenerados, y/o muestras que no contienen suficiente HPV para dar amplificación.

En 17 de 18 casos en donde un tumor cervical tuvo ADN del HPV 16 detectable, se encontró que el suero y/o la sangre tuvieron también ADN del HPV 16 detectable. No se detectó ADN del HPV 16 ni ADN del HPV 18 en el suero y/o la sangre en ninguno de los 3 casos en donde el tumor fue negativo para el ADN del HPV 16 y el ADN del HPV 18. Como se había observado en los cánceres de cabeza y cuello, los resultados de sangre y suero difirieron en muchos de los casos de cáncer cervical. De las 18 muestras que fueron positivas en el tumor: 8 fueron positivas en suero y sangre; 5 fueron positivas en suero pero no en sangre; 4 fueron positivas en sangre pero no en suero; y 1 fue negativa en suero y sangre. Muestras de suero y sangre de mujeres con displasia cervical, se examinaron entonces de conformidad con la invención. Ninguna de estas mujeres tuvo ADN del HPV detectable en su suero o sangre por medio de análisis TaqMan con la sonda degenerada. En contraste, el análisis por prueba espectroscópica de masa que comprendía algunas modalidades, detectó pequeñas cantidades de ADN del HPV 16 en suero y/o sangre de un subgrupo de individuos con cáncer cervical (cuadro 9) o displasia de alto grado (cuadro 10). Cuatro de cinco casos con displasia cervical de alto grado fueron positivos para ADN del HPV 16. Se detectó también ADN del HPV 16 en el suero de un individuo con células escamosas atípicas de significancia incierta, y en otro sujeto con un diagnóstico de neoplasia intraepitelial vulvar de grado I y displasia cervical de bajo grado. No se observó ADN del HPV 16 en el suero o la sangre de individuos que no tuvieron lesiones activas.

Además, las pruebas espectroscópicas de masa para el ADN del HPV 16 en suero o sangre fueron siempre negativas después de la remoción exitosa de la displasia previa de alto grado o del cáncer in situ (casos 4, 5, 6, 15, 16, 17, 22, 24, 27, 44). No estuvieron disponibles muestras antes de la remoción de la displasia en estos casos. El único sujeto (caso 1 ) que tuvo displasia cervical de alto grado sin ADN del HPV en suero o sangre, pudo haber tenido un tipo de HPV diferente de las sondas del HPV 16 o HPV 18 que se usaron en esa ocasión. Se extendieron entonces estos hallazgos para asegurar que pudieran discernirse los tipos de HPV diferentes del HPV 16 ó 18 en sangre y/o suero de individuos con displasias cervicales. Como se muestra en el cuadro 11 , una fracción apreciable de las muestras de sangre y/o suero fue positiva para el HPV cuando el virus estuvo presente en una displasia cervical. Esto incluyó varios casos en donde los tipos de HPV fueron diferentes del HPV 16 ó 18. Esto subraya la utilidad clínica potencial del monitoreo de la sangre y/o el suero con técnicas altamente sensibles que pueden detectar hacia abajo hasta el nivel de moléculas individuales. Esto ilustra la utilidad de la prueba espectroscópica de masa sensible, específica y cuantitativa que comprende algunas modalidades de la invención, sin que se limite el alcance de las modalidades posibles. El trabajo demuestra los puntos importantes de que existe menos HPV presente en los tumores que en la displasia, y de que pequeñas cantidades de HPV patogénico están presentes en muchos tumores y displasias en donde ni el HPV está presente ni otros tipos de HPV menos patogénicos o no patogénicos pueden estar presentes. En particular, el hallazgo de HPV patogénico en esencialmente todos los tumores, con las cantidades disminuyendo continuamente hasta cero, apoya la hipótesis de que existe una serie restringida de tipos de HPV patogénicos, siendo muy bajo el riesgo de que otro tipo de HPV cause un tumor. Por último, es sólo por medio de la aplicación de esta técnica sensible, que se han apreciado títulos muy bajos de HPV en sangre y/o suero. Puesto que este hallazgo ocurre solamente en personas con dísplasias o cánceres, y desaparece tras la remoción de una displasia, esto debe representar una forma excelente de detectar estas lesiones y/o de monitorear la eficacia terapéutica de las técnicas para remover estas lesiones. Sin limitación, de conformidad con algunas modalidades de la invención, el desarrollo técnico para lograr discernimiento a este nivel de HPV, incluye la capacidad para detectar secuencias de HPV no abundantes en una forma altamente sensible y específica. De esta manera, la invención comprende por primera vez la capacidad y utilidad para lograr la sensibilidad y especificidad necesarias para diagnosticar copias de HPV individuales. De esta manera, la invención comprende sistemas, composiciones y/o métodos para lograr este nivel de sensibilidad y especificidad, y permite la detección de eventos que hasta ahora no pudieron haber sido apreciados, incluyendo los hallazgos de que la displasia cervical está asociada con HPV detectable en la sangre y/o el suero, mientras que la normalidad no está asociada con HPV detectable en la sangre y/o el suero. Esto evita el uso de tecnología TaqMan inadecuada que da falsos positivos [4] y falsos negativos frecuentes (por resultados no publicados de los inventores), si se va a detectar HPV en suero. Otra ventaja de la invención, es que es cuantitativa así como sensible y específica, de modo que permite la determinación de la carga de tumores, con tumores más grandes o más agresivos estando presumiblemente asociados con mayores cargas de HPV reflejadas en mayores niveles en muestras cervicales (después de normalización para ADN total) [7], suero y/o sangre. Además, existe probablemente el beneficio clínico de que se determine si el suero y/o la sangre son afectados. Por ejemplo, los tumores que sufren difusión hematógena están probablemente asociados con su presencia incrementada en sangre, mientras que los tumores que sufren lísis incrementada están probablemente asociados con su presencia incrementada en suero. En suma, la tecnología de prueba espectroscópíca de masa fue más sensible, al mismo tiempo de que proveyó especificidad completa. Esta utilidad se extenderá a los miembros de poblaciones en riesgo de desarrollar estos tumores, y a los individuos en quienes se diagnosticó un tumor previo y están comúnmente bajo observación. Sin limitación, las modalidades preferidas de la invención comprenden sistemas, métodos y composiciones para detectar los cánceres descritos en la presente en pacientes humanos, obteniendo una muestra biológica del paciente, por ejemplo y sin limitación, muestras de suero, sangre u orina, y combinaciones de dos o más de las mismas, detectando el número de copias del genoma del HPV en las muestras de acuerdo a técnicas que incluyen sin limitación, las descritas en la presente, que tienen sensibilidades de detección abajo de cualquier prueba aprobada comúnmente, tales como la prueba de Digene, y calculando el número de copias del genoma del HPV en un volumen conocido u otra medida de concentración de la muestra, en donde la presencia del HPV en la muestra, tan baja como al nivel de una sola copia, es indicativa de cáncer en el paciente como se enseña mediante la invención. Sólo como un ejemplo, y sin limitación, mientras que la prueba de Digene no permite la detección abajo de 5000 copias por muestra de suero, la presente invención comprende una capacidad de detección abajo de los niveles de una sola copia. La invención comprende sistemas, composiciones y/o métodos que logran la detección a un nivel muy sensible que permite hacer las observaciones descritas en la presente que no fueron previamente posibles. De esta manera, la invención comprendió el hallazgo de que pequeñas cantidades del HPV en fluidos corporales están asociadas con cáncer o displasia, que pueden eliminarse entonces por remoción del tumor o la displasia. Por supuesto, el hallazgo de que la displasia cervical da anormalidades detectables en suero y sangre, pero que el suero y la sangre de controles normales son negativos, es completamente novedoso. De conformidad con la invención, la determinación de que la sangre es útil para tumores cervicales y de cabeza y cuello es también novedosa, ya que reclamaciones previas han usado selecciones de sangre por medio de técnicas que no fueron bastante sensibles para prevenir falsos negativos, y/o cuya especificidad no fue bastante grande para prevenir falsos positivos. Los esfuerzos previos por detectar el HPV en suero, usaron técnicas que no fueron suficientemente sensibles y/o específicas. Mediante el uso de la prueba espectroscópica de masa más sensible y específica de la invención, puede detectarse ahora el HPV en una alta fracción de tumores de vejiga asociados con esquistosomiasis, así como de tumores cervicales y de cabeza y/o cuello que están asociados con niveles de HPV en suero finitos y mensurables. La invención comprende el hallazgo de que puede mostrarse ahora que análisis muy sensibles y específicos del sedimento de la orina, suero y/o sangre son positivos para HPV en cáncer o displasia, cuando se usa un método de análisis suficientemente sensible y específico que detecta hacia abajo hasta el nivel de una sola copia (a pesar de los límites ineludibles impuestos por la incertidumbre inherente de la distribución de Poisson sobre números muy bajos; esto puede evitarse realizando análisis múltiples). Además, el HPV en suero y/o sangre puede detectarse en casos de displasia cervical; el HPV desaparece entonces cuando la displasia es extirpada. Considerada en conjunto, la invención permite la determinación de si un cáncer asociado con el HPV está presente en sujetos de alto riesgo o en sujetos que sufren tratamiento de displasia o cáncer. Como se expone en la presente, todas las referencias se incorporan en su totalidad en la presente como referencia.

Mientras que la presente invención se ha mostrado y descrito particularmente con relación a las modalidades preferidas y alternativas anteriores, los expertos en la técnica deben entender que varias alternativas a las modalidades de la invención descritas en la presente pueden usarse en la práctica de la invención, sin que se aparten del espíritu y alcance de la invención como se define en las siguientes reivindicaciones. Debe entenderse que esta descripción de la invención incluye todas las combinaciones novedosas y no obvias de elementos descritos en la presente, y que pueden presentarse reivindicaciones en esta solicitud o una solicitud posterior para cualquier combinación novedosa y no obvia de estos elementos. Las modalidades anteriores son ilustrativas, y ninguna característica o elemento individual es esencial para todas las combinaciones posibles que pueden ser reclamadas en esta solicitud o una solicitud posterior. En donde las reivindicaciones citan "un" o "un primer" elemento del equivalente de la misma, debe entenderse que dichas reivindicaciones incluyen la incorporación de uno o más de dichos elementos, ninguno requiriendo o excluyendo dos o más de dichos elementos. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la invención, y que los sistemas, métodos y composiciones dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes, sean abarcados por la misma.

CUADRO 1A Iniciadores para la primera amplificación por PCR (la preparación debe ser a 60°C) Longitud del producto de SECUENCIA DEL INICIADOR DELANTERO Longitud del SECUENCIA DEL INICIADOR INVERSO Longitud del PCR (nt) iniciador iniciador 102 HPV! 3 TG?A?A?CG?CG-UT CACAAC (S_.Q ID . O.1) 22 HPV1S GTTtCTCIGCGTCGTTGG?G {SEQ ID NO.2_) 20 94 HPV45 GTGCCAGAAACC?1TGAACC (SBQ ID KO.2) 20 HPV45 ?CACI GCCCICGGT?CTC-TC (SEQ LD NO .?-',) 20 100 HPV39 ?GA?CCrGCCAlACAAATtGC (SEQ tD NiO.3} 20 HPV39 TTaC?GTAGJGGTCGtCTGC (Sl-Q ID KTQ.25) 20 10. HPV59 T_r_TrTGCAAIOüGü?ACTG (SEQ ID .O. *) 20 KPV5S TTTC?GACICGCGGC.?T ACG (SEQ TD O ?fi) 2D S3 KPV56 TTAAcrccsscGGAA AAJJC (SEQ ?J> NO.5) '.9 HPV56 ?AACA?GACCCGGT'JC??C (SEQ ID NO.27) 19 .6 HPV 53 GACCACGT?C?ITGCACC?G (SF.Q ÍDKO.6) 20 HPV 53 TGCCITCnGC?G??C?G?C (SEQ ÍD NO.7.6) 20 *2 HPV51 (SEQ ID MO •/) 7.0 G-GPVS! TTCGTGGTcpTCíxrrrri-i-C: .;S_:Q n. NO ?9 ?0 104 HPV..] ?AAGTGGTGAICCGAAAACG (SEQ ID NO S) 2 [ÍPV31 lGC.\.\ TiCCG?GGICI-n C ¡SEQ ID NO 30) 20 01 102 HPV35 ACATGTC??I??CC'GI riGIG (SEQ tD NO.9) 20 HPV35 GG?CATAC-CCGACCTG ICC (SEQ lü NC.311 20 84 HPV33 QG?AAA?CCICGA?CATTOC (S=Q ID NO.10) 20 HPV3 1TGCATTCCÍCGCACTGTAG (SEQ LO NO.32) 20 87 HPV5S AGG?G?AICCACGGAO?TTG (S£Q ID NO. í 1} 20 I-EPVS8 (SUQ TD MO :?) ?0 BO HPV52 G?GG?TCC1GCAACACG?C(SEQ ID NO.12} 19 HPV52 TGCAGCCTÍATTTCATGC?C {SEQ ID NO 34) 20 10. HPV73 TCCAC_GGAI-_AGCAAAAGC(SEQ ID NO.13) 20 HPV73 CAGTTGCAGAIGG TCGCC?G (SEQ ID NU. 5) 20 10'1 HPV?/, AG??COÍCCCAG??C?CTAC (SEQ ID NO.14) 20 HPV26 CAGcccjvpG ?AG Trr ' (SRQ ID NO. 0} 20 36 HPV66 CGGAGGA?I?ACAATTC-C?C{SF.Q GD NO..5) 20 KPV?ó CCAAC?CIGCAAACATOACC {SEQ ÍD NO.57) 20 34 HPV68 AATGGCGCLATTTCAC?ACC (SEQ LD NO.1 M 20 HPV68 (SEO O.32) 20 10 HPV 16 TGC?C?G?GCIGCA?ACAAC (SEQ ID NO. i 7) 20 HrVlíi ATGCATAA AÍCCCGAA A?OC (SF.q ?r> NO. w) 20 85 HPVS2 TGCAGTCCCGTGCT?TI?CC (SEQID NO. I 8) 20 HPVS2 TCCC??A?I?C?AGGCC?TC (SEQ ID NO.10) 20 104 HPV23 TOGC OTOCITATG GGCÍG (.SEO D O. I«J) 20 HPV23 trrcc 'r?-A.GGtcG rGC (SEQ _D NO. a) 20 inírop ir. tren IOS l",RH cr ?GCG??TG?TGTGTTGTC (SEQ ;D NO.20} 21 E. CCTCAGAGGIGGT?C? GG?G ÚSEQ ÍD NO..2) 20 1 ¡"J_ chlíiniydia otrcGG?T pi?Gt c-ci_.c (!>EQ ? .NO. :>.]-; 2! c lau: CGGGCGGIGTGT?C?AGG .:S ID WO 43) 18 ¡?_ us¡s.eri GCT??CGCWG???t.GACC (SCO ID NO.2?. ) 20 nci._ GAATT?A?eac..tcAtccACC(s;¡Qin NO .4) 22 CUADRO 1B Iniciadores MassEXTENSION (Nota Mass ha sido corregido por sustitución con desoxnnosina) Peso Diferencia ID (u = no extendido, molecular al siguiente t = gen objetivo, (daltons) pico c = competidor interno) Iniciadores de amplificación (todos los iniciadores de PCR para amplificación peso molecular son normalizados a una Tm calculada de 58°C) mods SBE del La extensión de SBE debe ser a 58°C de longitud objetivo modificador 1 5199 289 18u 1 HPV1ST O-'U?GOJCÜAC?GIJAAL (SFQ ÍD .S'O 4. • 17 G S?89 flO ?ec 7 -¡PV.5 ¿ HP u 30 . HPV59 ' TI CÍ2.OG?-?CSCX:??O ??Í G.\G {SEO ID NO <8? -<_ G 7Sí ' ÍS') 159 35u 5 HPVid WO «i TZ c 2W 5816 .1 1ÓU -. HPVS3 ISS;CVZ?tTCCTCQAGC?GC AACrva (.•'iFQ I? NO SO; 21 G 13.5 5B57 -O 311 7 HPUSI 'Schp.fi.-iir?rj?t?I?/V.?GTCCAOTO (S3 ID NO 51) 180 e 56S7 49 31c H -!=-._•; 'SPhos?.TÜC?A?CCLAC?ßACGC i.SEQ ID NO 52) 18 r 80 _9Í6 4(1 ?Sc rfPVSS /_..,> .^'CC?TA?C?ICGCTGGACO (SEQ ID NO S3) 18 G •38 •0 5986 37 3Ei -o HÍ?'33 Toc ¡SI:Q JD O S?) ?o c '30 11 3073 32 45u -- HPV53 t .H,Q ID »ao SSI 21 r. '•7 .105 40 ,5c "7 HPVr)3 ÍS..II IGÍ7<TO-TT? .O?G?CTCGAÍIGAAT ( .EQ ID ND V,, 2_ G isa * 3 5J45 73 1SI 13 a* ?-j;o'-7í?AAAAA.AAAcr.?!trc_\.tcAA?'rAG GS?Q __> NO 57) 25 c 38 Í4 6218 1-3 9u H HPV2S ."-H>l ».A£3CT\TCt?AAAG TTC5AAT? (SKQ ? NO _S) 2- 1 li0 7 '?, 33u 15 ?'s1: AITCCACTGTGAA (S?Q IO NO K) ^ c ? li S315 47 39 u 'a •-iPVCB a? NO ÓO; 21 & ec 17 C362 40 4£c HPV IB ?ACC- ?CAOÍTAC? ÜCOAC ÍSLQ ID NO 4. ) '.9 G 1B S-,02 54 46. ií) 1 |P V02 '«pC3ccsrc>ctA i I?CCTGCC??A?C3 (SEQ ID NO ?\ 22 G rjh 5¿i6 2* 68 ?¡ lr- HPV2 EO a? NO «) 2-: G ?K,S J 5477 33 5_u 70 -3 C. /l 1507 13 59-. 21 U>_tra SPIIOJ/A GG??C ID NO. -<; 23 G co 22 = 526 21 33t CA?GAT?A. ?CIC.'?AOC AAT7<5E0 ?DNO SÍ; 23 _'' G_V 15 591 CUADRO 1B (CONTINUACIÓN) Peso Diferencia ID (u = no extendido: molecular al siguiente t = gen objetivo; (daltons) pico c = competidor interno) 21 65SK 1 . ?.'iC 25 5585 ;_ 33u 26 CC0 10 .'Jt 2b 672-. _. i 5"¡ u G7 .5 G3c 30 67S5 1Í- :i3t Si 67_5 21 68. 35 «174 -••0 53c 30 6914 53 S3t 3 69fiH "5 ?? ? cn- -1 3B 7013 •íü 31C 39 70£M 28 51t <5C 70S1 35 5 _u 41 7117 '20 !S2c 42 7136 20 2Gt 43 7157 20 P .t 44 7176 ¿0 7.«c 45 72 .7 -'Ü chlam-u ¿í. 7257 C?~ itUror?-[ 4? 7257 intron-r. !3 7330 2 5 u CUADRO 1 B (CONTINUACIÓN) Peso Diferencia ID (u = no extendido; molecular al siguiente t = gen objetivo; (daltons) pico c = competidor interno 49 7371 40 55c 50 7-111 95 _Gt 5 "• 7SC6 40 chiam-e 7540 36 cíilaus-t SO 7CL!Z 46 86».! 7623 40 52c 55 7Pf.3 .33 521 sa 7871 40 661 5<? ? - 11 79 _o_ oc- 73, D 40 peiss-C 62 _ 3S_ 40 23! 63 H i o 77 23c o . _ 1..'. 289 73 u 65 8 .72 <0 73; *HPV 18, inosina reemplaza a "A", no a "T". a . r*.. :. a. ü. n z. o r < r_, a r. a. : ar. c r « i. c s. 3 r. c > _ : x r :r.. • '.\ c Z X ? z CUADRO 1 D Designaciones del espaciador adherido al extremo 5' del iniciador de extensión CUADRO 2 Iniciadores usados para la prueba de PCR espectroscópica de masa usando 13 tipos del HPV Tipo de SECUENCIA DEL INICIADOR DELANTERO SECUENCIA DEL INICIADOR INVERSO Iniciadores MassEXTENSION HPV HF.'IS ?CGpC-GATG?CTGCAATGTTTC?GÍiAC;';; ;„_Qa>>."0. .«) ACG püC-?TGTAüTTGTTrGCAtiCrCTG-j ( -£Q ¡D NO..01 GAGCGACGC?G???37TAC (SSQ IE KO. E-l) HPV i n ACGTTCGATO?T?GCTQGGCACTAT?C?GÜ (:__.Q JO O .7) ?CHT IGa TGTGía7TTCTCrGCe C01T0 (S8 ID fiO, 3 CCC?TTCGTGCTCCAAC (SEC Hj NO. V-) ?-?pva? ACGp7jßATu,';AGGArrttrG??C?TCGCG GS?Q rc- NO. «) ?C GTGGA-GGTGGTG ACCGAAAACGGTTG (SF.Q ID NO.9S) ?TGGCC7C7GTAGGTTT (S?Q ID MO. tfvi HPV33 ACGTTGGATCCACAGTGC?GTTTCTCTACG <Sf. U) NO. 93} ACGTTGG?TGCG?TTrCATAA . A1TI CGG3 (SliQ H) NO.95) ?C?CGCCGCACAGCGCGG:T ( KQ ??> ?o i ou) HP 30 ACÜTTGGATG?CC??C?GGACAGACACCG (S;-Q TD NO ! .1) ACO ' GG?-'-CGCTGTGTCCAGRRCAV'?G '.SEQ ID NO.102) ACCV CCACCGTCCAC (SI-.Q _"> .70 '.0V. HPV39 ACG GGGGATGGCC?TAC??ATTGCCAGACC C_¡IO TO ND ÍO.IJ ACGTTGOA-GGCÜTCTGCA?TACAC?CAGG{_I-Q?DNO. IOSJ ?GC-AGACCTGTGCACAAC (SEO ID O KM, HPVÍ 5 ?CGTTGGATGCTÜTGCAC? ATCTGGT?GC (_EQ Ü3 MO. Í '37) ACGGTGG -C-A? GGCA?T?C?GÍ? Al GG CG ^S'SQ ÍD NO. :0.) AAATCTCG.TAG T?GTAGGG?CGTT (SEQ a. ?o ?o.) 11. Vf,1 ACGTTGOATOSGTT?TG?GCOAAAACGGTG ¡?Q ID HC HO; ?CGrrcG?rGUTCi '^CCCTCTTGTCTTCG ¡SEO ?D O. w.) CCGTGCAI'A'GAAWXGTGCAGTÜ (Süq i;; i- . ! i ¿ I iPVSX ACGTTGOATG?TTnTGTG GGTGCTaGAAC ;SKJ 3 NO ; :Í ?CG rTGG?TG?CCTCTCTTC3TTGrAGC?C {SHO 0 NO.114) GTGCTGG??ÍlAATCtíG'IG ¡SKq ID NO. : I i) í :P\'SS ACC.T7GG?TaCAAAC?7G?CCCGC7CCAAC (=EQ sil NO 11-i ACG GÍGGATGGTTAACTCCG GAGO i*AA?GU {S!s0 iJ) NO. ¡17} C?AC \TGTOCTATTAG??G?A/, (SEQ 11. NO 1 -X) ¡ iPViiß ACG ?ÜC?TGTCA .?TGTGTC?GGCSTTGS (SEQ ir» •:;.) I i») Al_GTTGCATGT?C(r-CAG?TCGClGCA?;\G:_- _0>K3.120) prrrc?GGc:GttGSAf_AC?T (S_Q ¡D NV. 12.) .-I. VS9 ACGTrGGATßGCAßp-CCCCTrTGCAA. AC tSEQ DNO : 22) GTGCAAAACACACAVG GATÍ- ÍSEQ ID I-JC.1:4; CD I..PV6- acGrrGGAT.oACCCCGTCCC-TATATACTAeC (SEORN-3. 1ÍS) CCGTATATACTACA T?AAG-::A (si;.;;- •!_ NO. ?_7) O El competidor usado para cada tipo de HPV es: i" (SEQ iD N'O S<l_) '.«lo} CUADRO 3 Análisis de ADN del HPV 16 por prueba espectroscópica de masa en cánceres de vejiga asociados con esquistosomiasis Detección por QPCR fluorescente Sedimento muestra # Tumor Suero de la orina 134 8.9E-06 6.2E-05 8.BE-05 138 7.5E-05 8.6E-05 negativo 17 Negativo 4.4E-06 20 Negativo 7.6E-06 3.0E-05 204 2.4E-06 7.5E-06 2.9E-03 216 2.6E-04 2.1 E-05 negativo 242 8.4E-05 1.3E-05 negativo 296 2.2E-05 7.6E-05 negativo 323 Negativo 7.2E-06 negativo 358 2.4E-05 negativo negativo 380 Negativo 6.3E-06 negativo 385 3.9E-06 2.3E-06 2.1 E-05 388 2.2E-05 negativo 40 7.5E-05 2.2E-05 negativo 44 1.5E-05 407 9.4E-05 4.0E-06 414 Negativo 2.0E-06 417 4.8E-06 1.1 E-07 424 Negativo negativo 427 3.5E-05 9.7E-06 466 9.9E-06 5.2E-06 51 4.0E-04 1.3E-04 negativo 64 4.1 E-04 4.0E-05 84 1.9E-06 4.8E-06 negativo 65 4.0E-04 8-5E-06 negativo 269 1.1 E-05 negativo 382 negativo negativo aM = attomolar; fM = femtomolar CUADRO 3 (CONTINUACIÓN) 10 15 aM = attomolar; fM = femtomolar CUADRO 4 Análisis de ADN del HPV 16 por prueba espectroscópica de masa en tumores de cabeza y cuello, sangre y suero aM = attomolar; fM = femtomolar CUADRO 5 Tumores: tipificación del HPV por análisis espectroscópico de masa y secuenciación degenerada del ADN Tipo de HPV por Tipo de HPV por js/equivalente Tumor espectroscopia secuenciación oma haploide de masa del ADN C10 HPV16 4.5E-03 HPV16 C12 HPV16 7.6E-03 HPV16 C14 HPV18 2.3E-02 HPV18 C16 HPV52 1.5E-02 Ninguno C18 HPV18 1.2E-03 Ninguno C20 HPV18 2.9E-02 HPV18 C22 HPV35 5.5E-02 HPV35 C24 HPV18 9.2E-03 HPV18 C26 HPV16 4.4E-02 HPV16 C27 HPV52 1.7E-02 Ninguno C28 HPV16 1.2E-02 HPV16 C30 HPV18 1.7E-02 HPV18 C32 HPV16.45 5.3E-05 HPV16 C33A HPV52 2.4E-05 Ninguno C37 HPV16 4.0E-02 HPV16 C37 HPV16 1.5E-01 HPV16 C3a HPV16 1.1 E-01 HPV16 C4II HPV18 4.3E-02 HPV18 C41 HPV68 2.3E-03 Ninguno C43 HPV16 4.8E-02 HPV16 C49 HPV16 1.8E-02 HPV16 C51 HPV16 1.2E-01 HPV16 C53 HPV31 7.8E-02 HPV31 C55 HPV31 4.1 E-05 HPV73 C57 HPV16 3.1 E-03 HPV16 C5T HPV16 0.0E+00 HPV16 C6 HPV45 7.0E-02 HPV45 C62 HPV52.16 6.1 E-03, 2.3E-05 Ninguno C63 HPV18 4.9E-02 HPV18 C64 HPV16 5.7E-04 HPV16 C67 HPV16 4.3E-01 HPV16 CUADRO 5 (CONTINUACIÓN) C73 HPV18 8.2E-03 Ninguno C8 Ninguno 0.0E+00 Ninguno CS122T HPV18 4.5E-02 HPV18 CS179T HPV16 1.2E+00 HPV16 CS18T HPV59.16 8.1 E-02, 3.6E-04 HPV16 CS191T HPV33 2.0E-02 HPV18 CS195T HPV59 9.1 E-03 Ninguno CS196T HPV16 4.8E-01 HPV16 CS198T HPV16 9.0E-04 HPV68 CS19T HPV16 HPV16 CS202T HPV16 2.8E-02 HPV16 CS203T HPV16 6.9E-01 HPV16 CS204T HPV16 6.9E-01 HPV16 CS205T HPV16.33 1.7E-04, 2.0E-05 HPV16 CS208T HPV18 4.8E-03 HPV18 CS210T HPV16 3.5E-01 HPV16 CS211T HPV18 3.0E-01 HPV18 CS213T HPV35.16 1.2E-02, 3.2E-05 HPV35 CS214T HPV16 2.5E-03 HPV16 CS22T HPV16 4.9E-03 HPV16 CS24T HPV16 1.1 E-01 HPV16 CS2T HPV45 1.2E-02 HPV45 CS30T HPV56 3.2E-02 Ninguno CS32T HPV52, 16 5.4E-02. 1.5E-03 HPV16 CS36T HPV16 4.6E-02 HPV16 CS43T HPV16 8.1 E-03 HPV16 CS45T HPV16 3.3E-01 HPV16 CS46T HPV16 9.5E-02 HPV16 CS47T HPV16 3.2E-01 CS49T HPV45,16,56 1.5E-02, 4.2E-03, 2.6E-04 HPV16 CS51T HPV45.16 1.6E-02, 1 JE-03 Ninguno CS59T HPV16 2.5E-02 HPV16 CS59T HPV31 3.7E-03 HPV31 CS63T HPV31 7.5E-01 HPV31 CS6T HPV33, 16 1.4E-02, 1.4E-03 Ninguno CS74T HPV45 2.2E-02 Ninguno CS80T HPV16 2.0E-02 HPV16 CS83T HPV16 1.0E-01 HPV16 CS85T HPV16 3.2E-01 HPV16 CS8T HPV16 1.3E-03 HPV16 CS90T HPV18.16 8.4E-03, 3.5E-04 HPV18 CS91T HPV18.16 2.0E-01. 4.3E-05 HPV18 CUADRO 5 (CONTINUACIÓN) CS92T HPV16 1.5E-01 HPV16 CS93T HPV18 9.9E-01 HPV18 CS96T HPV16 2.9E-02 HPV16 CS98T HPV45 1.5E-02 HPV45 CS9T HPV16 1.3E-04 HPV16 UMC- 2T HPV59 5JE-03 Ninguno UM- C3T HPV18 1.4E-01 Ninguno UMC- 3T HPV18 1.4E-01 Ninguno UMC- 4T HPV45 7.2E-02 HPV45 Líneas de élulas control Caski HPV16 8.1 E-01 HPV16 SiHa HPV16 6.3E-03 HPV16 Hela HPV18 5.9E-02 HPV18 CUADRO 6 Displasias patológicas con bajas i cantidades de HPV patogénico por prueba espectroscópica de masa Tipo de HPV por Tipo de HPV Tipo de HPV Cantidad de HPV por Muestra espectroscopia de por por blotting en Patología espectroscopia de masa masa secuenciación línea inversa HPV16, HPV35, PO033 toda ~1 aM ninguno Sin HPV CIN I HPV59 PO044 HPV39, 51, 16 8aM, ~1 aM,~1 aM ninguno Sin HPV CIN II -10 aM, -10 aM, ~1 aM, PO179 HPV39, 51, 59,68 Sin HPV CIN I -10 aM PO110 HPV35, 58 -1 aM, -1 aM HPV73 CIN I PO155 HPV51 -1 aM HPV81 HPV81 CIN I PO185 HPV35, 39, 58 43 aM, -1 aM, -1 aM HPV35 HPV6 CIN I PO223 HPV52 -1 aM ninguno HPV84 CIN I PO224 HPV59 -1 aM HPV81 HPV81 CIN I PO231 HPV35, 58 -1 aM, -1 aM HPV87 HPV42 CIN I PO053 HPV35, HPV39 ~5aM, -10 aM HPV35 HPV53 CINI PO183 HPV35, HPV56 -10 aM, 440 aM HPV43 HPV53 y 83 CINI PO129 HPV39, 58 -10 aM, 50 aM HPV91 HPV55 CINI PO091 HPV52 -10 aM HPV66 HPV66 CINI PO 130 HPV39 ~5aM HPV66 HPV66 CIN I P0134 HPV31 1.3 aM ninguno HPV66 CINI PO025 HPV39, HPV51 -5 aM, -1 aM HPV73 HPV73 CIN II PO 150 HPV35 -10 aM HPV73 HPV73 CINI PO 141 HPV39, HPV68 -5 aM, -5 aM HPV43 HPV84 CIN I CUADRO 7 Tipos de HPV y copias (aM) presentes por contenido de ADN del genoma haploide en muestras ThinPrep de cerviz CUADRO 7 (CONTINUACIÓN) CUADRO 7 (CONTINUACIÓN) CUADRO 7 (CONTINUACIÓN) CUADRO 7 (CONTINUACIÓN) CUADRO 7 (CONTINUACIÓN) CUADRO 7 (CONTINUACIÓN) CUADRO 7 (CONTINUACIÓN) CUADRO 8 Displasias positivas para HC2 con bajas cantidades de HPV patogénico por análisis espectroscópico de masa -vl CD CUADRO 8 (CONTINUACIÓN) -vl -vl CUADRO 9 CUADRO 10 Análisis de ADN del HPV 16 por prueba espectroscópica de masa en displasia cervical -vl CD CUADRO 11 Presencia del HPV en sangre y/o suero para diferentes tipos de HPV presentes en la displasia REFERENCIAS 1. OBISO, R. Y A. LORINCZ, DIGENE CORPORA TION. PHARMACOGENOMICS, 2004. 5(1 ): P. 129-32. 2. POLJAK, M., ET AL, HYBRID CAPTURE II HPV TEST DETECTS AT LEAST 15 HUMAN PAPILLOMAVIRUS GENOTYPES NOT INCLUDED IN ITS CURRENT HIGH-RISK PROBÉ COCKTAIL. J CLIN VIROL, 2002. 25 SUPL 3: P. S89-97. 3. CAPONE, R. B., ET AL, DETECTION AND QUANTITA TION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS (HPV) DNA IN THE SERA OF PATIENTS WITH HPV-ASSOCIATED HEAD Y NECK SQUAMOUS CELL CARCINOMA. CLIN CÁNCER RES, 2000. 6(11 ): P. 4171-5. 4. YANG, H. J., ET AL, QUANTIFICATION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS DNA IN THE PLASMA OF PATIENTS WITH CERVICAL CÁNCER. INT J GYNECOL CÁNCER, 2004. 14(5): P. 903-10. 5. MUÑOZ, N., ET AL., EPIDEMIOLOGIC CLASSIFICATION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPES ASSOCIATED WITH CERVICAL CÁNCER. N ENGL J MED, 2003. 348(6): P. 518-27. 6. CHIN-HONG, P. V., ET AL, AGE-RELATED PREVALENCE OF ANAL CÁNCER PRECURSORS IN HOMOSEXUAL MEN: THE EXPLORE STUDY. J NATL CÁNCER INST, 2005. 97(12): P. 896-905. 7. MOBERG, M., I. GUSTAVSSON Y U. GYLLENSTEN, TYPE-SPECIFIC ASSOCIATIONS OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS LOAD WITH RISK OF DEVELOPING CERVICAL CARCINOMA IN SITU. INT J CÁNCER, 2004. 112(5): P. 854-9. 8. DING, C. Y C. R. CANTOR, A HIGH-THROUGHPUT GENE EXPRESSION ANALYSIS TECHNIQUE USING COMPETITIVE PCR AND MATRIX-ASSISTED LASER DESORPTION IONIZATION TIME-OF-FLIGHT MS. PROC NATL ACAD SCI U S A, 2003. 100(6): P. 3059-64. 9. DING, C. Y C. R. CANTOR, QUANTITATIVE ANALYSIS OF NUCLEIC ACIDS-THE LAST FEW YEARS OF PROGRESS. J BIOCHEM MOL BIOL, 2004. 37(1 ): P. 1-10. 10. TANG, K., ET AL, MINING DISEASE SUSCEPTIBILITY GENES THROUGH SNP ANALYSES AND EXPRESSION PROFILING USING MALDI-TOF MASS SPECTROMETRY . J PROTEOME RES, 2004. 3(2): P. 218-27. 11. KHALED, H. M., ET AL, HUMAN PAPILLOMA VIRUS INFECTION AND OVEREXPRESSION OF P53 PROTEIN IN BILHARZIAL BLADDER CÁNCER. TUMORI, 2001. 87(4): P. 256-61. 12. GRAVITT, P. E., ET AL, GENOTYPING OF 27 HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPES BY USING L1 CONSENSUS PCR PRODUCTS BY A SINGLE-HYBRIDIZATION, REVERSE LINE BLOT DETECTION METHOD. J CLIN MICROBIOL, 1998. 36(10): P. 3020-7. 13. HEID CA, S. J., LIVAK KJ Y WILLIAMS PM., REAL TIME QUANTITATIVE PCR, IN GENOME RESEARCH. 1996. P. 986-994. 14. THOMPSON, G. H. Y A. ROMÁN, EXPRESSION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 6 E1 , E2, L1 Y L2 OPEN READING FRAMES IN ESCHERICHIA COL!. GENE, 1987. 56(2-3): P. 289-95. 15. DE RODA HUSMAN, A. M., ET AL, THE USE OF GENERAL PRIMERS GP5 AND GP6 ELONGATED AT THEIR 3' ENDS WITH ADJACENT HIGHLY CONSERVED SEQUENCES IMPROVES HUMAN PAPILLOMAVIRUS DETECTION BY PCR. J GEN VIROL, 1995. 76 (PARTE 4): P. 1057-62. 16. NELSON, J. H., ET AL, A NOVEL AND RAPID PCR-BASED METHOD FOR GENOTYPING HUMAN PAPILLOMAVIRUSES IN CLINICAL SAMPLES. J CLIN MICROBIOL, 2000. 38(2): P. 688-95. 17. STROUN, M., ET AL., ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF DNA FROM THE PLASMA OF CÁNCER PATIENTS. EUR J CÁNCER CLIN ONCOL, 1987. 23(6): P. 707-12. 18. YANG, H., ET AL, SENSITIVE DETECTION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS IN CERVICAL, HEAD/NECK, AND SCHISTOSOMIASIS-ASSOCIATED BLADDER MALIGNANCIES. PROC NATL ACAD SCI U S A, 2005. 102(21 ): P. 7683-8. 19. ELVIDGE, G. P., ET AL, DEVELOPMENT AND EVALUATION OF REAL COMPETITIVE PCR FOR HIGH-THROUGHPUT QUANTITATIVE APPLICATIONS. ANAL BIOCHEM, 2005. 339(2): P. 231 -41. 20. SCHEFFNER M., ET AL, THE E6 ONCOPROTEIN ENCODED BY HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPES 16 AND 18 PROMOTES THE DEGRADATION OF P53. CELL, 1990. 63(6): P. 1129-36. 21. HA, P. K., ET AL, REAL-TIME QUANTITATIVE PCR DEMONSTRATES LOW PREVALENCE OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 16 IN PREMALIGNANT AND MALIGNANT LESIONS OF THE ORAL CAVITY. CLIN CÁNCER RES, 2002. 8(5): P. 1203-9. 22. CHANG, J. Y., M. C. LIN, Y C. P. CHIANG, HIGH-RISK HUMAN PAPILLOMAVIRUSES MAY HAVE AN IMPORTANT ROLE IN NON-ORAL HABITS-ASSOCIATED ORAL SQUAMOUS CELL CARCINOMAS IN TAIWAN. AM J CLIN PATHOL, 2003. 120(6): P. 909-16. 23. NEVILLE, B. W. Y T. A. DAY, ORAL CÁNCER AND PRECANCEROUS LESIONS. CA CÁNCER J CLIN, 2002. 52(4): P. 195-215. 24. HERRERO, R., ET AL, HUMAN PAPILLOMAVIRUS AND ORAL CÁNCER: THE INTERNATIONAL AGENCY FOR RESEARCH ON CÁNCER MULTICENTER STUDY. J NATL CÁNCER INST, 2003. 95(23): P. 1772-83. 25. MCKAIG, R. G., R. S. BARIC, Y A. F. OLSHAN, HUMAN PAPILLOMAVIRUS AND HEAD AND NECK CÁNCER: EPIDEMIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY. HEAD NECK, 1998. 20(3): P. 250-65. 26. SCHWARTZ, S. R., ET AL, HUMAN PAPILLOMAVIRUS INFECTION AND SURVIVAL IN ORAL SQUAMOUS CELL CÁNCER: A POPULATION-BASED STUDY. OTOLARYNGOL HEAD NECK SURG, 2001. 125(1 ): P. 1-9. 27. KOCH, W. M., ET AL., HEAD AND NECK CÁNCER IN NONSMOKERS: A DISTINCT CLINICAL AND MOLECULAR ENTITY. LARYNGOSCOPE, 1999. 109(10): P. 1544-51. 28. GILLISON, M. L, ET AL, EVIDENCE FOR A CAUSAL ASSOCIATION BETWEEN HUMAN PAPILLOMAVIRUS AND A SUBSET OF HEAD AND NECK CANCERS. J NATL CÁNCER INST, 2000. 92(9): P. 709-20. 29. SCHWARTZ, S. M., ET AL, ORAL CÁNCER RISK IN RELATION TO SEXUAL HISTORY AND EVIDENCE OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS INFECTION. J NATL CÁNCER INST, 1998. 90(21 ): P. 1626-36. 30. SEYBOLT, G. F. Y G. N. PAPANICOLAU, [EXFOLIATIVE CYTOLOGY: ITS VALUÉ IN THE DIAGNOSIS OF CÁNCER]. ARCH MED CUBA, 1953. 4(6): P. 579-86. 31. ROCK, C. L., ET AL, PREVENTION OF CERVIX CÁNCER. CRIT REV ONCOL HEMATOL, 2000. 33(3): P. 169-85. 32. BOSCH, F. X., ET AL, PREVALENCE OF HUMAN PAPILLOMA VIRUS IN CERVICAL CÁNCER: A WORLDWIDE PERSPECTIVE. INTERNATIONAL BIOLOGICAL STUDY ON CERVICAL CÁNCER (IBSCC) STUDY GROUP. J NATL CÁNCER INST, 1995. 87(1 1 ): P. 796-802. 33. JACOBS, M. V., ET AL, GROUP-SPECIFIC DIFFERENTIATION BETWEEN HIGH- AND LOW-RISK HUMAN PAPILLOMAVIRUS GENOTYPES BY GENERAL PRIMER-MEDIATED PCR AND TWO COCKTAILS OF OLIGONUCLEOTIDE PROBES. J CLIN MICROBIOL, 1995. 33(4): P. 901-5. 34. WALBOOMERS, J. M., ET AL, HUMAN PAPILLOMAVIRUS IS A NECESSARY CAUSE OF INVASIVE CERVICAL CÁNCER WORLDWIDE. J PATHOL, 1999. 189(1 ): P. 12-9. 35. VAN HAM, M. A., ET AL, COMPARISON OF TWO COMMERCIAL ASSAYS FOR DETECTION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS (HPV) IN CERVICAL SCRAPE SPECIMENS: VALIDATION OF THE ROCHE AMPLICOR HPV TEST AS A MEANS TO SCREEN FOR HPV GENOTYPES ASSOCIATED WITH A HIGHER RISK OF CERVICAL DISORDERS. J CLIN MICROBIOL, 2005. 43(6): P. 2662-7. 36. CASTLE, P. E., ETAL, RESTRICTED CROSS-REACTIVITY OF HYBRID CAPTURE 2 WITH NONONCOGENIC HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPES. CÁNCER EPIDEMIOL BIOMARKERS PREV, 2002. 11(11 ): P. 1394-9. 37. NAM, J. M., S. I. STOEVA Y C. A. MIRKIN, BIO-BAR-CODE-BASED DNA DETECTION WITH PCR-LIKE SENSITIVITY. J AM CHEM SOC, 2004. 126(19): P. 5932-3. 38. NAM, J. M., C. S. THAXTON Y C. A. MIRKIN, NANOPARTICLE-BASED BIO-BAR CODES FOR THE ULTRASENSITIVE DETECTION OF PROTEINS. SCIENCE, 2003. 301 (5641 ): P. 1884-6.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un método para detectar, identificar y/o cuantificar ADN del HPV en una muestra biológica de mamífero, caracterizado porque comprende los pasos de: extraer ADN de una muestra biológica de mamífero; llevar a cabo una primera amplificación por PCR de por lo menos una porción del ADN extraído en presencia de por lo menos una secuencia de un competidor, dicha secuencia del competidor comprendiendo un polinucleótido sustancialmente homólogo a un polinucleótido en una secuencia de ADN de un tipo de HPV conocido, dicha secuencia del competidor teniendo una sustitución de nucleótido no presente en dicha secuencia de ADN del HPV; llevar a cabo una segunda amplificación por PCR en presencia de por lo menos un iniciador de extensión para dicho tipo de HPV conocido y por lo menos dos didesoxinucleótidos diferentes; y determinar el nivel de algún iniciador de extensión amplificado para dicho tipo de HPV conocido por espectrometría de masa. 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la muestra biológica de mamífero es un fluido corporal o una muestra de tejido. 3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho paso de determinación comprende la detección de algún iniciador de extensión amplificado a una concentración menor de aproximadamente 200 attomolar. 4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la primera amplificación comprende la presencia de una pluralidad de tipos de secuencias del competidor, cada uno comprendiendo un polinucleótido sustancialmente homólogo a un polinucleótido en una secuencia de ADN de un tipo de HPV conocido diferente, dicho tipo de secuencia del competidor teniendo una sustitución de nucleótido no presente en dicha secuencia de ADN del HPV respectiva, y en donde la segunda amplificación comprende la presencia de una pluralidad de tipos de iniciador externo, cada uno para un tipo de HPV conocido diferente. 5.- El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la pluralidad de tipos de HPV conocidos comprende dos o más de los tipos de HPV 16, 18, 23, 26, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 y 82. 6.- El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la pluralidad de tipos de HPV conocidos comprende por lo menos los tipos de HPV 16, 18, 23, 26, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 y 82. 7 '.- El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque comprende también: llevar a cabo una primera amplificación por PCR en presencia de por lo menos una porción del ADN extraído en presencia de por lo menos una secuencia de un competidor que comprende un polinucleótido sustancialmente homólogo a un polinucleótido en una secuencia de ADN de Neisseria gonorrhoeae o Chlamydia trachomatis, dicha secuencia del competidor teniendo una sustitución de nucleótido no presente en dicha secuencia de ADN de Neisseria gonorrhoeae o Chlamydia trachomatis] llevar a cabo una segunda amplificación por PCR en presencia de por lo menos un iniciador de extensión para dichas Neisseria gonorrhoeae o Chlamydia trachomatis, y por lo menos dos didesoxinucleótidos diferentes; y determinar el nivel de algún iniciador de extensión amplificado para Neisseria gonorrhoeae o Chlamydia trachomatis por espectrometría de masa. 8.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la primera amplificación comprende la presencia de por lo menos una secuencia de un competidor que comprende un polinucleótido sustancialmente homólogo a un polinucleótido en una secuencia de ADN del gen erbB-2, dicha secuencia del competidor teniendo una sustitución de nucleótido no presente en dicho gen erbB-2. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende el paso adicional de diagnosticar, monitorear o evaluar cáncer cervical, displasia cervical, neoplasia intraepitelial cervical, cáncer anal, neoplasia intraepitelial anal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga asociado con esquistosomiasis o papiloma en un mamífero después de dicho paso de determinación. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque por lo menos una secuencia de un competidor se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 71 , SEQ ID NO. 72, SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80, SEQ ID NO. 81 , SEQ ID NO. 82, SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84 y SEQ ID NO. 85. 11.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque comprende adicionalmente por lo menos una secuencia de un competidor seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 86, 87 y 88. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la primera amplificación comprende por lo menos una serie comparada de secuencias de iniciador delantero e inverso para dicho tipo de HPV conocido que consiste en SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 4 y SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 6 y SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 7 y SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 8 y SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 9 y SEQ ID NO. 31 , SEQ ID NO. 10 y SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 11 y SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 12 y SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 13 y SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 14 y SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 15 y SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 16 y SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO. 17 y SEQ ID NO. 39, SEQ ID NO. 18 y SEQ ID NO. 40 y SEQ ID NO. 19 y SEQ ID NO. 41. 13.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la primera amplificación comprende también por lo menos una serie comparada de secuencias de iniciador delantero e inverso seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO. 20 y SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 21 y SEQ ID NO. 43 y SEQ ID NO. 22 y SEQ ID NO. 44. 14.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque por lo menos un iniciador de extensión se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51 , SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56, SEQ ID NO. 57, SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61 , SEQ ID NO. 62 y SEQ ID NO. 63. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la segunda amplificación comprende también por lo menos un iniciador de extensión seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65 y SEQ ID NO. 66. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la primera amplificación comprende por lo menos una serie comparada de secuencias de iniciador delantero e inverso relacionadas con dicho tipo de HPV conocido, cada una de dichas secuencias comprendiendo por lo menos una base de inosina. 17.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque por lo menos un iniciador de extensión comprende por lo menos una base de inosina. 18.- Un método para detectar, identificar y/o cuantificar ADN del HPV en una fracción no celular de un fluido corporal de mamífero, caracterizado porque comprende los pasos de: extraer ADN de una fracción no celular de un fluido corporal de mamífero; llevar a cabo una primera amplificación por PCR de por lo menos una porción del ADN extraído en presencia de por lo menos una secuencia de un competidor, dicha secuencia del competidor comprendiendo un polinucleótido sustancialmente homólogo a un polinucleótido en una secuencia de ADN de un tipo de HPV conocido, dicha secuencia del competidor teniendo una sustitución de nucleótido no presente en dicha secuencia de ADN del HPV; llevar a cabo una segunda amplificación por PCR en presencia de por lo menos un iniciador de extensión para dicho tipo de HPV conocido y por lo menos dos didesoxinucleótidos diferentes; y determinar el nivel de algún iniciador de extensión amplificado para dicho tipo de HPV conocido por espectrometría de masa. 19.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el fluido corporal es plasma sanguíneo, suero, orina, fluido cerebroespinal, sudor, saliva, esputo o lágrimas. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque dicho paso de determinación comprende la detección de algún iniciador de extensión amplificado a una concentración menor de aproximadamente 200 attomolar. 21.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la primera amplificación comprende la presencia de una pluralidad de tipos de secuencias del competidor, cada uno comprendiendo un polinucleótido sustancialmente homólogo a un polinucleótido en una secuencia de ADN de un tipo de HPV conocido diferente, dicho tipo de secuencia del competidor teniendo una sustitución de nucleótido no presente en dicha secuencia de ADN del HPV respectiva, y en donde la segunda amplificación comprende la presencia de una pluralidad de tipos de iniciador externo, cada uno para un tipo de HPV conocido diferente. 22.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la pluralidad de tipos de HPV conocidos comprende dos o más de los tipos de HPV 16, 18, 23, 26, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 y 82. 23.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la pluralidad de tipos de HPV conocidos comprende por lo menos los tipos de HPV 16, 18, 23, 26, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 y 82. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque comprende también: llevar a cabo una primera amplificación por PCR en presencia de por lo menos una secuencia de un competidor que comprende un polinucleótido sustancialmente homólogo a un polinucleótido en una secuencia de ADN de Neisseria gonorrhoeae o Chlamydia trachomatis, dicha secuencia del competidor teniendo una sustitución de nucleótido no presente en dicha secuencia de ADN de Neisseria gonorrhoeae o Chlamydia trachomatis; llevar a cabo una segunda amplificación por PCR en presencia de por lo menos un iniciador de extensión para dichas Neisseria gonorrhoeae o Chlamydia trachomatis, y por lo menos dos didesoxinucleótidos diferentes; y determinar el nivel de algún iniciador de extensión amplificado para Neisseria gonorrhoeae o Chlamydia trachomatis por espectrometría de masa. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la primera amplificación comprende la presencia de por lo menos una secuencia de un competidor que comprende un polinucleótido sustancialmente homólogo a un polinucleótido en una secuencia de ADN del gen erbB-2, dicha secuencia del competidor teniendo una sustitución de nucleótido no presente en dicho gen erbB-2. 26.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque comprende el paso adicional de diagnosticar, monitorear o evaluar cáncer cervical, displasia cervical, neoplasia intraepitelial cervical, cáncer anal, neoplasia intraepitelial anal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga asociado con esquistosomiasis o papiloma en un mamífero después de dicho paso de determinación. 27.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque por lo menos una secuencia de un competidor se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 71 , SEQ ID NO. 72, SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80, SEQ ID NO. 81 , SEQ ID NO. 82, SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84 y SEQ ID NO. 85. 28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque comprende adicionalmente por lo menos una secuencia de un competidor seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 86, 87 y 88. 29.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la primera amplificación comprende por lo menos una serie comparada de secuencias de iniciador delantero e inverso para dicho tipo de HPV conocido que consiste en SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 4 y SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 6 y SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 7 y SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 8 y SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 9 y SEQ ID NO. 31 , SEQ ID NO. 10 y SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 11 y SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 12 y SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 13 y SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 14 y SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 15 y SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 16 y SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO. 17 y SEQ ID NO. 39, SEQ ID NO. 18 y SEQ ID NO. 40 y SEQ ID NO. 19 y SEQ ID NO. 41. 30.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la primera amplificación comprende por lo menos una serie comparada de secuencias de iniciador delantero e inverso seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO. 20 y SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 21 y SEQ ID NO. 43 y SEQ ID NO. 22 y SEQ ID NO. 44. 31.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque por lo menos un iniciador de extensión se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51 , SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56, SEQ ID NO. 57, SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61 , SEQ ID NO. 62 y SEQ ID NO. 63. 32.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque la segunda amplificación comprende también por lo menos un iniciador de extensión seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65 y SEQ ID NO. 66. 33.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la primera amplificación comprende por lo menos una serie comparada de secuencias de iniciador delantero e inverso relacionadas con dicho tipo de HPV conocido, cada una de dichas secuencias comprendiendo por lo menos una base de inosina. 34.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque por lo menos un iniciador de extensión comprende por lo menos una base de inosina. 35.- Un método para detectar, identificar y/o cuantificar ADN del HPV en una muestra biológica de mamífero, caracterizado porque comprende los pasos de: extraer ADN de una muestra biológica de mamífero; llevar a cabo una primera amplificación por PCR de por lo menos una porción del ADN extraído en presencia de por lo menos una secuencia de un competidor, dicha secuencia del competidor comprendiendo un polinucleótido sustancialmente homólogo a un polinucleótido en una secuencia de ADN de un tipo de HPV conocido, dicha secuencia del competidor teniendo una sustitución de nucleótido no presente en dicha secuencia de ADN del HPV; llevar a cabo una segunda amplificación por PCR en presencia de por lo menos un iniciador de extensión para dicho tipo de HPV conocido y por lo menos dos didesoxinucleótidos diferentes; y determinar el nivel de algún iniciador de extensión amplificado para dicho tipo de HPV conocido por espectrometría de masa; en donde la primera amplificación comprende por lo menos una serie comparada de secuencias de iniciador delantero e inverso para un tipo de HPV conocido que coincide sustancialmente con por lo menos una secuencia de un competidor, y en donde por lo menos un iniciador de extensión se relaciona con el mismo tipo de HPV conocido. 36.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque por lo menos una secuencia de un competidor se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 71 , SEQ ID NO. 72, SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80, SEQ ID NO. 81 , SEQ ID NO. 82, SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84 y SEQ ID NO. 85; por lo menos una serie comparada de secuencias de iniciador delantero e inverso se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 4 y SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 6 y SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 7 y SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 8 y SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 9 y SEQ ID NO. 31 , SEQ ID NO. 10 y SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 11 y SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 12 y SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 13 y SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 14 y SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 15 y SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 16 y SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO. 17 y SEQ ID NO. 39, SEQ ID NO. 18 y SEQ ID NO. 40 y SEQ ID NO. 19 y SEQ ID NO. 41 ; y por lo menos un iniciador de extensión se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51 , SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56, SEQ ID NO. 57, SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61 , SEQ ID NO. 62 y SEQ ID NO. 63. 37.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque la primera amplificación comprende por lo menos una serie comparada de secuencias de iniciador delantero e inverso relacionadas con dicho tipo de HPV conocido, cada una de dichas secuencias comprendiendo por lo menos una base de inosina. 38.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque por lo menos un iniciador de extensión comprende por lo menos una base de inosina. 39.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque dicho paso de determinación comprende la detección de algún iniciador de extensión amplificado a una concentración menor de aproximadamente 200 attomolar. 40.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque comprende el paso adicional de diagnosticar, monitorear o evaluar cáncer cervical, displasia cervical, neoplasia intraepitelial cervical, cáncer anal, neoplasia intraepitelial anal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga asociado con esquistosomiasis o papiloma en un mamífero después de dicho paso de determinación. 41.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque la primera amplificación comprende la presencia de una pluralidad de tipos de secuencias del competidor, cada uno comprendiendo un polinucleótido sustancialmente homólogo a un polinucleótido en una secuencia de ADN de un tipo de HPV conocido diferente, dicho tipo de secuencia del competidor teniendo una sustitución de nucleótido no presente en dicha secuencia de ADN del HPV respectiva, y en donde la segunda amplificación comprende la presencia de una pluralidad de tipos de iniciador externo, cada uno para un tipo de HPV conocido diferente. 42.- El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque la pluralidad de tipos de HPV conocidos comprende dos o más de los tipos de HPV 16, 18, 23, 26, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 y 82. 43.- El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque la pluralidad de tipos de HPV conocidos comprende por lo menos los tipos de HPV 16, 18, 23, 26, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 y 82. 44.- El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque comprende también: llevar a cabo una ppmera amplificación por PCR de por lo menos una porción del ADN extraído en presencia de por lo menos una secuencia de un competidor que comprende un polinucleótido sustancialmente homólogo a un polinucleótido en una secuencia de ADN de Neisseria gonorrhoeae o Chlamydia trachomatis, dicha secuencia del competidor teniendo una sustitución de nucleótido no presente en dicha secuencia de ADN de Neisseria gonorrhoeae o Chlamydia trachomatis; llevar a cabo una segunda amplificación por PCR en presencia de por lo menos un iniciador de extensión para dichas Neisseria gonorrhoeae o Chlamydia trachomatis, y por lo menos dos didesoxinucleótidos diferentes; y determinar el nivel de algún iniciador de extensión amplificado para Neisseria gonorrhoeae o Chlamydia trachomatis por espectrometría de masa. 45.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque la primera amplificación comprende el ADN extraído en presencia de por lo menos una secuencia de un competidor que comprende un polinucleótido sustancialmente homólogo a un polinucleótido en una secuencia de ADN del gen erbB-2, dicha secuencia del competidor teniendo una sustitución de nucleótido no presente en dicho gen erbB-2. 46.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque la primera amplificación comprende por lo menos una secuencia de un competidor seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 86, SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y por lo menos una serie comparada de secuencias de iniciador delantero e inverso seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO. 20 y SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 21 y SEQ ID NO. 43 y SEQ ID NO. 22 y SEQ ID NO. 44; y la segunda amplificación comprende por lo menos un iniciador de extensión seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65 y SEQ ID NO. 66. 47.- Un polinucleótido sintético, caracterizado porque comprende una secuencia de un competidor para detectar, identificar y/o cuantificar ADN microbiano en una muestra biológica, seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 71 , SEQ ID NO. 72, SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80, SEQ ID NO. 81 , SEQ ID NO. 82, SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86, SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88. 48.- Un par de polinucleótidos sintéticos, caracterizados porque comprenden iniciadores delantero e inverso para detectar, identificar y/o cuantificar ADN microbiano en una muestra biológica, seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 4 y SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 6 y SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 7 y SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 8 y SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 9 y SEQ ID NO. 31 , SEQ ID NO. 10 y SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 11 y SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 12 y SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 13 y SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 14 y SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 15 y SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 16 y SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO. 17 y SEQ ID NO. 39, SEQ ID NO. 18 y SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 19 y SEQ ID NO. 41 , SEQ ID NO. 20 y SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 21 y SEQ ID NO. 43 y SEQ ID NO. 22 y SEQ ID NO. 44. 49.- Un polinucleótido sintético, caracterizado porque comprende un iniciador de extensión para detectar, identificar y/o cuantificar ADN microbiano en una muestra biológica, seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51 , SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56, SEQ ID NO. 57, SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61 , SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65 y SEQ ID NO. 66. 50.- Un equipo para detectar ADN microbiano en una muestra biológica, caracterizado porque comprende un contenedor y uno o más de los polinucleótidos sintéticos de conformidad con las reivindicaciones 47, 48 y 49.