CN111020023A

CN111020023A - 基因拷贝数定量分析

Info

Publication number: CN111020023A
Application number: CN201910861185.8A
Authority: CN
Inventors: 丁春明; 金胜男; 金伟江
Original assignee: Zhejiang Zhongchuang Biomedical Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Zhongchuang Biomedical Co Ltd
Priority date: 2019-09-11
Filing date: 2019-09-11
Publication date: 2020-04-17
Also published as: WO2021047175A1

Abstract

本发明涉及基因拷贝数定量分析。本发明通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术平台结合单碱基延伸反应和竞争PCR技术检测，后续通过多步校正完成对基因拷贝数的准确定量。本发明还涉及用于执行上述方法的试剂盒。

Description

基因拷贝数定量分析

技术领域

本发明涉及基因检测领域，更具体涉及基因拷贝数的定量分析。

背景技术

基因拷贝数异常(copy number variations，CNV)是广泛存在于人类基因组的一种结构变异。基因拷贝数异常最早在病人的基因组中发现，如遗传性疾病患者、肿瘤患者；但后续的研究发现基因拷贝数异常在正常的个体中也广泛存在。虽然拷贝数异常发生的频率相对较低，但拷贝数异常的片段大小从1kb到数个Mb不等，其累及的基因序列长度相对较长，与人类的健康和疾病的有着密切关联。已有研究证明诸多基因拷贝数异常与疾病的发病、疾病表型存在着密切联系。基因拷贝数异常的检测对于疾病的诊断治疗，尤其是某些遗传性疾病(例如脊髓型肌萎缩症及α-地中海贫血)的诊断治疗及其重要。

脊髓性肌萎缩症是婴幼儿致死的主要遗传疾病之一，是一种常染色体隐性遗传的神经退行性疾病，表现为脊髓运动神经元变性，骨骼肌萎缩和全身无力。脊髓性肌萎缩症在中的发病率为1/6000-1/10000，全球不同人群携带者频率为1/40-1/50。

SMN基因(survival motor neuron gene)的检测是脊髓性肌萎缩症临床诊断的关键手段。95％的脊髓性肌萎缩患者是由于位于5号染色体长臂的SMN1基因纯合缺失或杂合缺失伴点突变，无法生成功能性的SMN蛋白，致脊髓运动神经元变性，称为5qSMA。这其中，90～95％的患者为SMN1基因纯合缺失，另有5％～10％左右的患者为SMN1杂合缺失伴点突变型即复合杂合型。此外在SMN1基因所在区域附近有一与之高度同源的基因SMN2(相似度高达99％，极难分辨)，在外显子区域仅存在2个位点的差异(7号外显子840C＞T，8号外显子1239G＞A)，在内含子区域有十数个位点的差异。由于SMN1与SMN2外显子7上的840C＞T的位点差异使得SMN2在转录生成mRNA时发生外显子跳跃，无法正确剪接，仅有10％左右的SMN2的转录产物为全长能翻译成功能性的SMN蛋白。有相关研究表明SMN2拷贝数与脊髓性肌萎缩症患者的表型相关，且当下已上市的治疗脊髓性肌萎缩症的nusinersen是基于修正SMN2mRNA的正确剪接，从而生成更多的功能性SMN蛋白起到治疗作用。因此，SMN基因主要检测内容包括：SMN1基因缺失检测、SMN2基因拷贝数检测、SMN1基因致病性点突变的检测。

α-地中海贫血是由于α珠蛋白基因(HBA基因)发生突变导致α肽链合成减少或无法合成，导致血红蛋白的组成成份改变，继而引发慢性溶血和贫血。HBA基因包括两个同源基因HBA1及HBA2，正常人中各2拷贝。HBA1基因和HBA2基因HBA基因缺陷包括HBA1和HBA2的基因缺失或致病性点突变。约80-90％的HBA基因缺陷人群是由于HBA1或HBA2的部分缺失或全缺失导致，10％-20％的HBA基因缺陷人群是由于HBA1或HBA2基因的致病性点突变导致。HBA基因缺陷人群是否发病及疾病的严重程度与与其受累HBA基因的拷贝数相关。此外，由于在这两个基因所在区域存在其他与之同源的相似序列，这对HBA1及HBA2的拷贝数定量造成了一定困难。

鉴于基因拷贝数检测对于疾病诊断及研究的重要意义，如何准确的定量基因拷贝数是首要解决的问题。目前常用于基因拷贝数检测的方法主要包括：多重连接探针检测(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)，实时荧光定量PCR(qPCR)等。

多重连接探针扩增技术通过设计多组与不同目的位点(涉及目的基因的外显子或内含子的多个位点，及目的基因相邻序列、及诸多内参基因)结合的探针，每组探针包含左探针(left probe oligo，LPO)及右探针(right probe oligo，RPO)，在探针与目的基因结合后，通过连接酶的作用连接同组的左右探针。每组探针的序列除与目的基因结合的序列(hybridization sequence)外包含相同的引物序列(forward primer sequence&reverseprimer sequence)及用于区分不同产物的标签序列(stuffer sequence)(标签序列包含的碱基数目有差异，使得不同组探针最终对应的连接产物的长度不一)。在连接反应完成后，所有的连接产物可以通过同一对PCR引物进行扩增，其后通过毛细管电泳区分不同长度的连接产物，分辨出不同目的位点的产物信息。其后通过两步校正结果分析基因拷贝数：①样本内校正：将各目的基因产物与内参基因产物比较获得其各自的比值(目的基因/内参基因)；②样本间校正：将待测样本各目的基因/内参基因的比值与正常对照样本(各待测基因拷贝数为2)的目的基因/内参基因的比值获得校正后的比值，该比值用于最后评估各基因的绝对拷贝数。

多重连接探针扩增技术检测流程繁琐，耗时偏长，检测成本较高。另外，由于技术本身的局限，该技术的探针设计比较困难，结果分析较为复杂。在对SMN1致病性点突变的多重检测上受限，设计特异性的多重点突变检测方案较为困难。此外，在样本DNA中目的基因与探针结合区域序列若存在突变位点或SNPs，则可能致连接反应失败，后续无扩增产物，致假阴性结果的产生。

实时荧光定量PCR技术通过在目的基因序列上设计PCR扩增引物及特异性的探针；同时在无拷贝数变异的基因序列上涉及PCR扩增引物及特异性的探针作为内参。在多重的实时荧光定量PCR反应中，选用不同荧光信号分别标记目的基因和内参基因。通过多通道实时荧光定量PCR仪器，实时采集用作标记的荧光信号。在实时荧光定量PCR检测待测样本基因拷贝数时，需同时检测对照样品作为参照(对照样品可为目的基因的人工合成序列与内参基因的人工合成序列按一定比例混合)。计算待测样本目的基因与内参基因Ct值的差值ΔCt_s，计算内参样本目的基因与内参基因Ct值的差值ΔCt_r，其后计算ΔΔCt＝ΔCt_s-ΔCt_r，根据ΔΔCt判读基因拷贝数。

该检测方案的单管反应通量低，多重检测不同基因拷贝数变异较为困难。在存在同源基因序列的检测中，需通过加入特异性阻断探针(如PNA或LNA探针)辅助，阻断同源基因之一，收集未被阻断的基因扩增信号。故不能在单管反应中完成对同源基因的检测。该方案的灵敏性、特异性受限于不同基因检测的设计，不同基因检测设计的灵敏性、特异性不同。当灵敏度欠佳时，虽可准确检测纯合缺失的患者(拷贝数为0)，很难精准的对拷贝数进行定量(1/2/3/4/4以上拷贝)。

因此，本领域需要能够更准确、迅速检测基因拷贝数的方法。

发明内容

本发明通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted LaserDesorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)技术平台结合单碱基延伸反应、real-competitive PCR技术检测，后续通过多步校正完成对基因拷贝数的准确定量。

该方法包括实验室方法和数据分析方法，可以准确检测人类基因组中的基因拷贝数变异(包括纯合子/杂合子缺失及重复)。

此外，对于人类基因组中存在的高度同源相似的序列，本技术也能通过这些序列的差异碱基设计检测方案，通过单碱基延伸反应可以区分差异碱基，同时完成同源序列的定量。

应用本发明可在单管反应中完成SMN1基因缺失检测、SMN2基因拷贝数检测、HBA1及HBA2的拷贝数定量。同时，核酸飞行质谱平台现已实现自动化，故本发明便于在临床推广应用，且能准确、全面的分析基因拷贝数变化，应用价值高。

具体地，本发明包括以下实施方案：

一方面，本发明涉及检测目的基因拷贝数的方法，包括：

a)设计所述目的基因的扩增和延伸引物、所述目的基因的竞争物、不存在拷贝数变异的内参基因的扩增和延伸引物，和所述内参基因的竞争物，其中所述目的基因的竞争物与所述目的基因存在至少1个核苷酸的差异并且与所述目的基因具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％的序列同一性，作为与所述目的基因的竞争性扩增模板在PCR扩增反应中同时扩增，所述目的基因的延伸引物在延伸反应中能够分别延伸所述目的基因和目的基因的竞争物的扩增产物；所述内参基因的竞争物与所述内参基因存在至少1个核苷酸序列的差异并且与所述内参基因具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％的序列同一性，作为所述内参基因的竞争性扩增模板在PCR扩增反应中同时扩增，所述内参基因的延伸引物能够在延伸反应中分别延伸所述内参基因和内参基因的竞争物的扩增产物；

b)在获自怀疑具有目的基因拷贝数变异的受试者的待测DNA样本和获自正常人的正常对照DNA样本中加入步骤a)所述的扩增引物，进行PCR扩增，得到目的基因、内参基因及其各自竞争物的PCR扩增产物；

c)在所述PCR扩增产物中加入步骤a)所述的延伸引物，进行延伸反应，得到目的基因、内参基因及其各自竞争物的延伸产物；

d)对所述延伸产物进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，并且将得到的各个延伸产物的数据进行以下分析：

i)样本内校正：计算待测样本中目的基因的校正用比值，即，内参基因/内参基因竞争物的比值，并且获得目的基因/目的基因竞争物的比值；用目的基因/目的基因竞争物的比值除以校正用比值，得到目的基因的初校后比值，即：目的基因与目的基因竞争物的比值/内参基因与内参基因竞争物的比值；

ii)样本间校正：按照步骤i)的方法，计算正常对照样本中目的基因的初校后比值；将步骤i)中获取的待测样本中的目的基因初校后比值与正常对照样本中相应的目的基因初校后比值相比，获得目的基因的终校后比值，即目的基因初校后比值_待测样本/目的基因初校后比值_{正常参考样本}；

iii)用待测样本目的基因终校后比值乘以2，得到待测样本中目的基因的拷贝数。

另一方面，本发明涉及检测目的基因拷贝数的试剂盒，其中含有所述目的基因的扩增和延伸引物、所述目的基因的竞争物、不存在拷贝数变异的内参基因的扩增和延伸引物，和所述内参基因的竞争物，其中所述目的基因的竞争物与所述目的基因存在至少1个核苷酸的差异并且与所述目的基因具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％的序列同一性，所述内参基因的竞争物与所述内参基因存在至少1个核苷酸的差异并且与所述内参基因具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％的序列同一性。

在一个实施方案中，DNA样本选自体液、血液、血清、血浆、尿、唾液、汗液、痰、精液、粘液、泪液、淋巴液、羊水、间质液、肺灌洗液、脑脊液、粪便和组织样本。

在一个实施方案中，所述目的基因的竞争物与所述目的基因存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的差异，并且所述内参基因的竞争物与所述内参基因存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的差异。

在一个实施方案中，所述目的基因是SMN1、SMN2、NAIP、HBA1、HBA2和/或HBQ基因。

在一个实施方案中，所述目的基因的扩增和延伸引物选自i)SMN17号外显子和SMN2 7号外显子的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：1-2和SEQ ID NO：6所示；ii)SMN18号外显子和SMN2 8号外显子的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：3-4和SEQ ID NO：5所示；iii)NAIP基因5号外显子的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：13-14和SEQ IDNO：15所示；iv)HBA1基因的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：17-18和SEQ ID NO：24所示；v)HBA2基因的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：19-20和SEQ ID NO：26所示；和vi)HBQ基因的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：21-22和SEQ ID NO：28所示。

在一个实施方案中，所述目的基因的竞争物选自i)SMN17号外显子和SMN2 7号外显子的竞争物，其如SEQ ID NO：7所示；ii)SMN1 8号外显子和SMN2 8号外显子的竞争物，其如SEQ ID NO：8所示；iii)NAIP基因5号外显子的竞争物，其如SEQ ID NO：16所示，iv)HBA1基因的竞争物，其如SEQ ID NO：23所示，v)HBA2基因的竞争物，其如SEQ ID NO：25所示，和vi)HBQ基因的竞争物，其如SEQ ID NO：27所示。

在一个实施方案中，所述内参基因是NFATC3基因，所述内参基因的扩增和延伸引物分别如SEQ ID NO：9-10和11所示，所述内参基因的竞争物如SEQ ID NO：12所示。

另一方面，本发明涉及引物，其如选自SEQ ID NO：1-6、SEQ ID NO：9-11、SEQ IDNO：13-15、SEQ ID NO：17-22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：28的序列所示。

另一方面，本发明涉及多核苷酸，其如选自SEQ ID NO：7、8、12、16、23、25和27的序列所示。

本发明可准确检测基因拷贝数变异，且同样可以应用于高度同源基因的精确拷贝数检测。

本发明可以在同一平台进行基因拷贝数的检测，提供疾病和健康相关基因的更全面分析。

不同于其他拷贝数变异检测方案，需有精准的DNA定量技术定量后，将所有待测样本与正常参考样本上样量统一。本发明可在DNA提取后，可通过nanodrop直接定量，甚至无需DNA定量步骤，理想待测样本上样量范围可为10-80ng，正常参考样本可选择在此区间任何量，比如10ng、20ng或者40ng用于后续校正即可，进一步精简操作，并降低检测成本。

本发明所用核酸飞行质谱平台已自动化，流程简单，耗时相对较少(8小时左右)，便于在临床推广应用。可通过本发明设计诸多与疾病相关的拷贝数变异检测方案，并在临床上实际推广应用。

附图说明

图1是SMN1、SMN2、NAIP基因拷贝数定量检测方案及预期结果示意图：以SMN1基因7号外显子上的设计为例，在SMN1基因7号外显子和SMN2基因8号外显子的差异碱基上下游设计PCR扩增引物，对该段序列进行扩增。此外，在PCR扩增时除gDNA模板外引入竞争物作为竞争性模板，竞争物的序列除差异碱基外，与gDNA扩增子的序列相同。基于上述差异碱基，进行了延伸引物的设计，不同的碱基之间分子量有差异，后续通过单碱基延伸反应和核酸飞行质谱检测平台识别区分SMN1、SMN2、竞争物的差异碱基。如结果示意图所示，可以区分不同SMN1基因拷贝数、不同SMN2基因拷贝数的人群，区分正常人、携带者及患者。

图2显示SMN1、SMN2、NAIP基因拷贝数定量检测方案在临床样本(正常、携带者、患者)中SMN1基因7号外显子检测结果及SMN2基因8号外显子中的检测结果。达成预期的检测效能，对正常、携带者、患者三类人群能准确区分诊断。

图3显示SMN1基因、SMN2基因、NAIP基因拷贝数定量方案拷贝数校正测试结果：目前其他拷贝数定量的检测方案大多要求较精准一致的模板上样量，而本方案的设计方案和校正方案对模板上样量的要求有较大的弹性空间。分别以10ng、20ng、40ng、80ng上样量做了15个重复。图3A，以随机4个10ng上样反应作为正常参考样本校正时的各反应拷贝数计算结果；图3B，以随机4个20ng上样反应作为正常参考样本校正时的各反应拷贝数计算结果；图3C，以随机4个40ng上样反应作为正常参考样本校正时的各反应拷贝数计算结果；图3D，以随机4个80ng上样反应作为正常参考样本校正时的各反应拷贝数计算结果。结果显示在以20ng上样反应作为正常参考样本校正时，10ng、20ng、40ng上样反应均能获得较为准确的拷贝数结果。

图4A-4D显示竞争物混合液储存稳定性测试结果：应用不同储存条件下竞争混合液进行了拷贝数定量检测方案的检测。图4A，应用添加了载体DNA，-20℃储存条件下竞争混合液的拷贝数定量结果；图4B，应用添加了载体DNA，4℃储存条件下竞争混合液的拷贝数定量结果；图4C，应用未添加载体DNA，-20℃储存竞争混合液的拷贝数定量结果；图4D，应用未添加了载体DNA，4℃储存竞争混合液的拷贝数定量结果。结果显示上述4种储存条件下，竞争物混合液均具有良好的稳定性，应用于拷贝数定量检测方案时，能稳定准确地对拷贝数进行定量。

图5A-5C显示竞争物反复冻融测试结果：对竞争物混合液进行多次冻融测试模拟在实际使用中的多次冻融，测试其在多次反复冻融后的稳定性。对竞争物混合液进行20次反复冻融，并应用其不同冻融次数的竞争物混合液做拷贝数定量检测方案的测试。图5A、5B，应用不同冻融次数的添加了载体DNA的竞争物混合液做拷贝数定量检测结果；

图5C，应用不同冻融次数的未添加载体DNA的竞争物混合液做拷贝数定量检测结果。结果显示添加和未添加载体DNA的竞争物混合液在反复冻融中均稳定性良好，均能准确进行拷贝数定量检测。

图6显示HBA基因拷贝数检测方案设计示意图：针对HBA基因常见三种缺失型，在HBA1基因和HBA2基因附近选取了三个高度保守的区域作为靶点进行了检测方案的设计。如图所示，αα^4.2缺失型仅缺失HBA2基因上游靶点HBA2，αα^3.7缺失型仅缺失HBA1基因上游靶点HBA1，--^SEA缺失型同时缺失HBA2基因上游靶点HBA2、HBA1基因上游靶点HBA1，及HBQ基因上游靶点HBAQ。

具体实施方式

现以SMN基因检测为例，对本发明的技术方案进行举例说明：

设计方案：

A.95％左右的脊髓性肌萎缩症患者的SMN1基因存在外显子7和/或外显子8的缺失。故本发明针对SMN基因外显子7及外显子8分别设计了PCR扩增引物，同时扩增SMN1及SMN2外显子7/8区域(扩增区域包含SMN1与SMN2外显子7上的差异位点，即7号外显子C840T，8号外显子G1239A)。针对SMN1和SMN2的两个差异位点所在分别设计了延伸引物，故在后续的单碱基延伸反应中可以区分SMN1和SMN2，通过和核酸飞行质谱平台可获得SMN1/SMN2，完成SMN1和SMN2的相对定量。

PCR引物命名及序列如下：

SMN_c.C840T_F：AACTTCCTTTATTTTCCTTAC(SEQ ID NO：1)

SMN_c.C840T_R：TAATGCTGGCAGACTTACTCC(SEQ ID NO：2)

SMN_c.G1239A_F：GTGAAATATTTTACTGGACTC(SEQ ID NO：3)

SMN_c.G1239A_R：TTTTCTCAACTGCCTCACCAC(SEQ ID NO：4)

延伸引物命名及序列如下：

SMN_c.G1239A_U：CCTCCCACCCCCACC(SEQ ID NO：5)

SMN_c.C840T_U：TTTATTTTCCTTACAGGGTTT(SEQ ID NO：6)

B.设计至少2个竞争物序列，分别对应步骤A所设计的两对PCR引物所扩增的目的序列，在以下位点(C840T＞G，G1239A＞C)分别引入序列变异(下划线标注碱基为引入的变异碱基)。

SMN_c.C840T_C：(95bp)

SMN_c.G1239A_C：(95bp)

C.为更加准确对SMN1和SMN2拷贝数的绝对定量，选取人类基因组上不存在拷贝数变异的基因序列作为内参。该段序列为位于人类16号染色体NFATC3基因外显子2上的一段序列，我们通过DECIPHER v9.30 database(该数据库涉包含30405人的基因组数据)选取的一段在其数据库人群中未见拷贝数变异的序列，并后续在UCSC的CNV database中确认该段序列确无拷贝数变异的记录。作为内参用于进一步的校正。选取的内参序列PCR扩增引物及延伸引物序列如下：

QC_g.G3C_F：ATATAGCCCATTAGGTGGTCC(SEQ ID NO：9)

QC_g.G3C_R：CTGTAGGTCATCTTCATGTGC(SEQ ID NO：10)

QC_g.G3C_U：TTGAATACTTGGGCACT(SEQ ID NO：11)

同时，如步骤B对该段扩增子待测位点引入不同于参考序列的碱基设计竞争物，其命名及序列如下：

QC_g.G3C_C：(109bp)

同步骤C中描述，在后续延伸反应中，基因组DNA模板和竞争物模板对应的延伸产物可通过核酸飞行质谱平台区分，并获得QC/竞争物用于后续校正，我们称之为内参校正比值。

D.有研究表明，脊髓性肌萎缩症患者的表型与NAIP基因拷贝数存在相关性，故如步骤D中QC测定的设计，我们对NAIP基因外显子5区域应用同样的方法进行了设计。其PCR扩增引物、延伸引物及竞争物序列分别如下：

NAIP-E5_c.G5C_F：GGAACCATTTGGCATGTTCCT(SEQ ID NO：13)

NAIP-E5_c.G5C_R：ACAGTGTTTTTCCTGTGGTGG(SEQ ID NO：14)

NAIP-E5_c.G5C_U：TGGGAAGAAGGAGATGAT(SEQ ID NO：15)

NAIP-E5_c.G5C_C：(81bp)

E.样本内校正：(1).我们通过步骤A-D中相应竞争物的设计，可在各设计中获得目的基因和竞争物的比值，包括SMN1 E7/竞争物、SMN2 E7/竞争物、SMN1 E8/竞争物、SMN2E8/竞争物、NAIP E5/竞争物及内参DNA序列的校正用比值QC/竞争物。在各反应中加入的竞争物为固定量，故上述目的基因比值和校正用比值可反映目的基因和内参基因的绝对量，且通过该比值使得我们在后续校正时减小了由于样本本身差异对PCR扩增反应的影响，定量更加准确。(2).其后通过将样本中获得的各目的基因比值与内参DNA序列(拷贝数稳定且正常的序列)的校正用比值相比，获得各目的基因在样本中的初校后比值。有赖于竞争物的设计，此时所获得的初校后比值避免了因目的序列与内参DNA序列PCR反应扩增效率可能不同造成的影响。(而在MLPA的设计中不存在类似竞争物的设计，使得其在样本内校正时只能获得目的基因/内参基因，若需减少样本差异或不同扩增效率差异造成的影响则需对数据进行更繁琐的校正。)注：此处样本包括待测的未知样本和3～4个用于进一步校正的已知拷贝数正常的参考样本。

F.样本间校正：在步骤A-F中我们获取了待测样本和一个或者多个正常参考样本的各目的基因初校后比值。将待测样本中的初校后比值与正常参考样本中的初校后比值相比获得各目的基因的终校后比值，如[SMN1 E7初校后比值_待测样本/SMN1 E7初校后比值_{正常参考样本}]。同时，已知正常参考样本中目的基因拷贝数均为2，故各待测样本的目的基因拷贝数即为各目的基因终校后比值*2，如SMN1 E7拷贝数＝[SMN1 E7初校后比值_待测样本/SMN1E7初校后比值_{正常参考样本}]*2。此外，有赖于竞争物联合内参DNA序列检测的设计，DNA上样量差异造成的影响在步骤F中已被大幅减少。故仅需保证待测样本上样量在一定区间内，同时选取在该区间内合适上样量的正常参考样本数据进行校正即可获得这些上样量不一的未知样本目的基因拷贝数。在样本类型及抽提DNA的方法确定且稳定的情况下，对待测样本进行粗糙的nanodrop定量甚至不需要预先定量，可通过设定多个不同上样量的正常样本用作校正即可获取待测样本目的基因拷贝数。(而在MLPA中，在同批实验中必须保证各待测样本与正常参考样本上样量均一致方可实验。)

本方案针对SMN1基因和SMN2基因的7号外显子和8号外显子的差异碱基进行了检测方案的设计(图1)，本方案能准确区分不同SMN1拷贝数、不同SMN2拷贝数的人群(图2)。

本拷贝数定量检测方案可应用于更多的机制明确的缺失型缺陷的单基因疾病。α-地中海贫血为HBA基因缺陷所致，90％的HBA基因缺陷为缺失型，故本拷贝数定量检测方案同样可应用于HBA基因缺失型的检测。故我们在完善的SMN基因检测方案的基础上，增添了HBA基因的拷贝数检测方案。

SMN基因拷贝数定量检测部分如上执行方案所述，增添的HBA基因拷贝数检测方案如下：

A.50％左右的HBA基因缺陷携带者为SEA缺失型αα/--^SEA，15％左右的HBA基因缺陷携带者为3.7缺失型(αα/αα^3.7)，15％左右的HBA基因缺陷携带者为4.2缺失型(αα/αα^4.2)，此外还有约10％左右的患者为SEA缺失型、3.7缺失型、4.2缺失型缺陷基因的复合型(如：--^SEA/αα^4.2，--^SEA/αα^3.7等)。不同于SMN基因检测方案设计思路，本方案在HBA2基因上游、HBA1基因上游、HBQ基因上游的特异性序列上进行了检测方案的设计。

B.在保证前述SMN检测方案的特异性的同时，本方案在HBA2基因上游、HBA1基因上游、HBQ基因上游的特异性序列上进行了检测方案的设计，故对这三个区域的PCR扩增引物设计如下。

HBA1_F：ACGTTGGATGTCAGCACCCTTCAGCCTGCTC(SEQ ID NO：17)

HBA1_R：ACGTTGGATGTTCTCTGCCCAAGGCAGCTTA(SEQ ID NO：18)

HBA2_F：ACGTTGGATGGAGACACTTCACTGAGAATAGG(SEQ ID NO：19)

HBA2_R：ACGTTGGATGATCTACAACTACTGCCACAGG(SEQ ID NO：20)

HBQ_F：ACGTTGGATGTGCCATAGGTGTTTACCAAGG(SEQ ID NO：21)

HBQ_R：ACGTTGGATGAGCTGGTAGCCATAAAGCCCTG(SEQ ID NO：22)

C.在上述PCR引物所扩增序列中选取合适的碱基突变(下划线标注)，进行竞争物及延伸引物的设计，设计如下：

HBA1_C(115bp)：

HBA1_U：AGGCAGCTTACCCTGG(SEQ ID NO：24)

HBA2_C(96bp)：

HBA2_U：tCTCTCTTTTTGGACAAAAATAC(SEQ ID NO：26)

HBQ_C(91bp)：

HBQ_U：agtAATATCTTTTATTCCCTGAGC(SEQ ID NO：28)

D.样本内校正：(1).我们通过竞争物的设计，可在各设计中获得目的基因和竞争物的比值，包括SMN1 E7/竞争物、SMN2 E7/竞争物、SMN1 E8/竞争物、SMN2 E8/竞争物、HBA1/竞争物、HBA2/竞争物、HBQ/竞争物及内参DNA序列的校正用比值QC/竞争物。在各反应中加入的竞争物为固定量，故上述目的基因比值和校正用比值可反映目的基因和内参基因的绝对量，且通过该比值使得我们在后续校正时减小了由于样本本身差异对PCR扩增反应的影响，定量更加准确。(2).其后通过将样本中获得的各目的基因比值与内参DNA序列(拷贝数稳定且正常的序列)的校正用比值相比，获得各目的基因在样本中的初校后比值。有赖于竞争物的设计，此时所获得的初校后比值避免了因目的序列与内参DNA序列PCR反应扩增效率可能不同造成的影响。(而在MLPA的设计中不存在类似竞争物的设计，使得其在样本内校正时只能获得目的基因/内参基因，若需减少样本差异或不同扩增效率差异造成的影响则需对数据进行更繁琐的校正。)注：此处样本包括待测的未知样本和3～4个用于进一步校正的已知拷贝数正常的参考样本。

E.样本间校正：在步骤A-E中我们获取了对未知待测样本和一个或者多个正常参考样本进行分析获得的各目的基因初校后比值与样本中各目的基因拷贝数成正比。故已知正常样本中各目的基因拷贝数为2，通过将未知样本中的初校后比值与正常参考样本中的初校后比值相比获得各目的基因的终校后比值，如[SMN1 E7初校后比值待测样本/SMN1 E7初校后比值正常参考样本]。同时，已知正常参考样本中目的基因拷贝数均为2，故各待测样本的目的基因拷贝数即为各目的基因终校后比值*2，如SMN1 E7拷贝数＝[SMN1 E7初校后比值待测样本/SMN1 E7初校后比值正常参考样本]*2。，即可获得未知样本中各目的基因拷贝数。此外，有赖于竞争物联合内参DNA序列检测的设计，DNA上样量差异造成的影响在步骤E中已被大幅减少。故仅需保证未知待测样本上样量在一定区间内，同时选取在该区间内合适上样量的正常参考样本数据进行校正即可获得这些上样量不一的未知待测样本目的基因拷贝数。在样本类型及抽提DNA的方法确定且稳定的情况下，对未知待测样本进行粗糙的nanodrop定量甚至不需要预先定量，可通过设定多个不同上样量的正常样本用作校正即可获取未知待测样本目的基因拷贝数。(而在MLPA中，在同批实验中必须保证各未知待测样本与正常参考样本上样量均一致方可实验。)

上述实验方案设计见图6以及下表：

实施例1：应用本发明方案与MLPA方案同时进行拷贝数定量测试并比较

核酸提取

收取确诊为脊髓性肌萎缩症患者2例、确诊为脊髓性肌萎缩症携带者5例、确诊为正常5例，及未知结果66例孕妇外周血样本(DNA已提取)。使用Qiagen Blood Mini Kit提取EDTA抗凝管所采集的全血样本。提取后采用Thermo Fish Picogreen DNA定量assay测定核酸浓度，并调整至20ng/ul。参考样本采用相同定量方案定量后调整浓度至20ng/ul。

核酸飞行质谱方案检测

A.PCR反应(试剂盒：Agena PCR reagent set)：

(1)配置拷贝数检测PCR引物混合液，下表为该混合液中包含的引物及其浓度：

(2)配置竞争物混合液，下表为该混合液中包含的竞争物及其浓度

(3)多重PCR反应体系配置，总反应体积10μL，如下表(试剂盒：Agena PCR reagentset)

样本检测：将待测样本DNA或参考样本DNA依序加入反应孔位，加样体积2μL；将竞争物混合液依序加入反应孔位作为竞争性模板，加样体积为2μL。

PCR反应程序设置如下表：

PCR反应完成后依序转移5μL PCR产物至新的反应板中，用于后续的虾碱性磷酸酶(SAP)反应。

B.SAP反应(试剂盒：Agena iPLEX pro reagent set)：

SAP反应体系配置如下表：

向步骤A中最后所得的5μL PCR产物依序加入2μL SAP反应液。

SAP反应程序设置如下表：

C.延伸反应(试剂盒：Agena iPLEX pro reagent set)：

(1)配置拷贝数检测延伸引物混合液，下表为该混合液中包含的引物及其浓度：

(2)延伸反应体系配置如下表：

延伸反应程序设置如下表：

D.核酸飞行质谱平台点样分析获取数据并分析，具体如下。

a)样本内校正：处理步骤D中获得的数据，获得待测样本中的目的基因和竞争物的比值，包括SMN1 E7/竞争物、SMN2 E7/竞争物、SMN1 E8/竞争物、SMN2 E8/竞争物、NAIP E5/竞争物及内参DNA序列的校正用比值QC/竞争物。将SMN1 E7/竞争物、SMN2 E7/竞争物、SMN1E8/竞争物、SMN2 E8/竞争物、NAIP E5/竞争物比上校正用比值QC/竞争物，获得各目的基因的初校后比值，即[目的基因和竞争物比值/校正用比值]。

b)样本间校正：同步骤a，获取正常参考样本中的各目的基因初校后比值，将步骤a中获取的待测样本中各目的基因初校后比值与正常参考样本中相应的目的基因初校后比值相比，获得各目的基因终校后比值，如[SMN1 E7初校后比值_待测样本/SMN1 E7初校后比值_{正常参考样本}]。

c)已知正常参考样本中目的基因拷贝数均为2，故各待测样本的目的基因拷贝数即为各目的基因终校后比值*2，如SMN1 E7拷贝数＝[SMN1 E7初校后比值_待测样本/SMN1 E7初校后比值_{正常参考样本}]*2。

MLPA方案检测

试剂盒：SALSA MLPA P021 SMA probe mix

DNA变性：依序向不同PCR反应管中各加入5μl上述样本DNA，所有样本上样总量均为60ng。

DNA变性条件如下表，反应所使用仪器为Bio-Rad S1000 Thermal Cycler：

A.杂交反应体系配置如下表：

杂交反应条件如下表，反应所使用仪器为Bio-Rad S1000 Thermal Cycler：

B.连接反应体系配置如下表：

连接反应条件如下表，反应所使用仪器为Bio-Rad S1000 Thermal Cycler：

C.PCR反应体系配置如下表，反应所使用仪器为Bio-Rad S1000 Thermal Cycler：

PCR反应条件如下表：

D.通过ABI 3730xl毛细管电泳分析PCR产物获得数据，并应用MRC-hollad公司提供的coffalyser.Net程序分析数据。

结果分析：

表一、12例已知样本核酸飞行质谱方案检测结果与MLPA方案检测结果比较

表二、66例孕妇外周血样本核酸飞行质谱方案与MLPA方案结果比较：

结论：本发明提供的核酸飞行质谱方案检测结果与MLPA方案一致。

实施例2：SMN基因核酸飞行质谱定量方案校正精度及批内精密度实验测试

核酸提取

使用apostle唾液样本基因组提取试剂盒提取已知正常志愿者唾液样本DNA，提取后采用Thermo Fisher Qubit 4.0测定核酸浓度。

核酸飞行质谱方案检测

A.PCR反应(试剂盒：Agena PCR reagent set)：

(3)多重PCR反应体系配置，总反应体积10μL，如下表：

样本检测：分别以10ng、20ng、40ng、80ngDNA作为模板，4个上样量均做15个重复反应孔(15次重复反应分3个批次完成，每个批次做5个重复)；将竞争物混合液依序加入反应孔位作为竞争性模板，加样体积为2μL。

PCR反应程序设置如下表：

PCR反应完成后依序转移5μL PCR产物至新的反应板中，用于后续的SAP反应。

B.SAP反应：

SAP反应体系配置如下表：

向步骤A中最后所得的5μL PCR产物依序加入2μL SAP反应液。

SAP反应程序设置如下表：

C.延伸反应：

配置拷贝数检测延伸引物混合液，下表为该混合液中包含的引物及其浓度：

延伸反应体系配置如下表：

延伸反应程序设置如下表：

D.核酸飞行质谱平台点样分析获取数据并分析，在获取各反应的目的基因初校比值后，随机选取4个10ng上样反应作为正常参考样本校正，计算其他所有反应中各目的基因的拷贝数。随后依次以20ng、40ng、80ng上样反应中的随机4个作为正常参考样本校正，计算其他所有反应中各目的基因的拷贝数。4次拷贝数计算结果见图3A-D。

如图3A-D所示：

1.在相同上样量的反应中，各目的基因拷贝数计算结果一致，且批间重复性亦良好；

2.在10ng、20ng、40ng、80ng不同上样量的情况下，各目的基因拷贝数计算结果分布模式一致；

3.如图3B所示，当以20ng上样反应作为正常参考样本校正时，10ng、20ng、40ng上样的反应均能获得较为准确的拷贝数，此时80ng上样的反应所计算的拷贝数有相对多的临界值(如计算结果为2.4-2.6拷贝)出现。

如图3C所示，当以40ng上样反应作为正常参考样本校正时，20ng、40ng、80ng上样的反应均能获得较为准确的拷贝数，此时10ng上样的反应所计算的拷贝数有少量的临界值(如计算结果为1.4-1.6拷贝)出现

4.综上，本实验方案具有良好的重复性，且有赖于内参DNA序列的设计，该方案对DNA上样量的要求有很大弹性空间。我们对于样本有稳定良好的DNA提取方案，产出质量均可靠，此时仅需通过nanodrop粗略定量即可。

表三：SMN核酸飞行质谱定量批内精度变异系数

实验结论：上述数据验证了竞争物联合内参DNA序列的实验设计及后续的校正方法可大幅减少上样量差异对拷贝数定量带来的影响。且从上述数据来看，在后续实验中选取10ng、20ng、40ng上样的正常样本用作校正在获取准确的结果的同时，减少了对DNA上样量的准确性的要求。此外，在15次重复中，批内变异系数均＜12％，反应稳定且具有良好的重复性。

实施例3：竞争物稳定性测试(长期储存测试、反复冻融测试)

由于本发明检测方案所依托于竞争物，我们对竞争物的稳定性进行了测试，包括长期储存测试和反复冻融测试。

一、长期储存测试：

1.配置2管具有载体DNA(carrier DNA)的竞争物混合物和2管不具有载体DNA的竞争物混合物分别储存于-20℃、4℃，并在各自管子上标记其储存温度。

配置竞争物混合液，下表为该混合液中包含的竞争物及其浓度。同时为测试加入载体DNA是否能增强其储存的稳定性，加入QIAGEN Salmon Sperm DNA(其在混合液中终浓度为100ng/μl)。

2.每隔一段时间取出并应用核酸飞行质谱检测方案检测测试其稳定性，分析比较不同时间点各个储存温度下的测试结果。

3.该测试所用样本为2个参考样本，上样量均为40ng。

4.应用前述核酸飞行质谱检测方案检测。

A.PCR反应(试剂盒：Agena PCR reagent set)：

(2)多重PCR反应体系配置，总反应体积10μL，如下表：

样本检测：以40ng gDNA作为模板；将不同条件下储存的竞争物混合液(含载体DNA/不含载体DNA)依序加入反应孔位作为竞争性模板，加样体积为2μL。

PCR反应程序设置如下表：

D.SAP反应(试剂盒：Agena iPLEX pro reagent set)：

SAP反应体系配置如下表：

向步骤A中最后所得的5μL PCR产物依序加入2μL SAP反应液。

SAP反应程序设置如下表：

E.延伸反应(试剂盒：Agena iPLEX pro reagent set)：

延伸反应体系配置如下表：

延伸反应程序设置如下表：

5.核酸飞行质谱平台点样分析获取数据并分析

6.结果分析见图4A-4D。

竞争物为人工合成的单链引物，本方案将其引入用作PCR反应的竞争性模板。理论上单链DNA相较双链DNA其稳定性会相对较差，本实验测试了不同储存条件下竞争物混合物是否会对本拷贝数定量方案造成影响。

如图4A-D所示：应用不同储存条件(储存温度、是否添加载体DNA)下对同一样本的检测结果无差异，均能准确定量。且在各储存条件下，三个批次(每个批次检测时间相差30天左右)的检测结果无差异，均能准确定量。

故本方案所配置竞争物混合物有良好的稳定性，在合适条件下长期储存的情况下能保证拷贝数定量方案的准确性。

二、反复冻融测试：

1.配置具有载体DNA的竞争物混合物和不具有携带者DNA的竞争物混合物并储存于-80℃。

下表为该混合液中包含的竞争物及其浓度。同时为测试加入载体DNA是否能增强其储存的稳定性，加入 QIAGEN Salmon Sperm DNA(其在混合液中终浓度为100ng/μl)。

2.待完全结冰后，取出置于室温条件下完全解冻。振荡离心，分别吸取10ul至新的管子中，标记为解冻1次，并将其置于-80℃保存。将原始管重新置于-80℃冰冻。

3.待完全结冰后，取出置于室温条件下完全解冻。再将原始管置于-80℃冰冻。

4.待完全结冰后，取出置于室温条件下完全解冻。振荡离心，分别吸取10ul至新的管子中，标记为解冻3次，并将其置于-80℃保存。将原始管重新置于-80℃冰冻。

5.重复3-4数次，获得解冻5、7、9、11、13、15、17、19次的竞争物混合物均置于-80℃保存。

6.将解冻1、3、5、7、9、11、13、15、17、19次的竞争物混合物全部取出，再次解冻获得解冻2、4、6、8、10、12、14、16、18、20次的竞争物混合物。

7.应用前述核酸飞行质谱检测方案检测。

A.PCR反应(试剂盒：Agena PCR reagent set)：

(2)多重PCR反应体系配置，总反应体积10μL，如下表：

样本检测：以40ngDNA作为模板；将冻融不同次数的竞争物混合液(含载体DNA/不含载体DNA)依序加入反应孔位作为竞争性模板，加样体积为2μL。

PCR反应程序设置如下表：

B.SAP反应(试剂盒：Agena iPLEX pro reagent set)：

SAP反应体系配置如下表：

向步骤A中最后所得的5μL PCR产物依序加入2μL SAP反应液。

SAP反应程序设置如下表：

C.延伸反应(试剂盒：Agena iPLEX pro reagent set)：

延伸反应体系配置如下表：

延伸反应程序设置如下表：

8.结果分析见图5A-5C。

竞争物为人工合成的单链引物，本方案将其引入用作PCR反应的竞争性模板。单链DNA相较双链DNA其稳定性会相对较差，反复冻融可能会加速DNA的降解。本实验测试了不同冻融次数对本实验方案所配置的竞争物混合物是否会最终影响拷贝数定量的准确性。

如图5A-C所示：本实验所配置的竞争物混合物，历经20次反复冻融，仍能准确检测拷贝数。且应用不同冻融次数的竞争物混合物之间的拷贝数定量结果无差异。

实施例4：SMN基因和HBA基因拷贝数的联合检测

核酸提取

采集7名志愿者2ml唾液样本，应用apostle唾液DNA提取试剂盒对唾液样本进行提取。提取后采用Thermo Fish Picogreen DNA定量assay测定核酸浓度，并调整至20ng/ul。参考样本采用相同定量方案定量后调整浓度至20ng/ul。

核酸飞行质谱方案检测

A.PCR反应(试剂盒：Agena PCR reagent set)：

(4)多重PCR反应体系配置，总反应体积10μL，如下表(试剂盒：Agena PCR reagentset)

PCR反应程序设置如下表：

B.SAP反应(试剂盒：Agena iPLEX pro reagent set)：

SAP反应体系配置如下表：

向步骤A中最后所得的5μL PCR产物依序加入2μL SAP反应液。

SAP反应程序设置如下表：

C.延伸反应(试剂盒：Agena iPLEX pro reagent set)：

(2)延伸反应体系配置如下表：

延伸反应程序设置如下表：

D.核酸飞行质谱平台点样分析获取数据并分析，具体如下。

a)样本内校正：处理步骤D中获得的数据，获得待测样本中的目的基因和竞争物的比值，包括SMN1 E7/竞争物、SMN2 E7/竞争物、SMN1 E8/竞争物、SMN2 E8/竞争物、HBA1/竞争物、HBA2/竞争物、HBQ/竞争物及内参DNA序列的校正用比值QC/竞争物。将SMN1 E7/竞争物、SMN2 E7/竞争物、SMN1 E8/竞争物、SMN2 E8/竞争物、HBA1/竞争物、HBA2/竞争物、HBQ/竞争物比上校正用比值QC/竞争物，获得各目的基因的初校后比值，即[目的基因和竞争物比值/校正用比值]。

E.通过步骤D分析数据获得各样本目的基因拷贝数如表四：

表四：SMN基因和HBA基因拷贝数的联合检测结果

序列表

<110> 浙江中创生物医药有限公司

<120> 基因拷贝数定量分析

<130> CPCH1961683N

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 1

aacttccttt attttcctta c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

taatgctggc agacttactc c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

gtgaaatatt ttactggact c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

ttttctcaac tgcctcacca c 21

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

cctcccaccc ccacc 15

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

tttattttcc ttacagggtt t 21

<210> 7

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 7

aacttccttt attttcctta cagggtttga gacaaaatca aaaagaagga aggtgctcac 60

attccttaaa ttaaggagta agtctgccag catta 95

<210> 8

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 8

gtgaaatatt ttactggact ctattttgaa aaaccatctg taaaagactg cggtgggggt 60

gggaggccag cacggtggtg aggcagttga gaaaa 95

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

atatagccca ttaggtggtc c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

ctgtaggtca tcttcatgtg c 21

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

ttgaatactt gggcact 17

<210> 12

<211> 109

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 12

atatagccca ttaggtggtc ccaaaccctt tcagtgccca agtattcaaa ttacatctat 60

ctctcctaac tgtcatcaag aattagatgc acatgaagat gacctacag 109

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

ggaaccattt ggcatgttcc t 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

acagtgtttt tcctgtggtg g 21

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

tgggaagaag gagatgat 18

<210> 16

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 16

gggaaccatt tggcatgttc cttccaagca tcatctcctt cttcccaatt tcctaaacat 60

ccaccacagg aaaaacactg t 81

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

acgttggatg tcagcaccct tcagcctgct c 31

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

acgttggatg ttctctgccc aaggcagctt a 31

<210> 19

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

acgttggatg gagacacttc actgagaata gg 32

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

acgttggatg atctacaact actgccacag g 31

<210> 21

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

acgttggatg tgccataggt gtttaccaag g 31

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

acgttggatg agctggtagc cataaagccc tg 32

<210> 23

<211> 115

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 23

ttctctgccc aaggcagctt accctgggtt gctcctggac acccagggca gggcctgagt 60

aagggcctgg ggagacaggg cagggagcag gctgaagggt gctgacctga tgcac 115

<210> 24

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

aggcagctta ccctgg 16

<210> 25

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 25

atctacaact actgccacag gctctctttt tggacaaaaa tacgatcata ctgtagatac 60

ctgtgtacaa cttcctattc tcagtgaagt gtctcc 96

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

tctctctttt tggacaaaaa tac 23

<210> 27

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 27

agctggtagc cataaagccc tggccctcaa ctgataggaa tatcttttat tccctgagcg 60

catgaatcac ccttggtaaa cacctatggc a 91

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

agtaatatct tttattccct gagc 24

Claims

1.检测目的基因拷贝数的方法，包括：

a)设计所述目的基因的扩增和延伸引物、所述目的基因的竞争物、不存在拷贝数变异的内参基因的扩增和延伸引物，和所述内参基因的竞争物，其中所述目的基因的竞争物与所述目的基因存在至少1个核苷酸的差异并且与所述目的基因具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％的序列同一性，作为与所述目的基因的竞争性扩增模板在PCR扩增反应中同时扩增，所述目的基因的延伸引物在延伸反应中能够分别延伸所述目的基因和目的基因的竞争物的扩增产物；所述内参基因的竞争物与所述内参基因存在至少1个核苷酸的差异并且与所述内参基因具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％的序列同一性，作为所述内参基因的竞争性扩增模板在PCR扩增反应中同时扩增，所述内参基因的延伸引物能够在延伸反应中分别延伸所述内参基因和内参基因的竞争物的扩增产物；

2.权利要求1的方法，其中所述DNA样本选自体液、血液、血清、血浆、尿、唾液、汗液、痰、精液、粘液、泪液、淋巴液、羊水、间质液、肺灌洗液、脑脊液、粪便和组织样本。

3.权利要求1或2的方法，其中所述目的基因是SMN1、SMN2、NAIP、HBA1、HBA2和/或HBQ基因。

4.权利要求1-3的任一项的方法，其中所述目的基因的竞争物与所述目的基因存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的差异，并且所述内参基因的竞争物与所述内参基因存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的差异。

5.权利要求3的方法，其中所述目的基因的扩增和延伸引物选自i)SMN1 7号外显子和SMN2 7号外显子的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：1-2和SEQ ID NO：6所示；ii)SMN18号外显子和SMN2 8号外显子的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：3-4和SEQ ID NO：5所示；iii)NAIP基因5号外显子的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：13-14和SEQ IDNO：15所示；iv)HBA1基因的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：17-18和SEQ ID NO：24所示；v)HBA2基因的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：19-20和SEQ ID NO：26所示；vi)HBQ基因的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：21-22和SEQ ID NO：28所示。

6.权利要求3的方法，其中所述目的基因的竞争物选自i)SMN1 7号外显子和SMN2 7号外显子的竞争物，其如SEQ ID NO：7所示；ii)SMN1 8号外显子和SMN2 8号外显子的竞争物，其如SEQ ID NO：8所示；iii)NAIP基因5号外显子的竞争物，其如SEQ ID NO：16所示，iv)HBA1基因的竞争物，其如SEQ ID NO：23所示，v)HBA2基因的竞争物，其如SEQ ID NO：25所示，和vi)HBQ基因的竞争物，其如SEQ ID NO：27所示。

7.权利要求3的方法，其中所述内参基因是NFATC3基因，所述内参基因的扩增和延伸引物分别如SEQ ID NO：9-10和11所示，所述内参基因的竞争物如SEQ ID NO：12所示。

8.检测目的基因拷贝数的试剂盒，其中含有所述目的基因的扩增和延伸引物、所述目的基因的竞争物、不存在拷贝数变异的内参基因的扩增和延伸引物，和所述内参基因的竞争物，其中所述目的基因的竞争物与所述目的基因存在至少1个核苷酸的差异并且与所述目的基因具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％的序列同一性，所述内参基因的竞争物与所述内参基因存在至少1个核苷酸的差异并且与所述内参基因具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％的序列同一性。

9.权利要求8的试剂盒，其中所述目的基因是SMN1、SMN2、NAIP、HBA1、HBA2和/或HBQ。

10.权利要求8或9的试剂盒，其中所述目的基因的竞争物与所述目的基因存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的差异，并且所述内参基因的竞争物与所述内参基因存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的差异。

11.权利要求9的试剂盒，其中所述目的基因的扩增和延伸引物是i)SMN1 7号外显子和SMN2 7号外显子的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：1-2和SEQ ID NO：6所示；ii)SMN18号外显子和SMN2 8号外显子的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：3-4和SEQ ID NO：5所示；iii)NAIP基因5号外显子的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：13-14和SEQ IDNO：15所示；iv)HBA1基因的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：17-18和SEQ ID NO：24所示；v)HBA2基因的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：19-20和SEQ ID NO：26所示；vi)HBQ基因的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：21-22和SEQ ID NO：28所示。

12.权利要求11的试剂盒，其中所述所述目的基因的竞争物选自i)SMN17号外显子和SMN2 7号外显子的竞争物，其如SEQ ID NO：7所示；ii)SMN1 8号外显子和SMN2 8号外显子的竞争物，其如SEQ ID NO：8所示；iii)NAIP基因5号外显子的竞争物，其如SEQ ID NO：16所示，iv)HBA1基因的竞争物，其如SEQ ID NO：23所示，v)HBA2基因的竞争物，其如SEQ ID NO：25所示，和vi)HBQ基因的竞争物，其如SEQ ID NO：27所示。

13.权利要求9的试剂盒，其中所述内参基因是NFATC3基因，所述内参基因的扩增和延伸引物分别如SEQ ID NO：9-10和11所示，所述内参基因的竞争物如SEQ ID NO：12所示。

14.引物，其如选自SEQ ID NO：1-6、SEQ ID NO：9-11、SEQ ID NO：13-15、SEQ ID NO：17-22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：28的序列所示。

15.多核苷酸，其如选自SEQ ID NO：7、8、12、16、23、25和27的序列所示。