CN111944890A

CN111944890A - 一种检测smn1拷贝数的荧光定量扩增体系及试剂盒

Info

Publication number: CN111944890A
Application number: CN202010782028.0A
Authority: CN
Inventors: 陈莹; 张奇; 王怡慧; 张颖; 张晔
Original assignee: BEIJING MICROREAD GENE TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: BEIJING MICROREAD GENE TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2020-11-17

Abstract

本发明涉及一种检测SMN1拷贝数的荧光定量扩增体系及试剂盒。本发明与常规荧光定量PCR方法类似地，只是在扩增体系中还有一条用于抑制SMN2扩增和/或产生荧光信号的Blocker。Blocker与探针同方向，可特异性结合SMN2。抑制SMN1同源基因SMN2目标区域的非特异性扩增。该体系可提高扩增检测SMN1基因的特异性，提高对SMN1基因拷贝数定量能力，实现对0、1、2及更多拷贝的有效区分。本发明的试剂盒可稳定、准确、简便地对SMN1基因Exon7和Exon8的拷贝数进行准确定量，实现对SMA患者、携带者和正常人的检测。

Description

一种检测SMN1拷贝数的荧光定量扩增体系及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种体外检测运动神经元存活基因(Survival of Motor Neuron，SMN1)拷贝数PCR体系及检测试剂盒。

背景技术

脊髓性肌萎缩症，Spinal muscular atrophy(SMA)，是一种脊髓前角运动神经元变性导致肌无力、肌萎缩常染色体隐性遗传病。SMA的携带率和发病率在各人种中基本相同，携带者频率1/40～1/60，新生儿中发病率约4～10/100,000。正常情况下人类机体会正常表达SMN蛋白，来维护脊髓前角细胞功能。当SMN蛋白表达下降甚至消失后，将导致脊髓前角细胞变性，从而使个体身体躯干和四肢近端骨骼肌进行性肌无力、肌萎缩，即脊髓性肌萎缩症(SMA)。

SMA的致病基因定位于五号染色体5q13.2区域。该区域整体呈现为一个巨大的反向重复结构，这也导致该区域内容易发生非等位基因间同源重组，造成基因缺失或重复等异常。

在该区域上的两个高度同源的基因被命名为运动神经元存活基因(survivalmotor neuron,SMN)。研究发现，靠近端粒的SMN1是SMA的致病性基因。如果两个SMN1基因拷贝全部缺失或带有致病性突变则会导致SMA；靠近中心体的SMN2不是SMA致病性基因，但其拷贝数与SMA临床表现严重程度相关。

SMN基因全长20kb，含有9个外显子(1、2a、2b、3-8)。SMN1和SMN2基因序列在包括启动子在内的全部基因区域高度一致。一般认为SMN1和SMN2基因只有5个碱基的区别，它们分布在内含子6到外显子8之间的区域内。SMN1和SMN2基因所有外显子序列仅存在两个碱基不同，其一是外显子7中的一个不同碱基(Exon 7+6，第840碱基，C/T)，该碱基为同义突变；其二是外显子8中的一个不同碱基(Exon 8+245，G/A)，该碱基位于终止密码子后，对蛋白编码无影响。因此，SMN1和SMN2所编码的氨基酸序列是完全一致的。

SMN基因转录产物长约1.7kb，编码294个氨基酸的SMN蛋白，参与构成与RNA加工有关的多蛋白复合体。SMN蛋白在人体组织中普遍表达，脊髓前角运动神经元对其需求较高，若SMN蛋白表达水平过低，会使神经元死亡，导致肌肉的萎缩。

SMN1可以表达稳定、完整的功能的SMN蛋白。虽然SMN2与SMN1基因序列极为相近，但SMN2在体内转录出的大部分转录产物没有正确剪接，仅有约10％的mRNA拼接正确并翻译出具有正常活性SMN蛋白。大部分转录本缺失了第七外显子，被称作Δ7SMN2，这些蛋白缺乏正常SMN蛋白功能且会被很快降解。因此SMN2不能完全代偿SMN1基因缺失或突变带来的SMN蛋白的不足，但其拷贝数量会影响SMN1缺失SMA患者的疾病严重程度。

造成SMN1和SMN2剪接不同的原因，在于两基因在7号外显子上的一个碱基不同，外显子7的第六位(Exon 7+6)即编码区的840位核苷酸，在SMN1中为C而在SMN2中为T(840C>T)。该碱基差异被认为影响了该区域剪切增强子的结构和功能，并最终造成RNA剪接方式的不同。所以该位置的碱基，840C>T，是影响能否产生正常SMN蛋白的关键碱基，也是区分SMN1和SMN2功能差异的关键碱基。

95～98％的SMA患者存在SMN1第7外显子和/或第8外显子的纯合缺失(Hum.Genet.12:1015-1023,2004)，另外约5％的患者存在SMN1杂合缺失且仅存的SMN1拷贝上存在致病性突变或其他未知致病原因。因此，定量检测SMN1基因第7号和第8号外显子拷贝数是SMA基因筛查和产前分子诊断的主要策略。

当前已有的，对SMN1拷贝数检测的方法主要有：

1.MLPA(Multiplex Ligation-dependent probe amplification)

该方法使用多组特异性探针与SMN1外显子7和其他相关位置以及大量对照位点位置杂交，并连接扩增。通过比较SMN1外显子7产物量与各个对照位点产物量，可定量确定SMN1拷贝数。由于长期以来对SMN1拷贝数检测没有更为准确的方法，MLPA方法是科研和临床检测上相对应用最广泛的方法。但该方法操作复杂，成本高，对待检测样本要求高，数据分析繁琐。而且每次检测要求同时检测多个对照样本，根据对照样本结果对检测结果进行修正，对照样本选取不当或结果异常也会导致检测错误。

2.qPCR

qPCR在较大尺度具备优秀的定量能力，但在区分基因的1个拷贝或2个拷贝上定量能力一般。理论上，1拷贝的CT值和2拷贝的CT值差异只有1，要保证有效区分CT差异为1的样本，对检测稳定性和重复性要求很高。

3.ddPCR(Droplet Digital PCR)

该方法定量能力较好，可有效对SMN1拷贝数进行检查。除了操作复杂、成本高外，ddPCR也需要对内参基因进行检测，类似于qPCR，对检测特异性、稳定性和重复性要求很高。

4.高分辨熔解曲线HRM

该方法以一对共同的引物扩增SMN1和SMN2外显子7相关区域，对产物测定熔解曲线。由于SMN1和SMN2序列上个别碱基差异，两种纯合双链和杂合双链的熔解曲线峰值不同，会导致两种产物在熔解曲线上表现出特定的样式。该方法的问题是，能定量确定SMN1和SMN2的拷贝数比例，但不能最终确定数值。如无法区分SMN1:SMN2＝1:2或者2:4，而且对SMN2拷贝数为0的样本也无法检测。为了解决这些问题，还需要引入其他检测，如确定SMN1和SMN2总拷贝数等。由于SMN1和SMN2拷贝数组合较多，区分不同的熔解曲线样式也较为不便及易发生错误。

5.NGS(Next Generation Sequencing)

通常的方法是扩增或捕获SMN1和SMN2外显子7相关区域，建库测序，根据840C/T比例确定SMN1和SMN2的拷贝数比例。但只有这个结果无法确定拷贝数最终数值，还需要通过其它方法获得SMN1和SMN 2的总拷贝数。总拷贝数的计算可以根据同时检测的大量其他基因的测序结果reads数与SMN基因总reads数，按照特定算法进行确定。上述方法可以有效检测SMN1拷贝数，但操作复杂、成本较高、结果计算复杂，且同样需要大量内参基因检测，对反应条件控制要求较高。

此外还有Sanger测序、单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、变性高效液相色谱分析(DHPLC)等方法，这些方法都存在定量能力低、稳定性差、操作繁琐、有可能需要其他检测修正结果等问题，不适于大规模临床检测使用。因此，迫切需要一种快速准确定量SMN1和/或SMN2基因拷贝数的检测方法。

发明内容

本发明提供一种SMN1基因拷贝数的检测体系，在常规荧光定量检测方法的基础上整合特异性阻断剂(Blocker)技术，进一步提高对SMN1拷贝数定量的特异性和区分度。

常规荧光定量检测方法，在一个荧光定量扩增体系中，通过特异性引物和探针，同时开展检测目的基因和内参基因，并通过比较目的基因和内参基因CT值差异确定目的基因拷贝数。但是SMN1基因拷贝数检测有两个特殊的困难。一是临床检测需求要区分SMA携带者和正常人，即区分1拷贝和2拷贝，这对检测的特异性和稳定性要求非常高；二是SMN1和SMN2基因序列一致性非常高，SMN2易于引起非特异的扩增，干扰SMN1定量准确程度。

为了解决上述两个问题，尤其是SMN2非特异性问题，本发明采用以下方案(以检测SMN1E7为例，检测E8原理相同)：

一种检测SMN1基因拷贝数的荧光定量扩增体系，其特征在于：扩增体系中含有下述特异性引物：

(1)检测内参基因的三条寡核苷酸：上游引物、下游引物和探针，

(2)扩增检测目的基因SMN1 Exon7或/和SMN1 Exon7的三条寡核苷酸：上游引物、下游引物和探针，

(3)抑制SMN2扩增和/或产生荧光信号的Blocker。

抑制SMN2扩增和/或产生荧光信号的Blocker：

SMN2 Exon7特异性Blocker：

SMN2 Blocker Exon7：5′–CTTCTTTTTGATTTTGTCTAAAACCCTGTAAGGA–C3 spacer–3′；

或者

SMN2 Exon8特异性Blocker：

SMN2 Blocker Exon8：5′–GGCCTCCCACCCCCACCTCAGTCTTTTACAG–C3 spacer–3′。

优选：扩增检测目的基因SMN1 Exon7的三条寡核苷酸分别为：

SMN1 Exon7上游引物：SMN1-e7-F：5′–CAAAATGCTTTTTAACATCCATATAAAGC–3′，

SMN1 Exon7下游引物：SMN1-e7-R：5′–ATGTGAGCACCTTCCTTCTTTTTG–3′，

SMN1 Exon7特异性探针：SMN1-e7-Probe：5′–FAM-TTTGTCTGAAACCCTG-MGB–3′，

优选：扩增检测目的基因SMN1 Exon8的三条寡核苷酸分别为：

SMN1 Exon8上游引物：SMN1-e8-F：5′–AAGTGGAATGGGTAACTCTTC–3′

SMN1 Exon8下游引物：SMN1-e8-R：5′–ACCGTGCTGGCCTCCCAC–3′

SMN1 Exon8特异性探针：SMN1-e8-Probe：5′–FAM-CCCACCCCAGTCT-MGB–3′

所述检测内参基因的三条寡核苷酸：

ACTIN上游引物：ACTIN-F：5′–TCTGCCTTACAGATCATGTTTGAGAC–3′

ACTIN下游引物：ACTIN-R：5′–GTACGGCCAGAGGCGTACAG–3′

ACTIN特异性探针：ACTIN-Probe：5′–HEX-AACACCCCAGCCAT-MGB–3′

所述引物添加有修饰或以修饰碱基取代正常碱基，所述修饰为荧光集团修饰、磷酸化修饰、硫代磷酸化修饰、锁核酸修饰或肽核酸修饰；或者所述引物在3’端-2至-15位改动1至3个碱基和/或在引物3’端-15位之后的序列进行改动，所述改动包括末端增加其他序列、删除部分末端序列、改变部分碱基序列。

所述扩增体系中还包括PCR缓冲液和DNA聚合酶。

一种用于检测SMN1基因拷贝数的试剂盒，所述试剂盒包括检测SMN1基因拷贝数的荧光定量扩增体系。

与常规荧光定量PCR方法类似地，体系中包含用于扩增检测内参基因(ACTIN)的三条寡核苷酸，上游引物(seq No.7)、下游引物(seq No.8)和探针(seq No.9)，以及用于扩增检测目的基因(SMN1 E7)的三条寡核苷酸，上游引物(seq No.1)、下游引物(seq No.2)和探针(seq No.3)。在此之外，体系中还有一条用于抑制SMN2扩增和/或产生荧光信号的Blocker(seq No.10)(如图1所示)。Blocker与探针同方向，都反向结合于功能性位点840C/T附近。在840碱基对应位置，Blocker为A碱基，可特异性结合SMN2；探针为G碱基，可特异性结合SMN1。Blocker3′端被封闭，无法继续延伸，可以特异性地阻止SMN2模板扩增，而且也可以阻止探针结合在SMN2来源的扩增产物，使其无法产生荧光信号。另外，Blocker与下游引物有一定重叠，当Blocker结合与SMN2模板时，下游引物无法结合，从而抑制了SMN2的扩增。检测SMN1 E8，包括包含用于扩增检测内参基因(ACTIN)的三条寡核苷酸，上游引物(seqNo.7)、下游引物(seq No.8)和探针(seq No.9)，以及用于扩增检测目的基因(SMN1 E8)的三条寡核苷酸，上游引物(seq No.4)、下游引物(seq No.5)和探针(seq No.6)。在此之外，体系中还有一条用于抑制SMN2扩增和/或产生荧光信号的Blocker(seq No.11)。

如果不使用Blocker，SMN1和SMN2的特异性只能通过上下游引物或探针来体现。理论上可以只利用一个碱基的差异实现特异性检测，但在实际应用中，这种方法稳定性难以保证，区分度相对较差。本发明在体系中加入针对SMN2的Blocker，可以干扰下游引物结合于SMN2、阻断SMN2的扩增、阻断探针与SMN2的非特异结合。与常规荧光定量技术相比，本发明的有益效果在于：可以有效减低SMN2同源序列对SMN1探针的结合，提高荧光定量PCR扩增SMN1Exon7和SMN1 Exon8特定序列的灵敏度，提高判定SMN1基因拷贝数的准确性。

附图说明

图1，本发明所述体系的引物设置；

圆圈表示待检测SNP，上下游引物、探针(Probe)、Blocker的位置、方向、修饰如图所示。

图2，常规荧光定量检测方法与本发明方法检测SMN1 Exon7的结果；

纵坐标为ΔCT值(目的基因CT值减去内参基因CT值)，横坐标为样本SMN1基因Exon7的拷贝数。图中A为常规荧光定量检测方法检测结果，图中B为本发明方法检测结果。

图3，本发明所述试剂盒检测临床样本的结果；

纵坐标为ΔCT值(目的基因CT值减去内参基因CT值)。图中A为检测SMN1 Exon7的结果，横坐标为样本SMN1基因Exon7的拷贝数。图中B为检测SMN1 Exon8的结果，横坐标为样本SMN1基因Exon8的拷贝数。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1在常规荧光定量检测方法基础上使用Blocker可提高检测区分度

以本发明所述方法，及不使用Blocker的常规荧光定量方法，同时检测一批样本的SMN1Exon7拷贝数，比较检测区分度。

样本：不同SMN1拷贝数的外周血DNA样本20例，其拷贝数已由MLPA方法确定。

常规荧光定量扩增体系中包括以下寡核苷酸：所述体系的引物设置见图1。

SMN1 Exon7上游引物：SMN1-e7-F：5′–CAAAATGCTTTTTAACATCCATATAAAGC–3′

SMN1 Exon7下游引物：SMN1-e7-R：5′–ATGTGAGCACCTTCCTTCTTTTTG–3′

SMN1 Exon7特异性探针：SMN1-e7-Probe：5′–FAM-TTTGTCTGAAACCCTG-MGB–3′

ACTIN上游引物：ACTIN-F：5′–TCTGCCTTACAGATCATGTTTGAGAC–3′

ACTIN下游引物：ACTIN-R：5′–GTACGGCCAGAGGCGTACAG–3′

ACTIN特异性探针：ACTIN-Probe：5′–HEX-AACACCCCAGCCAT-MGB–3′

本发明所述方法在此基础上额外加入一条Blocker。

SMN2 Exon7特异性Blocker：

SMN2 Blocker Exon7：5′–CTTCTTTTTGATTTTGTCTAAAACCCTGTAAGGA–C3 spacer–3′

除上述序列外，扩增体系中还包括以下组分：通用型荧光定量体系PROBE FASTqPCR Master Mix和Rox Low(Kapa Biosystems)，DNA模板2-10ng，无菌水。

具体检测步骤如下：

(1)配制PCR反应液。每个扩增反应体系包括，引物混合物1ul，PROBE FAST qPCRMaster Mix 5ul、ROX Low 0.2ul、样本DNA1ul，无菌水补足10ul。

(2)PCR扩增。反应条件为：95℃预变性5分钟；45个循环的95℃15秒，60℃30秒，每个循环结束时同时收集FAM通道和VIC/HEX通道荧光信号。

(3)根据FAM通道结果确定目的基因CT值，根据VIC/HEX通道结果确定内参基因CT值。

将20例样本检测结果根据ΔCT值(目的基因CT值减去内参基因CT值)统计如图2。

图2中A为不使用Blocker的常规荧光定量方法检测结果。如图可见，SMN1拷贝数为0的完全缺失样本仍有一定的ΔCT值，这说明即仍有一定程度的由SMN2引起的非特异荧光信号。虽然仍可有效区分SMN1拷贝数为0的完全缺失样本，但在区分SMN1拷贝数为1的携带者和SMN1拷贝数为2的正常人时，这种SMN2引起的非特异会影响检测准确性和区分度。具体地，图2中A中，SMN1拷贝数为1的ΔCT值最小值与拷贝数为2的ΔCT值最大值相差只有0.3；拷贝数为2的ΔCT值分布范围与拷贝数为3的范围有重叠，即无法完全区分拷贝数2和3；拷贝数为2的ΔCT值分布范围跨度超过1.1，这意味着对同是2拷贝的样本的拷贝数定量结果差异超过2倍。

图2中B为使用Blocker的本发明方法检测结果。SMN1拷贝数为0的样本在FAM通道无扩增荧光信号，所以没有ΔCT值。这说明该体系特异性好，即使没有SMN1竞争，SMN2也无法得到扩增产生荧光信号。相应于图2中A中常规荧光定量方法检测结果，SMN1拷贝数为1的ΔCT值最小值与拷贝数为2的ΔCT值最大值相差超过0.9；拷贝数为2的ΔCT值最小值与拷贝数为3的ΔCT值最大值相差超过0.3；拷贝数为2的ΔCT值分布范围跨度不足0.5。

比较图2中A和B可知，使用Blocker的本发明所述方法，与常规荧光定量方法相比，完全抑制了SMN2的非特异扩增，检测结果区分度显著提升。

实施例2以本发明所述试剂盒对临床样本进行检测

本发明所述试剂盒包括两个检测反应。用于检测SMN1 Exon7的体系如实施例1所述。用于检测SMN1 Exon8的体系中所包括的寡聚核苷酸有：所述体系的引物设置见图1。

SMN1 Exon8上游引物：SMN1-e8-F：5′–AAGTGGAATGGGTAACTCTTC–3′

SMN1 Exon8下游引物：SMN1-e8-R：5′–ACCGTGCTGGCCTCCCAC–3′

SMN1 Exon8特异性探针：SMN1-e8-Probe：5′–FAM-CCCACCCCAGTCT-MGB–3′

ACTIN上游引物：ACTIN-F：5′–TCTGCCTTACAGATCATGTTTGAGAC–3′

ACTIN下游引物：ACTIN-R：5′–GTACGGCCAGAGGCGTACAG–3′

ACTIN特异性探针：ACTIN-Probe：5′–HEX-AACACCCCAGCCAT-MGB–3′

SMN2 Exon8特异性Blocker：

SMN2 Blocker Exon8：5′–GGCCTCCCACCCCCACCTCAGTCTTTTACAG–C3 spacer–3′

两体系其余所有成分相同。具体检测步骤与条件与实施例一完全相同。

所检测模板为521例临床外周血DNA样本。

检测结果如图3所示。图3中A为用于检测SMN1 Exon7的体系的检测结果，图3中B为用于检测SMN1 Exon8的体系的检测结果。如图可见，两体系都体现出良好的区分度，尤其在拷贝数1与2之间，ΔCT差异都超过0.5。这说明本发明所述体系和试剂盒，可有效区分拷贝数为1的携带者和拷贝数为2的正常人，可满足临床应用中对携带者筛查的需求。

序列表

<110> 北京阅微基因技术有限公司

<120> 一种检测SMN1拷贝数的荧光定量扩增体系及试剂盒

<141> 2020-08-06

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caaaatgctt tttaacatcc atataaagc 29

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtgagcac cttccttctt tttg 24

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttgtctgaa accctg 16

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagtggaatg ggtaactctt c 21

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accgtgctgg cctcccac 18

<210> 6

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccaccccag tct 13

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tctgccttac agatcatgtt tgagac 26

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtacggccag aggcgtacag 20

<210> 9

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aacaccccag ccat 14

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cttctttttg attttgtcta aaaccctgta agga 34

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggcctcccac ccccacctca gtcttttaca g 31

Claims

1.一种检测SMN1基因拷贝数的荧光定量扩增体系，其特征在于：扩增体系中含有下述特异性引物：

(3)抑制SMN2扩增和/或产生荧光信号的Blocker。

2.根据权利要求1所述的扩增体系，所述抑制SMN2扩增和/或产生荧光信号的Blocker为：

SMN2 Exon7特异性Blocker：

SMN2 Blocker Exon7：5′–CTTCTTTTTGATTTTGTCTAAAACCCTGTAAGGA–C3 spacer–3′。

3.根据权利要求2所述的扩增体系，所述扩增检测目的基因SMN1 Exon7的三条寡核苷酸分别为：

SMN1 Exon7下游引物：SMN1-e7-R：5′–ATGTGAGCACCTTCCTTCTTTTTG–3′，

SMN1 Exon7特异性探针：SMN1-e7-Probe：5′–FAM-TTTGTCTGAAACCCTG-MGB–3′。

4.根据权利要求1所述的扩增体系，所述抑制SMN2扩增和/或产生荧光信号的Blocker为：

SMN2 Exon8特异性Blocker：

5.根据权利要求4所述的扩增体系，所述扩增检测目的基因SMN1 Exon8的三条寡核苷酸分别为：

SMN1 Exon8上游引物：SMN1-e8-F：5′–AAGTGGAATGGGTAACTCTTC–3′

SMN1 Exon8下游引物：SMN1-e8-R：5′–ACCGTGCTGGCCTCCCAC–3′

SMN1 Exon8特异性探针：SMN1-e8-Probe：5′–FAM-CCCACCCCAGTCT-MGB–3′。

6.根据权利要求1-5任一所述的扩增体系，所述检测内参基因的三条寡核苷酸：

ACTIN上游引物：ACTIN-F：5′–TCTGCCTTACAGATCATGTTTGAGAC–3′

ACTIN下游引物：ACTIN-R：5′–GTACGGCCAGAGGCGTACAG–3′

ACTIN特异性探针：ACTIN-Probe：5′–HEX-AACACCCCAGCCAT-MGB–3′。

7.根据权利要求6任一所述的扩增体系，所述引物添加有修饰或以修饰碱基取代正常碱基，所述修饰为荧光集团修饰、磷酸化修饰、硫代磷酸化修饰、锁核酸修饰或肽核酸修饰；或者所述引物在3’端-2至-15位改动1至3个碱基和/或在引物3’端-15位之后的序列进行改动，所述改动包括末端增加其他序列、删除部分末端序列、改变部分碱基序列。

8.根据权利要求7所述的扩增体系，所述扩增体系中还包括PCR缓冲液和DNA聚合酶。

9.一种用于检测SMN1基因拷贝数的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-7任一检测SMN1基因拷贝数的荧光定量扩增体系。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，所述扩增体系中包括下述特异性引物：

SMN1 Exon7下游引物：SMN1-e7-R：5′–ATGTGAGCACCTTCCTTCTTTTTG–3′，

ACTIN上游引物：ACTIN-F：5′–TCTGCCTTACAGATCATGTTTGAGAC–3′，

ACTIN下游引物：ACTIN-R：5′–GTACGGCCAGAGGCGTACAG–3′，

ACTIN特异性探针：ACTIN-Probe：5′–HEX-AACACCCCAGCCAT-MGB–3′，

SMN2 Exon7特异性Blocker：

SMN2 Blocker Exon7：5′–CTTCTTTTTGATTTTGTCTAAAACCCTGTAAGGA–C3 spacer–3′；或者

SMN1 Exon8上游引物：SMN1-e8-F：5′–AAGTGGAATGGGTAACTCTTC–3′，

SMN1 Exon8下游引物：SMN1-e8-R：5′–ACCGTGCTGGCCTCCCAC–3′，

SMN1 Exon8特异性探针：SMN1-e8-Probe：5′–FAM-CCCACCCCAGTCT-MGB–3′，

ACTIN上游引物：ACTIN-F：5′–TCTGCCTTACAGATCATGTTTGAGAC–3′，

ACTIN下游引物：ACTIN-R：5′–GTACGGCCAGAGGCGTACAG–3′，

ACTIN特异性探针：ACTIN-Probe：5′–HEX-AACACCCCAGCCAT-MGB–3′，

SMN2 Exon8特异性Blocker：