CN107529555A - 腓骨肌萎缩症相关pmp22基因拷贝数变异检测试剂盒 - Google Patents
腓骨肌萎缩症相关pmp22基因拷贝数变异检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种腓骨肌萎缩症相关PMP22基因拷贝数变异检测试剂盒，包括：10×PCR缓冲液，4×GCSolution，PCR引物混合液，TaqDNA聚合酶，探针引物混合液，DNA稀释液，10×Taq连接缓冲液，Taq连接酶，20m MEDTA，dNTP（2.5mM），MgCl2（25mM）。本发明基于CNVplex®高通量连接探针扩增技术（HLPA），检测PMP22基因拷贝数变异的试剂盒及检测体系，主要用于检测PMP22基因缺失或重复突变而导致腓骨肌萎缩症，以获取PMP22基因各目标位点的正确拷贝数的检测试剂盒。具有快速检测、高精确性、重复性高、分辨率高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因拷贝数变异检测试剂盒，具体而言，涉及一种腓骨肌萎缩症相关PMP22基因拷贝数变异检测试剂盒。
背景技术
腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease， CMT)，又称遗传性运动感觉性神经病(Hereditary motorsensory neuropathy， HMSN)，是一组最常见周围性基因遗传病，发病率约为1/2500。CMT的遗传方式主要为常染色体显性遗传(AD)，也可见常染色体隐性遗传(AR)及X连锁显性或隐性遗传(XD或XR)。CMT的主要临床特征为儿童期或青少年期起病，慢性进行性加重的肢体远端无力、肌萎缩伴腱反射减弱或消失，伴或不伴轻中度的感觉损害。临床上根据电生理和病理特征的不同，主要分为CMT1型（脱髓鞘型）、CMT2型（轴突型）。
CMT1型约占CMT总数的50%，而其中约有50%—70%的 CMT 1 型患者及 90%的散发病例为CMT1A 型，遗传方式为常染色体显性遗传。此类型是由于17 号染色体短臂 11.2 区(17p11.2)内包含周围髓鞘蛋白22（Peripheral myelin protein 22 ，PMP22）基因在内的1.5 MB 的正向串联重复突变所导致的。PMP22基因编码的周围髓鞘蛋白22在周围神经中有高度表达，其功能可能与调节细胞周期、维持髓鞘结构的完整性及作为粘附分子等有关。过度表达的 PMP22 不能进行正常的细胞内转移而积聚在高尔基复合体中，影响雪旺氏细胞的正常增生和分化，破坏了髓鞘的稳定性。
PMP22基因定位于染色体17p11. 2，全长约为40kb，包括6个外显子和5个内含子及其侧翼调控区域，其编码的蛋白质 PMP22 是一种含有 160 个氨基酸的跨膜整合糖蛋白，在外周神经系统髓鞘中含量丰富，占髓鞘蛋白总量的 2-5%。
基因大片段缺失和重复又称为基因拷贝数变异（Copy numbers variation ，CNVs）。随着微阵列CNV芯片技术以及二代测序技术的发展及应用，发现拷贝数变异（CNVs）广泛地存在于人类染色体基因组中。CNVs主要由基因组发生重组而导致，一般指长度为几kb-几Mb基因组大片段的拷贝数增加或者减少，主要表现为亚显微水平的重复，缺失和插入等。通过拷贝数检测方法对先证者PAP22各外显子的拷贝数进行检测，如果相应外显子缺失，则拷贝数结果小于2；如果相应外显子重复，则拷贝数结果大于2。但是目前针对CNVs的检测方法非常多，选择合适的技术用于PMP22基因检测极为重要。目前CNVs的检测方法主要有：多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)、微阵列比较基因杂交(array-based comparative genomic hybridization，array-CGH)、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）分型芯片、AffymetrixCNV芯片技术及二代测序技术等。此外，实时荧光定量PCR技术(real-time quantitativepolymerase chain reaction，RT-qPCR)和荧光原位杂交技术(fluorescence in situhybridization，FISH)等则主要用于CNVs的验证。其中array-CGH、SNP分型芯片、Affymetrix微阵列技术、二代测序技术等主要用于全基因组范围内未知CNVs的检测，这些全基因组CNVs检测技术先进，准确而高效，但相对比较昂贵，尤其是在检测某些特定基因或者特定区域时并不是最佳选择。RT-qPCR方法虽然经典，但是效率太低，一个反应体系中不能同时对多个片段进行检测。MLPA主要是针对特定基因或特定区域进行拷贝数检测的技术，2002年由Schouten等首次报道，是目前应用最为广泛的单一基因拷贝数检测技术，可在同一反应管中对50个不同片段的拷贝数进行检测，所需设施简单，PCR仪和毛细管电泳仪。荷兰MRC-Holland公司研发了数百种MLPA检测试剂盒，用于人类疾病，细胞遗传学及肿瘤研究，其中包括各种遗传性出血与血栓性疾病的相关基因的CNVs的检测。尽管MLPA在诊断特定基因外显子CNVs方面技术已经非常成熟，但是MLPA也存在一些比较突出的问题。首先，它对所检测标本的DNA质量要求相对较高，普通的DNA抽提方法无法满足实验要求，需要购买质量较好的商品化试剂盒进行抽提，增加了实验成本，而且检测标本和参照标本必须使用同种DNA抽提方法。因此研制和开发一种特异性强、敏感性高同时有快速、经济检验多个外显子拷贝数的PMP22基因检测方法显得尤为重要，对腓骨肌萎缩症的诊断和治疗起着重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种PMP22基因拷贝数变异检测试剂盒，基于CNVplex®高通量连接探针扩增技术（HLPA），检测PMP22基因拷贝数变异的试剂盒及检测体系，主要用于检测PMP22基因缺失或重复突变而导致腓骨肌萎缩症，以获取PMP22基因各目标位点的正确拷贝数的检测试剂盒。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种腓骨肌萎缩症相关PMP22基因拷贝数变异检测试剂盒，包括：
10×PCR缓冲液，
4×GCSolution，
PCR引物混合液，
TaqDNA聚合酶，
探针引物混合液，
DNA稀释液，
10×Taq连接缓冲液，
Taq连接酶，
20m MEDTA，
dNTP（2.5mM），
MgCl2（25mM）。
进一步的，所述探针引物混合液的序列如序列表SEQ ID NO.:1至SEQ ID NO.:30所示。
1.针对PMP22基因，设计十五对目标位点的连接探针，每对探针上具有用于PCR扩增的通用序列。
2.每对连接探针分别于目标位点杂交并在连接酶或化学连接作用下进行连接反应；
3.连接产物用通用引物进行扩增，扩增产物通过变性毛细管电泳将不同长度的扩增片段进行分离，得到每个扩增产物的位置信息以及荧光强度，并计算目标片段拷贝数值。
计算目标拷贝数步骤如下：计算每个PMP22基因目标位点的样本条带/参照基因条带的荧光峰高，然后将目标位点的该比值除以对应的参照样本的比值再乘以参照样本该目标区的拷贝数即得目标位点的相对拷贝数。
具体步骤1.将每个目的片段峰高分别除以group内n个参照探针，这样每个目的片段将有n组数据B；
2.校正参数的选取：a）计算n个正常参照样本数据的变异系数（CV），如果小于10%，计算平均数作为校正参数；b）如果大于>10%，计算任意n-1个数据的变异系数，如果存在<5%的组合，取CV最小的组合的平均数作为该组数据的校正参数，如果不存在，则取n个数据的中位数作为该组数据的校正参数。将每个目的片段n组数据B，分别除以对应的校正参数，获得n组校正数据C
3.对每个样本计算该目的片段的相对拷贝数（相对正常参照样本的绝对拷贝数的比值）：a)计算n个数据C的变异系数，如果小于10%，计算平均数作为该样本的目的的相对拷贝数；b)如果大于>10%，计算任意n-1个数据的变异系数，如果存在<5%的组合，取CV最小的组合的平均数作为该样本的目的的相对拷贝数，如果不存在，则取n个数据的中位数作为该样本的目的的相对拷贝数，将该数据MARK起来表述该数据变异较大。
本发明的有益效果是:
1、快速检测：使用的探针短，可以直接合成，无需克隆制备，整个实验过程仅需要一步连接反应，一步PCR循环和一步毛细管电泳，耗时不到24个小时.
2、高精确性：基于高特异性的连接原理，检测区域连接产物采用通用引物扩增，扩增效率基本一致。
3、重复性高：检测稳定性高，节约样品复孔的检测费用。
4、分辨率高：可对6拷贝以内的片段进行准确定量。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明所述检测方法的原理示意图；
图2为本发明实施例中样品A和样本B共同检测结果示意图1；
图3为本发明实施例中样品A和样本B共同检测结果示意图2；
图4为本发明实施例中样品A和样本B共同检测结果示意图3；
图5为本发明实施例中样品A和样本B共同检测结果示意图4。
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。
参照图1所示，利用本发明所述的PMP22基因拷贝数变异检测试剂盒对两个腓骨肌萎缩症患者进行PMP22基因的拷贝数检测。
一、检测样本：样本A和样本B均为临床诊断患有腓骨肌萎缩症患者，男性参照样本。
二、检测方法
主要包括以下步骤：
将待测样本A和样本B及一个已知目标位点拷贝数的男性参照样本的DNA用Biophotomerterplus(Eppendor)（核酸蛋白测定仪）进行精确定量，然后稀释至20ng/μl作为待测DNA样本待用。
PMP22基因拷贝数变异检测试剂盒提供以下试剂：10×PCR缓冲液，4×GCSolution，PCR引物混合液，TaqDNA聚合酶，探针引物混合液，DNA稀释液，10×Taq连接缓冲液，Taq连接酶，20mMEDTA，dNTP（2.5mM），MgCl2（25mM）。
连接反应体系（20μl）配置：
连接反应条件设置如下：98℃6分钟；5个循环连接（96℃20秒，60℃3h），在94℃2分钟，结束后半小时内加入20μl20mMEDTA；
PCR反应体系（20μl）配置
PCR反应条件设置如下：95℃2分钟；5个循环的Touchdown程序（94℃20秒，62℃-1℃/循环40秒和72℃1分钟）；27个循环扩增（94℃20秒，57℃40秒，72℃1分钟）；68℃30分钟，4℃保存。
取1μlPCR产物用ddH2O稀释10倍，然后取1μl取1μl与0.1μlLIZ500+8.9μlHi-Di混匀后，95℃5分钟变性后，置于ABI3130XL测序仪上进行毛细管电泳。
结果使用GeneMapper4.1软件进行数据分析，读取峰高等数据，参照图2、图3、图4、图5所示。
数据分析表
1.表2为2个检测样本及1个参照样本的15个位点和32个参照位点扩增体系数据。
表2
2.样本拷贝数
计算每个PMP22基因目标位点的样本条带/参照基因条带的荧光峰高，然后将目标位点的该比值除以对应的参照样本的比值再乘以参照样本该目标区的拷贝数即得目标位点的相对拷贝数。使用参照样本对应目标位点的拷贝数为2对检测结果进行进一步的校正，获取目标位点的精确拷贝数，得到结果如表3所示。
表3
三、结论
样本A和样本B均为PMP22基因杂合重复。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海杰傲奉生医学检验所有限公司，天昊生物医药科技（苏州）有限公司
<120> 腓骨肌萎缩症相关PMP22基因拷贝数变异检测试剂盒
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<213> Artificial Sequence
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ctgaagaaat ggcatattgg ttcag 25
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tacctgggtt ctgggcagtt c 21
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<212> DNA
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gttcacctcg tccttgctgg a 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gattaatgct ccatttcttg gtgtgg 26
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<212> DNA
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Claims (2)
1.一种腓骨肌萎缩症相关PMP22基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于，包括：
10×PCR缓冲液，
4×GCSolution，
PCR引物混合液，
TaqDNA聚合酶，
探针引物混合液，
DNA稀释液，
10×Taq连接缓冲液，
Taq连接酶，
20m MEDTA，
dNTP（2.5mM），
MgCl2（25mM）。
2.根据权利要求1所述的腓骨肌萎缩症相关PMP22基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于：所述探针引物混合液的序列如序列表SEQ ID NO.:1至SEQ ID NO.:30所示。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN201710267605.0A CN107529555A (zh) | 2017-04-21 | 2017-04-21 | 腓骨肌萎缩症相关pmp22基因拷贝数变异检测试剂盒 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20180102 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |