CN114085903B - 检测线粒体3243a>g突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法 - Google Patents
检测线粒体3243a>g突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114085903B CN114085903B CN202210063028.4A CN202210063028A CN114085903B CN 114085903 B CN114085903 B CN 114085903B CN 202210063028 A CN202210063028 A CN 202210063028A CN 114085903 B CN114085903 B CN 114085903B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- detection
- primer
- kit
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Abstract
本发明涉及基因技术领域,具体而言,涉及一种检测线粒体3243A>G突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法。本发明使用ARMS结合荧光PCR技术具有高特异性以及高灵敏性,检测时耗短、成本低,结果直观好判读。
Description
技术领域
本发明涉及基因技术领域,具体而言,涉及一种检测线粒体3243A>G突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法。
背景技术
线粒体是真核细胞中重要的细胞器,是为细胞提供能量的场所,其氧化代谢为机体提供了80%以上的能量。线粒体 DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)是细胞核染色体外的基因组,具有自我复制、转录和编码功能,是一套相对独立的遗传控制系统,但同时又受到核DNA 的控制。人类的mtDNA分子是一个长 16569bp 的双链闭环超螺旋 DNA分子,包括一条轻链(L链)和一条重链(H链),IL、IH1和IH2分别是L链和H链的转录起始点,包含有 13 个多肽编码基因,22个tRNA基因和 2个rRNA 基因。这些基因呈紧密排列,任何随机性突变都将诱导编码 DNA 序列过程,造成线粒体功能的异常。
线粒体病是指由于mtDNA或核 DNA缺陷引起线粒体呼吸链氧化磷酸化功能障碍为特点的一组遗传性疾病,不包括其他因素导致的继发性线粒体功能障碍性疾病。目前已发现近 200 种不同的人类 mtDNA 突变。A3243G 突变是mtDNA 上最常见的致病突变。m.3243A>G 突变位于 tRNALeu(UUR)基因的双氢尿嘧啶环中,此处是 16S rRNA 和tRNALeu(UUR)基因之间的交界处,是促进转录终止的蛋白质因子结合部位。因而,该位点发生基因突变将导致转录终止因子结合障碍,线粒体氧化磷酸化蛋白合成缺陷,ATP 生成不足。
m.3243A>G 突变患者可表现为综合征或非综合征线粒体疾病,也可以是无症状患者。m.3243A>G 突变最常见的综合征表现是线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作综合征(mitochondria encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-likeepisodes,MELAS),随后研究发现更多与 m.3243A>G 突变相关的临床表型,包括母系遗传糖尿病伴耳聋((maternally inherited diabetes and deafness, MIDD)、以肢带型无力为主要症状的线粒体肌病,以及肠梗阻、胰腺炎等非典型 MELAS综合征。
单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入等,常用的分析方法有PCR-测序法、Sanger测序法、高通量测序技术、PCR-芯片杂交法、突变扩增系统(amplificationrefractory mutation system, ARMS)等。这些传统技术中,直接测序的方法时间周期较长,不能及时为医生提供指导;芯片法成本高,使应用受到一定限制。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种引物对探针组合产品,所述引物对包括:选自核苷酸序列如SEQ ID NO:1~ SEQ ID NO:3至少一种所示的上游引物,核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的下游引物;
所述探针包括SEQ ID NO:5所示的检测探针。
本发明的第二方面涉及含有如上所述的引物探针组合产品的试剂盒。
本发明的第三方面检测线粒体基因 3243A>G 突变的方法,其包括:
使用如上所述的引物探针组合产品对待检测核酸进行扩增,并根据所述检测探针所述发出信号判断所检测位点的突变情况。
或者包括:
使用如上所述的引物探针组合产品对待检测核酸进行扩增,获取所述检测探针和所述内参探针的Ct值,分别定义为Ct检测和Ct内参,并计算ΔCt=|Ct检测-Ct内参|;
若ΔCt ≤14.8,则代表所述待检测核酸发生3243A>G 突变。
本发明的第四方面还涉及如上所述的引物探针组合产品在制备线粒体病检测试剂盒中的应用。
本发明使用ARMS结合荧光PCR技术具有高特异性以及高灵敏性,检测时耗短、成本低,结果直观好判读。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中ROC曲线图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。
除非另有说明,用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导,随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词,其是包容性或开放式的,不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数,以及所引述的端点。
本发明涉及一种引物对和探针组合产品,所述引物对包括:选自核苷酸序列如SEQID NO:1~ SEQ ID NO:3至少一种所示的上游引物,核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的下游引物;
所述探针包括SEQ ID NO:5所示的检测探针。
在一些实施方式中,所述引物对还包括内参引物对,所述探针还包括内参探针。
在一些实施方式中,所述内参引物对和所述内参探针用于定量检测线粒体保存区域的核酸片段的表达。
在一些实施方式中,所述内参引物对的上游引物、下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示,所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
另外,需要说明的是,在一个方面,有用的引物和探针包括与SEQ ID NO:1~8所示的引物或探针具有大于60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。还考虑了这样的引物和探针修饰并且可根据标准技术制备。
术语“%同一性”在两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列的上下文中,指的是相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或子序列,当比较和比对以用于最大对应时,如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查来测量的。例如,%同一性是相对于要比较的序列的编码区域的整个长度。
对于序列比较,通常一个序列用作参考序列,测试序列与该序列进行比较。当使用序列比较算法时,测试序列和参考序列被输入到计算机中,如果需要,指定子序列坐标,并且指定序列算法程序参数。然后,序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。可使用搜索算法例如BLAST和PSI-BLAST (Altschuletal., 1990、J Mol Biol 215:3, 403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic AcidsRes25:17, 3389-402)确定百分比同一性。
引物和探针修饰可以采用公知的方法。这些引物和/或探针序列的修饰版本可包括,通过非限制性例子,将一个或多个核苷酸添加到5’端,将一个或多个核苷酸添加到3’端,将一个或多个核苷酸添加到5’端和3’端,添加尾部,缩短序列,延长序列,将序列上下游移动几个碱基,或其任何组合。
碱基修饰例如3'P、5'P、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、8-氨基-2'-脱氧腺苷、C-5丙炔基-脱氧胞苷、C-5丙炔基-脱氧尿苷、2-氨基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、反向dT、反向二脱氧-T、羟甲基dC、异-dC、5-甲基dC、氨基乙基-吩噁嗪-脱氧胞苷,和锁核酸(LNA’s),并包括在碱基之一处的至少一个错配碱基,或者替换其中至少一个碱基为RNA碱基,以实现例如增加突变体特异性引物3’端的核酸相互作用,以增加Tm。双链稳定碱基修饰的加入对PCR有积极的影响,从而使其能够在较高的温度下进行,在此范围内已知Taq聚合酶显示出最大的活性。修饰后的探针应当保留区分待检测突变位点和野生型位点的能力。
如本说明书使用的术语“探针”是指可指示扩增的多种信号传导分子中的任意一种。例如,SYBR Green和其他DNA结合染料是检测探针。可以是基于序列的检测探针,例如5’核酸酶探针。一些检测探针是本领域已知的,例如Taqman探针、茎环分子信标、MGB探针、ScorpionTM探针、锁核酸(LNA)探针、肽核酸(PNA)探针等。
在一些实施方式中,所述探针为自身淬灭探针。
在一些实施方式中,各探针的荧光发射基团独立地选自AMCA、Pacific Blue、Atto425、BODIPY FL、FAM、Alexa Fluor 488、TET、JOE、Yakima Yellow、VIC、HEX、Quasar 570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、Aqua Phluor593、Texas Red、Atto 590、Cy5、Quasar 670、Cy5.5以及Cy5.5中的任一种。
在一些实施方式中,所述内参探针与所述检测探针的荧光发射基团信号可区分。
本发明可同时采用多通道进行,只需在不同通道采用单独的探针即可。在一些优选的实施方式中,检测探针和内参探针上的荧光发射基团在同一反应体系下可被区分。
在一个具体的实施例中,SEQ ID NO:5、8所示的探针上的荧光发射基团分别为FAM和VIC。
在一些实施方式中,各探针的淬灭基团独立地选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse以及MGB中的任一种,优选BHQ1。
本发明还涉及含有如上所述的引物探针组合产品的试剂盒。
术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品(例如,包装或容器),试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。
在一些实施方式中,所述的试剂盒还包含扩增缓冲液、dNTP、Mg2+、UNG 酶、DNA聚合酶、阳性质控品、阴性质控品、防腐剂以及水中的至少一种。
适合于实施本发明的聚合酶是本领域熟知的,可以从多个来源获得。热稳定性DNA聚合酶可以从多种商业途径获得,使用本领域技术人员熟知的方法。优选的热稳定性的DNA聚合酶可以包括但不限于:TaqDNA聚合酶或其突变体、衍生物或片段。
优选的,试剂盒中的核酸组分,例如引物、探针、阳性对照以及阴性对照以干粉形式存放于试剂盒中。阳性对照以及阴性对照也可以以质粒的方式存在。
各组分优选以冻干形式,例如以一种或多种所谓的冻干珠的形式实现。冻干珠通常可以被理解为是指在制造后(在所述制造后物质通常作为粉末存在)被压制成球形的冻干物。因此,可以例如以冻干形式提供PCR批次所需的组分,特别是DNA聚合酶、核酸组分以及反应缓冲剂组分。以这种方式,可以通过添加待定量的样品以及任选其它所需组分以对于用户非常友好的方式直接开始PCR过程。特别地,冻干形式的提供非常有利于自动化应用。
根据本发明的再一方面,还涉及一种检测线粒体基因 3243A>G 突变的方法,其包括:
使用如上所述的引物探针组合产品对待检测核酸进行扩增,并根据所述检测探针所述发出信号判断所检测位点的突变情况。
根据本发明的再一方面,还涉及一种检测线粒体基因 3243A>G 突变的方法,其包括:
使用如上所述的引物探针组合产品对待检测核酸进行扩增,获取所述检测探针和所述内参探针的Ct值,分别定义为Ct检测和Ct内参,并计算ΔCt=|Ct检测-Ct内参|;
若ΔCt ≤14.8,则代表所述待检测核酸发生3243A>G 突变。
在一些实施方式中,
在一些实施方式中,扩增时的退火时的温度为56℃~60℃,例如57℃、58℃、59℃;循环数为35~45,例如36、37、38、39、40、41、42、43、44。
在一些实施方式中,所述引物对和探针组合产品在同一反应体系下进行扩增。
如上所述的方法可以是非诊断或诊断目的的。
如上所述的方法可以用于辅助诊断线粒体病,线粒体病根据临床表现可以分为不同的亚型:1. 线粒体脑病:Leigh病、Alpers综合征、线粒体脊髓小脑共济失调伴癫痫发作综合征。2. 线粒体脑肌病:线粒体脑肌病伴高乳酸血症及卒中样发作、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维、Kearns-Sayrs综合征(KSS)、线粒体神经胃肠脑肌病。3. 线粒体神经病:Leber遗传性视神经病、神经源性肌萎缩-共济失调-色素视网膜病变综合征、感觉性共济失调神经病伴眼外肌麻痹。4. 线粒体肌病:慢性进行性眼外肌麻痹、线粒体肢带型肌病。
本发明所公开的组合产品、方法和/或试剂盒中的核酸样品的来源包括但不限于,细胞,例如循环血液、培养的细胞、肿瘤细胞。样本的来源例如咽拭子、鼻拭子、痰液、呼吸道吸取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、眼结膜拭子、唾液样品、粪便标本、抗凝血和血清标本中的一种或多种。DNA可以是基因组或者质粒或其他载体中的DNA。本发明用于检测基因组DNA中的突变,可以是灵长类动物(尤其是人)以及公知或未知的具有线粒体3243A>G突变的其他任何动物或其他。在一些实施方式中,模板序列或核酸样品可以是gDNA。在一些实施方式中,模板序列或核酸样品可以是线粒体DNA。在其他实施方式中,模板序列或核酸样品可以是cDNA。DNA或RNA模板序列或核酸样品可以是任意类型的组织,包括例如福尔马林固定的石蜡包埋组织样品。模板核酸还可以是使用本领域已知的技术化学合成的。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1 引物、探针的筛选
步骤1:m. 3243A>G引物和探针设计和选择
查找线粒体3243位点附近序列:在NCBI上查找线粒体基因组序列信息(NC_012920.1),截取3243位点上下游300~500bp的序列进行引物探针设计,标记为下划线的即是m.3243 A>G位点。
GTACGAAAGGACAAGAGAAATAAGGCCTACTTCACAAAGCGCCTTCCCCCGTAAATGATATCATCTCAACTTAGTATTATACCCACACCCACCCAAGAACAGGGTTTGTTAAGATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAAAACTTAAAACTTTACAGTCAGAGGTTCAATTCCTCTTCTTAACAACATACCCATGGCCAACCTCCTACTCCTCATTGTACCCATTCTAATCGCAATGGCATTCCTAATGCTTACCGAACGAAAAATTCTAGGCTATATACAACTACGCAAAGGCCCCAACGTTGTAGGCCCCTACGGGCTACTACAACCCTTCGCTGACGCCATAAAACTCTTCACCAAAGAGCCCCTAAAACCCGCCACATCTACCATCACCCTCTACATCACCGCCCCGACCTTAGCTCTCACCATCGCTCTTCTACTA
在引物和探针设计软件oligo 7和Primer Premier 5.0软件的辅助下,以m.3243位点的碱基为上游引物3’末端的最后一个碱基,设计13条上游引物及2套下游引物和探针,见表1。
首先,用下游引物探针set1和set2结合上游引物M-F1-2-2和M-F1-3-1对空白对照品、野生型样本DNA、突变型样本DNA、细菌DNA进行检测。结果表明,下游引物探针set2检测效果好,可入选用于多重体系的筛选。
其次,用筛选出的下游引物探针set2结合13条上游引物对空白对照品、野生型样本DNA、突变型样本DNA、细菌DNA进行检测。结果表明,M-F1-2-2、M-F1-2-3、M-F1-3-1、M-F1-3-2四条引物均达到初步筛选标准,可入选进入后续多重体系的引物筛选。
表1 m. 3243A>G引物和探针序列信息表
步骤2:内参引物和探针设计和选择
由于口腔脱落细胞中总含有人的DNA,同时考虑到线粒体DNA的拷贝数远高于基因组DNA,不宜选择常用的人管家基因作为内参,因此选择线粒体DNA上保存区域设计内参。在GenBank中检索到线粒体基因组序列67条,通过bioedit软件进行比对分析序列保守区域,在引物和探针设计软件oligo7和Primer Premier 5.0软件的辅助下,以taqman探针设计的原理设计出3套引物和对应的探针,探针5’端采用荧光报告基团(VIC)标记,3’端采用非荧光淬灭剂(BHQ-1)标记,以降低背景干扰,内参引物探针设计见表2。
用设计的3套内参引物探针对空白对照品、野生型样本DNA、突变型样本DNA、细菌DNA进行检测。结果表明,ICSet1和ICSet2的特异性较差,ICSet3符合筛选标准,可进入下一步多重体系的引物探针筛选。
表2内参引物和探针序列信息
步骤3:多重体系引物探针的序列选择
综合上述对m.3243A>G突变位点检测引物探针和内参引物探针选择的结果,入选的序列(见表3)进入下一步多重体系引物探针的筛选。
首先,用表3中的候选引物、探针分别对空白对照品进行检测,测试引物探针在多重体系下的特异性。结果表明,突变上游引物M-F1-2-2、M-F1-2-3、M-F1-3-1、突变下游引物探针Set2、内参引物探针ICSet3组合的多重体系符合要求,可进入下一步对野生型和突变型样本的测试。结果见表4。
其次,用上述选出的引物探针组合对15例野生型、5例突变型样本以及野生型样本和突变型样本梯度稀释后的低浓度样本进行检测。结果表明,突变上游引物M-F1-3-1、突变下游引物探针Set2、内参引物探针ICSet3为最佳组合,检测结果见表5。
综上,通过上述对设计的13条m.3243A>G突变上游引物、2套突变下游引物探针和3套内参引物探针的筛选。
表3多重体系候选引物探针序列信息
表4多重引物探针特异性筛选检测结果
表5 多重引物探针样本测试结果
实施例2:反应体系及反应程序的优化
通过对不同Mix使用量、不同引物、探针浓度及用量、DNA模板不同用量的研究,确立了最佳反应体系;通过对不同退火温度、时间、循环数的研究,确立了最佳反应程序。反应体系及反应程序见表8-表11。
具体的,线粒体基因3243A>G突变检测试剂盒(荧光 PCR 法),包括以下步骤:
S1:核酸提取;
S2:反应液配置;
S3:加样;
S4:qPCR扩增;
S5:数据分析。
步骤 S1 具体为:将装有口腔拭子的离心管涡旋震荡1min,使口腔脱落细胞彻底洗脱下来,丢掉拭子。取口腔脱落细胞悬液0.2ml,12000rpm离心10min,弃上清。加入50 μLDNA提取液和5μL蛋白酶K重悬细胞沉淀,混匀即可。于56℃孵育5min,再用95℃~100℃做加热处理10min,12000rpm离心10min,吸取上清50µl至1.5mL离心管(注意不要吸取到沉淀),即为所得DNA,冷冻保存。
步骤S1中提取液的配制如表6,蛋白酶K的配制如表7:
表6DNA提取液的配制
表7蛋白酶K的配制
步骤S2具体为:根据待测标本数量n(需包含阴性对照、阳性对照)分装PCR反应液,按照18μl/管分装至PCR反应管/板中。步骤S2中PCR反应液的配制如表8,PCR反应液采用实施例1中一组引物探针组合产品,配制用到的引物、探针序列见表9(本发明中若非特别强调,则采用的都是该组检测体系):
表8PCR反应液的配制
表9引物探针核酸标准序列
步骤S3具体为:将待测样本提取的核酸、阴性质控品提取的核酸、阳性质控品分别加入PCR反应液中,盖紧管盖或封好膜,瞬时离心数秒使液体集中至管底部,转入核酸扩增区。单反应总体系配制如下:
表10反应体系
步骤S4具体为:①将PCR反应管/板置入定量PCR仪的样品槽,按对应名称设置阳性对照、阴性对照和未知样本,并设置样本名称、检测靶标名称;②荧光检测通道选择:选择FAM通道检测m.3243 A>G,选择HEX/VIC通道检测内参;淬灭基团选择“none”;参比染料PassiveReference选择“none”;③反应程序设置;④选择反应体系为20μL;⑤设置完毕,保存文件,运行反应程序。步骤S4中用到的反应程序如表11:
表11反应程序
步骤S5具体为:①结果分析条件设定,调整基线、阈值线:②质控品判定;③检测结果的判断。所述步骤S5中使用的质控标准如表12,结果判断标准如表13:
表12质控标准
表13结果判断表
注:在进行产品特异性验证时,当待测样本为非人源样本,FAM通道有Ct值但无明显的扩增曲线,或Ct显示"undetermined",VIC通道有Ct值但无明显的扩增曲线,或Ct显示"undetermined",结果判断为阴性,未检出MT-TL1基因3243位点突变(m.3243A>G)。
实施例3:阳性判断值的研究
步骤1:内参基因参考值确定
当加入的DNA浓度过量的时候,容易产生假阳性信号,当DNA浓度不足或者PCR有抑制物的时候,容易出现假阴性,所以需要用内参基因扩增情况,监控加入DNA模板的质量及监控每个反应孔内DNA扩增的情况。
随机抽取60例口腔拭子样本DNA进行10倍梯度稀释至0.1ng/μL进行检测,统计Ct值的参考范围。结果表明,在DNA浓度为0.1ng/μL时,Ct值分布在23~26之间,平均值为24.34,标准偏差SD为0.75,内参的Ct值参考范围通过平均值加上2倍的标准偏差来确定,因此本试剂盒内参基因的参考值范围为Ct≤26。具体结果见表14。
表14 0.1ng/μL DNA内参的Ct值参考范围统计
步骤2:阳性判断值的研究
用质检合格的试剂对已经Sanger测序确认m.3243A>G突变情况的样本119例(其中包括m.3243A>G突变阳性样本18例,正常样本101例)、通过已知拷贝数的M3243A>G突变阳性质粒模拟的位于检测限附近的弱阳性样本39例,以及随机抽取的20例阴性样本DNA分别稀释至1ng/μL和0.1ng/μL(共40例),合计一共198例样本进行检测。通过ROC曲线对m.3243A>G和内参Ct值的差值ΔCt进行分析,以确定本试剂盒目标基因的阳性判断值。检测结果见表15-表17,ROC曲线见图1,曲线下的面积如表18。
结果表明:1)ROC曲线下的面积为0.996,表明试剂的诊断准确度很好;2)最好的诊断临界值为ΔCt=14.7883,此时,灵敏度(Sensitivity)为0.982,即98.2%;特异度为(1-0.043),即95.7%,两者相加值最高。暂拟定ΔCt=14.8为阳性判断值,检测结果的解释见表13。
表15 119例临床样本检测结果
表16模拟不同DNA浓度背景下弱阳性样本检测结果
表17低浓度DNA背景下阴性样本检测结果
表18曲线下的面积
表19曲线的坐标
步骤3:阳性判断值的验证
根据上述拟定的阳性判断值判定方法,检测35例已经Sanger测序确认m.3243A>G突变情况样本,结果表明,本试剂盒检测结果与Sanger测序结论完全一致,说明试剂盒设置的阳性判断方法合理。验证结果见表20。
表20阳性判断值验证结果
实施例4:检测限的研究
按照本发明最优选的S1-S5操作步骤,进行检测限实验的研究。具体方案为:
步骤1:质粒模拟样本的检测——初始实验
取一混合阴性样本DNA(初始浓度:2ng/μL),并通过标准曲线法定值(定值结果:8×105copies/μL),用1×TE缓冲液分别稀释至1ng/μL、0.2ng/μL,作为基质备用。然后在2ng/μL、1ng/μL、0.2ng/μL不同浓度基质中加入不同比例的m.3243 A>G突变质粒,制备成不同DNA浓度背景下,不同突变比例的模拟阳性样本,用于检测限的初步研究,每个样本重复检测3次,初步估计最低检测限的范围。样本配制方法见表21,检测结果见表22。
结果表明,以具有100%阳性检出率的最低浓度水平度作为估计检测限,根据初始实验结果,试剂盒的估计检测限为:0.1ng/μLDNA背景下,0.3%突变比例,可在此浓度附近制备梯度浓度样本进行最低检测限研究。
表21不同浓度比例样本的配制方法
表22最低检测限预实验结果
步骤2:质粒模拟样本的检测——正式实验
根据预实验的结果,设置样本浓度为0.1ng/μL-2%、0.1ng/μL-1%、0.1ng/μL-0.5%、0.1ng/μL-0.25%,使用质检合格的试剂分别检测20次,计算20次检测结果的阳性率。当各浓度20次检测结果阳性率为95%,且m.3243Ct值CV≤5%时,将符合该条件的最低浓度作为最低检测限,如果各浓度均符合条件,则继续向下稀释并检测至符合该条件的最低浓度作为最低检测限。
结果表明,当样本浓度为0.1ng/μL-2%、0.1ng/μL-1%、0.1ng/μL-0.5%时,阳性检出率均为100%;当样本浓度为0.1ng/μL-0.25%时,阳性检出率为90%。根据检测限判定标准(95%阳性检出率),将样本浓度0.1ng/μL-0.5%定为本试剂盒的检测限,即可检出0.2ng DNA背景下0.5%的突变。不同浓度比例样本的配制方法见表23,检测结果见表24。
表23不同浓度比例样本的配制方法
表24 检出限实验检测结果
步骤3:临床样本的检测
取1例已经临床确认的阳性口腔拭子样本(m.3243A>G,50%突变)以及若干例正常人口腔拭子样本,使用质检合格的试剂提取DNA,然后用Qubit 4.0测定提取后的DNA浓度,将阴、阳性样本均稀释到0.1ng/μL,之后检测0.1ng/μL的样本,选择与0.1ng/μL阳性样本内参Ct值接近的阴性样本备用,最后使用0.1ng/μL的阴性DNA稀释0.1ng/μL的阳性DNA为不同突变比例待检样本(0.1ng/μL-2%、0.1ng/μL-1%、0.1ng/μL-0.5%、0.1ng/μL-0.25%),每个样本重复检测20次,阳性检出率达到95%以上的最低浓度为本试剂盒最低检测限。
结果显示,所有样本的m.3243A>G的Ct值变异系数CV%均<5%,符合要求。样本0.1ng/μL-2%、0.1ng/μL-1%、0.1ng/μL-0.5%阳性检出率均为100%,样本0.1ng/μL-0.25%阳性检出率为80%。因此,根据最低检测限判定标准(95%阳性检出率),可将样本浓度0.1ng/μL-0.5%突变定为本试剂盒的最低检测限,即可检出0.1ng/μL DNA(即0.2ng DNA)背景下0.5%的突变。检测结果见表25。
表25 临床阳性样本最低检测限实验结果
实施例5:特异性的研究
按照本发明最优选的S1-S5操作步骤,进行特异性研究实验的检测。具体方案为:
用质检合格的试剂对口腔中常见定植菌、呼吸道常见病原体,如化脓性链球菌、表皮葡萄球菌、罗伊氏乳杆菌、假丝酵母菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒、合胞病毒,以及m.3243邻近位点m.3460G>A进行检测,每个样本重复3次,依据检测结果评价试剂盒特异性。结果表明,用本试剂盒检测化脓性链球菌、表皮葡萄球菌、罗伊氏乳杆菌、假丝酵母菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒、合胞病毒,以及m.3243邻近位点m.3460G>A均为阴性,本试剂盒特异性良好,不会对常见的病原体和邻近突变位点产生非特异反应。检测结果见表26。
表26 特异性实验检测结果
实施例6:精密度的研究
按照本发明最优选的S1-S5操作步骤,进行精密度实验的研究。具体方案为:
步骤1:质粒模拟样本的检测
使用人口腔拭子阴性DNA与m. 3243A>G突变质粒分别配制不同突变比例样本(中值R1:0.1ng/μL-2%突变,低值R2:0.1ng/μL-1%突变)。
由2名操作者(P1、P2)使用同批号的试剂和核酸样本,每天在同一台仪器上(A)分别检测R1、R2和阴性样本(N),连续进行为期10天的检测,每个样本重复检测10次。
2. 由同1名操作者(P1),使用同批号的试剂和核酸样本,同一天在两台仪器上(A、B)分别检测R1、R2和阴性样本(N),每个样本重复检测10次。
3. R1、R2样本通过统计m.3243A>G(FAM通道)的Ct值的变异系数来评价申报试剂在批内、批间(日间)、不同操作者间、不同仪器间的精密度。
4. 可接受标准:阴性样本的重复10次的结果应均为阴性;从每次检测同一样本的10次Ct值计算出批内精密度,当Ct值的变异系数CV<5%时,符合批内精密度要求;从每个操作者、每个浓度样本检测10天的所有100个Ct值计算出批间(日间)精密度,当Ct值的变异系数CV<5%时,符合批间(日间)精密度要求;从两名操作者检测每个浓度样本,检测10天的所有100个Ct值计算出不同操作者间精密度,当Ct值的变异系数CV<5%时,符合不同操作者间精密度要求;从每个浓度样本在不同仪器上检测的20个Ct值计算出不同仪器间精密度,当Ct值的变异系数CV<5%时,符合不同仪器间精密度要求。
结果表明,同一批号的试剂批内、批间(日间)精密度、不同操作者间和不同仪器间精密度均符合:阴性符合率100%,批内Ct值的变异系数CV≤5%,批间(日间)Ct值的变异系数CV≤5%,不同操作者间精密度CV≤5%,不同仪器间精密度CV≤5%。说明本试剂盒精密性良好。检测分析结果见表27-表31。
表27批内精密度-阴性符合率统计结果
表28批内精密度-中值R1、低值R2统计结果
表29连续10天批间(日间)精密度统计结果
表30连续10天不同操作者间精密度统计结果
表31不同仪器间精密度统计结果
步骤2:临床样本的检测
由同1名操作者,使用同一质检合格的试剂,同一天在同一仪器上分别检测阳性样本R1(80%突变)、R2(5%突变)和阴性样本(N),每个样本重复检测10次,计算Ct值的变异系数。
可接受标准:阴性样本重复检测10次的结果应均为阴性,Ct值的变异系数CV≤5%;阳性样本重复检测10次的结果应均为阳性,Ct值的变异系数CV≤5%。
结果表明,阴性样本重复检测10次,结果均为阴性,Ct值的变异系数CV≤5%;阳性样本R1重复检测10次,结果均为阳性,Ct值的变异系数CV≤5%;阳性样本R2重复检测10次,结果均为阳性,Ct值的变异系数CV≤5%。说明本试剂盒精密性良好,检测结果见表32。
表32 临床样本精密度实验检测结果
通过上述方法检测人口腔拭子样本中的线粒体基因3243A>G突变情况。提取方法简单,快速,能够满足产品检测需求;产品设计选用常用化学物质及普通Taqman探针,成本低,检测结果可靠;灵敏度高,最低可以检出0.2ngDNA背景下,含量低至0.5%的m.3243A>G突变;特异性好,对口腔中常见定植菌、呼吸道常见病原体,如化脓性链球菌、表皮葡萄球菌、罗伊氏乳杆菌、假丝酵母菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒、合胞病毒,以及m.3243邻近位点m.3460G>A不会产生非特异反应;精密性高,阴性符合率100%,批内Ct值的变异系数CV≤5%,批间(日间)Ct值的变异系数CV≤5%,不同操作者间精密度CV≤5%,不同仪器间精密度CV≤5%;操作简便,耗时短,全程约一个半小时。填补了目前市场上线粒体基因3243A>G突变检测(荧光PCR法)的空白状况,可为临床怀疑与此位点相关线粒体病的诊断与鉴别排除提供依据。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准,说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
序列表
<110> 广州嘉检医学检测有限公司
<120> 检测线粒体3243A>G突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cagggtttgt taagatgcct gg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cagggtttgt taagatgtct gg 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cagggtttgt taagatgacg gg 22
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gaggagtagg aggttgg 17
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
actttacagt cagaggttca attcc 25
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
aaatagggac ctgtatgaat gg 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tttggtagtt taggacctgt gg 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
cacgagggtt cagctgtctc tt 22
Claims (5)
1.引物对探针组合产品,其特征在于,所述引物对包括:选自核苷酸序列如SEQ ID NO:1~ SEQ ID NO:3至少一种所示的上游引物,核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的下游引物;
所述探针包括SEQ ID NO:5所示的检测探针;
所述引物对还包括内参引物对,所述探针还包括内参探针;所述内参引物对和所述内参探针用于定量检测线粒体保守区域的核酸片段的表达;所述内参引物对的上游引物、下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示,所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
2.根据权利要求1所述的组合产品,其特征在于,所述探针为自身淬灭探针,且所述内参探针与所述检测探针的荧光发射基团信号可区分。
3.含有权利要求1~2任一项所述的组合产品的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其还包含扩增缓冲液、dNTP、Mg2+、UNG 酶、DNA聚合酶、阳性质控品、阴性质控品、防腐剂以及水中的至少一种。
5.权利要求1~2任一项所述的组合产品在制备线粒体病检测试剂盒中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210063028.4A CN114085903B (zh) | 2022-01-19 | 2022-01-19 | 检测线粒体3243a>g突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210063028.4A CN114085903B (zh) | 2022-01-19 | 2022-01-19 | 检测线粒体3243a>g突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114085903A CN114085903A (zh) | 2022-02-25 |
CN114085903B true CN114085903B (zh) | 2022-04-26 |
Family
ID=80308887
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210063028.4A Active CN114085903B (zh) | 2022-01-19 | 2022-01-19 | 检测线粒体3243a>g突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114085903B (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117487921B (zh) * | 2023-12-25 | 2024-03-19 | 广州嘉检医学检测有限公司 | Casp3基因检测引物探针组合、试剂盒及其应用 |
CN117448448B (zh) * | 2023-12-25 | 2024-03-29 | 广州嘉检医学检测有限公司 | Il-1b基因检测引物探针组合、试剂盒及其应用 |
CN117448446A (zh) * | 2023-12-25 | 2024-01-26 | 广州嘉检医学检测有限公司 | Fcgr2a基因检测引物探针组合、试剂盒及其应用 |
CN117448447B (zh) * | 2023-12-25 | 2024-03-29 | 广州嘉检医学检测有限公司 | Itpkc基因检测引物探针组合、试剂盒及其应用 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1806052A (zh) * | 2003-04-16 | 2006-07-19 | 爱科来株式会社 | 检测或定量测定线粒体dna3243变异的方法及其试剂盒 |
CN103451268A (zh) * | 2012-05-31 | 2013-12-18 | 上海市儿童医院 | 一种检测线粒体a3243g杂合突变率的标准品、试剂盒及其检测方法 |
CN108192965A (zh) * | 2017-12-30 | 2018-06-22 | 北京中科唯新生物医学研究所有限公司 | 一种检测线粒体基因组a3243g位点异质性的方法 |
WO2020230601A1 (ja) * | 2019-05-10 | 2020-11-19 | ルカ・サイエンス株式会社 | ミトコンドリアリボソームrna変異検出用プライマーdnaセットを含むキット、ミトコンドリアリボソームrna発現用核酸、前記核酸を封入してなる脂質膜構造体及びそれらの利用 |
CN112111568A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-12-22 | 安徽医科大学第一附属医院 | 一种检测线粒体3243位点基因型的试剂盒及方法 |
CN113322317A (zh) * | 2021-07-05 | 2021-08-31 | 北京华诺奥美基因生物科技有限公司 | 一种用于线粒体肥胖基因突变检测的引物对和探针组及试剂盒 |
-
2022
- 2022-01-19 CN CN202210063028.4A patent/CN114085903B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1806052A (zh) * | 2003-04-16 | 2006-07-19 | 爱科来株式会社 | 检测或定量测定线粒体dna3243变异的方法及其试剂盒 |
CN103451268A (zh) * | 2012-05-31 | 2013-12-18 | 上海市儿童医院 | 一种检测线粒体a3243g杂合突变率的标准品、试剂盒及其检测方法 |
CN108192965A (zh) * | 2017-12-30 | 2018-06-22 | 北京中科唯新生物医学研究所有限公司 | 一种检测线粒体基因组a3243g位点异质性的方法 |
WO2020230601A1 (ja) * | 2019-05-10 | 2020-11-19 | ルカ・サイエンス株式会社 | ミトコンドリアリボソームrna変異検出用プライマーdnaセットを含むキット、ミトコンドリアリボソームrna発現用核酸、前記核酸を封入してなる脂質膜構造体及びそれらの利用 |
CN112111568A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-12-22 | 安徽医科大学第一附属医院 | 一种检测线粒体3243位点基因型的试剂盒及方法 |
CN113322317A (zh) * | 2021-07-05 | 2021-08-31 | 北京华诺奥美基因生物科技有限公司 | 一种用于线粒体肥胖基因突变检测的引物对和探针组及试剂盒 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
Accumulation of somatic mutation in mitochondrial DNA extracted from peripheral blood cells in diabetic patients;T. Nomiyama 等;《Diabetologia》;20021130;第45卷;第1577-1583页 * |
Analysis of Mitochondrial DNA Point Mutation Heteroplasmy by ARMS Quantitative PCR;Wang Jing 等;《Current Protocols in Human Genetics》;20110115;第1-16页 * |
Detection and Quantification of Heteroplasmic Mutant Mitochondrial DNA by Real-Time Amplification Refractory Mutation System Quantitative PCR Analysis: A Single-Step Approach;Ren-Kui Bai 等;《Clinical Chemistry》;20040601;第50卷(第6期);第996-1001页 * |
Effects of MOTS‑c on the mitochondrial function of cells harboring 3243 A to G mutant mitochondrial DNA;Chang Ho Ahn 等;《Molecular Biology Reports》;20200411;第47卷;第4029-4035页 * |
应用实时荧光定量聚合酶链反应结合突变阻滞形成系统进行线粒体脱氧核糖核酸A3243 G突变负荷检测;林晓贞 等;《中华神经科杂志》;20090331;第42卷(第3期);摘要,第198页左栏第1段至第右栏最后1段 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114085903A (zh) | 2022-02-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN114085903B (zh) | 检测线粒体3243a>g突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法 | |
CN107488711B (zh) | 点突变的基因型检测的方法及其试剂盒 | |
US20210246499A1 (en) | Detection of short homopolymeric repeats | |
CN111020031A (zh) | 序列特异性阻断剂结合特定pcr程序检测肿瘤基因突变的方法 | |
CN104328164A (zh) | 荧光探针杂交法检测人egfr基因突变试剂盒 | |
WO2017112738A1 (en) | Methods for measuring microsatellite instability | |
CN107058538B (zh) | 一种引物组合物及其组成的试剂盒和应用 | |
CN106939334B (zh) | 一种孕妇血浆中胎儿dna含量的检测方法 | |
CN110846408A (zh) | 用于检测ttn基因突变的引物组合及其应用 | |
CN106834434B (zh) | 用于检测COX-1、COX-2和GPIIIa基因多态性的核酸、试剂盒及方法 | |
WO2008077330A1 (en) | Taqman mgb probe for detecting maternal inherited mitochondrial genetic deafness c1494t mutation and its usage | |
CN110846409A (zh) | 用于检测tnni3k基因突变的引物组合及其应用 | |
WO2008077329A1 (fr) | Sonde destinée à détecter la mutation a1555g de surdité génétique mitochondriale héritée de la mère et son utilisation | |
CN108070675B (zh) | 一种同时检测三种曲霉的引物探针组合和荧光定量pcr试剂盒 | |
CN110295218B (zh) | 量化靶基因的突变型等位基因负担的方法 | |
CN116064775A (zh) | TRECs、KRECs和SMN1的检测试剂盒和检测方法 | |
CN116004775A (zh) | 一种人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物、试剂盒及方法 | |
CN112322722B (zh) | 检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用 | |
CN108504731B (zh) | 诊断脂质代谢相关疾病或阿尔茨海默病标志物的方法 | |
CN113322317A (zh) | 一种用于线粒体肥胖基因突变检测的引物对和探针组及试剂盒 | |
JP6205216B2 (ja) | 変異検出用プローブ、変異検出方法、薬効判定方法及び変異検出用キット | |
KR20100083487A (ko) | 윌슨병 진단용 조성물 | |
KR101728023B1 (ko) | Pcr―ldr을 이용한 atp7b 유전자의 돌연변이 검출 | |
CN117448448B (zh) | Il-1b基因检测引物探针组合、试剂盒及其应用 | |
KR102478811B1 (ko) | 멀티플렉스 pcr 플랫폼 기반의 알츠하이머 질환 진단을 위한 신규한 마커 조성물 및 이의 용도 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |