KR100808312B1 - 인위적 에스엔피 서열의 동시증폭을 이용한 염색체,유전자, 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정방법 - Google Patents

인위적 에스엔피 서열의 동시증폭을 이용한 염색체,유전자, 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정방법 Download PDF

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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Abstract

본 발명은 염색체, DNA 상의 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 분석 키트 및 측정 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 의한 카피 수 분석 키트는 인위적으로 염기의 변화가 이루어진 인위적인 SNP를 하나 이상 포함하는 서열로서, 프라이머 서열 부분을 포함하여 증폭될 서열이 인위적 SNP를 제외하고는 야생형 지놈 DNA 서열과 동일한 인위적 SNP 서열을 한 종 이상 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명에 의한 카피 수 측정 방법은 인위적인 SNP 서열과 야생형 지놈 DNA 서열의 특정 뉴클레오티드 서열이 경쟁적으로 증폭하도록 고안된 프라이머 쌍들을 이용하여, 한 종 이상의 인위적 SNP 서열과 검체시료 DNA를 혼합하여 이들로부터 특정 뉴클레오티드 서열을 동시에 경쟁적으로 증폭하는 제1단계; 상기 증폭된 검체시료 지놈 DNA 서열과 상기 증폭된 인위적 SNP 서열을 구별하여 각 증폭량을 측정하는 제2단계; 및 상기 측정된 증폭량에 기초하여 카피 수를 결정하는 제3단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 염색체, 유전자, 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 분석 키트 및 측정 방법은, 측정시간과 필요 노동력을 현저히 절감시킬 수 있을 뿐만 아니라, 특정 유전자 혹은 뉴클레오티드 서열의 카피 수를 결정하는 다른 분자적 방법에 비해 정확한 값을 얻을 수 있는 우수한 효과가 있다.
인위적 SNP 서열, 염색체, 연장 프라이머, 지놈 DNA, 염색체 카피 수

Description

인위적 에스엔피 서열의 동시증폭을 이용한 염색체, 유전자, 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정방법{Method for measuring the chromosome, gene or nucleotide sequence copy numbers using co-amplification of artificial SNP sequences}
도 1은 인위적 SNP 서열 (A'과 B')과 야생형 서열 (A와 B)을 예시한 개략도이다.
도 2는 본 발명에 의한 SNP를 이용한 염색체, 유전자, 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정방법을 도시한 개략도이다.
도 3은 표준시료와 검체시료(이상배수체 시료)에서 나온 결과를 예시한 개략도이다.
도 4는 지놈 DNA 서열과 인위적 SNP 서열에서 증폭된 산물을 구별하는 방법 중 단일염기연장 (single base extension) 방법을 도시한 개략도이다.
도 5는 지놈 DNA 서열과 인위적 SNP 서열에서 증폭된 산물을 구별하는 또 다른 방법을 도시한 개략도이다.
도 6은 지놈 DNA 서열과 인위적 SNP 서열에서 증폭된 산물을 구별하는 방법 중 녹는점의 차이를 이용한 방법을 도시한 개략도이다.
도 7은 본 발명에 의한 염색체, 유전자, 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카 피 수 분석 키트의 일실시예이다.
도 8은 본 발명에 의한 염색체, 유전자, 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 분석 키트의 일실시예이다.
도 9는 본 발명의 실시예 3의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실시예 4의 RR값 결정 과정을 나타내는 도면이다.
도 11은 본 발명의 실시예 4의 구체적인 RR값을 나타내는 도면이다.
도 12는 본 발명의 실시예 4에 있어서 정상인의 샘플의 nRR값과 다운 증후군 환자의 nRR값을 비교하여 나타낸 도면이다.
도 13은 본 발명에 의한 방법을 이용하여 얻어진 결과를 종래의 MLPA 방법과 비교하기 위한 것으로서, MLPA 방법에 따라 얻어진 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 본 발명에 의한 방법을 이용하여 얻어진 결과를 종래의 MAPH 방법과 비교하기 위한 것으로서, MAPH 방법에 따라 얻어진 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 염색체, 유전자, 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수를 측정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 염색체, 유전자, 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수를 분석하는 키트에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 인위적인 SNP 서열을 이용하여 염색체, 유전자, 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카 피 수를 측정하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 지놈 DNA 서열과 인위적인 SNP 서열을 동시에 증폭시킨 후 증폭된 유전자의 상대적인 양을 통해 염색체의 결실, 중복 등에 의한 염색체, 유전자, 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수의 변화를 측정하는 방법에 관한 것이다.
특정 염색체 서열의 변화는 인간의 질환과 증후군의 원인이 된다. 이와 같은 변화로는 다운증후군처럼 염색체 하나 전부가 더 있는 것 혹은 적은 것도 있으며, 디죠지(DiGeorge) 증후군처럼 수백만 염기쌍이 결실되어 있거나, 베커(Becker) 또는 뒤시엔느( Duchenne) 근이영양증 (muscular dystrophy)과 같이, 조그만 염색체 조각의 결실 혹은 중복 등이 있을 수 있다. 정신지체 환자들에서는 아말단(subtelomeric) 결실도 많이 보고 되고 있다 (Lamb등, 1989). 또한 BRCA1, MLH1/MLH2와 같은 특정 유전자의 염색체 부위가 암에서 흔히 변화되는데, 이는 그 유전자의 발현에 중요하다고 알려져 있다 (Petrij-Bosch등, 1997; Wijnen 등, 1998). 유전자 카피 수의 변화를 분석하는 것은, ERBB2 유전자의 증폭이 일어난 유방암 환자의 치료에 ERBB2에 특이한 항체를 사용하는 예에서 볼 수 있듯이, 암환자의 치료에도 중요한 요소가 될 수 있다(Leyland-Jones와 Smith, 2001).
현재 염색체 변화의 카피 수를 결정하는데 여러 가지 방법을 사용하고 있다. 염색체의 수와 구조적 변화를 측정하는 가장 표준적인 방법은 핵형분석 (karyotyping) 방법인데, 이는 환자의 혈액, 섬유아세포 혹은 양수세포를 배양해야하고, 결과를 해석하는데 많은 시간과 인력이 필요하다. 또한 핵형분석법으로는 보통 1메가베이스 이상의 염색체 변화만을 관찰할 수 있는데, FISH (fluorescent in situ hybridization) 방법으로 이러한 민감도를 보완할 수 있다. 그러나 FISH도 또한 많은 시간과 인력을 필요할 뿐 아니라 보통 한번에 4가지 이상의 목표 유전자의 변화를 측정하지는 않는다 (Klinger등, 1992). 또한 핵형분석법을 자동화하기 위한 한 방법으로 다중칼라 염색체 페인팅법(multicoloar chromosome painting)이 소개되었는데, 이것은 각 염색체의 부분을 서로 다른 색의 형광물질로 표지하여 쉽게 결실과 중복 혹은 전좌를 알아볼 수 있게 하였다(미국 특허 제6,066,459호). 다중칼라 염색체 페인팅법(Multicoloar chromosome painting)은 핵형분석법에 비해 민감도가 어느 정도 증가되기는 하지만, 기본적으로 핵형분석에 필요한 세포배양과 후처리 과정이 필요하다.
시간과 인력의 과도한 필요성을 극복하기 위해서, 최근 분자적 방법을 이용하여 염색체 변화를 알아내려고 노력하고 있다. 어레이(Array)를 기초로 한 CGH(comparative genomic hybridization)이 현재 가장 주목을 받고 있는 방법으로서, 유전 질환의 진단에 사용하기 위해 여러 가지 시도가 진행되고 있으며, 암조직의 염색체 변화를 알아내는 데에 이용되고 있다(Pinkel등, 1998; 미국 특허 제6,197,501호 및 제6,159,685호). 이 방법은 BAC 클론을 기판(substrate) 표면에 고착시켜 어레이(array)를 형성하고, 미리 표지한 표준 DNA와 샘플 DNA를 상기 어레이(array)에 하이브리드 형성시킨다. 표준시료와 샘플시료에서 오는 신호의 상대적인 양을 비교함으로써 결실과 중복과 같은 염색체 변화를 알아낼 수 있는 방법이다.
또한, 다중 PCR 방법으로 상대적인 증폭정도를 측정함으로써 카피 수를 결정 하는 방법이 있으며(Rahil 등, 2002), 이를 변형한 방법으로 MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification)가 최근 소개되었다(Schouten 등, 2002; Carrino, 1996). MLPA 방법으로 유전자를 증폭하는 동안 상대적인 증폭정도가 비교적 안정되었다고는 하나, 여전히 그 변이도가 비교적 커서(standard deviation= 0.13-0.3), 염색체 이상 환자의 진단에 응용하기에는 만족할 만한 수준으로 발전하지는 못했다.
또한, 짧은 프로브들을 지놈 DNA와 혼성화시킨 후, 이들을 회수하여 양적으로 증폭시켜 카피 수를 결정하는 MAPH(multiplex amplifiable probe hybridisation) 방법이 있다(John A. L. Amrmour 등, Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28, No. 2). 그러나, 여전히 변이도가 크기 때문에, 염색체 이상 환자의 진단에 응용하기에는 어려움이 있었다.
LOH (loss of heterozygosity)는 현재 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 결실이나 중복을 발견하는데 가장 많이 사용되는 방법이다. 그러나 LOH 방법은 결실 혹은 중복된 부위를 제외한 나머지 부위의 대립인자(allele) 구성이 시료와 꼭 같은 표준 시료가 있어야 한다. 따라서 주로 비암조직을 표준시료로 사용하여 암조직에서의 염색제 이상을 진단하는데 주로 사용하고 있다. LOH의 연구를 위해서는 마이크로새틸리트 마커(microsatellite marker) (Call 등, 1990)를 사용할 수도 있고, SNP(Lindblad-Toh 등, 2000)를 이용할 수도 있다. LOH 방법은 동형접합 결실(homozygous deletion)이 아니라면, 염색체의 변화가 결실인지 중복인지 구별하지 못하는 단점이 있다. Pont-Kindon과 Lyon (2003)은 염색체 이상을 발견하 는데 SNP를 이용한 또 다른 방법을 발표하였는데, 이들은 이형접합 대립인자(heterozyous allele)의 상대적인 양을 용융 곡선 분석법(melting curve analysis)을 이용하였다. 이 방법에서 두 대립인자의 상대적인 양이 정상과 달라지는 경우 삼염색체성(trisomy)이 있다는 것을 알아내는 방법이다. 이 경우 역시 염색체의 결실인지 중복인지 명확히 구별해 내지 못한다는 단점이 있으며, 한 염색체 위치의 변화를 발견하기 위해, 적어도 특정 환자의 DNA에서 하나 이상의 이형접합 대립인자를 찾아내야 한다는 단점이 있어서, 적어도 5-6개 이상의 SNP 위치에서 이형접합 여부에 대한 선행 실험이 필요하다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 하는 것으로서, 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수를 측정함에 있어서, 비용과 필요 노동력을 현저히 절감시킬 수 있을 뿐만 아니라, 특정 유전자의 카피 수를 결정하는 다른 분자적 방법에 비해 정확한 값을 얻을 수 있도록 하여 염색체의 중복 또는 결실을 포함한 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열 카피 수의 변화를 정확히 측정할 수 있도록 하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명에 의한 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 분석 키트는, 인위적으로 염기의 변화가 이루어진 인위적인 SNP를 하나 이상 포함하는 서열로서, 프라이머 서열 부분을 포함하여 증폭될 서열이 인위적 SNP를 제외하고는 야생형 지놈 DNA 서열과 동일한 한 종 이상 의 인위적 SNP 서열; 상기 인위적 SNP 서열과 그에 대응되는 염색체, 유전자 혹은 뉴클레오티드의 카피 수를 분석할 대상인 검체시료 DNA 서열을 동시에 증폭시키되, 서열 자체를 증폭시키거나, 상기 서열의 신호를 증폭시키는 증폭 수단; 상기 검체시료 DNA 서열과 상기 인위적 SNP 서열에 공통적으로 존재하는 서열로 구성된 프라이머; 증폭된 검체시료 DNA 서열과 증폭된 인위적 SNP 서열을 구별하되, 인위적 SNP 서열에 존재하는 야생형 지놈 DNA 서열과 다른 염기를 인지하여 상기 증폭된 검체시료 DNA 서열과 상기 증폭된 인위적 SNP 서열을 구별하여 상기 검체시료의 지놈 DNA 서열(A, B, C, D...)과 상기 인위적 SNP 서열(A', B' C' D'...)의 각 유전자량을 측정하는 수단; 및 상기 측정된 검체시료 DNA 서열의 유전자량을 인위적 SNP 서열을 기준으로 표준화시키기 위하여, 상기 각 증폭된 인위적 SNP 서열의 유전자량(A', B', C', D'...)과 그에 상응하는 상기 각 증폭된 검체시료 DNA의 유전자량(A, B, C, D...)의 비(A/A', B/B', C/C', D/D')를 구하여 얻어진 aSNP 표준화된 검체시료의 유전자량 데이터(A/A', B/B', C/C', D/D')를 저장하고, 상기 각 유전자 종에 대한 각 aSNP 표준화된 검체시료의 유전자량 데이터를 다른 유전자 종의 데이터와 비교한 데이터[RRAB=(A/A')/(B/B'), RRAC=(A/A')/(C/C'), RRAD=(A/A')/(D/D'), RRBC=(B/B')/(C/C')....]를 더 저장하며, 표준시료 DNA 서열(A*, B*, C*, D*)과 상기 인위적 SNP 서열(A', B', C', D')을 동시 증폭시켜 상기 증폭된 표준시료 DNA 서열의 유전자량을 aSNP 표준화된 표준시료의 유전자량 데이터(A*/A', B*/B', C*/C', D*/D')로 변환시키고, 다시 이를 다른 유전자 간의 비율 인 데이터[RRA*B*=(A*/A')/(B*/B'), RRA*C*=(A*/A')/(C*/C'), RRA*D*=(A*/A')/(D*/D'), RRB*C*=(B*/B')/(C*/C')....]의 형태로 변환하여 더 저장하며, 상기 각 유전자 종에 대하여, 상기 aSNP 표준화된 검체시료의 유전자량 데이터와 상기 aSNP 표준화된 표준시료의 유전자량 데이터의 비[nRRAB=RRAB/RRA*B*, nRRAC=RRAC/RRA*C*. nRRAD=RRAD/RRA*D*, nRRBC=RRBC/RRB*C*...]를 더 저장하는 수단을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기한 본 발명에 의한 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 분석 키트에서, 상기 인위적 SNP 서열은, 자연계에서는 1% 미만으로 나타나는 염기의 변화가 도입된 것이 바람직하며 이상적으로는 아직 보고되지 않은 0.1% 미만의 염기변화를 도입하는 것이 좋다. 자연적으로 1% 이상 발생하는 염기의 변화가 도입되는 경우에는, 지놈 DNA 서열과 인위적 SNP 서열의 구별을 위해 상기 염기의 변화가 사용될 수 없으므로, 본 발명의 목적을 달성하기 어렵게 된다. 흔하지 않은 염기의 변화를 갖고 있는 시료의 경우 결과가 비정상인으로 나올 수 있다. 이러한 경우 인위적 SNP 서열을 DNA 시료와 혼합하지 않고 DNA 시료만으로 실험과정을 진행하면 그 변화가 시료 DNA에서의 카피수 변화에 의해 일어나지 않았다는 것을 확인할 수 있다.
본 발명에 의한 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수를 측정하는 방법은, 인위적으로 염기의 변화가 이루어진 인위적인 SNP를 하나 이상 포함하는 서열로서, 증폭시 야생형 지놈 DNA 서열과 같은 프라이머 쌍으로 증폭하도록 고안되어 동시에 경쟁적으로 증폭하도록 한 한 종 이상의 인위적 SNP 서열, 그리고 검체시료 DNA 서열의 특정 뉴클레오티드 서열이 경쟁적으로 증폭하도록 하는 제1단계; 상기 증폭된 지놈 DNA 서열과 상기 증폭된 인위적 SNP 서열을 구별하여 상기 양 서열의 각 증폭량을 측정하는 제2단계; 및 상기 측정된 증폭량에 기초하여 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수를 결정하는 제3단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 시료 DNA 서열과 인위적 SNP 서열에서 각각 두 개 이상의 지놈 유전자 혹은 DNA 서열을 선택하여 동시에 증폭한 후 그 유전자들 또는 그 DNA 서열들의 상대적인 양을 결정하되, 정확한 정량 및 분석을 기하기 위하여, 상기 상대적인 양의 결정은, 상기 유전자들과 동시에 증폭된 인위적 SNP 서열의 증폭된 산물에 대한 상대적인 양을 근거로 하여 이루어지며, 이와 같이 정확성이 담보된 측정을 통해, 시료 DNA가 존재하는 특정 염색체의 중복 또는 결실 등의 변화를 결정하는 방법이다. 이 때, 지놈 DNA 서열과 인위적 SNP 서열의 구별은, 양 서열 내에 서로 다른 하나 이상의 염기가 존재한다는 것을 이용한다. 인위적 SNP 서열은 보통 야생형 서열의 염기 중 하나 이상이 다른 염기로 치환되어 있지만, 그 치환된 염기 이외의 나머지 염기는 야생형의 서열과 동일하게 함으로써, 증폭하는 과정에서 증폭 효율이 야생형 지놈 DNA 서열과 크게 달라지지 않게 한다. 이 때, 야생형 서열과 인위적 SNP 서열 사이에 차이가 있는 염기의 변화는 일반적인 인간들에서는 발견되지 않거나 매우 드믄 염기의 변화를 인위적으로 만든 것으로, 이것이 상기 서열들이 증폭된 이후에 지놈 DNA 서열과 인위적 SNP 서열을 구별할 수 있도록 하는 수단이 되는 것이다.
둘 이상의 인위적 SNP 서열들을 시료 지놈 DNA 서열과 혼합함에 있어서, 그 비율은 일정하게 실험적으로 미리 결정하는 것이 바람직한데, 이는 증폭 후 상기 두 서열(야생형 서열과 인위적 SNP 서열)에서 나온 신호의 크기가 비슷하도록 하는 실험조건에 따라 결정한다. 둘 이상의 유전자를 다중 PCR 방법으로 증폭하는 과정에서 사용하는 프라이머 (primer)는, 야생형과 인위적 SNP 서열에 공통적으로 나타나는 서열을 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 증폭 과정에서 시료 DNA의 유전자와 인위적 SNP 서열의 유전자는 서로 경쟁적으로 증폭하게 되는데, 증폭 산물의 상대적인 양은 야생형의 유전자의 양과 인위적 SNP 서열의 양의 상대적인 양과 비례한다. 둘 이상의 유전자가 동시에 증폭되도록 함으로써, 두 유전자 사이의 상대적인 양을, 인위적 SNP 서열로부터 증폭된 두 유전자의 상대적인 양을 근거로 계산함으로써, 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 변화를 알아낼 수 있게 된다. 이 때, 지놈 서열에서 만들어진 증폭 산물과 인위적 SNP 서열에서 만들어진 증폭산물과의 구별은 인위적으로 도입된 하나 이상의 염기서열 차이를 이용한다. 이 결과는 특정 유전자의 카피수를 결정하는 다른 분자적 방법에 비해 비교적 정확한 값을 얻을 수 있는데, 그 근거는 1천개 이상의 지놈 서열과 1천개 이상의 인위적 SNP 서열이 서로 경쟁적으로 증폭되어 그 상대적인 양이 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수의 측정에 사용되게 함으로써 증폭과정 중 그 상대적인 양의 변화가 최소화 될 수 있다는 장점을 가지고 있다.
본 발명은, 삼염색체성(trisomy), 일염색체성(monosomy), 성(sex) 염색체 이상과 같은 중복과 결실에 의한 염색체 이상을 진단하고 스크린하는데 사용할 수 있다. 또한 이 방법은 뒤시엔느(Duchenne) 근이형성증과 같은 작은 염색체의 결실로 인한 유전질환의 진단과 정신지체, 알츠하이머(Alzheimer) 질환, 당뇨병과 같이 여러 원인에 의해 생기는 유전적 소인이 있는 질환의 염색체에의 작은 변화를 알아내는데 유용하다. 암조직에서 암유전자 (oncogene)와 암억제유전자 (tumor suppressor gene)의 카피수 변화, 혹은 전반적인 염색체의 수 이상을 분석하는 데에도 이용할 수 있다.
본 발명을 더욱 명확히 설명하기 위하여, 본 발명에서 사용된 용어를 다음과 같이 정의한다.
"DNA" 혹은 "deoxynucleic acid"는 단일 혹은 두 사슬의 형태로 되어 있는 deoxyribonucleotide의 폴리머 (polymer)로, 자연적으로 존재하는 뉴클레오티드 (nucleotide)의 유사체(analog)들을 포함한다.
"프라이머 (primer)"는 일반적으로 15개에서 30개의 염기로 구성된 단일 사슬의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)이다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 형판 (template)의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 형판과 하이브리드형성을 할 수 있으면 된다. 프라이머의 위치 혹은 프라이머 결합부위는 프라이머가 하이브리드를 형성하는 표적 DNA의 절편을 말한 다.
하이브리드형성 (hybridization)은 보통 올리고뉴클레오티드와 표적 DNA가 특이하게 결합하도록하는 조건에서 실시한다.
"증폭 (Amplification)"은 표적 서열이 더 합성되도록 하는 과정을 말한다. 일반적으로 증폭은 어닐링(annealing), 합성, 변성과정을 반복하는데, 합성과정은 연장 (extension or elongation) 과정을 말한다. 또한 이러한 과정을 "PCR (polymerae chain reaction)" 이라고도 한다. "다중 (multiplex)" 증폭은 여러 가지 (둘 이상) 표적 서열을 동시에 같은 조건으로 증폭하는 과정을 말한다.
"다형성 부위(Polymorphic site)"는 여러 가지 염기가 발견되는 유전자좌 (locus)를 말한다. 보통 SNP는 최소한 두가지의 대립유전자(allele)가 존재하며 빈도는 일반인에서 1% 이상 나타나는 경우를 말한다. 가장 흔히 나타나는 대립유전자의 형태를 야생형이라고 하고, 적게 나타나는 형태를 돌연변이 대립유전자(allele)라고 한다.
"SNP (single nucleotide polymorphism)"은 단일 뉴클레오티드에서의 다형성(polymorphism)이다. 그 위치는 보통 매우 보존된 서열들이 그 전 후로 존재하게 된다. SNP는 보통 특정위치의 한 염기가 다른 염기로 치환되어 일어나게 되는데, 뉴클레오티드의 결실이나 중복에 의해서도 일어난다.
"인위적 SNP (artificial SNP) 혹은 aSNP"는 자연적으로 존재하지 않거나 거의 존재하지 않는 염기의 변화를 인위적으로 도입한 단일 뉴클레오티드의 다형성(polymorphism)을 말한다. 바람직하게는, 자연적으로는 1% 미만, 가장 바람직하게 는 0.1% 미만으로 존재하는 염기의 변화를 도입한 것이 바람직하다. 자연적으로 1% 이상 존재하는 염기의 변화인 경우에는 자연발생적인 염기의 변화와 구별되지 않으므로, 지놈 DNA 서열의 유전자 증폭량과 비교하기 위한 표준으로서의 기능을 수행하기 어렵게 된다. 이러한 관점에서는 0.1% 미만 존재하는 염기의 변화를 도입하는 것이 더욱 바람직하다.
"인위적 SNP 서열 (artificial SNP sequence)"은 인위적으로 염기의 변화가 이루어진 인위적인 SNP를 한 개 이상 가진 서열을 말한다. 특히, 여기서 말하는 인위적인 SNP 서열은 프라이머 서열 부분을 포함하여 증폭될 서열이 인위적 SNP를 제외하고는 야생형 지놈 DNA 서열과 동일한 서열을 의미한다.
"어레이(array)"는 표적 인자가 많다는 것을 말하고, 각 표적 인자는 정의된 일정양의 생물학적 분자들로 이루어진다.
"시료"는 생명체에서 얻어지는 생물학적 물질들이고, 대부분 인간 유래의 생물학적 물질을 말한다.
"염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피(copy) 수" 변화는 증가적 카피의 수뿐만 아니라 감소적 카피의 수를 포함한다. 즉, 염색체의 중복으로 인한 증가적 카피 수{예컨대, 상염색체의 경우 삼염색체성 (trisomy) 혹은 사염색체성 (tetrasomy)} 뿐만 아니라, 염색체의 결실로 인한 감소적 카피 수 {예컨대, 상염색체의 경우 일염색체성 (monosomy)}를 포함한다.
"야생형 지놈 DNA 서열"은 사람의 대표적인 DNA서열로, 서열을 이루는 모든 위치에서의 염기 하나하나가 10%이상의 정상인에서 발견되는 지놈의 DNA 서열을 말 한다.
"표준시료"는 염색체의 중복, 결실 또는 치환 등이 나타나지 않는 정상 유기체 지놈의 DNA 시료를 말한다. 또한 표준시료의 지놈 DNA 서열은 야생형 지놈 DNA 서열을 가지고 있다.
"aSNP 표준화"는, 표준시료 또는 검체시료와 같은 지놈 DNA 서열의 증폭된 유전자량을, 상기 시료와 동시 증폭된 인위적 SNP 서열의 증폭된 유전자량을 기준으로 하는 상대적인 수치로 표현하는 것을 말한다.
"검체시료"는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수를 측정하고자 하는 대상을 말한다.
이하에서, 도면을 참고로 하여, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
도 1은 두 종류의 인위적 SNP 서열(A'과 B')과 두 종류의 야생형 지놈 DNA 서열(A와 B)을 예시한 것이다. A와 A'는 두 프라이머 내부에 존재하는 서열에서 오직 하나의 염기만 차이가 있으며, B와 B'의 경우도 마찬가지이다. AF와 AR은 A 및 A' 유전자 단편을 증폭하기 위한 프라이머이고, BF와 BR은 B 및 B' 유전자를 증폭하기 위한 프라이머를 나타낸다. 도 1의 예에서는, A와 B 유전자 모두에서 야생형 지놈 서열에서는 G라는 염기로 되어 있는데, 이 염기가 인위적 SNP 서열인 A'과 B'에서는 T라는 염기로 치환되어 있다. 이러한 염기 변화는 하나 또는 둘 이상이 도입될 수 있으며 증폭과정에서 효율에 큰 변화가 없으면 된다. 인위적 SNP 서열에 염기를 치환하는 방법으로는 여러 가지 방법을 사용할 수 있으며, PCR 증폭과정 중 생기는 실수를 이용하는 방법이나, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 합성하는 방법 혹은 이 두 방법을 결합시킨 방법을 모두 사용할 수 있다.
이 방법은 유전자의 카피 수 결정에 두 가지 이상의 유전자를 이용하며 각각의 유전자좌는 동일한 염색체 내에 존재하는 유전자일수도 있으며 서로 다른 염색체들에 각각 존재하는 유전자일 수도 있다. 도2는 본 발명의 진행과정을 나타내고 있다. 도 2는 두 종류의 시료 DNA 서열과 두 가지 인위적 SNP 서열의 혼합물로부터 두 가지 표적 유전자 (A, A' 과 B, B')를 증폭하고 동시 증폭된 인위적 SNP 서열을 근거로 두 표적 유전자의 상대적인 양을 분석하는 과정을 예시한 개략도이다. 실험과정은 보통 표준시료와 검체시료를 동시에 진행한다. 그러나, 표준시료에 대한 측정을 먼저 수행하여 놓고 그 값을 표준값으로 설정하여 놓은 후, 원하는 검체가 있을 때마다 검체에 대한 측정을 실시하여, 상기 표준값과 비교할 수 도 있다. 도 2의 예에서는, 표준시료와 검체시료를 동시에 진행하였다. 표준시료 DNA (왼편)와 검체시료 (오른편)에 두 가지 이상의 인위적 SNP 서열을 각각 혼합한 후 실험을 다른 튜브에서 동시에 진행하였다.
본 발명을 위해서는, (1)인위적 SNP 서열과 시료 DNA 서열 간의 비율과 (2)두 가지 이상의 인위적 SNP 서열의 상대적인 비율을 일정하게 실험적으로 미리 결정하는 것이 바람직한데, 이러한 결정은, 증폭 후 두 종류의 서열(야생형 DNA 서열과 인위적 SNP 서열의 증폭산물)에서 나온 신호의 크기가 비슷하도록 하는 실험조건에 따라 결정한다. 일단, 인위적 SNP 서열들(A'과 B') 간의 상대적인 비율이 결정되면 이 혼합물은 그 비율로 혼합한 후 분주하고, 표준시료와 검체시료에 같이 분주된 혼합물을 사용한다. 또한 인위적 SNP 서열들의 혼합물과 시료 DNA 서열의 상대적인 양도 일정하게 한다.
시료 DNA 서열과 인위적 SNP DNA 서열의 혼합물에서 A와 B 유전자를 증폭하는데 사용하는 프라이머 (primer)는 A 및 A' 유전자의 증폭을 위해 AF와 AR을, B 및 B' 유전자의 증폭을 위해 BF와 BR을 사용한다. 본 발명은, 또한, 세 가지 이상의 유전자(A, B, C)를 동시에 증폭할 수 있다. 증폭과정에서 A와 A'는 서로 경쟁적으로 같거나 비슷한 효율로 증폭되고, B와 B'도 마찬가지로 증폭되어 A/A'과 B/B'의 상대적인 비 {=(A/A')/(B/B')}는 인위적 SNP DNA들의 상대적인 양이 일정하면 정상인에서 일정한 값을 가지게 된다.
A/A' 혹은 B/B'의 비를 알기 위해서, 지놈 DNA 서열과 인위적 SNP 서열에서 증폭된 각각의 산물을 구별해야하는데, 이 때 인위적으로 도입된 염기의 변화를 이용하게 된다. 이 방법으로는 여러 가지 방법이 이용될 수 있는데, 두 가지 방법을 도 4 및 5에서 예시하였다. 이에 대해서는 하기에서 상세히 설명하고자 한다.
도 3은 상기 도 2의 방법에 따라 진행된 실험의 결과를 나타낸 것이다. 즉, 표준시료와 검체시료(예의 경우, 이상배수체 시료)에서 나온 결과를 예시한 것이다. RR (relative ratio)은 (A/A')/(B/B')으로 정의한다. 검체시료{이상배수체(aneuploidy) 시료}에 염색체의 변화가 존재하는 경우에는 그 RR 값은 표준시료에서 나온 RR보다 크거나 작은 값이 나오게 된다. 예컨대, 시발점에서 A 유전자의 카피 수가 중복에 의해 많은 경우 A'에 비해 상대적으로 증폭된 양이 많게 되어 표준시료의 RR값과 달라지게 되는 것이다(A의 중복인 경우 검체시료의 RR은 표준시료의 RR보다 커진다). nRR (normalized RR, 표준화된 RR)은 [검체시료의 RR/표준시료의 RR]로 정의하는데, 도 3의 예에서는 검체시료의 RR와 표준시료의 RR을 비교한 nRR은 1이 아니고 2이기 때문에 A 유전자가 최초에 중복되어 있었다는 것을 알 수 있다. 즉, A 유전자가 포함된 염색체에 중복이 있음을 알게 된다. 만일, A와 B 두 가지 유전자가 모두 상염색체(autosome)에 있고 A 유전자에 삼염색체성(trisomy)이 있다면, 즉, nRR 값이 1.5가 되며, A 유전자가 하나 결실되어 있는 경우 nRR 값은 0.5가 된다. 이 경우, B의 유전자는 염색체의 변화가 없는 정상 염색체의 DNA 서열이어야 함은 물론이다.
B의 유전자가 정상이라는 것을 확인하기 위해서는, 증폭에 들어가기 전에, 인위적 SNP 서열과 검체시료 지놈 DNA 서열의 비율인 (A/A') 혹은 (B/B') 비율이 일정 비율 이내에 있는지 분석하면, 두 유전자 모두의 증폭과 결실을 판별할 수 있다. A와 B 모두에 증폭이 있는 경우, (A/A')와 (B/B')의 값이 모두 커져 있고, 결실이 있는 경우 모두 작아져 있게 된다(물론, RR이나 nRR값의 변화가 없다).
상기에서는 A와 B의 2개의 유전자만을 대상으로 분석하였지만, 2개보다 더 많은 염색체에 존재하는 유전자를 동시에 테스트하는 것이 더욱 바람직하다. 이러한 경우, 2개의 유전자만을 가지고 하는 실험에 비해 실험 결과의 정확성을 현저히 높일 수 있다. 더욱 바람직하게는 5개 이상의 서로 다른 염색체에 존재하는 유전자를 함께 테스트하여 서로의 값을 비교할 수 있다.
더 나아가서는, 수 개의 테스트를 동시에 수행하는 다중 테스트(multiplex test)를 통해 많은 염색체 부위를 동시에 분석할 수도 있으며, 되도록 많은 염색체 부위를 테스트할수록 염색체 변화의 결정은 더욱 정확해진다. 테스트하는 유전자가 동일 염색체 내에 존재하는 경우에는 테스트하는 유전자의 수만큼 크로스체크가 되는 것이므로, 염색체 변화를 매우 정확히 판단할 수 있게 된다. 또한, 테스트하는 유전자가 다른 염색체에 존재하는 경우에는, 가능하게는 한 개체의 모든 염색체에 대한 테스트를 동시에 수행함으로써, 수많은 유전적 질환 내지 유전적 변이 여부를 빠르고 간편하게 결정할 수 있다. 예컨대, 여러 가지 설계한 테스트 세트를 한꺼번에 시행함으로써, 즉 5개 유전자로 구성된 다중 단위로 한, 종류가 다른 12개의 다중 테스트로 설계한 경우, 총 60가지 염색체 부위를 한꺼번에 테스트하게 된다. 500개의 염색체 부위를 측정할 수 있는 테스트 키트, 즉 5개의 다중 단위로 이루어진 서로 다른 100개의 테스트를 50개의 웰을 사용하여 다중 어레이 방식으로 테스트한다면, 유전질환 환자를 대상으로 핵형분석(karyotyping)하는데 이용할 수 있다.
도 4는 지놈 DNA서열과 인위적 SNP 서열로부터 증폭된 산물을 구별하여 각 산물의 유전자량을 측정하는 방법 중 하나인 단일염기연장(single base extension)방법을 도시한 개략도이다. 이 방법은 Applied Biosystem사에서 공급되는 SNaPshot kit를 사용하여 수행될 수 있다. 연장 프라이머는 상기 인위적 SNP 서열과 상기 검체시료 DNA 서열 모두에 상보결합 하는 프라이머로서, 상기 인위적 SNP 서열의 제조를 위해 야생형 지놈 DNA 서열과 다른 염기가 인위적으로 도입되는 위치의 염기가, 상기 프라이머에 의해 첫 번째 중합될 염기가 되도록, 상기 프라이머의 3'말단이, 프라이머와 상보적으로 결합하는 가닥(strand)상에 존재하는 인위적으로 도입 된 염기의 3'쪽에 존재하는 첫 번째 염기와 상보결합을 하는 연장 프라이머를 사용한다. 상기 연장 프라이머는, 각각 다르게 표지된 네 가지의 다이디옥시 뉴클레오티드(dideoxy nucleotide)와 DNA 중합효소(보통 Taq polymerase)를 이용하여 상기 증폭된 산물과의 하이브리드 형성에 의해 단일염기가 연장된다. 연장된 프라이머는 모세관 전기영동법(capillary electrophoresis)로 전기영동하여, 상기 표지된 신호를 통해 상대적인 양을 측정할 수 있다.
이 반응에서 표지된 네 가지 다이디옥시 뉴클레오티드(dideoxy nucleotide)와 중합효소(polymerase)로 연장 프라이머(extension primer)를 연장시키면 두 가지 산물이 생성되는데, 이들은 각각 지놈 DNA 서열과 인위적 SNP 서열에 의해 생성된다. 두 가지 연장된 산물은 서로 다른 표지 형광물질에 의해 표지된 다이디옥시 뉴클레오티드로 구별되는데, 도 4의 예에서는 G 혹은 T로 연장되었다. 이 두 가지 산물은 모세관 전기영동법(capillary electrophoresis) (ABI 3100)로 전기영동한 후 상대적인 양을 측정할 수 있다.
도 5는 지놈 DNA 서열과 인위적 SNP 서열에서 증폭된 산물을 구별하는 또 다른 방법을 도시한 개략도이다. 이를 위해서는, 상기 도 4에서와 같은 연장 프라이머 (extension primer)를 사용할 수 있다. 도 5의 예에서는, 표지된 다이디옥시(dideoxy) GTP 와 표지되지 않은 나머지 다른 세 가지 디옥시 뉴클레오티드(deoxy nucleotide)를 사용하여 중합효소로 연장 프라이머를 연장시킨다. 이 때, 길이가 서로 다른 두 가지 연장된 연장 프라이머가 만들어 지는데, 각각은 지놈 DNA 서열과 인위적 SNP 서열에서 형성된 것이다. 이 두 가지 산물은 모세관 전기영동법 (ABI 3100)로 전기영동한 후 상대적인 양을 측정할 수 있다. 이 방법에서 네 가지 뉴클레오티드 중 어느 것을 표지된 다이디옥시 뉴클레오티드로 사용할 것인가 하는 선택은, 인위적 SNP 서열과 야생형 서열의 차이가 있는 위치의 염기에 따라 결정된다. 양 서열에 차이가 있는 위치의 각 염기들 중 어느 하나로 결정하면 된다.
본 발명은, 상기와 같이 서열 자체를 증폭하여 증폭된 유전자량을 비교함으로써 염색체 변화를 감지하는 것뿐만 아니라, 서열 자체는 증폭함이 없이 그 서열의 신호만을 증폭함으로써 염색체 변화를 감지하는 것 또한 포함한다. 신호의 증폭은 가지있는 사슬 뉴클레오티드(branched chain nucleotide)를 이용할 수 있다. 상기 신호는 특이 서열과 결합하는 서열을 포함하며 꼬리부분에는 신호가 증폭될 수 있도록 가지가 수백개 달려있는 형태일 수 있다. 특이서열 인지 부위가 표적 DNA(지놈 DNA와 인위적 SNP DNA)에 부착한 후, 이 가지들과 상보적으로 결합하는 표지된 올리고뉴클레오티드(labeled oligonucleotide)를 하이브리드(hybridize)시키면, DNA의 증폭이 없이도, 유전자 카피 수의 상대적인 양을 쉽게 측정할 수 있다. 신호의 증폭 방법은, 종래 알려져 있는 것 중 적합한 것을 사용할 수 있으며, 신호 증폭이 가능한 어떠한 방법이라도 사용될 수 있다.
도 6은 지놈 DNA 서열과 인위적 SNP 서열에서 증폭된 산물을 구별하는 방법으로서 녹는점의 차이를 이용한 방법을 도시한 개략도이다(녹는온도분석법: melting curve analysis). 이는 증폭된 서열들과 프로브간의 녹는점이 인위적으로 도입된 변이에 의해 달라진다는 것을 이용하는 방법이다. 프로브를 지놈 서열에서 증폭된 서열과 완전히 일치하도록 프로브를 제작하고, 프로브는 상보서열에 결합할 경우에 신호가 나오도록 고안한다. 또한 프로브는 인위적 SNP 서열과 상보결합하지만 인위적으로 도입된 변이 부위에서는 상보결합이 깨어져서 녹는 온도가 낮아지도록 고안한다. 프로브가 인위적 SNP 서열로부터 나온 산물과 결합하더라도 측정할 수 있는 신호가 나오도록 한다. 반응물의 온도를 점점 올리거나 내리면서 증폭된 산물과 프로브 사이에 하이브리드가 형성되거나 없어지는 것을 측정하면 두 가지 서로 다른 산물의 상대적인 양을 알 수 있다.
도 6의 예와는 달리, 프로브를 지놈 DNA서열과 완전히 상보결합 하도록 하여 인위적 SNP 서열과의 결합 후 녹는온도가 낮아지도록 고안할 수도 있다. 반응물의 온도를 점점 올리거나 내리면서 증폭된 산물과 프로브 사이에 하이브리드가 형성되거나 없어지는 것을 측정하면 두 가지 서로 다른 산물의 상대적인 양을 알 수 있다. 이러한 녹는온도분석시 동시 증폭된 유전자를 개별적으로 분석할 수도 있고 서로 다른 형광물질(fluorophore)을 사용하여 두 가지 이상의 유전자에 대한 녹는온도분석을 동시에 시행할 수도 있다. 상기 녹는온도분석의 방법에서도 앞의 방법들과 마찬가지로 RR과 nRR값이 염색체 이상의 판단 근거가 된다.
상기 도 4 내지 도 6에서, 표지하는 화합물로는, 어떤 종류의 형광물질(fluorophore)들도 사용가능하며, 그 예로 FAM, ROX, TAMRA, R110, R6G, Joe, HEX, TIETI, Alexa, Cy3 그리고 Cy5등을 들 수 있다.(Gene Link, www.genelink.com; AnaSpec inc, www.anaspec.com; Eurogentec, www.eurogentec.com; Synthegen LLC, www.synthegen.com)
이하, 본 발명은 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하나, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해 결정되는 것이다.
<실시예 1: 염색체, 유전자, 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 키트>
도 7은 본 발명에 의한 염색체, 유전자, 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 키트의 예로서, 특히, 한 개체의 전 염색체의 카피 수를 측정하기 위한 키트의 예이다. 이 예에서는, 플레이트1(plate1)의 웰(well)에는 유전자를 다중증폭할 수 있는 프라이머들과 인위적 SNP서열들이 들어 있는데, 각 웰 들에는 서로 다른 유전자의 조합이 함께 증폭되도록 고안한다. 예컨대, 각 웰 마다 5종의 유전자를 증폭하도록 고안하면 총 480종(5종x96웰)의 유전자를 동시에 분석할 수 있다. 각 웰에 한 사람 혹은 조직에서 얻은 일정양의 시료 DNA를 같은 양씩 분주하여 넣고, 이와 동시에 유전자 증폭을 위한 시약A도 각각의 웰에 분주하여 넣어준다. 유전자를 증폭한 후 전기영동으로 증폭된 산물을 확인하고 증폭에 사용하고 남아있는 프라이머들을 제거한다. 증폭된 산물의 일부를 또다른 플레이트2(plate2)에 넣고 단일염기연장법을 시행한다. 플레이트2(Plate2)의 각 웰(well)에는 증폭된 산물에서 단일염기가 연장될 수 있도록 각각 96조합의 연장 프라이머들이 들어있고, 단일염기연장을 위한 효소와 표지된 ddNTP, 완충액등은 독립된 시약으로 구성할 수 있 다. 단일염기연장반응이 끝나면 연장된 단일염기의 종류와 상대적인 양을 측정하기 위하여 모세관(capillary) 전기영동을 실시한다. 플레이트2(Plate2)의 구성은 단일염기연장법 이외에, 인위적 SNP와 지놈 DNA의 증폭산물의 상대적인 양을 측정할 수 있는 다른 수단들로 이루어질 수 있다. 모세관(Capillary) 전기영동으로 분석한 조 데이터(raw data)로부터 특정 유전자의 증폭이나 결실을 분석하는 것은 자동화된 일련의 소프트웨어로 고안할 수 있으며, 최종적으로 어느 염색체 부위에 증폭 혹은 결실이 있는지 분석할 수 있다. 이 분석과정에서 표준시료들을 미리 분석하여 각 유전자 위치마다 지놈 DNA와 인위적 SNP 서열에서 상대적으로 증폭되는 유전자들의 비율을 결정하고 컷오프(cutoff)값을 미리 결정해 놓은 데이터를 이용하여 특정 유전자의 결실과 증폭을 분석할 수 있다.
<실시예 2: 염색체, 유전자, 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 키트>
도 8은 본 발명에 의한 염색체, 유전자, 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 키트의 일예를 나타낸다. 이 예에서는 인위적 SNP (aSNP)와 지놈 DNA에서 증폭된 유전자 산물을 구별하기 위해 단일염기연장 수단을 예시하였으나, 기타의 수단을 사용할 수 있도록 구성할 수 있다. 시약A에는 인위적 SNP 서열들의 혼합물과 다중증폭을 위한 프라이머의 혼합물이 섞여있다. 시약 B는 유전자를 증폭하는데 사용하는 효소와 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(deoxynucleotide triphosphate) 혼합물과 완충액이 들어 있으며, 시약 B의 각 성분은 독립된 시약으 로 구성할 수도 있다. 시약 A와 B를 일정 양씩 섞고 각 튜브에 분주한다. 이 때, 검체에 대한 실험 이외에 표준시료용 튜브와 염색체 이상시료용 튜브를 준비하여 같이 실험을 시행할 수도 있다. 시약 A와 B가 혼합된 튜브에 염색체 카피 수를 측정하고자 하는 검체 염색체 유래의 분리한 지놈 DNA를 첫 번째와 두 번째 튜브를 제외한 튜브에 넣고, 표준시료 DNA와 염색체이상 DNA를 첫 번째와 두 번째 튜브에 각각 첨가한다. 유전자를 증폭한 후 증폭여부를 전기영동으로 확인하고, 증폭하고 남은 증폭용 프라이머들을 제거한다. 이 과정은 모두 키트 내에서 자동화할 수 있다. 증폭산물 중 일부를 단일염기연장을 위한 프라이머들과 혼합하고 단일염기연장을 실시한다. 이 과정은 인위적 SNP 또는 지놈 DNA에서 증폭된 산물의 상대적인 양을 측정하는 과정으로, 단일염기연장 이외의 다른 수단을 사용할 수 있다. 단일염기연장된 프라이머들을 모세관(capillary) 전기영동을 통해 어떤 염기가 연장되었는지를 확인하고 상대적인 양을 분석한다.
<실시예 3: DSCR1 유전자와 hexokinase 유전자를 이용한 유전자 카피 수의 측정>
DSCR1 유전자는 인간의 21번 염색체에 위치하며 hexokinase 유전자는 인간의 10번 염색체에 위치하는 유전자들이다.
DSCR1 유전자 절편을 다음과 같은 프라이머들을 이용하여 PCR 방법으로 증폭한다: DF (GCC AAA TCC AGA CAA GCA GTT TC) 와 DR (GAT CAG CCG CAG TCT CTC TAA CAC). 증폭과정 중 실수가 생기는 것을 유발하기 위해 다음과 같은 조건으로 40 cycle의 PCR 증폭을 매번 희석하여 3-5회 실시한다: 94℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 30s. 인위적 SNP 서열은 증폭된 PCR 산물의 316번째 염기인 G가 T로 치환되어 있었다.
다음의 두가지 프라이머를 이용하여 hexokinase 유전자를 PCR 방법으로 증폭하였다: HF (TCT GGG CTC TTG TCC AGT ATT GAG T)와 HR (ATT CCA ACC CTC CCT CCT GAG T). 그리고 증폭과정 중 실수가 생기는 것을 유발하기 위해 DSCR1의 증폭과 같은 조건으로 40 cycle의 PCR 증폭을 매번 희석하여 3-5회 실시한다. 인위적 SNP 서열은 증폭된 PCR 산물의 211번째 염기인 G가 T로 치환되어 있었다. 인위적 SNP 서열은 모두 T-vector (pCRII, Invitrogen)에 클론하였다.
야생형과 검체의 혈액에서 각각 지놈 DNA를 분리하고 각각의 정제된 DNA (50 ng)를 300 fg의 인위적 SNP hexonkinase-pCRII와 480 fg의 인위적 SNP DSCR1-pCRII를 혼합한 후 98℃에서 5분 동안 놓아두었다. 시료 DNA와 두 가지 인위적 SNP DNA가 섞여 있는 혼합물에서 DF, DR, HF와 HR등 네가지의 프라이머를 이용하여 다중 PCR을 다음과 같은 조건으로 35 cycle 시행하였다: 95℃ 30s, 59℃ 30s, 72℃ 30s. 증폭된 PCR 산물은 GeneClean kit (Bio101)을 이용하여 정제한 후, SNaPshot kit (Applied Biosystems)를 이용하여 단일염기연장을 시행하였는데, 다음과 같은 연장프라이머를 이용하였다: DE (GCC TCT TGG CAC CAC CT) for DSCR1 과 HE (GTT GTA AGC CCT CAG CAG TT) for hexokinase. 단일염기연장을 위한 조건으로 25회 cycle을 이용하였다: 96℃ 10s, 50℃ 5s, 60℃ 30s. 단일염기가 연장된 산물은 ABI 3100 (Applied Biosystems)에서 분석하였다. 도 9에 도시된 그래프에 나타난 바와 같이, 각각 다른 출처로부터 얻어진 6개의 야생형 시료에서 DSCR1과 hexokinase로부터 나오는 최종 산물의 RR(R1/R2)값의 평균을 구하였다(RRaverage, 즉 R1/R2average). RRaverage는 0.865이고, 표준편차 (SD)는 0.016이었다. 이에 반하여, 검체 지놈 DNA의 RR(R1/R2), 즉 RRpatient은 1.28로, 표준화된 RR값, 즉 nRR 값(normalized RR = RRpatient/RRaverage) 은 약 1.5 (1.28/0.865)이었다. 따라서, 21번 염색체는 1.5배 중복이 일어난 삼염색체성(trisomy)으로 판별되었다.
<실시예 4: DSCR1 유전자, hexokinase 유전자, Rb1 유전자 및 DCC 유전자를 이용한 유전자 카피 수의 측정>
DSCR1 유전자는 21번 염색체에, hexokinase 유전자는 10번 염색체에, Rb1 유전자는 13번 염색체에, DCC 유전자는 18번 염색체에 위치하는 유전자들이다. DSCR1 유전자와 hexonkinase 유전자의 인위적 SNP 서열은 상기 실시예 3에서 사용했던 서열을 그대로 사용하였다. Rb1과 DCC 유전자도 각각 RbF (AGG ACC CTA ACA CAG TAT ATC CCA AGT G), RbR (GAA ATA ATG TGG CTT TGA ACA TGC CAG T), 그리고 DCCF (CCT GGC TGT GGT CTC CTA GGT CAG ACT T)와 DCCR (GAG TCC TTC CAA ACT TGC CAT TTG TTC A)로 증폭한 후 T-vector (pCRII, Invitrogen)에 클론하고, 증폭된 Rb1의 44번째 염기인 C가 A로, 증폭된 DCC의 138번째 염기인 G가 T로 치환되어 있는 클론을 찾고, 각각의 aSNP 서열로 사용하였다.
정상인과 다운 증후군 환자의 혈액에서 지놈 DNA를 분리하고 각각의 정제된 DNA (20 ng)를 각각 300 fg의 hexokinase, DSCR1, Rb1, DCC의 인위적 SNP를 혼합하 고 98℃에서 5분 동안 놓아두었다. 시료 DNA와 두가지 인위적 SNP DNA가 섞여 있는 혼합물에서 네가지 유전자를 증폭하기 위한 DF, DR, HF, HR, Rb1F, Rb1R, DCCF, DCCR 등 8 가지 프라이머를 이용하여 다중 PCR을 다음과 같은 조건으로 32 cycle 시행하였다: 95℃ 30s, 59℃ 30s, 72℃ 30s. 증폭된 PCR 산물은 PCR purification kit (Qiagen)을 이용하여 정제한 후, SNaPshot kit (Applied Biosystems)를 이용하여 단일염기연장을 시행하였는데 다음과 같은 연장프라이머를 이용하였다: DSCR1를 위해 DE (GCC TCT TGG CAC CAC CT), hexokinase를 위해 HE (GTT GTA AGC CCT CAG CAG TT), Rb1를 위해 RbE (TCA TTT GTA TCT TAA TTC TTC AGG ACC C), DCC를 위해 DCCE (CTC TCA TTC TCT TTA TAG GTG TAT GAA CA). 단일염기연장을 위한 조건으로 15회 cycle을 이용하였다: 96℃ 10s, 50℃ 10s, 60℃ 30s. 단일염기가 연장된 산물은 ABI 3100 (Applied Biosystems)에서 분석하였다. 20명의 정상인의 표준시료에서 DSCR1, hexokinase, Rb1, DCC로부터 나오는 최종 산물의 샘플과 aSNP로 부터의 신호에서 나오는 peak ratio들 (도 10의 R1, R2, R3, R4)로부터 각각의 RRpatient (relative ratio)을 구하고(R1/R2, R1/R3, R1/R4, R2/R3, R2/R4, R3/R4), 각각의 표준시료 RR 값들의 평균값인 RRaverage (R1/R2average, R1/R3 average,...)를 구하였다. 이들 RRaverage를 이용하여 각 Down 환자의 nRR (normalized RR = RRpatient/RRaverage)을 구하면 도 12와 같았다. RRaverage의 표준편차 (SD)는 0.029-0.043 이었다. 정상인 20명 모두의 nRR은 0.9-1.1이었으며, 10명 다운 증후군 환자의 nRR은 nR1R2 (=normalized R1/R2), nR1R3 (=normalized R1/R3), nR1R4 (=normalized R1/R4)는 1.4-1.6이었고, 나머지 nRR은 모두 0.9-1.1이었다.
상기 결과로부터, 다운 증후군 환자는 DSCR1 유전자가 있는 21번 염색체에서 1.5배의 염색체 카피수 증가가 일어났음을 확인하였고, 이로써 다운 증후군 환자는 삼염색체성 염색체 이상임을 재확인할 수 있었다.
상기 실시예 4에 나타난 바와 같이. 종래의 MLPA(Multiplex Ligation dependent Probe Amplification) 방법이나 MAPH(Multiplex Amplifiable Probe Hybridisation)에 비해 현저히 높은 정확도를 나타낸다. 도 12의 그래프를 보면, 20명의 정상인 샘플의 모든 nRR 값이 약 0.9 내지 1.1 범위를 벗어나지 않는 것을 알 수 있다. 또한, 다운 증후군 샘플의 nRR값 중 정상 유전자의 nRR값은 0.9 내지 1.1 범위 이내이며(1±0.1 범위), 삼염색체성 유전자의 nRR값은 1명의 환자를 제외하고는 모두 1.4 내지 1.6 범위 이내에 속하였다 (1.5±0.1 범위).
도 13은 정상 샘플들의 양적 MLPA 분석을 나타내는 그래프이다. 박스는 전체 샘플의 50%의 분석값 범위를 나타내며, 직선은 95% 샘플의 분석값 범위를 나타낸다. 상기 그래프는 13번, 18번, 21번 염색체에 특이적인 개인의 프로브들의 분포를 나타낸다(n=474). SD는 프로브에 따라 0.13-0.3이다. 상기한 본 발명의 실시예 4의 결과와 달리, MLPA 방법의 경우 도 13의 그래프에 나타난 바와 같이, MLPA 방법은 정상 샘플의 분석값이 무려 0.5 내지 1.7에 걸쳐 있음을 알 수 있다. 더욱이 박스 부분은 50%의 샘플이 속하는 영역을 나타내는 것인데, 그것조차도 0.78 내지 1.23의 범위에 걸쳐 있다. 본 발명의 정상인의 분석값이 0.9 내지 1.1 범위내인 것과는 현격히 대조된다.
도 14는 12개 DNA 샘플(10 개체), 총 40개 프로브를 MAPH 방법을 이용하여 검사한 두개의 별개 실험으로부터 얻어진 신호 강도를 양적 분석한 것이다. 상염색체 프로브 및 여성의 X-결합 프로브는 1.0을 센터로 하여 분포되어 있고, 남성의 X-결합 프로브는 0.5 주변에 모여 있다. 도 14의 그래프에 나타난 바와 같이, MAPH 방법 역시 정확도가 본 발명에 비해 현저히 떨어지는 것을 볼 수 있다. 정상 샘플의 분석값이 a의 경우 무려 0.65 내지 1.45의 범위에 걸쳐 있고, b의 경우 0.7 내지 1.3의 범위에 걸쳐 있다. 결실된 검체 샘플의 분석값은 b의 경우 0.5가 포함되지도 않는 0.55 내지 0.75의 범위에 걸쳐 있다. 더욱이, 정상 샘플의 분석값이 결실된 검체 샘플의 분석값의 범위 중간(0.65)에 나타나기도 한다. 이는 본 발명에 의한 방법에 비해 현저히 정확도가 떨어지는 것이다.
본 발명에 따른 염색체, 유전자 및 특정 뉴클레오티드 카피 수 분석 키트 및 측정 방법은, 염색체의 변화를 분석함에 있어서, 시간과 필요 노동력을 현저히 절감시킬 수 있을 뿐만 아니라, 특정 유전자의 카피 수를 결정하는 다른 분자적 방법에 비해 정확한 값을 얻을 수 있도록 하는 우수한 효과가 있다.

Claims (32)

  1. 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수를 분석하는 키트로서,
    인위적으로 염기의 변화가 이루어진 인위적인 SNP를 하나 이상 포함하는 서열로서, 프라이머 서열 부분을 포함하여 증폭될 서열이 인위적 SNP를 제외하고는 야생형 지놈 DNA 서열과 동일한 한 종 이상의 인위적 SNP 서열;
    상기 인위적 SNP 서열과, 그에 대응되는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수를 분석할 대상인 검체시료 DNA 서열을 증폭시키되, 서열 자체를 증폭시키거나 상기 서열의 신호를 증폭시키며, 한 종 이상의 상기 검체시료 DNA 서열과 그에 대응되는 한 종 이상의 상기 인위적 SNP 서열을 동시에 증폭하는 증폭 수단;
    상기 검체시료 DNA 서열과 상기 인위적 SNP 서열에 공통적으로 존재하는 서열로 구성된 프라이머;
    증폭된 검체시료 DNA 서열과 증폭된 인위적 SNP 서열을 구별하여 각각의 유전자량을 측정하되, 인위적 SNP 서열을 구성하는 염기 중 인위적으로 도입된 염기를 인지하여, 상기 증폭된 검체시료 DNA 서열과 상기 증폭된 인위적 SNP 서열을 구별하여 검체시료 DNA 서열(A, B, C, D...)과 인위적 SNP 서열(A', B' C' D'...)의 각 유전자량을 측정하는 유전자량 측정수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 분석 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인위적 SNP 서열은, 자연계에서는 보고되지 않았거나 1% 미만으로 나타나는 염기의 변화가 인위적으로 도입된 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 분석 키트.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하며,
    상기 인위적 SNP 서열은 상기 정방향 프라이머와 상기 역방향 프라이머 사이에 상기 야생형 지놈 DNA 서열과 다른 염기가 위치하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 분석 키트.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 측정된 검체시료 DNA 서열의 유전자량을 인위적 SNP 서열을 기준으로 표준화시키기 위하여, 상기 각 증폭된 인위적 SNP 서열의 유전자량(A', B', C', D'...)과 그에 상응하는 상기 각 증폭된 검체시료 DNA의 유전자량(A, B, C, D...)의 상대적인 비(예컨대, A/A', B/B', C/C', D/D'...)를 구하여 얻어진 aSNP 표준화된 검체시료의 유전자량 데이터(A/A', B/B', C/C', D/D'...)를 저장하는 수단을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 염색체,유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 분석 키트.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 데이터 저장 수단은,
    상기 각 유전자 종에 대한 각 aSNP 표준화된 검체시료의 유전자량 데이터를 다른 유전자 종의 데이터와 비교한 데이터[예컨대, RRAB=(A/A')/(B/B'), RRAC=(A/A')/(C/C'), RRAD=(A/A')/(D/D'), RRBC=(B/B')/(C/C')....]를 더 저장하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 분석 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 데이터 저장 수단은, 표준시료 DNA 서열(A*, B*, C*, D*...)과 상기 인위적 SNP 서열(A', B', C', D'...)을 동시 증폭시켜 상기 증폭된 표준시료 DNA 서 열의 유전자량을 aSNP 표준화된 표준시료의 유전자량 데이터(A*/A', B*/B', C*/C', D*/D')로 변환시키고, 다시 이를 다른 유전자 간의 비율인 데이터[RRA*B*=(A*/A')/(B*/B'), RRA*C*=(A*/A')/(C*/C'), RRA*D*=(A*/A')/(D*/D'), RRB*C*=(B*/B')/(C*/C')....]의 형태로 변환하여 더 저장하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 분석 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 데이터 저장 수단은,
    상기 각 유전자 종에 대하여, 상기 aSNP 표준화된 검체시료의 유전자량 데이터와 상기 aSNP 표준화된 표준시료의 유전자량 데이터의 비[예컨대, nRRAB=RRAB/RRA*B*, nRRAC=RRAC/RRA*C*. nRRAD=RRAD/RRA*D*, nRRBC=RRBC/RRB*C*...]를 더 저장하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 분석 키트.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 유전자량 측정수단은,
    상기 인위적 SNP 서열과 상기 야생형 지놈 DNA 서열 모두에 상보결합 하는 프라이머로서, 상기 지놈 DNA 서열과 상기 인위적 SNP 서열 중 서로 다른 염기가 존재하는 위치에서, 상기 프라이머에 의해 첫 번째 중합이 일어나도록, 상기 프라이머의 3'말단이, 프라이머와 상보적으로 결합하는 가닥(strand)상에 존재하는 인위적 SNP 서열에 인위적으로 도입된 염기 위치의 3'쪽에 존재하는 첫 번째 염기와 상보결합을 하는 연장 프라이머;
    서로 다르게 표지된 ddGTP, ddCTP, ddATP 및 ddTTP로 구성된 다이디옥시 뉴클레오티드 혼합물; 및
    DNA 중합효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 분석 키트.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 유전자량 측정수단은,
    상기 인위적 SNP 서열과 상기 야생형 지놈 DNA 서열 모두에 상보결합 하는 프라이머로서, 상기 지놈 DNA 서열과 상기 인위적 SNP 서열 중 서로 다른 염기가 존재하는 위치에서, 상기 프라이머에 의해 첫 번째 중합이 일어나도록, 상기 프라이머의 3' 말단이, 프라이머와 상보적으로 결합하는 가닥(strand)상에 존재하는 인위적 SNP 서열에 인위적으로 도입된 염기 위치의 3'쪽에 존재하는 첫 번째 염기와 상보결합을 하는 연장 프라이머;
    GTP, CTP, ATP, TTP(혹은 UTP)중 야생형 DNA 서열과 인위적 SNP 서열사이에 차이가 있는 염기, 즉 연장 프라이머에 의해 첫 번째 중합이 일어나는 염기 및 그 염기와 상보결합하는 염기 중 어느 하나만을 표지된 다이디옥시 뉴클레오티드 (didexoy nucleotide triphosphate)로 구성하고 나머지 3종의 염기를 디옥시 뉴클레오티드 (deoxy-nucleotide triphosphate)로 구성된 뉴클레오티드 혼합물; 및
    DNA 중합효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 분석 키트.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 각 유전자량을 측정하는 수단은,
    상기 검체시료 DNA 서열의 전체 또는 그 단편과 동일하되, 단편인 경우에는 상기 인위적 SNP 서열과 다른 염기가 존재하는 위치에 해당하는 상기 검체시료 DNA 서열의 염기를 필수적으로 포함하는 서열로 구성되며, 상기 검체시료 DNA 서열과 상기 인위적 SNP 서열 모두에 상보결합하는 프로브;
    상기 프로브가 상기 인위적 SNP 서열 또는 상기 검체시료 DNA 서열에 상보결합하는 경우 신호를 내보내는 신호 수단;
    상기 프로브와 상기 각 서열간의 혼합물의 온도를 변화시키는 가열 및 냉각 수단; 및
    상기 온도의 변화에 따라 상기 지놈 DNA 서열과 상기 인위적 SNP 서열간에 나타나는 프로브 와의 상보결합할 때 녹는점의 차이에 근거하여 양 서열을 구별하고 상대적인 양을 측정하는 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 분석 키트.
  13. 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수를 측정하는 방법으 로서,
    인위적으로 염기의 변화가 이루어진 인위적인 SNP를 하나 이상 포함하는 서열로서, 프라이머 서열 부분을 포함하여 증폭될 서열이 인위적 SNP를 제외하고는 야생형 지놈 DNA 서열과 동일한 한 종 이상의 인위적 SNP 서열과, 그에 대응되는 염색체의 카피 수를 측정하고자 하는 한 종 이상의 검체시료 DNA 서열의 특정 뉴클레오티드 서열들이 경쟁적으로 증폭하는 제1단계;
    상기 증폭된 검체시료 DNA 서열과 상기 증폭된 인위적 SNP 서열을 구별하고 각 증폭량을 측정하는 제2단계; 및
    상기 측정된 증폭량에 기초하여 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수를 결정하는 제3단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 제1단계는, 상기 각 서열 자체를 증폭시키거나, 상기 서열의 신호를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 제1단계는,
    서열 자체를 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭시키며,
    상기 검체시료 DNA 서열과 상기 인위적 SNP 서열에 공통적으로 존재하는 서열로 구성된 프라이머를 이용하여 증폭시키는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 프라이머는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하며,
    상기 인위적 SNP 서열은 상기 정방향 프라이머와 상기 역방향 프라이머 사이에 상기 야생형 지놈 DNA 서열과 다른 염기가 위치하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 제2단계는,
    상기 인위적 SNP 서열에 존재하는 야생형 지놈 DNA 서열과 다른 염기를 인지하여 양 서열을 구별하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 방법.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 제2단계는,
    상기 인위적 SNP 서열과 상기 야생형 지놈 DNA 서열 모두에 상보결합 하는 프라이머로서, 상기 지놈 DNA 서열과 상기 인위적 SNP 서열 중 서로 다른 염기가 존재하는 위치에서, 상기 프라이머에 의해 첫 번째 중합이 일어나도록, 상기 프라이머의 3'말단이, 프라이머와 상보적으로 결합하는 가닥(strand)상에 존재하는 인위적 SNP 서열에 인위적으로 도입된 염기 위치의 3'쪽에 존재하는 첫 번째 염기와 상보결합을 하는 연장 프라이머, 서로 다르게 표지된 ddGTP, ddCTP, ddATP 및 ddTTP로 구성된 다이디옥시 뉴클레오티드 혼합물 및 DNA 중합효소와 반응시키는 단계; 및
    상기 반응을 통해 연장된 단일 염기가 상기 양 서열에서 다른 표지를 나타내는 것을 이용하여, 상기 양 서열을 구별하여 각 유전자량을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 방법 .
  19. 제13항에 있어서,
    상기 제2단계는,
    상기 인위적 SNP 서열과 상기 야생형 지놈 DNA 서열 모두에 상보결합 하는 프라이머로서, 상기 지놈 DNA 서열과 상기 인위적 SNP 서열 중 서로 다른 염기가 존재하는 위치에서, 상기 프라이머에 의해 첫 번째 중합이 일어나도록, 상기 프라이머의 3'말단이, 프라이머와 상보적으로 결합하는 가닥(strand)상에 존재하는 인위적 SNP 서열에 인위적으로 도입된 염기 위치의 3'쪽에 존재하는 첫 번째 염기와 상보결합을 하는 연장 프라이머, GTP, CTP, ATP, TTP(혹은 UTP)중 야생형 DNA 서열과 인위적 SNP 서열사이에 차이가 있는 염기, 즉 연장 프라이머에 의해 첫 번째 중 합이 일어나는 염기 및 그 염기와 상보결합하는 염기 중 어느 하나만을 표지된 다이디옥시 뉴클레오티드 (didexoy nucleotide triphosphate)로 구성하고 나머지 3종의 염기를 디옥시 뉴클레오티드 (deoxy-nucleotide triphosphate)로 구성된 뉴클레오티드 혼합물 및 DNA 중합효소와 반응시켜 프라이머로부터 뉴클레오티드가 중합되어 연장되도록 하는 단계; 및
    상기 연장의 결과로 얻어지는 산물의 길이 차이를 통해 상기 양 서열을 구별하여 각 유전자량을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 방법.
  20. 제13항에 있어서,
    상기 제2단계는,
    상기 검체시료 DNA 서열의 전체 또는 그 단편과 동일하되, 단편인 경우에는 상기 인위적 SNP 서열을 구성하는 염기 중 인위적으로 도입된 염기가 존재하는 위치에 해당하는 상기 검체시료 DNA 서열의 염기를 필수적으로 포함하는 서열로 구성되며, 상기 검체시료 DNA 서열과 상기 인위적 SNP 서열 모두에 상보결합하는 프로브를, 상기 인위적 SNP 서열 및 상기 검체시료 DNA 서열의 증폭된 산물과 혼합시켜 하이브리드를 형성시키는 단계; 및
    상기 혼합된 혼합물의 온도를 점진적으로 증가시키거나 감소시킴에 따라 상기 양 서열 간에 나타나는 프로브와의 상보결합할 때 녹는점의 차이를 통해 상기 양 서열을 구별하고 상대적인 양을 측정하는 단계를 포함하며,
    상기 프로브가 인위적 SNP 서열 또는 상기 검체시료 DNA 서열에 상보결합하는 경우 신호를 내보내도록 조작된 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 방법.
  21. 제13항에 있어서,
    상기 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 방법은,
    두 종 이상의 유전자(A, B, C, D...)를 동시에 증폭하고, 각 유전자 별로 각 유전자 종에 대한 각 증폭량을 측정하는 것을 특징으로 하며,
    상기 두 종 이상의 유전자들은, 서로 동일 염색체 내에 존재하거나, 서로 다른 염색체 내에 존재하는 것임을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 방법.
  22. 제13항에 있어서,
    상기 제3단계는,
    상기 각 증폭된 인위적 SNP 서열의 유전자량과 그에 상응하는 상기 각 증폭된 검체시료 DNA의 유전자량의 상대적인 비(예컨대, A/A', B/B', C/C', D/D'...)를 통해, 상기 측정된 검체시료 DNA 서열의 유전자량을 인위적 SNP 서열을 기준으로 표준화시키는 단계(S1)를 포함하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 제3단계는,
    상기 단계(S1) 이후에,
    상기 각 유전자 종에 대한 각 aSNP 표준화된 검체시료의 유전자량 데이터를 다른 유전자 종의 데이터와 비교한 데이터[예컨대, RRAB=(A/A')/(B/B'), RRAC=(A/A')/(C/C'), RRAD=(A/A')/(D/D'), RRBC=(B/B')/(C/C')....]를 계산하는 단계(S2)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 제1단계 전 또는 제1단계 내지 제3단계와 동시에,
    인위적으로 염기의 변화가 이루어진 인위적인 SNP를 하나 이상 포함하는 서열로서, 프라이머 서열 부분을 포함하여 증폭될 서열이 인위적 SNP를 제외하고는 야생형 지놈 DNA 서열과 동일한 한 종 이상의 인위적 SNP 서열과, 그에 대응되는 표준시료 DNA 서열의 특정 뉴클레오티드 서열들을 경쟁적으로 증폭하고, 상기 증폭된 표준시료의 지놈 DNA 서열과 상기 증폭된 인위적 SNP 서열을 구별하여 상기 양 서열의 각 증폭량을 측정하여, 인위적 SNP 서열의 증폭량에 대한 표준시료 지놈 DNA 서열의 증폭량의 상대적인 비율을 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 인위적 SNP 서열의 증폭량에 대한 표준시료 DNA 서열의 증폭량의 상대적인 비를 결정하는 단계는,
    상기 표준시료 DNA 서열(A*, B*, C*, D*...)과 상기 인위적 SNP 서열(A', B', C', D'...)을 동시 증폭시켜 상기 증폭된 표준시료 DNA 서열의 유전자량을 aSNP 표준화된 표준시료의 유전자량 데이터(A*/A', B*/B', C*/C', D*/D')로 표준화시키고, 다시 이를 다른 유전자 간의 비율인 데이터[예컨대, RRA*B*=(A*/A')/(B*/B'), RRA*C*=(A*/A')/(C*/C'), RRA*D*=(A*/A')/(D*/D'), RRB*C*=(B*/B')/(C*/C')....]의 형태로 변환하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 제3단계는,
    상기 단계(S2) 이후에,
    상기 각 유전자 종에 대하여, 상기 aSNP 표준화된 검체시료의 유전자량 데이터와 상기 aSNP 표준화된 표준시료의 유전자량 데이터의 비[예컨대, nRRAB=RRAB/RRA*B*, nRRAC=RRAC/RRA*C*. nRRAD=RRAD/RRA*D*, nRRBC=RRBC/RRB*C*...]를 계산하는 단계(S3)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티 드 서열의 카피 수 측정 방법.
  27. 제23항 또는 제26항에 있어서,
    상기 제3단계는,
    상기 단계(S2 또는 S3) 이후에,
    상기 검체시료 DNA 서열의 각 유전자 종 간의 RR값 또는 nRR값을 서로 비교하여, 각 유전자가 위치한 염색체의 중복 또는 결실 여부를 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 방법.
  28. 제13항에 있어서,
    상기 제1단계에서, 상기 인위적 SNP 서열은 중합효소 연쇄반응을 통한 증폭 동안 발생되는 실수를 이용하여 인위적으로 염기 변화를 도입하거나, 올리고뉴클레오티드 합성하는 도중 인위적으로 염기를 변화시킨 후 유전자를 클로닝함으로써 인위적인 염기변화를 도입하여 제조된 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 방법.
  29. 제13항에 있어서,
    상기 방법은, 2종 이상의 유전자 종을 동시에 증폭하여 염색체의 카피 수를 측정하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 2종 이상의 유전자 종으로 구성된 유니트를 두 종 이상 포함하여, 동시에 대량의 염색체 부위를 동시에 테스트하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    한 개체의 모든 염색체를 동시에 테스트하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 방법.
  32. 제13항에 있어서,
    상기 제1단계 이전에,
    두 종 이상의 유전자에 해당하는 두 종 이상의 인위적 SNP 서열들 간의 상대적인 유전자량 비율 및 인위적 SNP 서열과 지놈 DNA 서열 간의 상대적인 유전자량 비율을 미리 결정하여, 유전자 종과 서열의 종류(인위적 SNP 및 지놈 DNA)에 상관없이, 중복 및 결실이 없는 표준 상태의 신호를 유사한 정도로 사전에 조정하는 신호 조정 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 염색체, 유전자 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정 방법.
KR20050066736A 2004-07-26 2005-07-22 인위적 에스엔피 서열의 동시증폭을 이용한 염색체,유전자, 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정방법 KR100808312B1 (ko)

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