CN114686573B

CN114686573B - 一种检测靶核酸拷贝数重复的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN114686573B
Application number: CN202011563857.6A
Authority: CN
Inventors: 李庆阁; 黄秋英; 刘颖
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2024-04-12
Anticipated expiration: 2040-12-25
Also published as: CN114686573A

Abstract

本申请涉及分子诊断领域。具体而言，本申请涉及一种检测待测样本的基因组中靶核酸拷贝数重复的方法以及试剂盒。本发明的方法简单、高效且低成本。

Description

一种检测靶核酸拷贝数重复的方法和试剂盒

技术领域

本申请涉及分子诊断领域。具体而言，本申请涉及一种检测待测样本的基因组中靶核酸拷贝数重复的方法以及试剂盒。

背景技术

基因组拷贝数变异(Copy number variation,CNV)，通常是指基因组DNA插入、缺失或者重复一段大于50bp的片段。CNV在人类基因组上广泛分布，不仅可以作为一种多态性遗传标记参与人类的进化进程，还与多种疾病密切相关，比如染色体非整倍体异常、染色体整倍体异常、亚端粒重复、常见微缺失/微重复等多种遗传病。目前CNV的检测方法主要有荧光原位杂交(FISH)、定量PCR(qPCR)技术、多重连接探针扩增(MLPA)技术、微阵列比较基因组杂交技术(aCGH)和高通量测序技术(NGS)。

荧光原位杂交通过特异性寡核苷酸荧光探针检测分裂中期染色体，可明确染色体来源和染色体结构异常部分。该技术对染色体缺失、重复或易位等检测特异性高，检测周期仅1-2天。但该技术检测通量受镜检技术工作量大、实验操作过程较繁琐并且耗时长的影响而无法大量筛查。

qPCR技术利用标准曲线计算未知模板的含量，无需开盖处理，操作简便，但是一管反应体系中最多只能检测4个不同位点，检测通量较低，同时参照和靶位点采用不同的引物对和探针，结果的准确性受到标本浓度、纯度等影响较大。

MLPA技术是目前应用较广泛的染色体拷贝数变异的检测方法，该方法包括DNA变性、杂交、连接、PCR扩增以及毛细管电泳分析等步骤，可单管同时检测多个靶基因和参照基因，检测通量高，成本相对低，但连接反应耗时长，PCR反应需多次开盖易污染以及毛细管电泳检测成本高，限制了这种方法在临床上的广泛应用。

微阵列比较基因组杂交技术和SNP芯片通过荧光信号强度的差异来确定基因拷贝数比例，从而得出染色体数目。此方法能够检出全基因组水平5kb-3Mb的拷贝数变异，检测微缺失、微重复等精细的拷贝数变异的能力极佳，且检出率高、分辨率高、灵敏度高，但这种方法使用的检测仪器以及耗材的价格都比较昂贵，对模板的质量要求也比较高，阻碍了其大规模应用，也给用户造成了较大的经济负担。

高通量测序技术可以对整个人类基因组的CNV进行扫描，当末端区域出现DNA片段缺失或者重复时，测序的覆盖深度就会显示出差异。但是这种方法的成本高，检测周期长，并且需要专业人员进行生物信息学分析。

为了解决上述方法具有的操作繁琐、价格昂贵、对模板要求高、需要专业人员等不一而足的缺点，本发明提供一种简便易行、准确快速、经济高效、稳定可靠、灵敏特异的靶核酸拷贝数重复检测技术。

发明内容

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“拷贝数”是指某一种基因或某一段特定的DNA序列在某一生物的基因组中出现的数目。在人体中，体细胞染色体数目为23对，其中22对为男女所共有，称为常染色体(autosome)；另外一对为决定性别的染色体，男女不同，称为性染色体(sex chromosome)。某些基因在性染色体的Y染色体上，这些基因在正常情况下只有一个拷贝，其拷贝数为1；而常染色体是成对出现的，因此，在常染色体上的基因在正常情况下拷贝数为2。

如本文中所使用的，术语“归一化峰高比值(Normalized Height Ratio,NHR)”是指待测样本基因组的靶核酸在某一二态性SNP位点上第一等位基因和第二等位基因的峰高比值相对于正常样本基因组的靶核酸在该SNP位点上第一等位基因和第二等位基因的峰高比值平均值的倍数，其典型地等于1。具体来说，某一种二等位基因或某一段特定的DNA序列在正常情况下在二倍体基因组(例如，人基因组)中的归一化峰高比值为1。当出现某一等位基因重复时，该基因的归一化峰高比值可能小于1或者大于1。例如，在人体中，某一基因在正常样本的21号染色体上为双拷贝，且该正常样本的归一化峰高比值为1；而某一基因在21三体患者的21号染色体上为三拷贝，且该21三体患者的归一化峰高比值接近0.5或2。在本文中，NHR带有的下标表示NHR这个数据的来源。

如本文中所使用的，术语“熔解峰峰高(Rm)”是指将熔解曲线的熔解峰的左侧最低点和右侧最低点连接成线，以熔解峰最高点向水平方向做垂线，两条线的交点与熔解峰的最高点的距离即为熔解峰峰高(Rm)。

如本文中所使用的，“峰高比值(Height Ratio，HR)”是指二态性SNP位点上不同等位基因对应的熔解峰峰高(Rm)的比值。例如，某一二态性SNP位点的等位基因为C/T，待测样品在该SNP位点上的基因型别为CT，则HR为C所对应的熔解峰峰高与T所对应的熔解峰峰高的比值。在本文中，HR带有的下标表示HR这个数据的来源。

如本文中所使用的，术语“单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)”是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的核酸序列多态性。术语“SNP位点”为基因组中具有单核苷酸多态性的位点。在本文中，SNP位点包括，具有单核苷酸多态性的单个位点以及具有1个或多个(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，或更多个)核苷酸的插入的位点。在本文中，SNP位点通过其参考号(例如rs ID)命名。可以利用rs ID在公共数据库中查询SNP位点及其型别，例如，通过NCBI的dbSNP数据库，ChinaMAP数据库，JSNP数据库等。

如本文中所使用的，当提及SNP位点的“基因型别”时，其是指某一生物个体所有同源染色体(通常是两条同源染色体)中该SNP位点上的基因组合的总称。在本文中，SNP位点的“基因型别”指来自胎儿或母亲的一对同源染色体中该SNP位点上的基因组合。例如，某个体rs5858210位点的基因型别为“A/G”表示，该个体的一对同源染色体在rs5858210位点上分别具有核苷酸序列“A”和“G”。“某个体rs5858210位点的基因型别为A/A”表示，该个体的一对同源染色体在rs5858210位点上均具有核苷酸序列“A”。相应地，单条染色体上含有该SNP位点的一段基因(即，核苷酸区段)即被称为含有该SNP位点的“等位基因”。如本文中所使用的，对于某个SNP位点而言，除了该SNP位点上的核苷酸差异之外，不同的等位基因通常具有完全相同的核苷酸序列。当某个体的一对同源染色体在某SNP位点上具有相同的核苷酸序列(即，具有相同的等位基因)时，该个体在该SNP位点上的基因型别是纯合的。当某个体的一对同源染色体在某SNP位点上具有不同的核苷酸序列(即，具有不同的等位基因)时，该个体在该SNP位点上的基因型别是杂合的。

如本文中所使用的，术语“二态性SNP位点”为具有两个等位基因的SNP位点。例如，rs979393位点具有等位基因T和G，该位点为二态性SNP位点。

如本文中所使用的，术语“互补”意指，两条核酸序列能够根据碱基配对原则(Waston-Crick原则)在彼此之间形成氢键，并由此形成双链体。在本申请中，术语“互补”包括“实质上互补”和“完全互补”。如本文中所使用的，术语“完全互补”意指，一条核酸序列中的每一个碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，而不存在错配或缺口。如本文中所使用的，术语“实质上互补”意指，一条核酸序列中的大部分碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，其允许存在错配或缺口(例如，一个或数个核苷酸的错配或缺口)。通常，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，“互补”(例如实质上互补或完全互补)的两条核酸序列将选择性地/特异性地发生杂交或退火，并形成双链体。相应地，术语“不互补”意指，两条核酸序列在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下不能发生杂交或退火，无法形成双链体。如本文中所使用的，术语“不能完全互补”意指，一条核酸序列中的碱基不能够与另一条核酸链中的碱基完全配对，至少存在一个错配或缺口。

如本文中所使用的，术语“杂交”和“退火”意指，互补的单链核酸分子形成双链核酸的过程。在本申请中，“杂交”和“退火”具有相同的含义，并且可互换使用。通常，完全互补或实质上互补的两条核酸序列可发生杂交或退火。两条核酸序列发生杂交或退火所需要的互补性取决于所使用的杂交条件，特别是温度。

如本文中所使用的，术语“PCR反应”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指使用核酸聚合酶和引物来扩增靶核酸的反应(聚合酶链式反应)。如本文中所使用的，术语“多重扩增”是指，在同一个反应体系中对多个靶核酸进行扩增。如本文中所使用的，术语“不对称扩增”是指，对靶核酸进行扩增所获得的扩增产物中，两条互补的核酸链的量不相同，一条核酸链的量大于另一条核酸链。

如本文中所使用的，并且如本领域技术人员通常理解的，术语“正向”和“反向”仅仅是为了便于描述和区分一个引物对中的两条引物；它们是相对而言的，并不具有特别的含义。

如本文中所使用的，术语“熔解曲线分析”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，通过测定双链核酸分子的熔解曲线来分析双链核酸分子存在或其身份(identity)的方法，其通常用于评估双链核酸分子在加热过程中的解离特征。用于进行熔解曲线分析的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如The Journal of MolecularDiagnostics2009,11(2):93-101)。在本申请中，术语“熔解曲线分析”和“熔解分析”具有相同的含义，并且可互换使用。

在本申请的某些优选实施方案中，可通过使用标记有报告基团和淬灭基团的检测探针来进行熔解曲线分析。简言之，在环境温度下，检测探针能够通过碱基配对作用与其互补序列形成双链体。在此情况下，检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团彼此分离，淬灭基团无法吸收报告基团发出的信号(例如荧光信号)，此时，能够检测到最强的信号(例如荧光信号)。随着温度的升高，双链体的两条链开始解离(即，检测探针逐渐从其互补序列上解离)，并且解离下的检测探针呈单链自由卷曲状态。在此情况下，解离下的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团互相靠近，由此报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)被淬灭基团所吸收。因此，随着温度的升高，所检测到信号(例如荧光信号)逐渐变弱。当双链体的两条链完全解离时，所有的检测探针均呈单链自由卷曲状态。在此情况下，所有的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)都被淬灭基团所吸收。因此，基本上无法检测到报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)。因此，对包含检测探针的双链体在升温或降温过程中发出的信号(例如荧光信号)进行检测，就能观察到检测探针与其互补序列的杂交和解离过程，形成信号强度随着温度变化而变化的曲线。进一步，对所获得的曲线进行求导分析，可获得以信号强度变化速率为纵坐标，温度为横坐标的曲线(即，该双链体的熔解曲线)。该熔解曲线中的峰即为熔解峰，其所对应的温度即为所述双链体的熔点(T_m)。通常而言，检测探针与互补序列的匹配程度越高(例如，错配的碱基越少，配对的碱基越多)，那么双链体的T_m就越高。因此，通过检测双链体的T_m，可确定双链体中与检测探针互补的序列的存在和身份。在本文中，术语“熔解峰”、“熔点”和“T_m”具有相同的含义，并且可互换使用。

本申请的发明人通过深入的研究，利用多重不对称扩增和多色探针熔解曲线分析，建立了一种检测靶核酸拷贝数重复的方法，以及用于实施所述方法的试剂盒。

因此，在一个方面，本申请提供了一种检测待测样本的基因组中靶核酸拷贝数重复的方法，其包括以下步骤:

(a)提供含有来源于所述待测人样本的靶核酸的样品，所述靶核酸包含一种或多种候选SNP位点，并且，

提供通用引物，并且，针对每一种候选SNP位点，提供至少一个靶特异性引物对；其中，

所述通用引物包含第一通用序列；

所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述候选SNP位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；所述反向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；并且，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第一通用序列能够与所述第二通用序列的互补序列杂交或退火，且所述第二通用序列与所述第一通用序列存在差异，所述差异包括位于第一通用序列3'端的一个或多个核苷酸各自独立地被缺失或置换；并且，所述第一通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；和

(b)在允许核酸扩增的条件下，使用所述通用引物以及所述靶特异性引物对，通过扩增样品中的靶核酸，从而获得扩增产物；

(c)对步骤(b)获得的扩增产物进行熔解曲线分析，并获得各SNP位点的基因型别，即判断样本的各SNP位点是杂合基因型还是纯合基因型(例如，样本的扩增产物中SNP位点的各等位基因对应的熔解峰都出现，则SNP位点杂合型；SNP位点的各等位基因对应的熔解峰只出现一个，则SNP位点纯合型)；

(d)根据步骤(c)的熔解曲线分析结果，挑选至少一个(例如，1个，2个，3个，4个，5个，10个，15个，20个，或更多个)杂合的SNP位点作为目标SNP位点，在所述目标SNP位点上具有第一等位基因和第二等位基因；

(e)计算所述目标SNP位点的第一等位基因和第二等位基因对应的熔解峰峰高Rm的比值HR_待测，并计算所述HR_待测与参考值的比值NHR_待测；将所述比值NHR_待测与参考范围进行比较，从而判断待测样本的靶核酸拷贝数是否重复；其中，所述参考值为正常人在所述目标SNP位点的第一等位基因和第二等位基因对应的Rm的比值HR_对照的平均值，且所述参考范围为正常人基因组中所述目标SNP位点的归一化峰高比值NHR_对照的波动范围。

在某些实施方案中，所述靶核酸为染色体(例如，常染色体)。

在本发明的方法中，所挑选的目标SNP位点均具有第一等位基因和第二等位基因。因此，进行熔解曲线分析后，在每个目标SNP位点均能够得到第一等位基因和第二等位基因对应的熔解峰，同时能够获得第一等位基因和第二等位基因对应的Rm。在某些实施方案中，Rm可由实时荧光定量PCR仪的配套软件(例如SLAN全自动医用PCR分析系统8.2.2)自动输出。在此类实施方案中，Rm可通过对熔解曲线的熔解峰的左侧最低点和右侧最低点连接成线，以熔解峰最高点向水平方向做垂线，计算两条线的交点与熔解峰的最高点的距离得出。

在本发明的方法中，正向引物和反向引物分别包含特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列和反向核苷酸序列，由此，在PCR反应过程中，靶特异性引物对(正向引物和反向引物)将退火至靶核酸，并启动PCR扩增，产生初始扩增产物，其包含分别与正向引物和反向引物互补的两条核酸链(核酸链A和核酸链B)。

进一步，由于反向引物和通用引物均包含第一通用序列，因此，与反向引物互补的核酸链B也能够与通用引物互补。由此，在PCR反应过程中，通用引物能够退火至核酸链B，并正常启动PCR扩增(即，正常合成核酸链B的互补链)。与此同时，由于第一通用序列能够在允许核酸杂交或退火的条件下与第二通用序列的互补序列杂交或退火，因此，在PCR反应过程中，通用引物(其包含第一通用序列)也能够退火至与正向引物(其包含第二通用序列)互补的核酸链A。然而，由于第二通用序列与第一通用序列存在差异(其中，位于第一通用序列3'端的一个或多个核苷酸各自独立地被缺失或置换)，因此，通用引物(尤其是其3'端)并不能够与核酸链A完全互补，这导致通用引物对核酸链A的PCR扩增受到了抑制(即，核酸链A的互补链的合成受到抑制)。

因此，随着PCR反应的进行，通用引物将分别退火至初始扩增产物的核酸链A和核酸链B，并进一步启动PCR扩增，其中，核酸链B的互补链的合成将正常进行，而核酸链A的互补链的合成将受到抑制。因此，随着PCR扩增的进行，核酸链A的互补链(核酸链B)的合成效率将显著低于核酸链B的互补链(核酸链A)，导致核酸链B的互补链(核酸链A)被大量合成和扩增，而核酸链A的互补链(核酸链B)的合成和扩增受到抑制，从而产生大量单链产物(核酸链A，其含有与正向引物/第二通用序列互补的序列以及反向引物/通用引物的序列)，实现了对靶核酸的不对称扩增。

另外，由于反向引物中的第一通用序列能够在允许核酸杂交或退火的条件下与正向引物中的第二通用序列的互补序列杂交或退火，因此，在PCR反应过程中，因正向引物和反向引物的非特异性扩增而形成的引物二聚体在变性后将产生其5'端和3'端包含能够彼此互补退火的单链核酸，该单链核酸在退火阶段容易自身退火，形成稳定的锅柄结构，阻止通用引物对该单链核酸的退火和延伸，从而抑制引物二聚体的进一步扩增。因此，在本发明的方法中，引物二聚体的非特异性扩增能够被有效抑制。由此，本发明的方法特别适合用于进行含有一种或多种SNP位点的靶核酸的多重扩增。例如，在本发明的方法中，可以将通用引物与多个靶特异性引物对组合使用，实现对一个或多个含有一种或多种SNP位点的靶核酸的多重扩增。

在某些实施方案中，其中，所述参考值和所述参考范围通过如下方法获得:

(I)提供含有来源于多个健康人样本(例如，至少3个，至少4个，至少5个，至少10个，或更多个)的靶核酸的多个样品(例如，至少3个，至少4个，至少5个，至少10个，或更多个)，每一种靶核酸均包含一种或多种候选SNP位点，并且，

所述通用引物包含第一通用序列；

(II)在允许核酸扩增的条件下，使用所述通用引物以及所述靶特异性引物对，扩增所述靶核酸，从而获得扩增产物；

(III)对步骤(II)获得的与各样本对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析，并获得各SNP位点的基因型别，即判断样本的各SNP位点是杂合基因型还是纯合基因型(例如，样本的扩增产物中SNP位点的各等位基因对应的熔解峰都出现，则SNP位点为杂合型；SNP位点的各等位基因对应的熔解峰只出现一个，则SNP位点为纯合型)；

(IV)根据步骤(III)的熔解曲线分析结果，挑选至少一个(例如，1个，2个，3个，4个，5个，10个，15个，20个，或更多个)杂合的SNP位点作为目标SNP位点，在所述目标SNP位点上具有第一等位基因和第二等位基因；

(V)计算各样本中所述目标SNP位点上第一等位基因和第二等位基因对应的熔解峰峰高Rm的比值HR_对照，计算HR_对照的平均值即获得所述参考值；并且，计算各样本中所述目标SNP位点上HR_对照与所述参考值的比值NHR_对照，并获得NHR_对照的平均值和标准差(SD)，各样本中所述目标SNP位点上NHR_对照的平均值±3SD的范围即为所述参考范围。

在某些实施方案中，其中，在步骤(e)中，通过如下方法判断待测样本的靶核酸拷贝数是否重复：当所述NHR_待测处于所述参考范围内，所述靶核酸的核苷酸序列正常；当所述NHR_待测处于所述参考范围外(例如，大于或小于)，所述靶核酸的核苷酸序列发生重复。

在某些优选的实施方案中，在步骤(IV)中，根据步骤(III)的熔解曲线分析结果，在各个样本中挑选至少一个(例如，1个，2个，3个，4个，5个，10个，15个，20个，或更多个)杂合的SNP位点作为目标SNP位点，在所述目标SNP位点上具有第一等位基因和第二等位基因。

在某些实施方案中，同一目标SNP位点各熔解峰的Rm值来自多个样本。并且，由于批间差、批内差等原因，目标SNP位点各熔解峰的Rm值可能存在细微差异。因此，每一个目标SNP位点的上第一等位基因和第二等位基因对应的Rm的比值HR可能存在多个数值，因此需计算每一个目标SNP位点上该比值的平均值。同理，每一个目标SNP位点的NHR也存在多个数值，因此需计算每一个目标SNP位点上NHR的平均值，并通过该平均值计算标准差(SD)，各样本中所述目标SNP位点上NHR的平均值±3SD的范围即为所述参考范围。

在某些实施方案中，所述方法可以用于诊断目的(例如，所述样品是来自患者的样品)，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品，或者，所述样品中的靶核酸选自染色体的非编码区)。

在某些优选的实施方案中，本发明的方法能够同时扩增1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个靶核酸，例如至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少8个，至少10个，至少12个，至少15个，至少18个，至少20个，至少25个，至少30个，至少40个，至少50个，或更多个靶核酸。在某些优选的实施方案中，本发明的方法能够同时并且不对称扩增1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个靶核酸。在此类实施方案中，相应地，在步骤(a)中针对每一种靶核酸，提供靶特异性引物对。因此，在此类实施方案中，在步骤(1)中提供1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个靶特异性引物对，例如，至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少8个，至少10个，至少12个，至少15个，至少18个，至少20个，至少25个，至少30个，至少40个，至少50个，或更多个靶特异性引物对。

为了便于进行多重不对称扩增且有效抑制引物二聚体的非特异性扩增，在某些优选的实施方案中，所述通用引物的工作浓度高于所述正向引物和反向引物的工作浓度。在某些优选的实施方案中，所述通用引物的工作浓度比所述正向引物和反向引物的工作浓度高至少1倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少8倍，至少10倍，至少12倍，至少15倍，至少18倍，至少20倍，至少25倍，至少30倍，至少40倍，至少50倍或更多倍。在某些优选的实施方案中，所述通用引物的工作浓度比所述正向引物和反向引物的工作浓度高1-5倍，5-10倍，10-15倍，15-20倍，20-50倍或更多倍。

在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，所述正向引物和反向引物的工作浓度是相同的或者不同的。在某些优选的实施方案中，所述正向引物和反向引物的工作浓度是相同的。在某些优选的实施方案中，所述正向引物和反向引物的工作浓度是不同的。

在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，使用核酸聚合酶(特别是模板依赖性核酸聚合酶)来进行PCR反应。在某些实施方案中，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶，例如热稳定的DNA聚合酶。在某些实施方案中，所述热稳定的DNA聚合酶获自，Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermuschliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermusoshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcusgorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictiumoccultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus。在某些实施方案中，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶。

在某些实施方案中，所述靶核酸的序列长度至少为5bp(例如，至少为10bp，至少为20bp，至少为30bp，至少为40bp，至少为50bp，至少为60bp，至少为70bp，至少为80bp，至少为90bp，至少为100bp，至少为500bp，至少为1000bp)。

在某些实施方案中，所述候选SNP位点具有选自以下的1个或多个特征：

(i)所述候选SNP位点之间的距离大于1kb；

(ii)所述候选SNP位点为二态性SNP位点；

(iii)所述候选SNP位点的等位基因频率在0.2至0.8之间(例如，0.3至0.7之间，0.4至0.6之间)。

(i)所述候选SNP位点之间的距离大于1kb；

(ii)所述候选SNP位点为二态性SNP位点；

(iii)所述候选SNP位点的等位基因频率在0.4至0.6之间。

在某些实施方案中，在步骤(a)中，针对每一种SNP位点，还提供一个检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述SNP位点的区域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；

并且，在步骤(c)中，使用所述检测探针对步骤(b)获得的扩增产物分别进行熔解曲线分析。

在某些实施方案中，在步骤(b)中，将所述样品与所述通用引物、所述靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，将检测探针加入到步骤(b)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(b)中，将所述样品与所述通用引物、所述靶特异性引物对和所述检测探针，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，进行熔解曲线分析。

在某些实施方案中，所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，检测探针包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，检测探针包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，检测探针包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在某些实施方案中，所述检测探针的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt。

在某些实施方案中，所述检测探针具有3'-OH末端；或者，所述检测探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端。

在某些实施方案中，所述检测探针各自独立地为自淬灭探针；在此类实施方案中，当检测探针未与其他序列杂交时，淬灭基团位于能够吸收或淬灭报告基团的信号的位置(例如，淬灭基团位于报告基团的邻近)，从而吸收或淬灭报告基团发出的信号。在这种情况下，所述检测探针不发出信号。进一步，当所述检测探针与其互补序列杂交时，淬灭基团位于不能吸收或淬灭报告基团的信号的位置(例如，淬灭基团位于远离报告基团的位置)，从而无法吸收或淬灭报告基团发出的信号。在这种情况下，所述检测探针发出信号。

此类自淬灭检测探针的设计在本领域技术人员的能力范围之内。例如，可在所述检测探针的5'末端标记报告基团而在3'末端标记淬灭基团，或可在所述检测探针的3'末端标记报告基团而在5'末端标记淬灭基团。由此，当所述检测探针单独存在时，所述报告基团与所述淬灭基团彼此接近并相互作用，使得所述报告基团发出的信号被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针不发出信号；而当所述检测探针与其互补序列杂交时，所述报告基团与所述淬灭基团相互分离，使得所述报告基团发出的信号不能被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针发出信号。

然而，应当理解的是，报告基团和淬灭基团并非必须标记在检测探针的末端。报告基团和/或淬灭基团也可以标记在检测探针的内部，只要所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。例如，可将报告基团标记在检测探针的上游(或下游)，而将淬灭基团标记在检测探针的下游(或上游)，并且二者相距足够的距离(例如相距10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，或更长的距离)。由此，当所述检测探针单独存在时，由于探针分子的自由卷曲或者探针的二级结构(例如发夹结构)的形成，所述报告基团与所述淬灭基团彼此接近并相互作用，使得所述报告基团发出的信号被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针不发出信号；并且，当所述检测探针与其互补序列杂交时，所述报告基团与所述淬灭基团相互分离足够的距离，使得所述报告基团发出的信号不能被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针发出信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离，例如10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距不超过80nt，不超过70nt，不超过60nt，不超过50nt，不超过40nt，不超过30nt，或不超过20nt。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距至少5nt，至少10nt，至少15nt，或至少20nt。

因此，可在检测探针的任何合适的位置标记报告基团和淬灭基团，只要所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号即可。然而，在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的至少一种位于检测探针的末端(例如5'或3'末端)。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的5'末端或者距离5'末端1-10nt的位置，并且报告基团和淬灭基团相距合适的距离，使得在检测探针与其互补序列杂交之前，淬灭基团能够吸收或淬灭报告基团的信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的3'末端或者距离3'末端1-10nt的位置，并且报告基团和淬灭基团相距合适的距离，使得在检测探针与其互补序列杂交之前，淬灭基团能够吸收或淬灭报告基团的信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团可相距如上文所定义的距离(例如10-80nt或更长的距离)。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的5'末端，并且另一种位于3'末端。

在某些实施方案中，所述检测探针中的报告基团为荧光基团(例如，ALEX-350,FAM,VIC,TET,CALGold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL FluorRed 590,ROX,CAL Fluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)。

在某些实施方案中，所述检测探针无抵抗核酸酶活性，或者具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性，例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性；例如，所述检测探针的主链包含抵抗核酸酶活性的修饰，例如硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'-O-氨基丙基修饰，2'-O-烷基修饰，2'-O-烯丙基修饰，2'-O-丁基修饰，和1-(4'-硫代-PD-呋喃核糖基)修饰。

在某些实施方案中，所述检测探针是线性的，或者具有发夹结构。

在某些实施方案中，所述检测探针各自独立地具有相同或不同的报告基团。在某些实施方案中，所述检测探针具有相同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；或，所述检测探针具有不同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据报告基团的信号种类及熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在。

在某些实施方案中，在步骤(c)中，对步骤(b)的产物进行逐渐的升温或降温并实时监测每一种检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得每一种报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线；然后，对所述曲线进行求导，从而获得步骤(b)的产物的熔解曲线。

在某些实施方案中，所述通用引物由第一通用序列组成，在某些优选的实施方案中，所述通用引物还包含额外的序列，其位于第一通用序列的5'端。在某些优选的实施方案中，所述额外的序列包含一个或多个核苷酸，例如1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在本申请中，所述通用引物用于进行PCR扩增，因此在某些实施方案中，第一通用序列位于或构成所述通用引物的3'部分。

在本申请的实施方案中，所述通用引物可以是任意的长度，只要其能够进行PCR反应即可。例如，所述通用引物长度可以为5-50nt，例如5-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。

在本申请的某些实施方案中，所述通用引物(或其任何组成成分)可以包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，通用引物(或其任何组成成分)包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，通用引物(或其任何组成成分)包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，通用引物(或其任何组成成分)包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在某些实施方案中，在所述正向引物中，所述正向核苷酸序列直接连接至第二通用序列的3'端，或者，通过核苷酸连接体连接至第二通用序列的3'端。在某些实施方案中，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。

在某些实施方案中，所述正向引物还包含额外的序列，其位于第二通用序列的5'端。在某些实施方案中，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。

在某些实施方案中，所述正向引物从5'至3'包含或由第二通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第二通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成。

在某些实施方案中，所述正向核苷酸序列位于或构成所述正向引物的3'部分。

在某些实施方案中，所述正向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt。

在某些实施方案中，所述正向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。

在某些实施方案中，所述正向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。

在某些实施方案中，在所述反向引物中，所述反向核苷酸序列直接连接至第一通用序列的3'端，或者，所述反向核苷酸序列通过核苷酸连接体连接至第一通用序列的3'端。在某些实施方案中，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。

在某些实施方案中，所述反向引物还包含额外的序列，其位于第一通用序列的5'端。在某些实施方案中，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。

在某些实施方案中，所述反向引物从5'至3'包含或由第一通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第一通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成。

在某些实施方案中，所述反向核苷酸序列位于或构成所述反向引物的3'部分。

在某些实施方案中，所述反向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt。

在某些实施方案中，所述反向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。

在某些实施方案中，所述反向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。

在某些实施方案中，所述第一通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；例如，所述第一通用序列中位于3'末端的至少一个核苷酸，例如1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸，不能与所述正向引物的互补序列互补。

在某些实施方案中，所述第二通用序列与所述第一通用序列的差异包括或在于，位于第一通用序列3'端的1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸各自独立地被缺失或置换。

在某些实施方案中，所述样品选自DNA，RNA，或者其任何组合。

在某些实施方案中，所述靶核酸是DNA或RNA。

在某些实施方案中，其中，所述方法的步骤(a)-(c)通过包含下述步骤(I)-(VI)的方案来进行：

(I)提供含有来源于所述待测人样本的靶核酸的样品，所述靶核酸包含一种或多种候选SNP位点；和，提供通用引物，以及，针对每一种待扩增的靶核酸，提供一个靶特异性引物对；其中，所述通用引物和靶特异性引物对如前所定义；

(II)将所述样品与所述通用引物和靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合；任选地，添加检测探针；

(III)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物；

(IV)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；

(V)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；和

(VI)任选地，重复步骤(III)-(V)一次或多次。

在某些实施方案中，在步骤(III)中，在80-105℃的温度下温育步骤(II)的产物，从而使核酸变性。

在某些实施方案中，在步骤(III)中，温育步骤(II)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min。

在某些实施方案中，在步骤(IV)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，或65-70℃的温度下温育步骤(III)的产物，从而允许核酸退火或杂交。

在某些实施方案中，在步骤(IV)中，温育步骤(III)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min。

在某些实施方案中，在步骤(V)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，65-70℃，70-75℃，75-80℃，80-85℃的温度下温育步骤(IV)的产物，从而允许核酸延伸。

在某些实施方案中，在步骤(V)中，温育步骤(d)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，2-5min，5-10min，10-20min或20-30min。

在某些实施方案中，在相同或不同的温度下进行步骤(IV)和(V)。

在某些实施方案中，重复步骤(III)-(V)至少一次，例如至少2次，至少5次，至少10次，至少20次，至少30次，至少40次，或至少50次。在某些实施方案中，当重复步骤(III)-(V)一次或多次时，每一个循环的步骤(III)-(V)所使用的条件各自独立地是相同的或不同的。

在本申请的第二方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括，能够不对称扩增含有候选SNP位点的靶核酸的鉴定引物组。

在某些实施方案中，所述鉴定引物组包含：通用引物，以及，针对每一种候选SNP位点，提供至少一个靶特异性引物对，其中，

所述通用引物包含第一通用序列；

所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述候选SNP位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；所述反向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；并且，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第一通用序列能够与所述第二通用序列的互补序列杂交或退火，且所述第二通用序列与所述第一通用序列存在差异，所述差异包括位于第一通用序列3'端的一个或多个核苷酸各自独立地被缺失或置换；并且，所述第一通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补。

在某些实施方案中，所述引物组包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个靶特异性引物对。

在某些实施方案中，所述通用引物如前所定义。

在某些实施方案中，所述靶特异性引物对如前所定义。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包括选自下列的一种或多种组分：核酸聚合酶，用于进行核酸扩增的试剂，用于进行熔解曲线分析的试剂，或其任何组合。

在某些实施方案中，所述核酸聚合酶是模板依赖性核酸聚合酶，例如DNA聚合酶，特别是热稳定的DNA聚合酶。在某些实施方案中，所述核酸聚合酶如前所定义。

在某些实施方案中，所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dNTPs(标记或未标记的)、水、包含离子(例如Mg²⁺)的溶液、单链DNA结合蛋白、或其任何组合。

在某些实施方案中，所述用于进行熔解曲线分析的试剂包括检测探针。在某些实施方案中，所述检测探针如前所定义。

在某些实施方案中，所述候选SNP位点之间的距离大于1kb。

在某些实施方案中，所述候选SNP位点为二态性SNP位点。

在某些实施方案中，所述候选SNP位点的等位基因频率在0.2至0.8之间(例如，0.3至0.7之间，0.4至0.6之间)。

在某些实施方案中，所述候选SNP位点之间的距离大于1kb。

在某些实施方案中，所述候选SNP位点为二态性SNP位点。

在某些实施方案中，所述候选SNP位点的等位基因频率在0.4至0.6之间。

在某些实施方案中，所述试剂盒用于检测待测样本中的靶核酸拷贝数重复。

易于理解，本申请试剂盒中的鉴定引物组(通用引物和靶特异性引物对)和检测探针用于实施如上所述的方法。因此，上文中对于鉴定引物组(通用引物和靶特异性引物对)和检测探针所进行的详细描述(包括各种优选特征和示例性特征的描述)同样也适用于此处。

在本申请的第三方面，提供了一种如前所定义的鉴定引物组用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于不对称扩增靶核酸，或者用于检测待测样本中的靶核酸拷贝数重复。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包含如前所定义的检测探针。

在某些实施方案中，所述试剂盒用于实施如前所描述的方法。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包含用于确定待测样品的基因组中一个或多个SNP位点的基因型别的试剂。

在某些实施方案中，所述试剂盒为如前所述的试剂盒。因此，上文中对于鉴定引物组(通用引物、靶特异性引物)和检测探针所进行的详细描述(包括各种优选特征和示例性特征的描述)同样也适用于此处。

发明的有益效果

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：

(1)与现有多重qPCR相比，本发明采用一对特异性和同一条检测探针对SNP位点不同等位基因进行检测，解决了qPCR使用不同引物对和探针来扩增靶基因和参照基因带来的扩增和检测效率，使得检测体系更为稳定，同时本发明采用多重不对称无引物二聚体系统，进一步提升了多重PCR的稳定性；本发明系统使用杂合SNP等位碱基的归一化峰高比值对染色体重复进行检测，检测重复1拷贝样本与正常染色体比值为2：1或1：2，而qPCR的方法检测重复1拷贝样本则需要鉴别1.5：1的相对拷贝数比值，故本方法对阴阳性样本检测波动的容忍程度更高。

(2)与MLPA技术、array-CGH、SNP芯片、高通量测序技术等相比，本发明系统无需PCR后操作，更加简便、快速、低成本、高通量。

综上，本发明提供了一种简单、高效、低成本的染色体重复的检测法。本发明方法能够检测的SNP位点的最大数目不受限于所使用荧光标记种类(仪器荧光检测通道数目)的限制。也即，本发明方法能够在有限荧光标记种类仪器荧光检测通道数目上实现对更多数量的SNP位点的同时检测(多重检测)。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1示意性地描述了本发明方法用于检测靶核酸的拷贝数的示例性实施方案，以阐释本发明方法的基本原理。

图1A示意性地描述了该实施方案中所涉及的引物组和自淬灭荧光检测探针，其中，引物组包括：通用引物，以及，包含正向引物和反向引物的靶特异性引物对；检测探针为双标记自淬灭荧光探针，5'末端和3'末端分别标记荧光基团和淬灭基团，其与靶核酸杂交形成的双链杂交体有固定的熔点。其中，

通用引物包含第一通用序列(Tag1)；

正向引物包含第二通用序列(Tag2)和特异于靶核酸的正向核苷酸序列，且正向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；

反向引物包含第一通用序列和特异于靶核酸的反向核苷酸序列，且反向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；并且，

正向引物和反向引物能够特异性扩增目的靶核酸；并且，

在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第一通用序列能够与所述第二通用序列的反向互补序列杂交或退火，且所述第二通用序列与所述第一通用序列存在差异，所述差异包括位于第一通用序列3'端的一个或多个核苷酸各自独立地被缺失或置换；并且，所述第一通用序列不能与正向引物的互补序列完全互补。

图1B示意性地描述了使用图1A的引物组进行扩增时，引物二聚体的非特异性扩增被抑制的原理，其中，因正向引物和反向引物的非特异性扩增而形成的引物二聚体在变性后将产生其5'端和3'端包含彼此互补的反向序列的单链核酸，该单链核酸自身在退火阶段将形成锅柄结构，阻止通用引物对该单链核酸的退火和延伸，从而抑制引物二聚体的进一步扩增。

图1C示意性地描述了使用图1A的引物组和检测探针对含有SNP位点的多个靶核酸同时检测的原理。在该实施方案中，针对每个含有SNP位点的靶核酸分别设计一对正向引物和反向引物以及一条自淬灭荧光检测探针，具体检测流程如下：

首先，由浓度低的靶特异性引物对启动PCR扩增，产生初始扩增产物，其包含分别与正向引物和反向引物/通用引物互补的两条核酸链(核酸链A和核酸链B)；随后，由浓度高的通用引物对所述初始扩增产物进行后续的PCR扩增。

由于反向引物和通用引物均包含第一通用序列，因此，与反向引物互补的核酸链B也能够与通用引物互补。由此，在PCR反应过程中，通用引物能够退火至核酸链B，并正常启动PCR扩增(即，正常合成核酸链B的互补链)。

与此同时，由于第一通用序列能够在允许核酸杂交或退火的条件下与第二通用序列的互补序列杂交或退火，因此，在PCR反应过程中，通用引物(其包含第一通用序列)也能够退火至与正向引物(其包含第二通用序列)互补的核酸链A。然而，由于第二通用序列与第一通用序列存在差异(其中，位于第一通用序列3'端的一个或多个核苷酸各自独立地被缺失或置换)，因此，通用引物(尤其是其3'端)并不能够与核酸链A完全互补，这导致通用引物对核酸链A的PCR扩增受到了抑制(即，核酸链A的互补链的合成受到抑制)。

因此，随着PCR扩增的进行，核酸链A的互补链(核酸链B)的合成效率将显著低于核酸链B的互补链(核酸链A)，导致核酸链B的互补链(核酸链A)被大量合成和扩增，而核酸链A的互补链(核酸链B)的合成和扩增受到抑制，从而产生大量目标单链产物(核酸链A，其含有与正向引物/第二通用序列互补的序列以及反向引物/通用引物的序列)，实现不对称扩增。进一步，还可以将如上所定义的通用引物与至少两个或更多个如上所定义的靶特异性引物对组合使用，其中，每一个靶特异性引物对各自包含一个正向引物和一个反向引物，且能够特异性扩增一种靶核酸，其中，所述正向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，所述反向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，由此，本发明的实施方案(引物组)可以用于实现对至少两个或更多个靶核酸的多重、不对称扩增。

PCR扩增完之后，预先加入的多条自淬灭荧光检测探针与对应的含有SNP位点的核苷酸单链分别结合，形成检测探针与核苷酸单链的双链杂交体，因所形成的双链杂交体不同，经熔解曲线分析后，即能获得不同的熔解峰，再根据熔点(T_m)实现不同SNP的区分以及同一个SNP不同基因型的区分。正常二倍体基因组杂合SNP的两个等位基因的拷贝数比值相等，即1：1；而染色体拷贝数异常，例如，染色体三体样本的杂合的SNP由于染色体1拷贝重复，两个等位基因的拷贝数比值成为2：1或者1：2。这种拷贝数的差异在熔解曲线分析时会反映到熔解峰的峰高上(例如，SNP 1的等位基因A和G)。

通过软件获得杂合型SNP位点上第一等位基因和第二等位基因的Rm后，计算所述SNP位点的第一等位基因和第二等位基因对应的Rm的比值HR_待测，并计算所述HR_待测与参考值的比值NHR_待测，从而分析得到所述待测样品中靶核酸的拷贝数，其中，所述参考值为正常人在所述目标SNP位点的第一等位基因和第二等位基因对应的Rm的比值HR_对照的平均值，且所述参考范围为正常人基因组中所述目标SNP位点的归一化峰高比值NHR_对照的波动范围。

图2显示了基于本发明系统构建的21号染色体拷贝数检测体系检测正常样本和21三体样本得到的NHR分布情况。其中，黑色小圆点为对照样本的检测结果，箱型图的上下限为NHR_对照的平均值±3SD；灰色实心方形为待测样本1(正常样本)的检测结果；灰色实心菱形和灰色空心菱形分布为为待测样本2和待测样本3(不同的21三体样本)的检测结果。

图3显示了基于本发明系统构建的21号染色体拷贝数检测体系检测不同样本的典型结果。其中黑色实线为正常样本的检测结果；黑色点线和黑色虚线为不同21三体样本的检测结果。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。应当理解的是，这些实施例只是用于说明本发明的原理和技术效果，而并不是表示本发明的所有可能性。本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数。本领域技术人员可以根据本发明的原理，利用其它类似的材料或反应条件来实施其他技术方案。此类技术方案没有脱离本发明描述的基本原理和概念，并且涵盖在本发明的范围内。

实施例1.检测染色体拷贝数重复的候选SNP位点的选取

本实施例以人21号染色体拷贝数检测为例，列举了本发明系统检测染色体拷贝数重复时优选的候选SNP位点具备的条件：(1)位于21染色体可能重复的区域(如唐氏综合征关键区域)且等位基因频率在0.4-0.6之间的二态性SNP位点；(2)SNP位点之间的距离应大于1kb；(3)SNP位点附近区域(前后至少10bp范围)不能出现等位基因频率在0.01以上的其它SNP位点。本实施例按照以上优选的标准筛选了11个候选SNP位点，具体如表1所示，SNP位点信息及序列从美国国家生物技术信息中心(NCBI)的dbSNP数据库查询和下载。

表1.实施例1选取的候选SNP位点信息

/>

实施例2.采用本发明系统用于21三体的检测

本实施例中，采用本发明的原理(如图1所示)，基于实施例1中选定的SNP位点，以21三体的检测为例，说明本发明用于检测染色体重复的实施流程。

步骤一：引物探针设计与检测体系建立

首先根据实施例1中的SNP位点，设计各个SNP位点的正向引物、反向引物和荧光检测探针以及所使用的通用引物，共包括11条正向引物、11条反向引物和、1条通用引物、以及11条自淬灭荧光检测探针，具体序列如表2所示。

表2：实施例2所涉引物和探针序列及使用浓度

/>

随后基于本发明的原理，构建多重不对称PCR检测体系，在单个PCR反应中同时对11个SNP位点检测、确定基因型别，具体的检测方案以及不同SNP各等位基因的熔点值如表3所示。

本实施例使用25μL的PCR反应体系来进行PCR扩增和熔解曲线分析，所述PCR反应体系包括：1×Taq PCR buffer(TaKaRa，北京)，3.0mM MgCl₂，0.16mM dNTPs，2U Taq HS(TaKaRa，大连)，表1中描述的引物和探针(以指定的工作浓度使用)，5μL人类基因组DNA。PCR反应程序为95℃预变性5min；95℃变性15s，52℃退火15s，76℃延伸20s，6个循环；95℃变性15s，58℃退火15s，76℃延伸20s，55个循环。可在58℃退火阶段采集相应通道(ATTO，FAM，HEX，ROX、CY5、Quasar 705)的荧光信号。熔解曲线分析反应程序为：95℃变性1min，37℃保温3min，按照0.04℃/step的升温速率，分析从40℃到85℃的熔解曲线，在温度递增过程中采集各个通道(ATTO，FAM，HEX，ROX、CY5、Quasar 705)的荧光信号。本实施例采用的仪器为SLAN 96实时荧光PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司)。

表3：检测方案

/>

步骤二：正常样本的检测与数值确定

在检测待测样本前，本方法先通过检测不同来源、不同提取方式的正常人基因组DNA样本，确定正常样本各SNP位点HR_对照值的波动范围，求其平均值作为正常对照的HR_对照的平均值。具体操作如下：对不同提取方式和不同来源的正常人基因组85份(47份血液样本使用经典的酚氯仿提取方法提取，11份血液样本和27份唾液样本使用Lab-Aid824核酸提取Midi试剂提取)。采用上述体系对样品的SNP位点进行检测，挑取其中基因型别为杂合的SNP位点，通过实时荧光PCR仪的配套软件“SLAN全自动医用PCR分析系统8.2.2”输出R_m2和R_m1，并计算R _m2/R _m1，由此得到每个样品在该SNP位点上的HR_对照。因采集了85份样本，所以每个SNP位点得到了多个HR_对照，因此再计算每个SNP位点的HR_对照的平均值(表4)以及各对照样本每个有效SNP位点的NHR_对照(图2黑色圆点)，同时计算每个SNP位点NHR_对照的平均值(表4)和标准差SD(表4)，以NHR_对照的平均值±3SD作为NHR_对照的波动范围(表4)。

表4：正常样本归一化峰高比值波动范围

步骤三：待测样本检测及结果判定

用本实施例体系检测待测样本，熔解曲线分析后，选取SNP基因型为杂合型的样本进行分析。具体分析步骤为：首先，通过实时荧光PCR仪的配套软件“SLAN全自动医用PCR分析系统8.2.2”输出的R_m2和R_m1，计算R_m2/R_m1，得到HR_待测，再按表4，计算对应SNP的HR_待测/HR_对照的平均值，得到待测样本每个杂合型SNP位点的NHR_待测。结果判定规则：假定待测样本有n个杂合位点，当n＝1时，则直接根据该位点的NHR_待测，对比表4中NHR_对照的波动范围，判断样本的类型(即当NHR_待测处于NHR_对照的波动范围以外时，表明待测样本的染色体重复，当NHR_待测处于NHR_对照的波动范围以内时，表明待测样本的染色体正常)；当n≥2时，分别对各杂合型SNP位点的NHR_待测，对比表4中NHR_对照的波动范围，判定标本的类型(即当NHR_待测处于NHR_对照的波动范围以外时，表明待测样本的染色体重复，当NHR_待测处于NHR_对照的波动范围以内时，表明待测样本的染色体正常)，若出现根据个别SNP位点判定结果与其它SNP位点判定结果不一致的情况，以占多数SNP位点NHR判定结果作为待测样本最终的类型。

本实施例随后检测了3个待测样本，检测结果如图3和表5所示，3份样本的11个SNP位点均为杂合型，按上述判读规则进行判读，判读结果表明，1个为正常样本，2份21三体样本(图2中灰色实心菱形和灰色空心菱形为不同21三体样本的各SNP位点NHR结果)。

本实施例结果表明，本发明方法所设计的21体检测体系可以用于21号染色体三体的检测，各样本的检测结果都与对照方法(染色体核型分析)结果一致。

表5：检测正常样本和21三体样本

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门大学

<120> 一种检测靶核酸拷贝数重复的方法和试剂盒

<130> IDC200448

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs13049947-P

<400> 1

acccataaat caagaaatcc 20

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs13049947-F

<400> 2

gtcgcaagca ctcacgtaga gatgagctac acttaatgct caaa 44

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs13049947-R

<400> 3

gtcgcaagca ctcacgtaga gtcatagagg catcttcctg g 41

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs1734505-P

<400> 4

ggaggtggga accggattcc agcgc 25

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs1734505-F

<400> 5

gtcgcaagca ctcacgtaga gggagcgtgc gtgaatg 37

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs1734505-R

<400> 6

gtcgcaagca ctcacgtaga gacagtctta ggtattcagt taatagca 48

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs979393-P

<400> 7

gtcaacttga gaggttttta atat 24

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs979393-F

<400> 8

gtcgcaagca ctcacgtaga ggtttacagc gggcactatc 40

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs979393-R

<400> 9

gtcgcaagca ctcacgtaga gagtgaattt attggcagct catt 44

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs2836533-P

<400> 10

ggcacaccca ttccaaccca atcgcctctc a 31

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs2836533-F

<400> 11

gtcgcaagca ctcacgtaga gcacatctgt cctttctgac c 41

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs2836533-R

<400> 12

gtcgcaagca ctcacgtaga gagctccgcc aatcttgg 38

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs2835906-P

<400> 13

catcaaaaga agcgtaaaat 20

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs2835906-F

<400> 14

gtcgcaagca ctcacgtaga ggtctgtttt tgtgtaagtc tgata 45

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs2835906-R

<400> 15

gtcgcaagca ctcacgtaga gacaaggatg agtccccgtt a 41

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs7275547-P

<400> 16

tgcctctgag tgaatgcctc ttcgtcacct 30

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs7275547-F

<400> 17

gtcgcaagca ctcacgtaga gtctcttgag agccaggaca 40

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs7275547-R

<400> 18

gtcgcaagca ctcacgtaga gaccagtgag aggaggtaca ga 42

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs1005546-P

<400> 19

ctttgttgtc atgtctctca a 21

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs1005546-F

<400> 20

gtcgcaagca ctcacgtaga gctaggaaat cccaggtcgt a 41

<210> 21

<211> 50

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs1005546-R

<400> 21

gtcgcaagca ctcacgtaga gacagaagaa ttccactaga taatatgaga 50

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs857998-P

<400> 22

cagctctccc agcagatagg caagcccct 29

<210> 23

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs857998-F

<400> 23

gtcgcaagca ctcacgtaga gctgcagttg gagaaagttg t 41

<210> 24

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs857998-R

<400> 24

gtcgcaagca ctcacgtaga gaaagaactg atggcctctg ta 42

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs2252992-P

<400> 25

gctcacactt cttagacgca gtgctcca 28

<210> 26

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs2252992-F

<400> 26

gtcgcaagca ctcacgtaga gggaaatgtc tgttgtccaa tct 43

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs2252992-R

<400> 27

gtcgcaagca ctcacgtaga gaccccaaga acagagcaca 40

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs2835084-P

<400> 28

cagatattta ccatggtga 19

<210> 29

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs2835084-F

<400> 29

gtcgcaagca ctcacgtaga gaggtttcac tggaatgcta cc 42

<210> 30

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs2835084-R

<400> 30

gtcgcaagca ctcacgtaga ggagggtcat ctgatgggtc 40

<210> 31

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs2835735-P

<400> 31

ggctcttgag ttgggcaaca agggttccca g 31

<210> 32

<211> 44

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs2835735-F

<400> 32

gtcgcaagca ctcacgtaga gagtgttcaa cttgcactag gata 44

<210> 33

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> rs2835735-R

<400> 33

gtcgcaagca ctcacgtaga gacaccaagt ctgcactca 39

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Tag

<400> 34

gtcgcaagca ctcacgtaga ga 22

Claims

1.一种非疾病诊断治疗目的的检测待测样本的基因组中靶核酸拷贝数重复的方法，其包括以下步骤:

所述通用引物包含第一通用序列；

(c)对步骤(b)获得的扩增产物进行熔解曲线分析，并获得各SNP位点的基因型别；

(d)根据步骤(c)的熔解曲线分析结果，挑选至少一个杂合的SNP位点作为目标SNP位点，在所述目标SNP位点上具有第一等位基因和第二等位基因；

2.权利要求1的方法，其中，所述靶核酸为染色体。

3.权利要求1的方法，其中，靶核酸为常染色体。

4.权利要求1的方法，其中，挑选1个，2个，3个，4个，5个，10个，15个，20个，或更多个杂合的SNP位点作为目标SNP位点，在所述目标SNP位点上具有第一等位基因和第二等位基因。

5.权利要求1的方法，其中，所述参考值和所述参考范围通过如下方法获得:

(I)提供含有来源于多个健康人样本的靶核酸的多个样品，每一种靶核酸均包含一种或多种候选SNP位点，并且，

所述通用引物包含第一通用序列；

(III)对步骤(II)获得的与各样本对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析，并获得各SNP位点的基因型别；

(IV)根据步骤(III)的熔解曲线分析结果，挑选至少一个杂合的SNP位点作为目标SNP位点，在所述目标SNP位点上具有第一等位基因和第二等位基因；

6.权利要求5的方法，其中，提供至少3个，至少4个，至少5个，至少10个，或更多个健康人样本。

7.权利要求5的方法，其中，提供至少3个，至少4个，至少5个，至少10个，或更多个样品。

8.权利要求1的方法，其中，在步骤(e)中，通过如下方法判断待测样本的靶核酸拷贝数是否重复：当所述NHR_待测处于所述参考范围内，所述靶核酸的核苷酸序列正常；当所述NHR_待测处于所述参考范围外，所述靶核酸的核苷酸序列发生重复。

9.权利要求1的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)所述方法用于检测1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个靶核酸的拷贝数；

(2)在所述方法的步骤(a)中，提供1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个靶特异性引物对；

(3)在所述方法的步骤(b)中，所述通用引物的工作浓度高于所述正向引物和反向引物的工作浓度；

(4)在所述方法的步骤(b)中，所述正向引物和反向引物的工作浓度是相同的或者不同的；

(5)在所述方法的步骤(b)中，使用核酸聚合酶来进行PCR反应；

(6)所述靶核酸的序列长度至少为5bp；

(7)所述候选SNP位点具有选自以下的1个或多个特征：

(i)所述候选SNP位点之间的距离大于1kb；

(ii)所述候选SNP位点为二态性SNP位点；

(iii)所述候选SNP位点的等位基因频率在0.2至0.8之间；

(8)在步骤(c)中，通过实时荧光PCR仪的配套软件获得各SNP位点上各等位基因对应的熔解峰峰高(Rm)。

10.权利要求9所述的方法，其中，所述通用引物的工作浓度比所述正向引物和反向引物的工作浓度高1-5倍，5-10倍，10-15倍，15-20倍，20-50倍或更多倍。

11.权利要求9所述的方法，其中，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶。

12.权利要求9所述的方法，其中，所述核酸聚合酶为热稳定的DNA聚合酶。

13.权利要求9所述的方法，其中，所述核酸聚合酶获自，Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcusliteralis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus oshimai,Thermusruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermusthermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcusgorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictiumoccultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus。

14.权利要求9所述的方法，其中，所述核酸聚合酶为Taq聚合酶。

15.权利要求1所述的方法，其中，所述候选SNP位点具有选自以下的1个或多个特征：

(i)所述候选SNP位点之间的距离大于1kb；

(ii)所述候选SNP位点为二态性SNP位点；

(iii)所述候选SNP位点的等位基因频率在0.3至0.7之间。

16.权利要求1所述的方法，其中，所述候选SNP位点具有选自以下的1个或多个特征：

(i)所述候选SNP位点之间的距离大于1kb；

(ii)所述候选SNP位点为二态性SNP位点；

(iii)所述候选SNP位点的等位基因频率在0.4至0.6之间。

17.权利要求1的方法，在步骤(a)中，针对每一种SNP位点，还提供一个检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述SNP位点的区域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；

18.权利要求17的方法，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)在步骤(b)中，将所述样品与所述通用引物、所述靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，将检测探针加入到步骤(b)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(b)中，将所述样品与所述通用引物、所述靶特异性引物对和所述检测探针，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，进行熔解曲线分析；

(2)所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(3)所述检测探针的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt；

(4)所述检测探针具有3'-OH末端；或者，所述检测探针的3'-末端是封闭的；

(5)所述检测探针为自淬灭探针；

(6)所述检测探针中的报告基团为荧光基团；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团；

(7)所述检测探针无抵抗核酸酶活性，或者具有抵抗核酸酶活性的抗性；

(8)所述检测探针是线性的，或者具有发夹结构；

(9)所述检测探针各自独立地具有相同或不同的报告基团；

(10)在步骤(c)中，对步骤(b)的产物进行逐渐的升温或降温并实时监测每一种检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得每一种报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线；然后，对所述曲线进行求导，从而获得步骤(b)的产物的熔解曲线。

19.权利要求18的方法，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)天然存在的核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；

(2)非天然的核苷酸是肽核酸(PNA)或锁核酸；

(3)通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端；

(4)所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；

(5)所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离；

(6)所述荧光基团选自ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL Fluor Gold 540,JOE,HEX,CALFluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red590,ROX,CAL Fluor Red 610,TEXAS RED,CALFluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705；

(7)所述淬灭基团选自DABCYL、BHQ、ECLIPSE和/或TAMRA；

(8)所述检测探针具有5'核酸酶活性；

(9)所述检测探针的主链包含抵抗核酸酶活性的修饰；

(10)所述检测探针的主链包含选自下述的修饰：硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'-O-氨基丙基修饰，2'-O-烷基修饰，2'-O-烯丙基修饰，2'-O-丁基修饰，和1-(4'-硫代-PD-呋喃核糖基)修饰；

(11)所述检测探针具有相同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；或，所述检测探针具有不同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据报告基团的信号种类及熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在。

20.权利要求1的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)所述通用引物由第一通用序列组成，或者，包含第一通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第一通用序列的5'端；

(2)所述第一通用序列位于或构成所述通用引物的3'部分；

(3)所述通用引物的长度为5-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt；

(4)所述通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。

21.权利要求20所述的方法，其中，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。

22.权利要求1的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)在所述正向引物中，所述正向核苷酸序列直接连接至第二通用序列的3'端，或者，通过核苷酸连接体连接至第二通用序列的3'端；

(2)所述正向引物还包含额外的序列，其位于第二通用序列的5'端；

(3)所述正向引物从5'至3'包含或由第二通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第二通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；

(4)所述正向核苷酸序列位于或构成所述正向引物的3'部分；

(5)所述正向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt；

(6)所述正向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；

(7)所述正向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(8)在所述反向引物中，所述反向核苷酸序列直接连接至第一通用序列的3'端，或者，所述反向核苷酸序列通过核苷酸连接体连接至第一通用序列的3'端；

(9)所述反向引物还包含额外的序列，其位于第一通用序列的5'端；

(10)所述反向引物从5'至3'包含或由第一通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第一通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；

(11)所述反向核苷酸序列位于或构成所述反向引物的3'部分；

(12)所述反向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt；

(13)所述反向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；

(14)所述反向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(15)所述第一通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；和

(16)所述第二通用序列与所述第一通用序列的差异包括或在于，位于第一通用序列3'端的1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸，各自独立地被缺失或置换。

23.权利要求22的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(2)所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(3)所述第一通用序列中位于3'末端的至少一个核苷酸不能与所述正向引物的互补序列互补。

24.权利要求1的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)所述样品选自DNA，RNA，或者其任何组合；

(2)所述靶核酸是DNA或RNA。

25.权利要求1所述的方法，其中，所述方法的步骤(a)-(c)通过包含下述步骤(I)-(VI)的方案来进行：

(I)提供含有来源于所述待测人样本的靶核酸的样品，所述靶核酸包含一种或多种候选SNP位点；和，提供通用引物，以及，针对每一种待扩增的靶核酸，提供一个靶特异性引物对；其中，所述通用引物和靶特异性引物对如权利要求1所定义；

(III)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物；

(IV)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；

(V)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；和

(VI)任选地，重复步骤(III)-(V)一次或多次。

26.权利要求25所述的方法，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)在步骤(III)中，在80-105℃的温度下温育步骤(II)的产物，从而使核酸变性；

(2)在步骤(III)中，温育步骤(II)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min；

(3)在步骤(IV)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，或65-70℃的温度下温育步骤(III)的产物，从而允许核酸退火或杂交；

(4)在步骤(IV)中，温育步骤(III)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min；

(5)在步骤(V)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，65-70℃，70-75℃，75-80℃，80-85℃的温度下温育步骤(IV)的产物，从而允许核酸延伸；

(6)在步骤(V)中，温育步骤(d)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，2-5min，5-10min，10-20min或20-30min；

(7)在相同或不同的温度下进行步骤(IV)和(V)；和

(8)重复步骤(III)-(V)至少一次。

27.权利要求25所述的方法，当重复步骤(III)-(V)一次或多次时，每一个循环的步骤(III)-(V)所使用的条件各自独立地是相同的或不同的。

28.一种试剂盒，所述试剂盒包括，能够不对称扩增含有候选SNP位点的靶核酸的鉴定引物组；其中，所述鉴定引物组包含：通用引物，以及，针对每一种候选SNP位点，提供至少一个靶特异性引物对，其中，

所述通用引物包含第一通用序列；

29.权利要求28的试剂盒，所述鉴定引物组具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)所述引物组包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个靶特异性引物对；

(2)所述通用引物具有选自下列的一个或多个技术特征：

(I)所述通用引物由第一通用序列组成，或者，包含第一通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第一通用序列的5'端；

(II)所述第一通用序列位于或构成所述通用引物的3'部分；

(III)所述通用引物的长度为5-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt；

(IV)所述通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(3)所述靶特异性引物对具有选自下列的一个或多个技术特征：

(I)在所述正向引物中，所述正向核苷酸序列直接连接至第二通用序列的3'端，或者，通过核苷酸连接体连接至第二通用序列的3'端；

(II)所述正向引物还包含额外的序列，其位于第二通用序列的5'端；

(III)所述正向引物从5'至3'包含或由第二通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第二通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；

(IV)所述正向核苷酸序列位于或构成所述正向引物的3'部分；

(V)所述正向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt；

(VI)所述正向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；

(VII)所述正向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(VIII)在所述反向引物中，所述反向核苷酸序列直接连接至第一通用序列的3'端，或者，所述反向核苷酸序列通过核苷酸连接体连接至第一通用序列的3'端；

(IX)所述反向引物还包含额外的序列，其位于第一通用序列的5'端；

(X)所述反向引物从5'至3'包含或由第一通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第一通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；

(XI)所述反向核苷酸序列位于或构成所述反向引物的3'部分；

(XII)所述反向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt；

(XIII)所述反向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；

(XIV)所述反向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(XV)所述第一通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；和

(XVI)所述第二通用序列与所述第一通用序列的差异包括或在于，位于第一通用序列3'端的1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸，各自独立地被缺失或置换。

30.权利要求29的试剂盒，其中，所述试剂盒具有选自下列的一个或多个技术特征：

31.权利要求28的试剂盒，所述试剂盒还包括选自下列的一种或多种组分：核酸聚合酶，用于进行核酸扩增的试剂，用于进行熔解曲线分析的试剂，或其任何组合。

32.权利要求28的试剂盒，所述试剂盒具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)所述核酸聚合酶是模板依赖性核酸聚合酶；

(2)所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶的工作缓冲液、dNTPs、水、包含离子的溶液、单链DNA结合蛋白、或其任何组合；

(3)所述用于进行熔解曲线分析的试剂包括检测探针；

33.权利要求32的试剂盒，所述核酸聚合酶如权利要求11-14任一项所定义。

34.权利要求32的试剂盒，所述检测探针如权利要求17-19任一项所定义。

35.权利要求28的试剂盒，所述候选SNP位点具有选自以下的1个或多个特征：

(1)所述候选SNP位点之间的距离大于1kb；

(2)所述候选SNP位点为二态性SNP位点；

(3)所述候选SNP位点的等位基因频率在0.2至0.8之间。

36.权利要求28的试剂盒，所述候选SNP位点具有选自以下的1个或多个特征：

(1)所述候选SNP位点之间的距离大于1kb；

(2)所述候选SNP位点为二态性SNP位点；

(3)所述候选SNP位点的等位基因频率在0.4至0.6之间。

37.权利要求28的试剂盒，所述试剂盒用于检测待测样本中的靶核酸拷贝数重复。

38.权利要求28或29所定义的鉴定引物组用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于不对称扩增靶核酸，或者用于检测待测样本中的靶核酸拷贝数重复。

39.权利要求38所述的用途，所述试剂盒还包含权利要求17-19任一项所定义的检测探针。

40.权利要求38所述的用途，所述试剂盒用于实施权利要求1-27任一项所描述的方法。

41.权利要求38所述的用途，所述试剂盒还包含用于确定待测样品的基因组中一个或多个SNP位点的基因型别的试剂。