CN112074613A - 用于复杂基因库的pcr的多种特异性/非特异性引物 - Google Patents

Abstract

公开了用于包含复杂靶基因库的样品的单一步骤PCR的组合物和方法，其可以同时扩增样品中常见的各种各样的变体靶基因序列，同时保持基因变体的原始比率。本文描述的组合物和方法利用(1)基因特异性引物库以及(2)非特异性PCR引物，所述基因特异性引物库包含含有靶序列的复杂混合物的样品中存在的多种变体，这些都是混合物中变体扩增所需的，其可能引入扩增偏倚，所述非特异性PCR引物被设计为靶向多种基因特异性引物变体，并且消除扩增偏倚。

Description

用于复杂基因库的PCR的多种特异性/非特异性引物

技术领域

本文公开了可用于进行复杂靶基因库例如微生物组样品的单一步骤聚合酶链式反应(PCR)的组合物和方法，其使用特异性和非特异性引物来扩增靶序列，同时保持基因变体的原始比率并且减少或消除引物浓度依赖性PCR扩增偏倚(amplification bias)。

背景技术

研究微生物组涉及对存在的微生物的类型进行分类以及每种类型有多少种。16S、18S、23S、内部转录间隔区(ITS)或者保守和可变遗传区的其他组合的靶向测序可用于鉴定复杂混合物中的微生物。大多数靶向区包含存在于生命的许多结构域中的保守序列，这些序列可以被PCR引物靶向，这些引物位于特定生物体特有的保守性较差的可变区的侧翼，从而对该生物体提供阳性鉴定。PCR测定具有的优势在于，用于微生物组分析所需的测序量可以比完整微生物组测序所需的测序量少几个数量级。使用16S、23S或其他靶向DNA测序技术的PCR测定典型地涉及设计在靶基因的保守区退火的引物。尽管引物位点可能是保守的，但生物体之间存在足够的变异，使得单一引物组典型地无法捕获所有变体基因。由于引物序列与变体基因的退火较差，因此生物体不是表示很差就是会表示缺失。可以通过包括与变体退火的额外引物来解决微生物变体表示缺失的问题(Apprill,A.,et al,Aquat MicrobEcol,2015and Caporaso,J.G.et al.,PNAS,2011)，但是此种方法可能会导致依赖于靶标和PCR引物的相对丰度的差异扩增(Castelino,Madhura et al.“Optimisation ofMethods for Bacterial Skin Microbiome Investigation:Primer Selection andComparison of the 454versus MiSeq Platform.”BMC Microbiology 17(2017):23.PMC.Web.11Feb.2018)，引入了PCR偏倚。为了阐明，在包含多个靶标的PCR反应中，高丰度靶标将比低丰度靶标更快地耗尽其相应的引物，并且随着反应的进行，耗尽的引物将导致该靶标的PCR效率更低。低丰度靶标将不会以相同的速率经历引物耗尽，因此低丰度PCR在更长时间中保持有效。PCR期间引物耗尽的结果是，靶基因(表示生物体)的原始种群比率将失真，人为地增大了微生物混合物中生物体的表示的低丰度和/或抑制了高丰度，这会使微生物组数据的解释显著复杂化。

可以通过包括PCR引物变体来解决缺失微生物变体的问题，但这引入了引物浓度依赖性PCR扩增偏倚的新问题。

本文公开的组合物和方法在同一PCR反应中利用特异性和非特异性引物以与起始样品中存在的靶序列的水平成比例的比率扩增靶序列，从而减少或消除了引物浓度依赖性PCR扩增偏倚的问题，同时仍然捕获包含复杂靶基因库的样品诸如微生物组中的变体。

发明内容

本文公开了用于包含复杂靶基因库的样品的单一步骤聚合酶链式反应(PCR)(例如，微生物组样品的16S rRNA扩增)的组合物和方法，其可以同时扩增样品中常见的各种各样的变体靶基因序列，同时保持基因变体的原始比率。本文描述的组合物和方法利用(1)基因特异性引物库以及(2)非特异性PCR引物，所述基因特异性引物库包含含有靶序列(例如微生物基因序列)的复杂混合物的样品中存在的多种变体，这些都是混合物中变体扩增所需的，其可能引入扩增偏倚，所述非特异性PCR引物被设计为靶向多种基因特异性引物变体，并且消除扩增偏倚。非特异性引物被设计为使得它们在发生了两轮特异性PCR后，直到第三轮PCR才能够与靶标退火。与以前的方法相比，此方法的主要优点是可以将两种类型的引物(特异性和非特异性)组合在同一PCR反应中，使得如果在复杂样品混合物的PCR期间耗尽了一种或多种靶基因特异性引物，则非特异性引物可以在以后的几轮中接管扩增。结果是，将减少或消除由于PCR期间特异性引物耗尽而引起的偏倚，保持相应靶基因的准确成比例表示。

附图说明

图1-引物设计为了清楚起见，仅示出了两条链中的一条，第二条链引物以类似的方式设计。为了靶向具有变化的保守位点序列的基因组，PCR引物的生物体特异性区(白框，标记有实例生物体)可能包含与标准大肠杆菌(E.Coli)序列不同的序列变体(小灰色框)。引物的5'非特异性区(位于白框的5'的黑色“尾”)对于每种特异性引物是相同的。非特异性序列被设计为使得其不会与基因组DNA退火。与特异性PCR引物的生物体特异性区互补的基因组DNA显示为一条较细、较长的与PCR引物的特异性部分退火的链。特异性引物的5’非特异性部分是全部彼此相同的，并且与非特异性引物的序列相同。如图2所示，直到第三轮PCR，当合成原始退火的特异性引物的反向互补链时，非特异性引物序列才具有退火靶标。

图2非特异性引物在PCR的第三轮退火如图1中设计引物组，图2中示出了大肠杆菌序列情况下的实例性反应。在PCR第1轮中，仅特异性PCR引物的特异性区会与基因组靶标退火，非特异性部分显示为未退火的下垂部(flap)。第1轮延伸不会复制非特异性序列，因此特异性引物也专门用于第2轮PCR。第2轮延伸将生成互补的非特异性引物序列，允许在第3轮中进行非特异性引物退火。在第3轮以及以后，PCR可以使用特异性或非特异性引物库，因此，如果特异性引物被耗尽，则仍然会有大量过量的非特异性引物以继续反应。应注意的是，对于正向和反向引物，非特异性引物可以是相同的(如所示，为简单起见)或不同的。

图3微生物组样品中16S基因的PCR扩增。V1V3 16S rRNA基因扩增子的0.8％琼脂糖凝胶。V1V3扩增子大小为～700个碱基对(bp)。在泳道2中仅使用限量的V1V3特异性引物进行PCR反应，泳道3中仅使用非特异性引物，以及泳道4中使用特异性和非特异性引物的混合物。泳道2中相对较弱的特异性条带是限量的特异性引物的直接结果，这限制了扩增子产物的量。如泳道4所示，添加作为有限的引物的替代的非特异性引物，如同时包含特异性和非特异性引物的泳道4中的700bp明亮条带所证明的。反应描述：如以下实例所述，进行PCR反应混合物和热循环方案，并进行以下修改：在泳道1中不包括非特异性引物，在泳道2中不包括特异性引物。如实例中所述，泳道3包含两种引物。当PCR完成后，将2ul反应在0.8％琼脂糖凝胶上在100V下电泳1小时。泳道1和5包含2-log梯带作为大小参考，在500、1000和3000个碱基处具有明亮条带。

图4 16S基因的qPCR扩增。在靶向16S rRNA基因的V1V3区的qPCR扩增中，使用来自8种生物体模拟微生物组群落和青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)的DNA作为模板。滴定青春双歧杆菌的特异性引物以表示引物耗尽；没有特异性引物，则没有青春双歧杆菌PCR产物。青春双歧杆菌gDNA的量保持恒定，因此由qPCR报告的Cq对于每个反应应该是类似的，除非特异性和非特异性引物浓度影响结果。在有和没有固定量的非特异性引物的情况下进行特异性引物滴定。除了滴定的青春双歧杆菌引物外，PCR反应还包含青春双歧杆菌特异性荧光qPCR探针、靶向其他生物体的V1V3引物、来自模拟微生物组中的其他生物体的gDNA和青春双歧杆菌gDNA。通过监测青春双歧杆菌特异性qPCR探针的荧光来评估结果。qPCR反应的Cq与由青春双歧杆菌特异性探针产生的荧光的量直接相关。增加的PCR产物会生成更高的荧光，并且因此Cq会更早(或更低)。在其中青春双歧杆菌特异性引物滴定并且不存在非特异性引物的反应中(实线)，低于83nM引物没有信号，表明由于引物不足，青春双歧杆菌PCR不能保持成比例表示。这模拟了这样的情况，其中特异性引物被高丰度靶标耗尽(引物在反应期间被用尽)，并且不可用于随后的几轮PCR，大幅降低了青春双歧杆菌的最终PCR产物的比例。基于引物浓度而不是gDNA浓度，像这样的事件将减少或消除青春双歧杆菌的成比例表示。然而，在存在非特异性引物的情况下(虚线)，即使处于青春双歧杆菌特异性引物的原始水平的1/500时，也可以检测到青春双歧杆菌gDNA的扩增。这模拟了一种情况，其中特异性引物被高丰度靶标耗尽，但非特异性引物的存在使扩增能够继续，从而导致群落中青春双歧杆菌的比例的更准确表示。

具体实施方式

本发明包括特异性和非特异性PCR引物，其被设计为扩增多种生物体中的靶基因的变异，同时减少由PCR期间引物之间竞争导致的扩增偏倚。特异性PCR引物库包含与多种生物体退火的序列变体，并且此外应用在任何靶生物体的基因组中都不存在的通用引物“尾”。非特异性引物由单一序列组成，与在特异性引物上的通用引物“尾”序列相同。由于非特异性引物序列没有基因组靶标，因此它在第1次和第2次PCR循环中不会退火。

多种基因特异性引物与非特异性人工序列引物的组合能够覆盖基因变体，同时降低潜在的PCR偏倚。尽管一个反应中包括特异性和非特异性引物，但非特异性引物不能在第三轮扩增之前参与。

在PCR的第一轮中，如果存在其基因组靶标，则生物体特异性PCR引物的特异性部分将结合。特异性引物的非特异性5'部分(图1和2中示出为未退火的下垂部，其序列与非特异性引物库中的引物相同)不会退火，因为基因组DNA(gDNA)中没有互补序列。

第1轮PCR合成了互补的gDNA链，但在特异性引物的尾上没有针对非特异性序列合成的互补物。结果，在第二轮PCR期间，再次仅生物体特异性退火靶标是可获得的。在PCR第二轮期间，第一轮产物向回复制通过包括引物的完整非特异性部分的PCR引物序列。从这一点开始，之后的每个PCR轮可以继续使用生物体特异性引物(如果可用)或非特异性引物(对于所有模板都过量存在)。

因此，本文公开了用于确定样品中靶DNA序列的比率的多引物测定法，通过以下进行：(a)在单一容器中使所述样品与多种寡核苷酸引物接触，其中，所述多种寡核苷酸引物包括：(i)一组或多组正向和反向特异性引物，具有被设计为不与所述样品中的DNA序列退火的非特异性核苷酸序列，所述非特异性核苷酸序列连接至与靶DNA序列的特异性连续碱基序列互补的特异性核苷酸序列；以及(ii)一组或多组正向和反向非特异性引物，具有与(i)中所述非特异性核苷酸序列相同的核苷酸序列的；(b)在所述容器中进行最少三轮的多引物扩增反应，其中，所述非特异性引物的组直到第三轮扩增反应才参与所述扩增反应；以及(c)检测对应于所述靶DNA序列的扩增产物的存在，其中，所述扩增产物的比率反映所述样品中所述靶DNA序列的比率。非特异性引物被设计为具有不与样品中的任何DNA序列退火的核苷酸序列，并且直到三次扩增反应的第三轮才会产生扩增子。可以使用本领域已知的方法设计引物。

在一些实施方式中，所述正向和反向特异性引物的组包括在所述非特异性核苷酸序列和所述特异性核苷酸序列之间的接头序列。在一些实施方式中，所述接头序列具有约5至约25个核苷酸的长度。在一些实施方式中，所述接头序列包括用于鉴定各种样品的唯一条形码序列。用特异性DNA标签对各种样品进行条形码编码，允许将许多样品组合在一起用于测序，简化工作流程，降低工作流程的复杂性，减少生成结果的时间并且降低成本。可以选择具有足够长度的DNA条形码，以生成具有足够可变性的所需数量的条形码，以解释一般的测序错误，通常大小范围为约2至约20个碱基，但可以更长或更短。

在一些实施方式中，所述靶序列包括选自由以下组成的组的基因的序列：16SrRNA、23S rRNA、18S rRNA、ITS1、ITS2、HSP65、rpoB、recA、内部转录间隔区(ITS)、人HLA、微生物毒素产生基因、微生物致病性基因、微生物质粒基因、人免疫系统基因、免疫系统组件、核糖体RNA基因以及其他非人生物体的可变基因区。在一些实施方式中，16S rRNA靶序列包括选自由以下组成的组的区：V1V3、V3V4、V4-V5和V1V9。在一些实施方式中，所述靶序列包括区V1V9-EXT，所述区V1V9-EXT包括：16S rRNA基因的V1V9区的部分或全部以及相邻的(i)内部转录间隔区基因和(ii)23S基因的部分或全部。

在一些实施方式中，所述正向特异性引物具有以下核苷酸序列：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATATGCGCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGRGTTYGATYCTGGCTYAG，其中，Y是C或T，并且R是A或G。在一些实施方式中，所述反向特异性引物具有以下核苷酸序列：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTYACCGCRRCTGCTGGCAC，其中，Y是C或T，并且R是A或G。在一些实施方式中，所述正向非特异性引物具有以下核苷酸序列：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATATGCGCACACTCTTTCCCTACACGA。在一些实施方式中，所述反向非特异性引物具有以下核苷酸序列：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTC。

在一些实施方式中，样品中的所述靶DNA源自选自由以下组成的组的来源：排泄物、细胞裂解物、组织、血液、肿瘤、舌头、牙齿、颊粘膜拭子、痰、粘液、伤口拭子、皮肤拭子、阴道拭子或最初从人、动物、植物或环境样品(诸如土壤、水或空气)中获得的任何其他生物材料、组织或流体，包括原始样品、复杂样品、混合物和微生物组样品。

在一些实施方式中，所述靶DNA源自选自由以下组成的组的生物体：孢子、生物膜、多细胞生物体、单细胞生物体、原核生物、真核生物、微生物、细菌、古菌、原生动物、藻类、真菌和病毒。

本文还公开了由以下通式表示的核酸扩增引物：5'-A-B-C-3'或5’-A-C-3’或5’-B-A-C-3’或5’-A-C-B-3’或5’-C-B-A-3’或5’-C-A-3’或5’-B-C-A-3’或5’-C-A-B-3’，其中，‘A’表示不与靶核酸退火的具有约15至约100个核苷酸长度的非特异性核苷酸序列，‘B’表示具有约5至约30个核苷酸长度的接头核苷酸序列，以及‘C’表示与模板核酸的特异性连续碱基序列互补的具有约10至约30个核苷酸长度的核苷酸序列。在优选的实施方式中，所述核酸扩增引物由以下通式表示：5'-A-B-C-3'。

在一些实施方式中，所述靶DNA序列选自人、微生物、动物、植物或病毒基因序列。在一些实施方式中，靶DNA序列包括选自由以下组成的组的基因：16S rRNA、23S rRNA、18SrRNA、ITS1、ITS2、HSP65、rpoB、recA、内部转录间隔区(ITS)、人HLA、微生物毒素生产基因、微生物致病性基因、微生物质粒基因、免疫系统基因、免疫系统组件、嗅觉受体基因、核糖体RNA基因以及由原核生物和真核生物的相关基因的其他变体。

在一些实施方式中，所述特异性引物与选自由以下组成的组的16S rRNA序列的区互补：V1V3、V3V4、V4-V5和V1V9。在一些实施方式中，所述特异性引物与包括16S rRNA基因的整个V1V9区以及其相邻ITS和23S rRNA基因的部分或全部的V1V9-EXT区互补。

本发明还包括利用本文描述的任何组合物和方法的试剂盒。

本文公开的方法的优点包括可以将具有不同的浓度、序列和对它们的靶标的亲和力的多种特异性引物组合在单个PCR测定中。由于存在在所有靶标生物体中具有相同的浓度、序列和亲和力的非特异性引物，因此显著降低了这些多种引物之间的PCR引物竞争的可能性。这使得可以使用多种PCR引物，这些引物包括各种各样的基因组靶标，以及跨所有靶标的更均匀扩增。由于非特异性引物可以在第二轮(循环)后进行扩增，因此用于所有扩增子的总引物库在PCR期间保持一致。因为可以选择非特异性靶序列以包括PCR后文库创建所需的序列用于测序，所以可以从衔接子和文库处理中移除许多已证明会导致样品串扰和标签跳跃的步骤(MacConaill,L.E.,Burns,R.T.,Nag A.,Coleman,H.A.,Slevin,M.K.,Giorda,K.,Light,M.,Lai,K.,Jarosz,M.,McNeill,M.S.,Ducar,M.D.,Meyerson,M.,Thorner,A.R.,Unique,dual-indexed sequencing adapters with UMIs effectivelyeliminate index cross-talk and significantly improve sensitivity of massivelyparallel sequencing.BMC Genomics.2018Jan 8；19(1):30)。

实施例

本文描述的实施例将本发明的组合物和方法应用于从微生物组样品中扩增DNA序列。通过裂解靶微生物组中的细胞来生成DNA，然后将所得的DNA用作靶向存在于所有细菌和古菌中的16S rRNA基因的PCR扩增中的模板。可以使用微生物的16S rRNA基因序列来鉴定微生物，该序列在大多数(即便不是全部)细菌和古菌中稍有不同。16S基因序列的变异意指细菌和古菌的个别物种在16S rRNA基因中具有特征性DNA变异，作为该物种的标识符或指纹。从Shoreline Biome(Farmington，CT)可获得的试剂盒、方案和软件能够使用在16SrRNA和23S rRNA基因两者中设计的扩增子，对样品中的微生物进行全面的指纹识别，并且同时以高分辨率一次对许多样品进行16S rRNA分析。测序后，可通过将16S基因的DNA序列映射到已知读段的数据库中来鉴定已知微生物。未知微生物将包含与数据库中任何微生物均不同的16S DNA序列，但可以使用其独特的16S序列进行追踪。另外，样品中对于每种微生物获得的读段数量可以揭示样品中每种微生物的相对丰度。相对丰度可以是每种个体微生物组的状态的重要指标。改变微生物的相对丰度或完全遗漏某些微生物的裂解或PCR技术可能导致错误地表征正在研究的微生物组的状态的测序结果。如所描述的，本发明是用于从样品中获得各种各样微生物的正确相对丰度的改进方法。

具体步骤:

步骤1.Shoreline Biome DNA制备试剂盒：

内容物：

1.特异性PCR引物，例如16S扩增子(V1V3)-其他扩增子包括V3V4、V4-V5、V1V9、V1V9-EXT(整个V1V9以及邻近的内部转录间隔区(ITS)和23S基因的部分或全部)

a.正向特异性引物序列(粗体的非特异性尾，带下划线的V1 16S基因特异性序列，16种引物的混合物，其中Y＝C或T、R＝A或G)

b.

c.反向特异性引物序列(粗体的非特异性尾，带下划线的V3 16S基因特异性序列，8种引物的混合物，其中Y＝C或T、R＝A或G)

d.

2.非特异性引物序列

a.正向非特异性引物序列-(粗体)

b.反向非特异性引物序列

3.聚合酶、dNTP混合物

4.由排泄物的微生物组制备的基因组DNA

a.DNA的许多可能来源，包括皮肤、口腔或其他身体部位，环境来源包括土壤、水或空气(例如，来自过滤器)、组织、动物或植物，或其他携带微生物或微生物群落的样品或其他感兴趣的样品。

b.使用Shoreline Biome DNA制备方法制备(但其他制备方法是本领域已知的或可商购的，包括来自Qiagen/MoBio(德国镇，马里兰州)、Epicenter(麦迪逊，威斯康星州)、Zymo(尔湾，加利福尼亚州)以及其他，或来自Zymo，ATCC(Manassas，维吉尼亚州)的纯化的微生物组DNA以及其他)。

步骤2.PCR方案的步骤：

1.制备20ul PCR混合物

a.72 nM特异性引物混合物，正向和反向引物

b.150nM非特异性引物，正向和反向

c.1单位Taq聚合酶

d.10mM Tris-HCl,pH 8.3

e.50mM KCl

f.1.5mM MgCl2

g.10ng排泄物的微生物组基因组DNA

h.H2O至20ul最终体积

2.热循环方案：

3.将2微升的3个独立反应负载到1X TBE中的0.8％琼脂糖凝胶上，并且在100V下电泳60分钟。每个包含特异性引物的反应均产生了预期的700个碱基对的条带，而单独非特异性引物未产生产物(见图3)。

本文描述的实施例将本发明的组合物和方法应用于DNA序列的扩增。16S引物可用于微生物组研究，由于它们作为通用引物，可检测复杂样品中的大多数细菌。此属性还使得检测由于引物耗尽而引起的特异性扩增偏倚同时保持样品的复杂性变得困难。为了克服这些问题，开发了一种模型用作微生物组样品的代表性实例，并且表明，如本实例中所描述的，如果将非特异性引物添加到PCR反应中，则可以用非常有限的特异性引物进行扩增。使用8-生物体模拟微生物组群落和额外的生物体(青春双歧杆菌)来代表微生物组样品。之所以特别选择青春双歧杆菌，是因为它不被V1V3引物扩增，并且因此可以用于通过限制其特异性引物的量检测扩增。

具体步骤:

步骤1.Shoreline Biome DNA制备试剂盒：

内容物：

5.特异性PCR引物，例如16S扩增子(V1V3)-其他扩增子包括V3V4、V4-V5、V1V9、V1V9-EXT(整个V1V9以及邻近的内部转录间隔区(ITS)和23S基因的部分或全部)

a.正向特异性引物序列(粗体的非特异性尾，带下划线的V1 16S基因特异性序列，16种引物的混合物，其中Y＝C或T、R＝

A或G)

b.

c.反向特异性引物序列(粗体的非特异性尾，带下划线的V3 16S基因特异性序列，8种引物的混合物，其中Y＝C或T、R＝A或G)

d.

6.非特异性引物序列

a.正向非特异性引物序列-(粗体)

b.反向非特异性引物序列

7.双歧特异性引物

a.正向Bifido特异性引物序列

5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATATGCGCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGATTCTGGCTCAGGATGAACGC-3’

b.反向双歧特异性引物序列

5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCTGATAGGACGCGACCCCAT-3’

8.聚合酶、dNTP混合物

9.来自10-生物体模拟微生物组群落和青春双歧杆菌的DNA步骤2.PCR方案的步骤：

4.制备20ul PCR混合物

a.600nM V1V3特异性引物混合物，正向和反向引物

b.400nM非特异性引物，正向和反向

c.1-500nM双歧特异性引物混合物，正向和反向

d.1单位Taq聚合酶

e.10mM Tris-HCl,pH 8.3

f.50mM KCl

g.1.5mM MgCl2

h.10ng模拟群落DNA

i.1ng双歧DNA

j.H2O至20ul最终体积

5.热循环方案：

已经描述了本发明的一种或多种实施方式。然而，将理解可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种修改。因此，其他实施方式在所附权利要求的范围内。

参考文献

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Claims (14)

1.一种用于确定样品中靶DNA序列比率的多引物测定法，包括：

(a)在单一容器中使所述样品与多种寡核苷酸引物接触，其中，所述多种寡核苷酸引物包括：

(i)一组或多组正向和反向特异性引物，所述一组或多组正向和反向特异性引物具有被设计为不与所述样品中的DNA序列退火的非特异性核苷酸序列，所述非特异性核苷酸序列连接至与靶DNA序列的特异性连续碱基序列互补的特异性核苷酸序列；以及

(ii)一组或多组正向和反向非特异性引物，所述一组或多组正向和反向非特异性引物具有与(i)中所述非特异性核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(b)在所述容器中进行最少三轮的多引物扩增反应，其中，所述非特异性引物的组直到第三轮所述扩增反应才参与所述扩增反应；以及

(c)检测对应于所述靶DNA序列的扩增产物的存在，其中，所述扩增产物的比率反映所述样品中所述靶DNA序列的比率。

2.根据权利要求1所述的测定法，其中，所述一组或多组正向和反向特异性引物还包括在所述非特异性核苷酸序列和所述特异性核苷酸序列之间的接头序列。

3.根据权利要求2所述的测定法，其中，所述接头序列具有约5至约25个核苷酸的长度。

4.根据权利要求3所述的测定法，其中，所述接头序列包括唯一的DNA条形码序列以鉴定所述样品。

5.根据权利要求1所述的测定法，其中，所述靶序列包括选自由以下组成的组的基因的序列：16S rRNA、23S rRNA、18S rRNA、ITS1、ITS2、HSP65、rpoB、recA、内部转录间隔区(ITS)、人HLA、微生物毒素产生基因、微生物致病性基因、微生物质粒基因、人免疫系统基因、免疫系统组件、核糖体RNA基因以及其他非人生物体的可变基因区。

6.根据权利要求5所述的测定法，其中，所述16S rRNA靶序列包括选自由以下组成的组的区：V1V3、V3V4、V4-V5和V1V9。

7.根据权利要求1所述的测定法，其中，所述靶序列包括区V1V9-EXT，所述区V1V9-EXT由以下组成：16S rRNA基因的V1V9区的部分或全部以及相邻的(i)内部转录间隔基区基因和(ii)23S基因的部分或全部。

8.根据权利要求1所述的测定法，其中，所述正向特异性引物具有以下核苷酸序列：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATATGCGCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGRGTTYGATYCTGGCTYAG，其中，Y是C或T，并且R是A或G。

9.根据权利要求1所述的测定法，其中，所述反向特异性引物具有以下核苷酸序列CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTYACCGCRRCTGCTGGCAC，其中，Y是C或T，并且R是A或G。

10.根据权利要求1所述的测定法，其中，所述正向非特异性引物具有以下核苷酸序列：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATATGCGCACACTCTTTCCCTACACGA。

11.根据权利要求1所述的测定法，其中，所述反向非特异性引物具有以下核苷酸序列：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTC。

12.根据权利要求1所述的测定法，其中，所述样品中的所述靶DNA源自选自由以下组成的组的来源：排泄物、细胞裂解物、组织、血液、肿瘤、舌头、牙齿、颊粘膜拭子、痰、粘液、伤口拭子、皮肤拭子、阴道拭子或最初从人、动物、植物或环境样品中获得的任何其他生物材料、组织或流体，包括原始样品、复杂样品、混合物和微生物组样品。

13.根据权利要求1所述的测定法，其中，所述靶DNA源自选自由以下组成的组的生物体：孢子、生物膜、多细胞生物体、单细胞生物体、原核生物、真核生物、微生物、细菌、古菌、原生动物、藻类、真菌和病毒。

14.核酸扩增引物，由以下通式表示：5'-A-B-C-3'，其中，A表示不与靶核酸退火的具有约15至约100个核苷酸长度的非特异性核苷酸序列，B表示具有约5至约30个核苷酸长度的接头核苷酸序列，以及C表示与模板核酸的特异性连续碱基序列互补的具有约10至约30个核苷酸长度的核苷酸序列。

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