KR102438915B1 - 표적 염기 배열을 검출하는 방법 프로브를 설계 및 제조하는 방법 및 키트 - Google Patents

표적 염기 배열을 검출하는 방법 프로브를 설계 및 제조하는 방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

핵산 시료 중에 표적 염기 서열이 존재하는지 여부를 용이하게 판단 가능하게 할 수 있는, 표적 염기 서열을 검출하는 방법 등을 제공하는 것을 과제로 한다. 형광 표지 검출 프로브와 경합 프로브와를 핵산 시료에 첨가하여 시료 중의 핵산과 하이브리다이즈시켜, 반응 시료의 온도를 변화시키면서 형광 강도를 측정하여 온도 - 형광 강도 곡선을 1차 미분한다. 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브의 염기 길이, 염기 서열, 핵산 시료의 첨가량은 표적 염기 서열을 포함하는 대조 표적 핵산 시료 및 비표적 염기 서열을 포함하는 대조 비표적 핵산 시료의 각각에, 형광 표지 검출 프로브와 경합 프로브을 가하여 얻어진 대조 표적 반응 시료 및 대조 비표적 반응 시료의 각각의 온도를 변화시키면서 형광 강도를 측정하여 온도 - 형광 강도 곡선을 1차 미분하면 대조 표적 반응 시료의 1차 미분 곡선이 피크를 가지나, 대조 비표적 반응 시료의 1차 미분 곡선이 피크를 실질적으로 가지지 않도록 결정된다.

Description

표적 염기 배열을 검출하는 방법 프로브를 설계 및 제조하는 방법 및 키트
본 발명은, 표적 염기 배열을 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 예를 들면, 단염기 다형성(SNP : single nucleotide polymorphism) 등의 단일 염기 변이를 포함하는 표적 염기 배열을 검출하는 방법, 해당 방법에 사용하기 위한 프로브의 설계 방법 및 제조 방법, 및 상기 프로브를 포함하는 키트에 관한 것이다.
SNP로는, 개체 간에 있어서 게놈 배열 중의 하나의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 옮겨져 있는 변이이며, 개체의 집단 전체의 1%를 넘는 빈도로 존재하는 변이를 말한다. SNP에는 체질·질환 감수성·약제 응답성 등의 다양한 표현형의 개체 차의 원인이 되는 것이 존재한다. 예를 들면, 인간의 알코올 분해 능력은 ALDH2 유전자의 SNP에 의존하고 있음이 알려져 있으며, 약물 대사에 관련하는 CYP패밀리에 있는 SNP는, 개개인에 대한 약제의 효과에 기여하는 것도 알고 있다. 또한, 최근, 암의 수술 후 경과 및 치료 효과를 예측하는 바이오 마커로서 특정 SNP가 보고되었고, SNP를 판별하는 것의 유용성은 높다. 또한, SNP를 판별하는 것에 이용되는 1 염기의 차이를 판별하는 기술은, SNP에 한정되지 않고, 단일 염기 치환에 의한 돌연변이(점 돌연변이)을 포함하는 염기 배열의 판별에도 효과적으로 활용할 수 있어, 존재 빈도가 1% 미만과 같은 약물 내성 병원균의 검출에도 응용할 수 있다. 때문에 염기 배열 간의 1 염기의 차이를 쉽게 동정할 수 있는 기법의 수요가 높아진다고 예측된다.
SNP의 간편한 판별법으로서, 프로브 검출법이 알려져 있다. 프로브 검출법은, 검출 대상의 염기 배열에 상보적인 염기 배열을 가진 검출 프로브를 하이브리다이즈시킨 완전 일치의 이중 사슬의 Tm 값이, 검출 대상의 염기 배열과 1 염기 다른 염기 배열의 핵산에 상기 검출 프로브를 하이 브리다이즈시킨 1 염기 불일치의 이중 사슬의 Tm 값 보다도 5℃ 정도 높은 것을 이용하여, Tm 값의 차이에 의한 염기 배열을 판별하는 방법이다. Tm 값은 검출 대상 염기배열의 염기조성, 반응시료의 염농도 등의 조건에 따라 변동하고, 이러한 조건이 노이즈가 되어 안정된 측정 결과를 얻기 어려운 경우가 있다. 따라서, 이러한 노이즈를 저감하는 궁리가 고안되고 있다.
예를 들면, 특허 문헌 1에는, 표적 핵산의 단일 염기 변이 부위를 포함하는 영역의 3'말단 측 및 5'말단 측의, 한편으로, 「검출형 프로브」의 일부 영역을 하이브리다이즈시키고, 다른 한쪽에, 검출형 프로브와 단일 염기 변이 부위 이외에서 부분적으로 일치하는 염기 배열을 가진 「부분 경합형 프로브」의 일부 영역을 하이브리다이즈하여, 단일 염기 변이 부위를 포함하는 영역에서 검출형 프로브와 부분 경합형 프로브와 나머지의 영역들을 경합시키는 방법, 즉, 검출형 프로브와 부분 경합형 프로브의 모두와도 표적 핵산 중 각각 대응하는 영역에 하이브리다이즈할 수 있지만, 이 모두의 프로브가 단일 염기 변이 부위를 포함하는 영역에서 서로 경합하는 수법이 개시되어 있다. 이 수법에서는, 경합 부분인 「단일 염기 변이 부위를 포함하는 영역」에 있어서의 변이 식별력이 올라가는 것과 동시에, 1 염기 불일치의 하이브리다이즈의 안정도를 낮출 수 있어, 완전 매치의 경우와의 Tm 값의 차이에 의한 판별의 정밀도를 높일 수 있다.
특허 제 5597939 호
그러나, 특허문헌 1에 기재의 수법은, 핵산 시료에 포함된 염기 배열이 검출 프로브의 염기 배열에 완전히 일치인지 1 염기 불일치인지, Tm 값의 차이에 의해 판별하는 것에 변함이 없다. 본 발명자들은, Tm 값의 차이에 의한 판별법에는, 염 농도 등의 실험 조건, 시료 유래의 협잡물, 조합 오차 등에 의해 오판정이 발생할 수 있으며, 오판정을 방지하고 단일 염기 치환의 유무의 판단을 쉽게한다는 관점에서, 개선의 여지가 있음을 발견하였다.
특허문헌 1에서도 채용되고 있는대로, Tm 값의 측정에는, 예를 들면, QP (Quenching 프로브/Primer)법 등의, 검출 프로브를 표지한 형광 색소의, 핵산과 검출 프로브와의 하이브리다이즈 또는 해리에 동반하는 소광 또는 발광을 검출하는 방법이 이용되고 있다. 이러한 방법에는, 핵산 시료에 검출 프로브를 첨가한 반응 시료의 온도를 변화시키면서 형광 강도를 측정하여, 측정 결과에서 얻어진 온도 - 형광 강도 곡선을 1차 미분한 곡선이 가지는 피크(극대값)(소광 또는 발광이 일어나는 온도에 해당)를 Tm 값으로 한다. 이 Tm 값의 차이에 의해 SNP를 판별하는 수법에는, 측정된 Tm 값이 고온 측인지 저온 측인지를 판정하는 것이 필요하며, 오차 등에 따라 판정이 곤란하게 되거나 오판정을 부를 가능성이 있다.
또한, 예를 들면 SNP의 판별의 표적으로 하는 핵산이, SNP의 2개의 대립 유전자의 헤테로 접합체인 경우에는, 고온 측의 Tm 값과 저온 측의 Tm 값 사이의 온도에서 소광 또는 발광 피크가 나타나는 경우가 있다. 이러한 경우에는 측정 결과의 Tm 값과 고온 측 또는 저온 측의 Tm 값과의 차이가, 예를 들면 2℃ 정도로 작아지게 되며, 판별이 곤란하다.
따라서, 본 발명은, 핵산 시료 중에 표적 염기 배열이 존재하는지 여부를 용이하게 판단 가능할 수 있는, 표적 염기 배열을 검출하는 방법, 해당 방법에 사용되는 키트, 및, 해당 방법에 사용되는 프로브를 설계 및 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 예의 연구를 계속하는 가운데, 1 염기 불일치의 염기 배열에 특이적으로 하이브리다이즈하는 경합 프로브를 사용하여, 검출 프로브의 1 염기 불일치의 하이브리다이즈를 저해하는 것으로, 저온 측의 Tm 값에서 소광 또는 발광을 발생하지 않도록 하여, 표적 염기 배열만 검출할 수 있는 검출계를 실현할 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은, 검출 프로브와 핵산과의 하이브리다이즈의 반응 시료에 대해 얻어지는 온도 - 형광 강도 곡선을 1차 미분하면, 보통은 Tm 값의 온도에서 소광 또는 발광에 따라 1차 미분 곡선의 피크가 나타나는 곳, 검출 프로브의 1 염기 불일치의 하이브리다이즈를 저해하는 것으로, 그 피크가 나타나지 않게 하고, 표적 염기 배열의 검출에 의한 피크가 나타나는 경우와 명확하게 판별할 수있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 다음의 사항에 관한 것이다.
[1] 핵산 시료로부터, 염기 변이 뉴클레오티드를 포함하는 표적 염기 배열(A)를 검출하는 방법으로서, 해당 방법은 이하의 단계:
(1) 핵산 시료에, QP(Quenching 프로브/Primer) 법에 사용 가능한 형광 색소로 표지된 검출 프로브와, 경합 프로브를 가하여, 반응 시료를 얻는 것, 이에 따라, 반응 시료 중의 표적 염기 배열(A)를 가지는 표적 핵산에, 형광 표지 검출 프로브 또는 경합 프로브가 하이브리다이즈한다;
(2) 반응 시료의 온도를 변화시키면서 형광 강도를 측정하는 것; 및
(3) (2)의 측정 결과로부터 얻어진 온도 - 형광 강도 곡선을 1차 미분하는 것을 포함하고,
여기에서,
(i) 형광 표지 검출 프로브의 염기 배열은, 표적 염기 배열(A)에 상보적인 염기 배열(A')를 포함하고,
(ii) 경합 프로브의 염기 배열은, 염기 변이 뉴클레오티드가 염기 미변이 뉴클레오티드에 옮겨져 있는 이외는 표적 염기 배열(A)와 동일한 염기 배열인 비표적 염기 배열(B)에 상보적인 염기 배열(B')를 포함하고,
(iii) 형광 신호 검출 프로브 및 경합 프로브 각각의 염기 길이 및 염기 배열 및 핵산 시료에의 첨가량은, 이하의 순서:
(a) 표적 핵산은 포함되어 있으나, 비표적 염기 배열(B)를 가지는 비표적 핵산은 실질적으로 포함되어 있지 않은 대조 표적 핵산 시료, 및 표적 핵산은 실질적으로 포함되지 않지만, 비표적 핵산은 포함되어 있는 대조 비표적 핵산 시료의 각각에, 형광 표지 검출 프로브와 경합 프로브을 가하여, 대조 표적 반응 시료 및 대조 비표적 반응 시료를 얻는 것;
(b) 각 대조 반응 시료의 온도를 변화시키면서 형광 강도를 측정하는 것; 및
(c) 측정 결과로부터 얻어진 온도 - 형광 강도 곡선을 각각 1차 미분하는 것에 따르면, 대조 표적 반응 시료의 1차 미분 곡선이 피크(극대값)를 가지나, 대조 비표적 반응 시료의 1차 미분 곡선이 피크를 실질적으로 가지지 않도록, 결정되어 있는 것을 특징으로 하는 상기의 방법.
[2] 이하의 단계:
(4) (3)에서 얻어진 1차 미분 곡선이 피크를 가지는 경우, 핵산 시료 중에 표적 염기 배열(A)가 존재하는 것으로 판단하는 것을 더 포함하고,
여기에서, 핵산 시료가 표적 핵산의 외에, 비표적 핵산도 포함할 수 있는 [1]에 기재의 방법.
[3] 비표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 적어도 5℃ 높고,
표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 낮은, [1] 또는 [2]에 기재의 방법.
[4] 비표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 적어도 10℃ 높고, 표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 낮은, [1] 또는 [2]에 기재의 방법.
[5] 비표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 적어도 10℃ 높고, 표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값 + 5℃를 초과하지 않는, [1] 또는 [2]에 기재의 방법.
[6] 비표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 적어도 15℃ 높고, 표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값 + 5℃를 초과하지 않는, [1] 또는 [2]에 기재의 방법.
[7] 비표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 적어도 15℃ 높고, 표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 낮은, [1] 또는 [2]에 기재의 방법.
[8] (I) 표적 핵산 상의, 형광 표지 검출 프로브와 하이브리다이즈하는 영역이, 경합 프로브와 하이브리다이즈하는 영역을 포함하거나; (II) 표적 핵산 상의, 경합 프로브와 하이브리다이즈하는 영역이, 형광 표지 검출 프로브와 하이브리다이즈하는 영역을 포함하거나; 또는 (III) 표적 핵산 상의, 경합 프로브와 하이브리다이즈하는 영역이, 형광 표지 검출 프로브와 하이브리다이즈하는 영역과 일치하는, [1] 내지 [7]의 어느 하나에 기재의 방법.
[9] 핵산 시료에의 경합 프로브의 첨가량이, 형광 표지 검출 프로브의 첨가량의 적어도 10 배(몰비)인, [1] 내지 [8]의 어느 하나에 기재의 방법.
[10] 핵산 시료에의 경합 프로브의 첨가량이, 형광 표지 검출 프로브의 첨가량의 적어도 20 배(몰비)인, [1] 내지 [9]의 어느 하나에 기재의 방법.
[11] QP(Quenching 프로브/Primer) 법에 사용 가능한 형광 색소가, TAMRA(상표), BODIPY(등록 상표) FL, PACIFIC BLUE(상표) 및 CR6G(등록 상표)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 종의 형광 색소인, [1] 내지 [10]의 어느 하나에 기재의 방법.
[12] 핵산 시료가 생체에 유래하는, [1] 내지 [11]의 어느 하나에 기재의 방법.
[13] 염기 변이 뉴클레오티드가, 단일 염기 치환의 변이를 포함하는 DNA인, [1] 내지 [12]의 어느 하나에 기재의 방법.
[14] [1] 내지 [13]의 어느 하나에 기재의 방법에 사용 가능한 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브를 설계하는 방법으로서, 해당 방법은,
(1') (a) ~ (c)에 따라, 대조 표적 반응 시료의 1차 미분 곡선이 피크(최대 값)을 가지는, 반면 비표적 반응 시료의 1차 미분 곡선이 피크를 실질적으로 가지지 않도록, 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브 각각의 염기 길이 및 염기 배열을 결정하는 것을 포함하는 상기 방법.
[15] [1] 내지 [13]의 어느 하나에 기재의 방법에 사용 가능한 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브를 제조하는 방법으로서, 해당 방법은,
(1") 제14항에 기재된 방법에 따라 설계된 각각의 염기 길이 및 염기 배열의 올리고 뉴클레오티드를 합성하는 것; 및
(2") 형광 표지 검출 프로브의 올리고 뉴클레오티드를, QP법에 사용 가능한 형광 색소로 표지하는 것을 포함하는 상기 방법.
[16] [1] 내지 [13]의 어느 하나에 기재의 방법에서 사용될 수 있는 키트이며, 형광 표지 검출 프로브 경합 프로브 및 사용 설명서를 포함하는 상기 키트.
본 발명에 따르면, 검출을 피하고 싶은 1 염기 불일치의 비표적 염기 배열이 존재하는 경우에, 이의 비표적 염기 배열에 대하여 특이적인 경합 프로브를 하이브리다이즈시켜, 형광 표지 검출 프로브의 1 염기 불일치의 하이브리다이즈를 발생하지 않도록 함으로써, 온도 - 형광 강도의 측정 결과에, 표적 염기 배열을 검출했을 때에만 소광 또는 발광 피크가 나타나게 할 수 있다. 따라서, Tm 값의 차이를 이용한 판별 수법과는 달리, 소광 또는 발광 피크의 유무에 의해 표적 염기 배열의 유무를 알 수 있기 때문에, Tm 값에 영향을 미치는 염농도 등의 조건에 영향을 받지 않고(높은 로버스트성), 핵산 시료 중에 표적 염기 배열이 존재하는지 여부를 용이하게 판단 가능할 수 있다.
[도 1] 도 1은, 실시예 1에 있어서, rpoB 유전자의 516 번째 코돈의 점 돌연변이 (야생형, 변이형 및 야생형/변이형 헤테로)를 포함하는 핵산 시료에, 야생형(rpoB 516Asp)을 검출하기 위한 검출 프로브 및 경합 프로브를 첨가하여 측정한 온도 - 형광 강도 곡선의 1차 미분 곡선(열 해리 곡선)을 나타낸다.
[도 2] 도 2는, 실시예 2에 있어서, rpoB 유전자로부터 증폭시킨 표적 핵산 및 비표적 핵산, 및 표적 핵산의 검출을 위해 설계한 형광 표지 검출 프로브 및 다양한 경합 프로브의 염기 배열을 나타낸다.
[도 3a] 도 3a은, 실시예 2에 있어서, 각 반응 시료에 대해 얻어진 온도 - 형광 강도 곡선을 나타낸다.
[도 3b] 도 3b은, 실시예 2에서 얻어진 온도 - 형광 강도 곡선을 1차 미분하여 얻은 곡선을 나타낸다.
[도 4a] 도 4a은, 실시예 3에 있어서, rpoB 유전자로부터 증폭시킨 표적 핵산 및 비표적 핵산의 염기 배열을 나타낸다.
[도 4b] 도 4b는, 실시예 3에 있어서, 표적 핵산의 검출을 위해 설계한 형광 표지 검출 프로브 및 다양한 경합 프로브의 염기 배열, 각 프로브가 표적 핵산 및 비표적 핵산의 각각과 하이브리다이즈한 Tm 값, 및 표적 핵산 및 비표적 핵산의 각각에 대한 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값에서 각 경합 프로브의 Tm 값을 뺀 값, 및, 각 경우의 온도 - 형광 강도 곡선의 1차 미분 곡선의 소광 피크의 유무를 나타낸다.
[도 4c] 도 4c은, 실시예 3에 있어서, 표적 핵산의 검출을 위해 설계한 형광 표지 검출 프로브 및 다양한 경합 프로브의 표적 핵산 및 비표적 핵산의 각각과 하이브리다이즈한 Tm 값을 나타낸다.
[도 5] 도 5는, 실시예 3에서 얻어진 온도 - 형광 강도 곡선을 1차 미분하여 얻은 곡선을 나타낸다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
또한, 본 명세서에 있어서, 용어 SNP는, 당해 기술 분야에서 SNPs와 동의어로 사용한다. 나아가, 본 명세서에 있어서, 용어 SNP가 사용되어 설명된 사항에 대해서는, 기본적으로는, 「SNP」을 「단일 염기 치환의 변이를 포함하는 DNA」로 대체해도, 동일의 설명이 이루어진다. 즉, 이하의 설명에 있어서, SNP는 검출의 대상의 일례이며, 본 발명은, 단일 염기 치환의 변이를 포함하는 DNA를 검출하는 기술에 널리 적용될 수 있다.
본 명세서 중에 별기하지 않는 한, 본 발명에 대해 사용되는 과학적 및 기술적 용어는, 당업자에게 일반적으로 이해되는 의미를 가지는 것으로 한다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 분자 생물학, 미생물학, 유전자 및 단백질 및 핵산 화학에 관하여 사용되는 용어 및 기술은 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것으로 한다. 본 명세서 중에 참조된 모든 특허출원 및 기타 간행물은 그 전체를 참조하는 것에 의해 본 명세서에 통합된다.
<검출 방법>
본 발명에 따른 검출 방법은, 이하의 단계 (1) ~ (3)을 적어도 포함하는 핵산 시료로부터, 염기 변이 뉴클레오티드를 포함하는 표적 염기 배열(A)를 검출하는 방법이다.
(1) 핵산 시료에, 형광 표지 검출 프로브와, 경합 프로브을 가하여, 반응 시료를 얻는 것, 이에 따라, 반응 시료 중의 표적 염기 배열을 가지는 표적 핵산에, 형광 표지 검출 프로브 또는 경합 프로브가 하이브리다이즈한다;
(2) 반응 시료의 온도를 변화시키면서 형광 강도를 측정하는 것; 및
(3) (2)의 측정 결과로부터 얻어진 온도 - 형광 강도 곡선을 1차 미분하는 것.
본 명세서에 있어서, 「표적 염기 배열을 검출한다」로는, 핵산 시료 중에 포함되어 있는 핵산의 염기 배열이, 표적 염기 배열과 동일한 염기 배열을 포함하는지 여부를 판별하는 것을 말한다.
핵산은, DNA 또는 RNA이면 특히 한정되지 않으며, 천연의 것으로서도 합성 된 것이라도 좋다. 천연 핵산으로는, 예를 들면, 생물로부터 회수된 게놈 DNA, mRNA, rRNA, 헤테로 핵(hn) RNA 등이 있다. 또한, 합성된 핵산으로는, 예를 들면, β - 시아노에틸포스포로아미다이트법, DNA 고상 합성법 등의 공지의 화학적 합성법으로 합성된 DNA나 PCR 등의 공지의 핵산 합성법으로 합성된 핵산, 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA 등이 있다.
본 명세서에 있어서, 표적 염기 배열을 포함하는 염기 배열을 가지는 핵산을, 「표적 핵산」이라고 한다.
「핵산 시료」는 핵산을 함유하는 시료라면, 특히 한정되는 것이 아니나, 동물, 식물, 미생물, 배양 세포 등으로부터 핵산을 추출한 샘플인 것이 바람직하다. 동물 등으로부터 핵산의 추출은, 예를 들면, 페놀/클로로포름 법 등의 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 핵산 시료는, 생체에 유래하는 것이면 좋다. 여기에서 핵산 시료가 「생체에 유래한다」로는, 핵산 시료가 생체로부터 채취된 시료 자체라는 의미에 한정되지 않고 생체에서 채취된 시료에서 출발만 하면 좋고, 예를 들면, 핵산 추출 후에 증폭되거나, 복제되거나, 다른 염기 배열 중에 편입되거나, 유전 공학적인 조작을 받은 것인 경우도 포함한다. 예를 들면, 증폭 후의 핵산이나, 복제 된 핵산 등도, 「생체에 유래한 핵산 시료」에 포함된다. 생체에서 유래 핵산 시료에 대하여 본 발명의 방법을 적용하는 것으로, 그 생체에 대한 유전자 진단에 도움을 줄 수 있다.
또한, 핵산 시료 중에 함유된 핵산이, 이중 가닥 핵산인 경우, 미리 단일 가닥 핵산하여 두는 것이 바람직하다. 단일 가닥 핵산을 이용하는 것에 의해, 후술하는 단계 (1)에서, 상기 단일 가닥 핵산에, 검출 프로브 또는 경합 프로브를 하이브리다이즈시킬 수있다. 추출된 이중 가닥 핵산의 단일 가닥화는 열에너지를 추가 등의 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다.
「하이브리다이즈」로는, 단일 가닥 핵산끼리(예를 들면 열처리에 의해 단일 가닥화한 검출 대상의 DNA와 프로브와) 상보적인 염기쌍을 형성하고 결합하여 이중 가닥이 되는 것을 말한다. 본 명세서에 있어서,「하이브리다이즈」에는, 하나의 염기 배열에 대해서 완전하게 상보적인 염기 배열이 하이브리다이즈한 경우, 및, 하나의 염기 배열과 다른 염기 배열 사이에서, 예를 들면, 1 ~ 수 염기쌍, 상보적인 염기쌍을 형성할 수 없는 부분(불일치 부분)이 있어도, 상보성을 가지는 부분끼리 염기쌍을 형성함으로써 배열 전체로서는 하이브리다이즈한 경우가 포함된다. 본 명세서에서는 하나의 염기 배열에 대해서 완전하게 상보적인 염기 배열이 하이브리다이즈한 것을 「완전 일치의 하이브리다이즈」「특이적으로 하이브리다이즈한다」라고 표현하고, 불일치를 포함하는 경우를 「불일치의 하이브리다이즈」「비특이적으로 하이브리다이즈」라고 표현할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「염기 변이 뉴클레오티드」, 「염기 미변이 뉴클레오티드」의 염기의 상위 부위로는, 예를 들면, SNP, 삽입 변이, 결실 변이, 반복 배열 변이에 의한 변이 부위를 들 수 있다.
일반적으로, 이러한 상위 부위는, SNP의 변이 부위이며, 「염기 변이 뉴클레오티드」및 「염기 미변이 뉴클레오티드」는, 각각 1개의 뉴클레오티드이다. 그러나, 예를 들면, 염기 변이가 1 염기의 결실 변이인 경우, 결실 부위를 끼운 연속 2 염기를 「염기 변이 뉴클레오티드」로 하며, 결실을 포함하지 않는 연속 3 염기를 「염기 미변이 뉴클레오티드」로서 본 발명을 적용하는 것도 가능하다. 또한, 예를 들면, 염기 변이가 1 염기의 삽입 변이인 경우, 삽입된 뉴클레오티드와 그 양옆으로 연속하는 뉴클레오티드의 합계 3 염기을 「염기 변이 뉴클레오티드」로 하며, 삽입을 포함하지 않는 연속 2 염기을 「염기 미변이 뉴클레오티드」로 하여, 본 발명을 적용하는 것도 가능하다. 결실 염기 수 또는 삽입 염기 수가 2 염기 이상 이어도 좋다. 즉, 본원에 첨부된 특허 청구 범위에 있어서의 「염기 변이 뉴클레오티드가 염기 미변이 뉴클레오티드로 대체하고 있다」라는 기재는 「염기 변이 뉴클레오티드」 및 「염기 미변이 뉴클레오티드」가 각각 연속하는 수 개의 뉴클레오티드로 있는 같은 경우도 포함한다.
본 발명에 있어서, 「염기 변이 뉴클레오티드」와 「염기 미변이 뉴클레오티드」와의 관계는, 예를 들면, SNP 등의 대립 유전자 (Allele, 대립 유전자)의 야생형과 변이형과의 서로 다른 염기의 상대적인 관계에 있다고 할 수 있다. 따라서, 일반적으로는 「염기 변이 뉴클레오티드를 포함하는 표적 염기 배열」은, 변이형의 염기 배열이며,「염기 미변이 뉴클레오티드」를 포함하는 「비표적 염기 배열」은, 야생형의 염기 배열이나, 이와는 반대로, 「염기 변이 뉴클레오티드를 포함하는 표적 염기 배열」을 야생형의 염기 배열로 간주하는 것과 동시에, 「염기 미변이 뉴클레오티드」를 포함하는「비표적 염기 배열」을 변이형 염기 배열이라고 봐도 좋다. 후자의 예를, 후술하는 실시예 1 및 2에서 설명한다. 즉, 본 명세서의 「염기 변이 뉴클레오티드」라는 용어에서 「변이」, 「미변이」는, 반드시 그 뉴클레오티드가 변이형의 것인지의 여부를 의미하는 것이 아니라, 본 방법의 검출 대상과 하지 않는 비표적 염기 배열 중의 SNP 부위(검출에 관한 단일 염기 치환에 의한 변이가 생길 부위)의 염기를 기준으로 하여, 다른 염기인지 여부를 의미한다.
본 명세서 중에 있어서, 「표적 염기 배열」로는, 목적의 염기 변이 뉴클레오티드를 포함하는 핵산(표적 핵산)의 염기 배열 중의, 염기 변이 뉴클레오티드를 함유하는 일정한 길이의 부분 배열을 말한다. 표적 염기 배열의 길이는, 그 부분 배열에 상보적인 염기 배열을 가지는 동일한 길이의 프로브가 스트린젠트 조건 하에서 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 것이면 특히 한정되는 것은 아니다. 또한, 표적 염기 배열의 길이는 표적 염기 배열의 종류, 후술하는 검출 프로브 및 경합 프로브의 염기 배열 등을 고려하여 적절히 결정할 수 있다.
본 명세서 중에 있어서, 「비표적 염기 배열」은, 염기 변이 뉴클레오티드가 염기 미변이 뉴클레오티드로 옮겨져 있는 이외는 표적 염기 배열과 동일한 염기 배열을 말한다. 이러한 비표적 염기 배열은, 검출 대상이 아님에도 불구하고, 검출 대상의 표적 염기 배열과 유사하기 때문에, 표적 염기 배열에 상보적인 염기 배열을 가지는 검출 프로브와 비특이적 하이브리다이즈할 수 있다. 따라서, 기존의 프로브법은 표적 염기 배열 이외에 비표적 염기 배열도, 검출 프로브와의 하이브리다이제이션에 의해 검출될 수 있으며, 검출된 염기 배열이 비표적 염기 배열인 경우, 하이브리다이제이션의 열 안정성(Tm 값)이 표적 염기 배열의 경우보다도 낮은 것으로 판별되는 (구체적으로는, 이하의 실시예 2의 「검출 프로브만」 참조).
본 명세서 중에 있어서, 이의 비표적 염기 배열을 포함하는 염기 배열을 가지는 핵산을 「비표적 핵산」라고 한다.
본 명세서에서 「검출 프로브」 및 「경합 프로브」는, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 아날로그 및 이들의 수식체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상이 인산 디에스테르 결합에 의해 연결한 것이다.
여기서, 뉴클레오티드 아날로그는, 비천연의 뉴클레오티드이며, 천연 뉴클레오티드인 디옥시리보 뉴클레오타이드(DNA)나 리보 뉴클레오티드(RNA)와 유사한 기능을 가지는 것을 말한다. 즉, 뉴클레오티드 아날로그는, 뉴클레오티드와 마찬가지로 인산 디에스테르 결합에 의해 가닥을 형성할 수 있으며, 또한, 뉴클레오티드 아날로그를 이용하여 형성된 프라이머나 프로브는, 뉴클레오티드만을 이용하여 형성된 프라이머나 프로브와 마찬가지로, PCR 및 하이브리다이즈에 이용할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 아날로그로서, 예를 들면, PNA(폴리뉴클레오티드 유도체), LNA(BNA), ENA(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids) 및 이들의 복합체 등이있다. 여기서, PNA는, DNA나 RNA의 인산과 5 탄당으로 이루어진 주쇄를 폴리아미드 사슬로 대체한 것이다. 또한, LNA(BNA)는, 리보 뉴클레오시드의 2'부위의 산소 원자와 4'부위의 탄소 원자가 메틸렌을 통해 결합되어 있는 2 개의 고리 구조를 가지는 화합물이다.
여기서, 수식체로는, 예를 들면, 수식 디옥시리보 뉴클레오타이드, 수식 리보 뉴클레오타이드, 수식 포스페이트 - 당 - 골격 올리고 뉴클레오티드, 수식 PNA, 수식 LNA(BNA), 수식 ENA 등이 있다. 여기서, 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 아날로그 수식에 사용되는 물질은, 본 발명의 효과를 해치지 않는 한, 특히 한정되는 것은 아니며, 뉴클레오티드 등의 수식에 통상적으로 사용되는 물질을 사용할 수 있다. 수식 뉴클레오티드나 수식 뉴클레오티드 아날로그로는 예를 들면, 아미노기, 카르복시 바이닐기, 인산기, 메틸기 등의 관능기에 의해 수식된 뉴클레오티드 등, 메틸기에 의해 2-O-메틸화 수식된 뉴클레오티드 등, 포스포로티오에이트화 수식된 뉴클레오티드 등, 후술하는 형광 색소 등의 표지 분자에 의해 수식된 뉴클레오티드 등이 있다.
검출 프로브는, QP(Quenching 프로브/Primer) 법에 사용 가능한 형광 색소로 표지되어 있다. QP 법은, 일종의 형광 색소에, 구아닌 염기가 공간적으로 근접하는 것에 의해, 형광이 소광하는 것을 이용한 검출 방법이다. 검출 프로브를, 구아닌 염기와의 근접에 의해 소광하는 형광 색소로 표지하는 것에 의해 검출 프로브와, 표적 핵산(구아닌 염기를 포함한다)과의 근접의 유무를 검출할 수 있다. 구체적으로는, 표적 핵산에서, 내부에 구아닌 염기를 갖도록 표적 염기 배열을 설정하고, 또한, 검출 프로브는, 그 표적 핵산의 구아닌 염기와 상보적으로 되는 부위에, 형광 색소에 의해 표지되는 시토신 염기를 갖도록 미리 설계한다. 표적 핵산과, 검출 프로브가 하이브리다이즈한 경우는, 표지된 검출 프로브의 형광 색소와, 표적 핵산 중의 구아닌 염기가 근접하여 형광 색소의 소광이 일어난다.
QP 법에 사용 가능한 형광 색소로는, 예를 들면, TAMRA(상표)(인비트로젠 사제), BODIPY(등록 상표) FL(인비트로젠 사제), PACFIC BLUE(상표)(인비트로젠 사제), CR6G(등록상표)(인비트로젠 사제) 등을 들 수 있다. 각 형광 색소의 검출 프로브에의 표지는, 유기 합성 방법 등의 통상적으로 사용되는 방법으로 할 수 있다.
이하, 검출 프로브를 「형광 검출 프로브」라고도 한다.
형광 표지 검출 프로브의 염기 배열은, 표적 염기 배열(A)에 상보적인 염기 배열(A')를 포함한다. 경합 프로브의 염기 배열은, 비표적 염기 배열(즉, 염기 변이 뉴클레오티드가 염기 미변이 뉴클레오티드로 바뀌어져 있는 이외는 표적 염기 배열과 동일한 염기 배열) (B)에 상보적인 염기 배열(B')를 포함한다. 「프로브의 염기 배열」로는, 이의 프로브의, 핵산에 하이브리다이즈하는 영역의 길이의 염기 배열을 말한다. 또한, 본 명세서 중, 「표적 염기 배열(A)에 상보적인 염기 배열(A')」라는 문구에서 「상보적」은, 염기 배열(A)와 (A')가 완전하게 상보적인 관계에 있고, 염기 배열(A)와 (A')와에서 형성된 이중 가닥 부분의 모든 염기가 상보적인 것을 의미한다. 「비표적 염기 배열(B)에 상보적인 염기 배열(B')」라는 문구에서 「상보적」도 동일하게 염기 배열(B)와 (B')가 완전하게 상보적인 관계에 있는 것을 의미한다.
「형광 표지 검출 프로브의 염기 배열」이 「표적 염기 배열에 상보적인 염기 배열을 포함한다」것은, 형광 표지 검출 프로브의 염기 배열(A')이 표적 염기 배열(A)에 상보적인 경우와, 형광 표지 검출 프로브의 염기 배열(A')이 표적 핵산의 표적 염기 배열(A)를 포함하는 표적 염기 배열(A) 보다 긴 영역의 염기 배열에 상보적인 경우와를 포함한다.
「경합 프로브의 염기 배열」이 「비표적 염기 배열에 상보적인 염기 배열을 포함한다」것은, 경합 프로브의 염기 배열(B')가 비표적 염기 배열(B)에 상보적인 경우와, 경합 프로브의 염기 배열(B')가 비표적 핵산 상의 비표적 염기 배열(B)를 포함하는 비표적 염기 배열(B) 보다도 긴 영역의 염기 배열에 상보적인 경우를 포함한다.
본 발명의 검출 방법의 각 단계에 대해 설명한다.
우선, 단계 (1)에서, 반응 시료 중의 표적 염기 배열을 가지는 표적 핵산에, 형광 표지 검출 프로브 또는 경합 프로브를 하이브리다이즈시킨다. 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브 각각의 염기 길이 및 염기 배열 및 핵산 시료에의 첨가량은, 소정의 조건을 충족하도록 결정되어 있지만, 그 조건에 대해서는 후술한다. 표적 핵산과, 형광 표지 검출 프로브와, 경합 프로브와의 하이브리다이즈의 반응 조건은, 특히 한정되는 것은 아니나, 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브의 Tm 값 등을 고려한 후, 통상의 온도, pH, 염농도, 완충액 등의 조건 하에 수행할 수 있다.
여기서, Tm 값으로는, 올리고 뉴클레오티드의 50%가, 이의 상보 사슬과 분리 할 때의 온도이며, 프로브 핵산에 하이브리다이즈시켰을 때 이중 가닥의 열 안정성의 지표이다. Tm 값의 산출 방법으로는, 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들면, 17 ~ 25 염기의 프로브의 경우, 다음의 식(Wallace formula)으로 추정할 수있다.
Tm = 2 × (배열 중의 A의 수 + 배열 중의 T의 수) + 4 × (배열 중 G의 수 + 배열 중의 C의 수)
또한, 보다 정확성을 기하기 위하여, Tm 값은, 예를 들면, 종래 공지의 MELTCALC 소프트웨어(http:/www.meltcalc.com/) 등에 의해 산출 할 수 있으며, 인접법(Nearest Neighbor Method)에 의해 결정할 수도 있다.
하이브리다이즈 반응은, 완충 작용이 있는 염을 포함하는 반응 용액 중에서 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 반응 용액의 pH는 pH 6.5 ~ 8.5의 범위인 것이 바람직하고, pH 6.7 ~ 7.7의 범위인 것이 보다 바람직하고, 상기 반응 용액의 염의 농도는 5 ~ 250 mM의 범위인 것이 바람직하고, 10 ~ 100mM의 범위인 것이 보다 바람직하다. 완충 작용을 하는 염으로는 카코딜산염, 인산염, 트리스염 등을 들 수 있다. 또한, 반응 용액이 알칼리 금속 및/또는 알칼리 토금속의 염을 포함하는 것이 바람직하고, 염화나트륨 및/또는 염화 마그네슘을 포함하는 것이 보다 바람직하다.
표적 핵산에는, 우선적으로는, 표적 염기 배열에 상보적인 염기 배열을 포함하는 형광 표지 검출 프로브가 하이브리다이즈한다. 형광 표지 검출 프로브의 핵산에의 하이브리다이즈하여 형광이 소광한다. 표적 핵산에는, 어느 정도의 비율로, 경합 프로브가 하이브리다이즈하는 경우도 있다. 경합 프로브가 표적 핵산에 하이브리다이즈하는 비율은, 형광 표지 검출 프로브의 표적 핵산에의 하이브리다이즈의 비율이 충분히 많고, 그 검출이 실질적으로 방해되지 않는 정도이다.
또한, 핵산 시료 중에 비표적 염기 배열을 가지는 비표적 핵산이 존재하는 경우에는, 이 단계에서, 비표적 핵산에 경합 프로브가 우선적으로 하이브리다이즈한다. 그 결과, 비표적 핵산에 형광 표지 검출 프로브의 불일치의 하이브리다이즈의 대부분은 억제되고, 이의 불일치의 하이브리다이즈에 의한 소광 또는 발광은 실질적으로 검출되지 않는다.
따라서, 형광 표지 검출 프로브에 표지된 형광 색소의 소광 또는 발광이 검출된 경우에는, 해당 핵산 시료 중에, 형광 표지 검출 프로브의 염기 배열과 상보적인 표적 염기 배열을 가지는 표적 핵산이 존재하는 것을 알 수 있다. 또한, 소광 또는 발광이 검출되지 않은 경우에는, 해당 핵산 시료 중에, 형광 표지 검출 프로브의 염기 배열과 상보적인 표적 염기 배열이 존재하지 않는 것을 알 수 있다.
형광 표지 검출 프로브에 표지된 형광 색소의 소광 또는 발광은, 단계 (2) 및 (3)을 수행하는 것에 의해 검출할 수 있다. 단계 (2)에서, 반응 시료의 온도를 변화시키면서 형광 강도를 측정하는 것에 의해, 형광 강도의 변화를 나타내는 온도 - 형광 강도 곡선이 얻어진다. 반응 시료의 온도를 변화시키면서 형광 강도를 측정하는 방법에는, 예를 들면, 시판의 실시간 PCR 장치(ABI Prism (등록 상표) 7900HT, ABI Prism 7700 (Applied Biosystems), iCycler iQ (상표) Real-Time PCR Detection System (BIO-RAD) MX3000p, MX3005p (Agilent technologies) 등)을 이용할 수 있으며, 구체적으로는, 실시간(Real Time) PCR의 형광 분석과 동일의 융해 곡선 분석 기능을 이용할 수 있다. 단계 (3)에 있어서, 단계 (2)에서 얻어진 온도 - 형광 강도 곡선을 1차 미분하는 것에 의해, 이의 온도 - 형광 강도 곡선의 요철을 예민하게 관찰할 수 있다. 온도 - 형광 강도 곡선의 1차 미분은, 상기의 실시간 PCR 기기의 전용 소프트웨어 등을 이용하여 간단하게 할 수 있다. 형광 표지 검출 프로브의 하이브리다이즈 또는 해리에 의한 소광 또는 발광이 있는 경우에는, 이의 Tm 값에서 형광 강도의 변화율이 커지기 때문에 1차 미분의 결과에 피크(극대값)이 나타난다. 또한, 본 명세서에서, 「피크 (극대값)」로는, 플러스 측에의 극대치에 한정하지 않고, 마이너스 측에의 극대치도 나타내는 것이다(실시예 참조). 특히, 핵산에 근접하는 것에 의해 소광이 일어나는 TAMRA(상표)나 BODIPY(등록 상표) FL 같은 형광 색소로 표지된 형광 표지 검출 프로브를 이용한 경우에는 온도가 Tm 값 이하로 떨어지면 형광 표지 검출 프로브의 형광이 하이브리다이즈에 의해 소광하기 때문에 마이너스 측에의 피크가 나타나는데, 본 명세서에서 이를 「소광 피크」라고 부르는 것이다.
여기서, 본 발명에서는, 반응 시료 주에, 형광 표지 검출 프로브와 1 염기 불일치에서 하이브리다이즈할 수 있는 비표적 핵산이 포함되어있는 경우, 비표적 핵산에 형광 표지 검출 프로브의 하이브리다이즈를 경합 프로브에 의해 저해함으로써 1차 미분의 결과에 불일치의 하이브리다이즈에 의한 피크가 나타나지 않는 것처럼, 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브의 조건을 설정하고 있다.
형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브의 염기 길이 및 염기 배열 및 핵산 시료에의 첨가량은, 이하의 순서:
(a) 표적 핵산은 포함되어 있으나, 비표적 염기 배열(B)를 가지는 비표적 핵산은 실질적으로 포함되어 있지 않은 대조 표적 핵산 시료, 및 표적 핵산은 실질적으로 포함되지 않지만, 비표적 핵산은 포함되어 있는 대조 비표적 핵산 시료의 각각에, 형광 표지 검출 프로브와 경합 프로브을 가하여, 대조 표적 반응 시료 및 대조 비표적 반응 시료를 얻는 것;
(b) 각 대조 반응 시료의 온도를 변화시키면서 형광 강도를 측정하는 것; 및
(c) 측정 결과로부터 얻어진 온도 - 형광 강도 곡선을 각각 1차 미분하는 것에 따르면, 대조 표적 반응 시료의 1차 미분 곡선이 피크(극대값)를 가지나, 대조 비표적 반응 시료의 1차 미분 곡선이 피크를 실질적으로 가지지 않게 된다는 기능적인 조건을 충족하기 위해 결정되어 있다.
비표적 핵산 또는 표적 핵산이 「실질적으로」 포함되지 않는 것은, 시료 중에 당해 비표적 핵산 또는 표적 핵산이 전혀 포함되지 않는 경우에 더하여, 당해 비표적 핵산 또는 표적 핵산이 검출되지 않을 정도로 소량 밖에 포함되지 않는 경우도 의미한다. 「대조 비표적 반응 시료의 1차 미분 곡선이 피크를 실질적으로 가지지 않게 된다」로는, 예를 들면, 엄밀하게는, 대조 비표적 반응 시료의 1차 미분 곡선이 피크를 가지고 있어도, 그 피크의 강도(형광 강도의 최대의 편차 폭)가, 대조 표적 반응 시료의 1차 미분 곡선의 피크의 강도에 비해 크게 약화되고(평탄화하여), 대조 표적 반응 시료의 1차 미분 곡선과 같은 피크 형상을 가지지 않을 경우를 포함할 수 있다.
형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브의 염기 길이 및 염기 배열 및 핵산 시료의 첨가량의 조건은, 상기 순서 (a) ~ (c)에 따라, 당업자에 과도한 부담을 주지 않고 실험적으로 결정할 수 있으며, 실질적으로는, 적어도 각 프로브의 Tm 값과 각 프로브의 첨가량(몰비)와의 2개의 상관하는 요소를 결정하면 된다. 예를 들면, 이하에 나타낸 바와 같이, 상기의 기능적인 조건을 충족하는 가능성이 높은 형광 검출 프로브 및 경합 프로브 각각의 염기 길이 및 염기 배열 및 핵산 시료의 첨가량의 바람직한 조건의 예가, 본 발명자들에 의해 발견되어 있다. 당업자는, 이러한 예에 근거하여, 상기 조건을 충족하도록 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브 각각의 염기 길이 및 염기 배열 및 핵산 시료의 첨가량을 결정할 수도 있다.
본 발명자들은, 예를 들면, 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브 각각의 염기 길이 및 염기 배열의 조건으로, 비표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다, 적어도 5℃, 바람직하게는 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃ 또는 20℃ 높고, 한편, 표적 핵산에 대해 경합 프로브의 Tm 값이 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 낮은, 바람직하게는 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃ 또는 10℃ 낮은 것이 바람직하다는 사실을 발견하였다.
형광 표지 검출 프로브/경합 프로브와의 몰비에도 의하지만, 비표적 핵산에 대한 경합 프로브의 Tm 값 및 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값의 차이가 적어도 5℃면, 형광 표지 검출 프로브 및 비표적 핵산과 불일치의 하이브리다이즈에 의한 피크가 억제되기 쉬운 경향이 있다. 또한, 표적 핵산에 대해 경합 프로브의 Tm 값이 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 낮으면 표적 핵산에 대한 형광 표지 검출 프로브의 하이브리다이즈가 쉽게 되어, 표적 핵산을 검출할 때, 1차 미분 곡선 피크가 더 예리하게 되는 경향이있다.
또한, 비표적 핵산에 대한 경합 프로브의 Tm 값 및 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값과의 차이, 및 표적 핵산에 대한 경합 프로브의 Tm 값 및 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값의 차이는, 상호 관련하여 변동하며, 독립적으로 설정할 수 없다. 따라서, 표적으로 하는 배열에 의해서는, 상기의 바람직한 Tm 값 조건의 조합을 충족시키지 못하는 경우가 있을 수 있다. 예를 들면, 비표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 적어도 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃ 또는 20℃ 높을 때, 표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 낮게 되지 않을 수도 있다. 표적 핵산에 대해 경합 프로브의 Tm 값이 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 높아지면, 표적 핵산에 대한 형광 표지 검출 프로브의 하이브리다이즈가 경합 프로브에 방해받기 쉬워지며, 그 결과, 표적 핵산을 검출하는 경우의 1차 미분 곡선의 피크가 감소하는 경향이 생긴다. 그러나, 그러한 경우에도 또한, 형광 표지 검출 프로브와 비표적 핵산과 불일치의 하이브리다이즈에 의한 피크가 충분히 억제(평탄화) 된 피크의 유무가 시각적으로 판단할 수 있는 것이라면, 본 발명의 효과가 달성되므로 바람직할 수 있다. 예를 들면, 비표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 적어도 10℃, 바람직하게는 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 더욱 바람직하게는 15℃, 16℃ 17℃, 18℃, 19℃ 또는 20℃ 높고, 표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이 형광 표지 프로브의 Tm 값 + 5℃를 넘지 않고, 바람직하게는 형광 표지 프로브의 Tm 값 + 4℃, 형광 표지 프로브의 Tm 값 +3℃, 형광 표지 프로브의 Tm 값 + 2℃, 형광 표지 프로브의 Tm 값 + 1℃ 또는 형광 표지 프로브의 Tm 값을 초과하지 않는 경우에도 적합할 수 있는 것이 발견되었다(구체적으로는, 이하의 실시예 3의, 경합 프로브로서 「RB516A-3-P-8」을 사용한 예를 참조).
또한, 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브 각각의 핵산 시료의 첨가량 조건으로서, 경합 프로브의 첨가량이 형광 표지 검출 프로브의 첨가량의 적어도 몰비로 1 배(즉 1 : 1), 바람직하게는 2 ~ 9 배(몰비), 보다 바람직하게는 적어도 10 배(몰비), 보다 바람직하게는 적어도 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배 100 배, 150 배, 200 배, 250 배, 300 배, 400 배, 500 배 또는 1000 배(몰비)인 것을 들 수 있다. 상술한 바와 같이 비표적 핵산에 대한 경합 프로브 및 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값의 차이에 따라 다르지만, 첨가량이 경합 프로브 /형광 표지 프로브의 몰비로 10 이상이면 형광 표지 검출 프로브의 불일치의 하이브리다이즈에 의한 피크가 충분히 억제되는 경향이 있다.
검출해야 할 표적 핵산의 배열 그 자체나, 검출 경합 프로브가 해당 배열의 어떤 영역을 커버하는가에 따라 다르지만, 일반적으로, 비표적 핵산에 대한 경합 프로브의 Tm 값 및 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값과의 차이가 클수록 경합 프로브/형광 표지 프로브의 첨가량(몰비)는 작아지는 경향이 있다. 당업자는 표적 핵산의 배열을 바탕으로, 프로브에 걸리는 Tm 값의 차이와 첨가량과를, 본 발명에 따른 순서에 근거하여, 일상적인 실험으로 용이하게 확인할 수 있다.
또한, 예를 들면, 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브 각각의 염기 길이 및 염기 배열의 조건으로는,
(I) 표적 핵산에서 형광 표지 검출 프로브와 하이브리다이즈하는 영역이 경합 프로브와 하이브리다이즈하는 영역을 포함하거나;
(II) 표적 핵산의 경합 프로브와 하이브리다이즈하는 영역이 형광 표지 검출 프로브와 하이브리다이즈하는 영역을 포함하거나; 또는
(III) 표적 핵산의 경합 프로브와 하이브리다이즈하는 영역이 형광 표지 검출 프로브와 하이브리다이즈하는 영역과 일치하는 것을 포함할 수 있다.
또한, 이의 (I) ~ (III)에서 말하는 「하이브리다이즈」는, 완전 일치의 하이브리다이즈도 불일치의 하이브리다이즈도 포함한다. (I) 또는 (II)의 경우에는 형광 표지 검출 프로브와 하이브리다이즈하는 영역 및 경합 프로브와 하이브리다이즈하는 영역 중, 어느 하나 좁은 쪽의 영역이, 표적 염기 배열에 해당한다. (III)의 경우에는 형광 표지 검출 프로브와 경합 프로브가, 함께 표적 염기 배열과 동일한 염기 길이를 가지며, 완전히 일치하는 영역에서 서로 경합하여 하이브리다이즈 할 수 있다.
이상, 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브에 대한 바람직한 조건의 예를 들었다. 그러나, 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브는, 그 조건을 충족하는 것 이외에도, 상기 순서 (a) ~ (c)에 따르면, 대조 표적 반응 시료의 1차 미분 곡선이 피크가 있으나, 대조 비표적 반응 시료의 2차 미분 곡선이 피크를 실질적으로 가지지 않는 것이면 좋다.
본 발명에는, 반응 시료 중에 비표적 핵산이 포함되어 있었다고 해도, 비표적 핵산에 형광 표지 검출 프로브의 불일치의 하이브리다이즈가 경합 프로브에 의해 거의 억제되기 때문에, 비표적 핵산은 형광 표지 검출 프로브에 의해 실질적으로 검출되지 않으며, 온도 - 형광 강도 곡선의 2차 미분 곡선에 피크로 나타나는 것도 없다. 그리고, 반응 시료 중에 표적 핵산이 포함된 경우에만, 형광 표지 검출 프로브의 핵산에의 하이브리다이즈에 의한 피크가 나타난다.
따라서, 본 발명에 따른 검출 방법에는, 온도 - 형광 강도 곡선의 1차 미분 곡선의 피크의 유무에 따라, 표적 염기 배열의 유무를 명확하게 판별할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 검출 방법은, Tm 값에 영향을 미치는 요인인 반응액 중의 염농도가 어느 정도 변화해도, 판별능에 영향이 생기기 어렵고, 안정하며 정확한 검출 결과를 얻을 수 있다는 이점이 있다.
본 발명에 따른 검출 방법은, 이상 설명한 단계 (1) ~ (3)에 더하여,
(4) (3)에서 얻어진 1차 미분 곡선이 피크를 가지는 경우, 핵산 시료 중에 표적 염기 배열(A)가 존재하는 것으로 판단하는 것을 포함하여도 좋다. 여기에서 핵산 시료가, 표적 핵산의 외에, 비표적 핵산도 포함하여도 좋다. 이러한 단계 (4)는, 단계 (1) ~ (3)에서 얻어진 온도 - 형광 강도 곡선의 1차 미분 곡선이 피크를 가지는 형상이거나 피크를 실질적으로 가지지 않는 형상인지에 의해, 표적 염기 배열(A)의 유무를 용이하게 판단할 수 있다. 여기에서 핵산 시료가, 표적 핵산 이외에, 비표적 핵산도 포함할 수 있다는 것은, 이 방법에 의해, 예를 들면, 유전자 진단 등에 있어서, 대립 유전자의 헤테로 접합체에 포함된 표적 염기 배열의 존재 유무를 용이하게 판단할 수 있다는 것이다.
<프로브의 설계 방법>
본 발명은, 상기 검출 방법에 사용 가능한 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브를 설계하는 방법을 제공할 수 있다. 상기 방법은,
(1') (a) ~ (c)에 따라, 대조 표적 반응 시료의 1차 미분 곡선이 피크(극대 값)을 가지나, 비표적 반응 시료의 1차 미분 곡선이 피크를 실질적으로 가지지 않도록, 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브 각각의 염기 길이 및 염기 배열을 결정하는 것을 포함한다.
이러한 프로브의 설계 방법에 의해, SNP의 1 염기의 차이를 고밀도로 검출하여, 온도 - 형광 강도 곡선의 1차 미분 곡선의 피크의 유무에 의해 표적 염기 배열의 유무를 용이하게 판단하는 것이 가능하게 되도록 프로브 세트를 실현할 수 있다.
<프로브의 제조 방법>
또한, 본 발명은, 상기 검출 방법에 사용 가능한 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브를 제조하는 방법을 제공할 수 있다. 상기 방법은,
(1") 상기의 프로브의 설계 방법의 방법에 따라 설계된 각각의 염기 길이 및 염기 배열의 올리고 뉴클레오티드를 합성하는 것; 및
(2") 형광 표지 검출 프로브의 올리고 뉴클레오티드를, QP 법에 사용 가능한 형광 색소로 표지하는 것
을 포함한다. 올리고 뉴클레오티드는, 인공적으로 합성시켜도, 생합성시켜도 좋고, 그 배열에 따른 제조 방법은 당해 기술 분야에서 이미 주지이며, 당업자는 적절한 방법을 선택할 수 있다.
<키트>
또한, 본 발명은, 상기 검출 방법에 있어서 사용되기 위한 키트를 제공할 수도 있다. 본 발명에 따른 키트는, 상기의 형광 표지 검출 프로브, 경합 프로브 및 사용 설명서를 포함한다. 사용 설명서는, 예를 들면, 검출할 수 있는 표적 염기 배열에 대한 정보, 상기의 검출 방법의 단계 (1) ~ (3) 또는 단계 (1) ~ (4)에 대한 정보 및 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브 각각의, 핵산 시료에의 첨가량에 대한 정보 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는, 유전자 진단에 사용되기 위한 키트여도 좋다.
<유전자 진단의 방법>
또한, 본 발명은, 상기의 검출 방법을 이용한 유전자 진단의 방법을 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 유전자 진단의 방법은,
(1-1) DNA를 포함하는 검체로부터, 진단 대상의 DNA 영역을 포함하는 핵산 시료를 얻는 것;
(1-2) 핵산 시료에, QP(Quenching 프로브/Primer) 법에 사용 가능한 형광 색소에 표지된 검출 프로브와, 경합 프로브를 가하여, 반응 시료를 얻는 것, 이에 따라 반응 시료 중의 표적 염기 배열(A)을 가지는 표적 핵산에, 형광 표지 검출 프로브 또는 경합 프로브가 하이브리다이즈한다;
(2) 반응 시료의 온도를 변화시키면서, 형광 강도를 측정하는 것; 및
(3) (2)의 측정 결과로부터 얻어진 온도 - 형광 강도 곡선을 1차 미분하는 것을 포함하고, 여기에서, 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브는 상기 표적 염기 배열의 검출 방법과 동일한 조건 (i) ~ (iii)을 충족하는 것이다. 본 발명에 따른 유전자 진단 방법은, 표적 염기 배열을 가지는 유전자의 유무의 판단을 보다 용이하게 하기 위해, 상기의 검출 방법의 단계 (4) ((3)에서 얻어진 1차 미분 곡선이 피크를 가지는 경우, 핵산 시료 중에 표적 염기 배열(A)가 존재한다고 판단하는 것)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 유전자 진단의 방법은, 더욱 간편한 방법으로 하기 위하여, 단계 (1-1)에 있어서 진단 대상의 DNA 영역의 핵산을 충분히 포함하는 핵산 시료를 얻는 수단으로서, 상기 DNA 영역의 핵산을 LAMP 법에 의해 증폭시키고 있다. 이에 의해, PCR 법을 이용한 기존의 유전자 진단 방법에 비해 더 빨리 간편한 유전자 진단 방법을 제공할 수 있다. 또한, 본 방법의 LAMP 법에 의한 증폭 후의 핵산은, 상술한 바와 같이 「생체에 유래하는 핵산 시료」의 일례이다.
이하의 실시예는, 본 발명에 대해, 보다 구체적으로 설명하는 것이며, 본 발명의 범위를 어느 정도로 한정하는 것은 아니다. 당업자로서 통상의 지식 및 기술을 가진 자는, 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위에서, 하기 실시예에서 나타난 형태에 다양한 개변을 수행할 수 있으나, 그러한 개변된 형태도 본 발명에 포함된다.
당업자는, 이하의 실시예를 참조하여, 본 발명의 효과를 달성할 수 있는 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브를, 다양한 대상의 염기 배열에 대해 적절히 설계하는 것이 가능하며, 과도한 시행 착오를 필요로 하지 않는다.
[실시예]
실시예 1 : 경합 프로브의 첨가에 의한 rpoB 유전자 변이의 검출
본 발명에 따른 표적 염기 배열을 검출하는 방법을 이용하여, 결핵균의 리팜피신 내성 획득에 관한 rpoB 유전자의 내성 결정 영역(rifampicin resistance determining region, RRDR)을 대상으로 단일 염기 변이 검출을 실시하였다. 이 단일 염기 변이 검출에는, rpoB 유전자의 염기 배열의 516 번째 코돈 중의, 1 염기가 A에서 T로 치환되는 것에 의해 그 코드하는 아미노산이 Asp에서 Val로 치환되는 변이를 대상으로 하였다. 이 변이 부위를 포함하는 영역의 염기 배열은, 「표적 염기 배열을 가지는 표적 핵산」(A 대립 유전자) 또는「비표적 염기 배열을 가지는 비표적 핵산」(T 대립 유전자)로 표현된다. 또한, 실시예 1은 「염기 변이 뉴클레오티드를 포함하는 표적 염기 배열」을 야생형의 염기 배열로 하며, 「염기 미변이 뉴클레오티드」를 포함하는 「비표적 염기 배열」을 변이형의 염기 배열로 하여, 핵산 시료 중에 야생형의 염기 배열이 포함되는지 여부를 판별하는 예에 해당한다.
여기에서, 전제로서, 실시예 1에는, A 대립 유전자 중의 표적 염기 배열의 센스 가닥이 상기 변이 부위에 「A」를 가지며, T 대립 유전자 중의 비표적 염기 배열의 센스 가닥이 상기 변이 부위에 「T」를 가지나, 실제로 검출 프로브·경합 프로브를 하이브리다이즈시킨 대상은 각각의 염기 배열의 안티센스 가닥이다. 따라서, 실시예 1의 내용을, 본원에 첨부된 특허 청구 범위의 기재에 비추어 보면 A 대립 유전자의 센스 가닥에 상보하는 안티센스 가닥이, 청구항 중의 「표적 핵산」의 일례에 상당하며, 「표적 염기 배열의 센스 사슬」에 상보하는 「표적 염기 배열의 안티센스 가닥」이, 청구항 중의「표적 염기 배열」의 일례에 상당한다. 마찬가지로, T 대립 유전자의 안티센스 가닥이, 청구항 중의 「비표적 핵산」의 일례에 상당하며, 비표적 염기 배열의 안티센스 가닥이 청구항 중의 「비표적 염기 배열 」의 일례에 상당한다.
A 대립 유전자 중의, 변이 부위의 뉴클레오티드「A」(이에 상보적인 안티센스 가닥의 「T」가, 청구항 중의 「염기 변이 뉴클레오티드」의 일례에 상당한다.)를 포함하는 일정 범위의 염기 배열을, 표적 염기 배열의 센스 가닥으로서, 표적 염기 배열의 센스 가닥과 동일한 염기 배열의 올리고 뉴클레오티드를 포함하는 검출 프로브(RB516A-2)를 디자인하였다. T 대립 유전자 중의, 상기 A 대립 유전자 중인 표적 염기 배열의 범위와 동일한 범위의 염기 배열(즉, 상기 변이 부위의 뉴클레오티드「A」(A 대립 유전자의 안티센스 가닥에서는「T」)이 단일 염기 변이 후의 뉴클레오티드 「T」(T 대립 유전자의 안티센스 가닥에서는 「A」)로 바뀐 이외는 상기 표적 염기 배열과 동일한 염기 배열)인 비표적 염기 배열에 대해, 이의 비표적 염기 배열의 센스 가닥과 동일의 염기 배열의 올리고 뉴클레오티드를 포함하는 경합 프로브(RB516T-2-P)를 설계하였다. 또한, 상기에서, T 대립 유전자 중의 변이 부위의 뉴클레오티드 「T」에 상보하는, T 대립 유전자의 안티센스 가닥인 「A」가, 청구항 중의 「염기 미변이 뉴클레오티드」에 상당한다. 또한, 상기와 같이, 각 염기 배열의 센스 가닥과 동일한 염기 배열하는 것에 의해, 검출 프로브 (RB516A-2)는, 표적 염기 배열의 안티센스 가닥(청구항 중의 「표적 염기 배열」)에 상보적인 염기 배열을 가지며, 경합 프로브 (RB516T-2-P)는, 비표적 염기 배열의 안티센스 가닥(청구항 중의 「비표적 염기 배열」)에 상보적인 염기 배열을 가진다. 이렇게 설계한 염기 길이 및 염기 배열의 올리고 뉴클레오티드를 각각 합성하여, 검출 프로브를 형광 색소 TAMRA (상표)로 표지하여 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브를 제작하였다. 또한, 경합 프로브에는, 형광 색소의 표지를 하지 않고, 인산기를 수식하였다.
Figure 112019043798140-pct00001
핵산 시료를, 이하와 같이 제조하였다:
상기의 rpoB RRDR의 배열이 변이형인 유전자 배열과, 그 단일 염기 변이 부위의 배열이 야생형인 유전자 배열과의 각각에 대해, 게놈 DNA 중의 이하의 영역:
Mycobacterium tuberculosis H37Rv ID : ref|NC_000962.3|760767-761516
(미국 국립 생물 공학 정보 센터(NCBI)의 GenBank 내에서 검색 가능.)
를 서브클로닝한 플라스미드를 제한 효소 처리(Xba I/Xho I)하여 얻어진 샘플을, 주형으로 사용하였다. 보다 구체적으로는, 상기 데이터베이스에서 그 H37Rv의 배열을 취하여, 인위적으로 약제 내성 배열(변이형)로 되도록 변이시킨 플라스미드를 제작하여(유로핀 제노믹스 사의 인공 유전자 합성 서비스에 의함) 사용하였다. 마찬가지로, 감수성 배열(야생형)의 플라스미드도 합성하고, 헤테로에 대해서는, 합성한 야생형과 변이형의 플라스미드를 혼합하여 사용하였다.
상기의 주형에 대해, 이하의 프라이머를 이용하여, 65℃에서 90분간 LAMP 반응을 수행하였다. LAMP 반응은 Loopamp(등록 상표) 실시간 탁도 측정 장치 LA200( Teramecs)에 의해 실시하였다.
Figure 112019043798140-pct00002
반응액의 조성(25 μL 중)은, 다음과 같이 하였다.
20 mM Tricine pH 8.8, 50 mM KCl, 8 mM MgSO4, 1.4 mM ATP, 1.4 mM GTP, 1.4 mM CTP, 1.4 mM TTP, 0.5% Tween 20, 16U Bst-Large Fragment.
또한, LAMP증폭 반응 전에, 형광 표지 검출 프로브(최종 농도 0.04 μM)와 경합 프로브(최종 농도 1.2 μM)와를 첨가하였다. 여기서, 프로브를 LAMP 증폭 반응 전에 첨가하고 있는 것은, 반응 후의 증폭 산물이 들어가 있는 용기를 개봉하면, 증폭 산물의 캐리오버 콘타미네이션의 리스크가 높아지는 것을 방지하기 위해서 이다.
상기의 반응에 의해, 변이형의 주형중의 T 대립 유전자 및 야생형의 주형중의 A 대립 유전자를, 각각 특이적으로 증폭시켰다. 이에 의해, 증폭 산물에, 형광 표지 검출 프로브(최종 농도 0.04 μM)와 경합 프로브(최종 농도 1.2 μM)가 첨가된 것에 상당하는 반응 시료가 얻어졌다. 이들의 반응 시료를 장치 MX3005p(Agilent technologies)으로 99℃에서 5분간 가열 후, -2℃/30초의 속도로 강온하고, 30초 마다 형광값을 측정하였다. 측정에 의해서 얻은 온도-형광 강도 곡선에 상당하는 데이터에 대해서, MX3005p(Agilent technologies) 전용 소프트웨어에 의한 미분값을 산출하였다. 도 1에 나타낸 1차 미분 곡선(열 해리 곡선)를 얻었다.
도 1의 실험 데이터가 나타낸 바와 같이, 표적 염기 배열과 같은 영역의 비표적 염기 배열의 센스 가닥과 동일한 염기 배열을 가진 경합 프로브를 첨가함으로써, 반응 시료 중에 표적 염기 배열이 있으면 열 해리 곡선에 정점(소광 피크)이 나타나고, 반응 시료 중에 표적 염기 배열이 실질적으로 포함되지 않으면 실질적으로 피크가 나타나지 않는 검출계를 실현할 수 있었다.
이 검출계에 의하면, 야생형의 1 염기 변이를 가자지 않는 개체에 유래하는 표적 핵산(A 대립 유전자)에 대해 상기의 검출 방법을 적용하면, 얻어진 열 해리 곡선이 피크를 가지는 것으로부터, 그 개체가 변이형의 1 염기 변이를 가지지 않는 야생형이라고 판단할 수 있는 한편, 변이형의 1 염기 변이를 가지는 개체에 유래하는 비표적 핵산(T 대립 유전자)에 대해 상기의 검출 방법을 적용하면, 얻어진 열 해리 곡선이 피크를 가지지 않는 것으로부터, 그 개체가 야생형의 표적 핵산을 가지지 않는다고 판단할 수 있다.
또한, 핵산 시료가 대립 유전자에서 유래하는 경우로서, 단일 염기 변이의 유전자형이 변이형/야생형의 헤테로인 경우를 상정하고, 표적 핵산(A 대립 유전자)와 비표적 핵산(T 대립 유전자)과의 혼합물에 대해서도 마찬가지 실험을 하였다. 얻어진 열 해리 곡선(도 1 중, 1 점 쇄선으로 나타냄)은, 표적 핵산(A 대립 유전자)만의 경우로 얻어진 피크보다 약한 피크를 가진다. 그러므로, 열 해리 곡선이 피크를 가지는 것으로부터, 그 개체가 야생형의 단일 염기 미변이를 가진다고 판단할 수 있다. 또한, 검출 프로브와 경합 프로브의 조건에 따라서는, 피크의 강도에 의해, 단일 염기 변이 유전자형이 야생형의 호모인지 변이형/야생형의 헤테로인지를 예측하고, 반 정량적인 판별도 가능함을 시사한다.
실시예 2: 경합 프로브의 설계 조건(1)(부분 경합형 프로브와의 비교)
실시예 1과 동일의 rpoB RRDR의 유전자에 대해서, 단일 염기 변이의 검출을 위한 프로브의 설계 조건을 검토하였다. 도 2와 같이 표적 염기 배열을 가지는 표적 핵산(A 대립 유전자, 배열 번호 9(3'→ 5' 방향으로 본 배열) 및 비표적 염기 배열을 가진 비표적 핵산(T 대립 유전자, 배열 번호 10(3'→ 5' 방향으로 본 배열)을 각각, 대조 표적 핵산 시료 및 대조 비표적 핵산 시료에 사용하였다. 이들의 표적 핵산 및 비표적 핵산에 대해, 표적 염기 배열의 센스 가닥 및 비표적 염기 배열의 센스 가닥과 동일의(즉, 배열 번호 9로 나타내지는 염기 배열 중의 표적 염기 배열 및 배열 번호 10으로 표시되는 염기 배열 중의 비표적 염기 배열에 각각 상보적인) 염기 배열을 가지는 검출 프로브 및 경합 프로브를 각각 설계하였다. 이들 의 검출 프로브와 경합 프로브는, 서로 동일한 염기 길이를 가지며, 서로 변이 부위의 뉴클레오티드(「T」 또는「A」)에 상보적인 1 염기가 다른 이외는 동일한 염기 배열을 가진다.
본 발명의 경합 프로브를 사용한 경우와 비교하기 때문에, 2가지 부분 경합형 프로브를 설계하였다. 부분 경합형 프로브-1 및 부분 경합형 프로브-2는, 그 염기 배열 일부가, 표적 핵산 상의 검출 프로브와 공통의 영역에 대해서 하이브리다이즈할 수 있도록 설계되어 있다.
본 실시예에서는, 경합 프로브의 설계 조건을 검토하기 위해, 표적 핵산은 포함되어 있으나, 비표적 핵산은 실질적으로 포함되지 않은 핵산 시료(대조 표적 핵산 시료) 및 표적 핵산은 실질적으로 포함되지 않으나, 비표적 핵산은 포함된 핵산 시료(대조 비표적 핵산 시료)에 각각, 검출 프로브(최종 농도 0.04 μM)및 경합 프로브(최종 농도 1.2 μM)을 첨가한 각 반응 시료에 대해서, 실시예 1과 마찬가지로 온도를 변화시키면서 형광 강도를 측정하였다.
마찬가지로, 대조 표적 핵산 시료 및 대조 비표적 핵산 시료에, 각각, 검출 프로브(최종 농도 0.04 μM) 및 부분 경합형 프로브 -1 또는 -2(최종 농도 1.2 μM)을 첨가한 각 반응 시료에 대해서도, 온도를 변화시키면서 형광 강도를 측정하였다.
또한, 대조 실험으로서, 대조 표적 핵산 시료 및 대조 비표적 핵산 시료에, 각각, 검출 프로브(최종 농도 0.04 μM)만 첨가하여, 온도를 변화시키면서 형광 강도를 측정하였다. 결과를 도 3a에 나타낸다.
도 3b에 나타낸 바와 같이, 검출 프로브만 이용한 경우나, 검출 프로브와 함께 부분 경합형 프로브를 이용한 경우에는, 대조 비표적 핵산 시료에 대해서 얻어진 온도 - 형광 강도 곡선의 1차 미분 곡선이, 대조 표적 핵산 시료에 대한 1차 미분 곡선의 소광 피크보다도 저온 측에 소광 피크를 가지고 있었다. 이것은, 검출 프로브의 비표적 핵산과의 불일치의 하이브리다이즈에 의한 소광 피크이다. 예를 들면, 염농도 등의 조건에 따라서는, 이 불일치의 하이브리다이즈에 의한 소광 피크가 나타나는 온도가 고온으로 시프트 하는 것이 있으며, 검출 프로브의 표적 핵산과의 완전 일치의 하이브리다이즈에 의한 소광 피크로 오인될 가능성이 있다.
한편, 검출 프로브와 함께 상기의 경합 프로브를 이용한 경우에는 대조 비표적 핵산 시료에 대한 1차 미분 곡선이, 소광 피크를 실질적으로 보유하지 않았다.따라서, 이 경합 프로브는, 본 발명의 검출 방법에 상기 검출 프로브와 함께 사용 가능하고, 이 경합 프로브를 이용하는 것에 의해서, 표적 핵산이 실질적으로 포함되지 않으면 실질적으로 소광 피크가 나타나지 않는 검출계를 실현할 수 있다.
이 결과는, 특허 문헌 1에 기재의 발명에 비하여 본 발명의 효과가 현저성을 여실히 드러낸 예라 할 수 있다.
실시예 3: 경합 프로브의 설계 조건(2)(Tm 값에 대하여)
실시예 1 및 실시예 2와 동일한 rpoB RRDR의 유전자에 대해서, 경합 프로브 설계를 위한 Tm 값 조건을 검토하기 위해서, 형광 표지 검출 프로브와 경합 프로브, 각각의 표적 핵산·비표적 핵산에 대한 결합력을 Tm 값으로 산출하고, 상술한 온도 - 형광 강도 곡선의 1차 미분 곡선의 소광 피크의 유무와의 관계성을 조사하였다.
본 실시예에서는 실시예 1·실시예 2와 달리, 표적 핵산을 T 대립 유전자(변이형의 염기 배열)로 하고, 비표적 핵산을 A 대립 유전자(야생형의 염기 배열)로 하였다. 즉, 도 4a에 나타낸 바와 같이 표적 염기 배열을 가진 표적 핵산(T 대립 유전자, 배열 번호 10(3'→ 5' 방향으로 본 배열), 및 비표적 염기 배열을 가진 비표적 핵산(A 대립 유전자, 배열 번호 9(3'→ 5' 방향으로 본 배열)을, 각각, 대조 표적 핵산 시료 및 대조 비표적 핵산 시료로 사용하였다. 본 실시예에서는 T 대립 유전자에 완전 일치하는(즉, 배열 번호 10으로 표시되는 염기 배열 중의 표적 염기 배열에 완전히 상보적인) 검출 프로브를, 형광 색소 BODIPY(등록 상표)FL으로 표지함으로써 형광 표지 프로브(형광 표지 검출 프로브로서)를 제작하였다. 또한, A 대립 유전자에 완전 일치하는(즉, 배열 번호 9로 나타내지는 염기 배열 중의 비표적 염기 배열에 완전히 상보적인) Tm 값의 다른 경합 프로브 10종을 제작하였다. Tm 값이 다른 복수의 경합 프로브는, 형광 표지 프로브에 대해서 경합 프로브의 염기길이를, 형광 표지 프로브보다 몇 염기 짧은 것으로부터 형광 표지 프로브보다 몇 염기가 긴 것까지 여러가지로 변경하는 것으로 제작하였다.
T 대립 유전자에 완전히 일치하는 형광 표지 프로브 1 종(최종 농도 0.04 μM)와, A 대립 유전자에 완전히 일치하는 Tm 값이 다른 경합 프로브 10 종(최종 농도 1.2 μM)을 이용하여, 실시예 1과 동일의 방법으로 소광 피크 유무를 측정하였다. 형광 표지 프로브와 경합 프로브의 각각의 표적 핵산·비표적 핵산에 대한 Tm 값은, 도 4b의 표 및 도 4c의 그래프에 나타내져 있다. 완전 일치(T 대립 유전자에 대한 형광 표지 프로브, A 대립 유전자에 대한 경합 프로브) 불일치 (A 대립 유전자에 대한 형광 표지 프로브, T 대립 유전자에 대한 경합 프로브)에 대한 Tm 값은 Meltcalc 99 free (http://www.meltcalc.com /)을 이용하여, 설정 조건: Na eq. [mM] 50 조건에서 산출하였다.
그 결과, 도 4b 및 도 5에 나타낸 바와 같이, A 대립 유전자에 대한 경합 프로브(A 대립 유전자 완전 일치)의 Tm 값이 형광 표지 프로브 (T 대립 유전자 완전 일치)의 Tm 값보다 10.1℃ 이상 높은 경우(경합 프로브로서 「RB516A-3-P-7」, 「RB516A-3-P-8」, 「RB516A-3-P-9」 또는 「RB516A-3-P-10」을 사용한 경우), A 대립 유전자를 주형으로 한 경우의 소광 피크가 사라졌다.
한편, T 대립 유전자에 대한 경합 프로브(A 대립 유전자 완전 일치)의 Tm 값이 형광 표지 프로브(T 대립 유전자 완전 일치)의 Tm 값보다 -1.8℃ 이상 높아지면 T 대립 유전자를 주형으로 한 경우의 소광 피크가 단계적으로 감소하고, 9.9℃ 높아진 경우(경합 프로브로서 「RB516A-3-P-9」 또는 「RB516A-3-P-10」을 사용한 경우), T 대립 유전자를 주형으로 한 경우의 소광 피크는 사라졌다. 이것은 이론적으로 표적 핵산에 대한 경합 프로브의 Tm 값이 형광 검출 프로브의 Tm 값보다 높은 경우에는 표적 핵산에 경합 프로브가 형광 검출 프로브보다도 안정적으로 하이브리다이즈하기 때문에 표적 핵산에 대한 형광 표지 검출 프로브의 하이브리다이즈가 저해되고, 검출 가능한 소광이 감소하기 때문이라고 생각된다.
이 실험으로부터, 대조 표적 반응 시료(T 대립 유전자를 함유하는 시료)의 1차 미분 곡선이 소광 피크가 있으나, 대조 비표적 반응 시료(A 대립 유전자를 함유하는 시료)의 1차 미분 곡선 소광 피크를 실질적으로 가지지 않게 되는 것은, 형광 표지 프로브「RB516T-3b」와 경합 프로브「RB516A-3-P-7」와의 조합 또는 형광 표지 프로브「RB516T-3b」와 경합 프로브「RB516A-3-P- 8」와의 조합을 이용한 경우임을 알 수 있으며, 이러한 조합의 프로브 세트가 적합하다고 결정할 수 있다.
이의 예에서 Tm 값 조건으로서, 비표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이 형광 표지 프로브의 Tm 값보다 10.1℃ 이상 높고, 표적 핵산에 대해 경합 프로브의 Tm 값이 형광 표지 프로브의 Tm 값보다 낮은 것이 바람직하다는 것이 발견되었다.
또한, 이 예에서는, 표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이 형광 표지 프로브의 Tm 값을 초과하여도, 그 차이가 6.1℃ 이하의 경우는, 대조 표적 반응 시료의 1차 미분 곡선이 소광 피크를 가지며, 대조 비표적 반응 시료의 1차 미분 곡선 이 소광 피크를 실질적으로 가지지 않으므로, 본 발명에 충분히 적용 가능하다고 생각된다. 따라서, 예를 들면, 비표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이 형광 표지 프로브의 Tm 값보다 적어도 10℃ 높고, 표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 프로브의 Tm 값 + 6. 1℃를 넘지 않는 것, 더욱 바람직하게는 형광 표지 프로브의 Tm 값 + 5℃를 넘지 않는 것도, 다른 바람직한 Tm 값 조건의 일례라고 할 수 있다.
여기에서, 표적 핵산에 대한 경합 프로브의 Tm 값이 형광 표지 프로브의 Tm 값을 초과하는 경우에는, 비표적 핵산에 대한 경합 프로브의 Tm 값도 더 높아지는 경향이 있고, 예를 들면, 비표적 핵산에 대한 경합 프로브의 Tm 값이 형광 표지 프로브의 Tm 값보다 15℃ 이상 높아질 수 있다(구체적으로, 도 4b을 참조하면 경합 프로브 「RB516A-3-P-8」을 사용하는 경우에 경합 프로브의 Tm 값이 형광 표지 프로브의 그것보다 16.8℃ 높다). 따라서, 예를 들면, 비표적 핵산에 대해 경합 프로브의 Tm 값이 형광 표지 프로브의 Tm 값보다 적어도 15℃ 높고, 표적 핵산에 대해 경합 프로브의 Tm 값이 형광 표지 프로브의 Tm 값 + 5℃를 넘지 않는 것도, 다른 바람직한 Tm 값 조건의 일례라고 할 수 있다.
또한, 상기 실시예 1 및 실시예 2에는, 야생형의 염기 배열을 가지는 표적 염기 배열을 검출하는 예를 설명하고, 상기 실시예 3에서는, 상기 실시예 1 및 실시예 2와는 반대로, 변이형의 염기 배열을 검출하기 위한 프로브의 설계 조건의 검토의 예를 설명했으나, 표적 염기 배열을 야생형의 염기 배열로 하는 변이형의 염기 배열로하는지는, 특별 한정되는 것은 없다. 예를 들면, 상기 실시예 3에서 설명한 방법을, 상기 실시예 3과는 반대로, 야생형의 염기 배열을 검출하기 위한 프로브의 설계 조건의 검토에 적용할 수 있다. 이러한 변경을 한 경우, A 대립 유전자에 완전히 일치하는 1 개의 형광 표지 프로브와 T 대립 유전자에 완전히 일치하는 Tm 값이 다른 복수의 경합 프로브를 각각 설계하여, 상기와 같은 방법으로 소광 피크의 유무를 측정하면 된다.
실시예 4 : 다른 유전자에 대해 단일 염기 변이의 검출을 위한 프로브의 설계 조건(Tm 값)를 검토한 예
본 발명자들은, rpoB RRDR 이외의 단일 염기 변이의 검출에 대해서도, 본 발명의 검출 방법을 적용할 수 있음을 보여주었다. 본 실시예에서는 실시예 1 ~ 3과는 달리 인간의 유전자 중에 있는 특정 단일 염기 변이의 판별을 목적으로 하여, 검출 프로브 및 경합 프로브의 설계 조건(Tm 값)를 검토하였다. 본 실시예에서는, 우선, 대상으로 하는 단일 염기 변이 부위를 포함하는 적당한 길이의 표적 염기 배열을 결정하고, 표적 염기 배열에 대해 상보적인 검출 프로브를 제작하여 형광 색소로 표지하고, 형광 표지 검출 프로브로 하였다. 또한, 동일한 검출 프로브에 대해 경합 프로브의 염기 길이를, 검출 프로브보다 몇 염기 짧은 것으로부터 검출 프로브보다 몇 염기 긴 것까지 다양하게 변경하여, 상기와 같이 대조 표적 반응 시료 및 대조 비표적 반응 시료에 대한 1차 미분 곡선을 요구하는 실험을 실시, 단일 염기 변이의 검출을 위한 프로브의 설계 조건을 검토하였다. 이 실험에서 경합 프로브 각각의 염기 길이 및 염기 배열의 조건으로, 비표적 핵산에 대해 경합 프로브의 Tm 값이 검출 프로브의 Tm 값보다 적어도 5℃ 높고, 표적 핵산에 대해 경합 프로브의 Tm 값이 검출 프로브의 Tm 값보다 낮으며, 경합 프로브/형광 표지 검출 프로브의 첨가량(몰비)가 30/1 인 경우에, 대조 표적 반응 시료의 1차 미분 곡선이 소광 피크를 가지나, 대조 비표적 반응 시료의 1차 미분 곡선 소광 피크를 실질적으로 가지지 않게 된다(또는, 소광 피크를 가지고 있어도 대조 표적 반응 시료의 1차 미분 곡선 소광 피크에 비해 분명히 약한 소광 피크이며, 대조 표적 반응 시료의 경우와는 분명하게 구별 가능하다)라는 결과가 얻어졌다.
그러나, 비표적 핵산에 대한 경합 프로브의 Tm 값과 검출 프로브의 Tm 값과의 차이가 5℃ 미만인 경우에는 검출 프로브와 비표적 핵산과 불일치의 하이브리다이즈에 의한 소광 피크가 억제되지 않고, 대조 비표적 반응 시료의 1차 미분 곡선에도, 대조 표적 반응 시료의 1차 미분 곡선과 유사한 소광 피크가 보이는 결과로 되었다. 한편, 표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값을 검출 프로브의 Tm 값보다 높은 경우에는 표적 핵산의 검출에 의한 소광 피크 자체가 작아진다는 결과가 얻어졌다. 이것은, 표적 핵산에 경합 프로브 쪽이 검출 프로브보다 안정적으로 하이브리다이즈하기 위해, 표적 핵산에 대한 검출 프로브의 하이브리다이즈에 의한 검출이 억제되기 때문이다.
또한, 상기 조건에서, 비표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값을 검출 프로브의 Tm 값보다 적어도 15℃ 높은 것 이외에는 상기 조건과 동일한 경우에는, 동일한 비표적 핵산에 대한 경합 프로브의 Tm 값을 검출 프로브의 Tm 값보다 5 ~ 10℃ 정도 높게 한 경우와 비교하여, 대조 비표적 반응 시료의 1차 미분 곡선의 형태가 더 평탄하게 접근하는 것으로 확인되었다. 이로부터, 본 발명에 있어서, 비표적 핵산에 대한 경합 프로브의 특이성(하이브리다이제이션의 열 안정성)을, 비표적 핵산에 대한 검출 프로브의 하이브리드다이제이션의 열 안정성에 대하여 보다 대폭적으로 높은 것으로, 특이성이 낮은 불일치의 하이브리다이즈에 의한 소광 피크를 보다 확실하게 억제할 수 있는 것으로 생각된다.
상기 실시예 3 및 실시예 4의 결과에서 알 수 있듯이, 바람직한 Tm 값 조건은, 검출할 표적 핵산의 배열 자체나 형광 표지 검출 프로브·경합 프로브가 각 배열의 어떤 영역을 커버하는지에 따라 다르며, 또한 각 프로브의 첨가 농도와 시료 중의 염농도 등에 의거하여 복잡하게 변화하고 있다. 그러나, 당업자는 상기 실시예 3 및 실시예 4에서 발견된 바람직한 Tm 값을 참고로 하여 본 발명에 따른 절차에 따라 실험을 실시하는 것으로, 본 발명의 효과를 달성하기 위해 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브의 염기 길이 및 염기 배열을 결정하는 것이 가능하며, 과도한 시행 착오를 필요로하지 않는다.
본 발명은 간편하고 확실하게 SNP 등의 1 염기의 차이를 판별하는 수단을 제공하며, 기존의 방법과 달리 Tm 값에 영향을 미치는 반응 시료의 염 농도 등의 조건의 엄격한 관리를 불필요하게 된 것에 의해, SNP 타이핑 기술의 단순화를 실현할 수 있으며, 유전자 검사, 신약 개발, 의료 진단 등 다양한 응용 가능성이 있다.
<110> Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha <120> Method for Detecting a Target Base Sequence, Method for Designing Probes, Process for Producing the same, and Kit <130> PCT2842EK <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotides as a detection probe <400> 1 aattcatgga ccagaacaac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotides as a competitive probe <400> 2 aattcatggt ccagaacaac 20 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctcacgtgac agaccgccgg ccgcgatcaa ggagttc 37 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cacccgtcgc actacgttgg gcccctcagg 30 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tggctggtgc cgaag 15 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cggatgtgcc cgatcgaa 18 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cagacgttga tcaacatccg 20 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cgcgtacacc gacagc 16 <210> 9 <211> 49 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 9 gtcaaccccg acagcgggtt gttctggtcc atgaattggc tcagctggc 49 <210> 10 <211> 49 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 10 gtcaaccccg acagcgggtt gttctggacc atgaattggc tcagctggc 49 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotides as a detection probe <400> 11 ccaattcatg gaccagaaca acc 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotides as a competitive probe complementary to T allele <400> 12 ccaattcatg gtccagaaca acc 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotides as a partially-competetive probe complement to T allele <400> 13 tggtccagaa caacccgctg tcg 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotides as a partially-competetive probe complement to T allele <400> 14 gtccagaaca acccgctgtc ggg 23

Claims (16)

  1. 핵산 시료로부터, 염기 변이 뉴클레오티드를 포함하는 표적 염기 배열(A)를 검출하는 방법으로서, 해당 방법은 이하의 단계:
    (1) 핵산 시료에, QP(Quenching 프로브/Primer) 법에 사용 가능한 형광 염료로 표지된 검출 프로브와, 경합 프로브를 가하여, 반응 시료를 얻는 것, 이에 따라, 반응 시료 중의 표적 염기 배열(A)를 가지는 표적 핵산에, 형광 표지 검출 프로브 또는 경합 프로브가 하이브리다이즈한다;
    (2) 반응 시료의 온도를 변화시키면서 형광 강도를 측정하는 것; 및
    (3) (2)의 측정 결과로부터 얻어진 온도 - 형광 강도 곡선을 1차 미분하는 것을 포함하고,
    여기에서,
    (i) 형광 표지 검출 프로브의 염기 배열은, 표적 염기 배열(A)에 상보적인 염기 배열(A')를 포함하고,
    (ii) 경합 프로브의 염기 배열은, 염기 변이 뉴클레오티드가 염기 미변이 뉴클레오티드에 옮겨져 있는 이외는 표적 염기 배열(A)와 동일한 염기 배열인 비표적 염기 배열(B)에 상보적인 염기 배열(B')를 포함하고,
    (iii) 형광 신호 검출 프로브 및 경합 프로브 각각의 염기 길이 및 염기 배열 및 핵산 시료에의 첨가량은, 이하의 순서:
    (a) 표적 핵산은 포함되어 있으나, 비표적 염기 배열(B)를 가지는 비표적 핵산은 실질적으로 포함되어 있지 않은 대조 표적 핵산 시료, 및 표적 핵산은 실질적으로 포함되지 않지만, 비표적 핵산은 포함되어 있는 대조 비표적 핵산 시료의 각각에, 형광 표지 검출 프로브와 경합 프로브을 가하여, 대조 표적 반응 시료 및 대조 비표적 반응 시료를 얻는 것;
    (b) 각 대조 반응 시료의 온도를 변화시키면서 형광 강도를 측정하는 것; 및
    (c) 측정 결과로부터 얻어진 온도 - 형광 강도 곡선을 각각 1차 미분하는 것에 따르면, 대조 표적 반응 시료의 1차 미분 곡선이 피크(극대값)를 가지나, 대조 비표적 반응 시료의 1차 미분 곡선이 피크를 실질적으로 가지지 않도록, 결정되어 있는 것을 특징으로 하는 상기의 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    이하의 단계:
    (4) (3)에서 얻어진 1차 미분 곡선이 피크를 가지는 경우, 핵산 시료 중에 표적 염기 배열(A)가 존재하는 것으로 판단하는 것을 더 포함하고,
    여기에서, 핵산 시료가 표적 핵산 외에, 비표적 핵산도 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    비표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 적어도 5℃ 높고,
    표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 낮은 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    비표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 적어도 10℃ 높고,
    표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 낮은 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    비표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 적어도 10℃ 높고,
    표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값 + 5℃를 초과하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    비표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 적어도 15℃ 높고,
    표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값 + 5℃를 초과하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    비표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 적어도 15℃ 높고,
    표적 핵산에 대해, 경합 프로브의 Tm 값이, 형광 표지 검출 프로브의 Tm 값보다 낮은 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (I) 표적 핵산 상의, 형광 표지 검출 프로브와 하이브리다이즈하는 영역이, 경합 프로브와 하이브리다이즈하는 영역을 포함하거나;
    (II) 표적 핵산 상의, 경합 프로브와 하이브리다이즈하는 영역이, 형광 표지 검출 프로브와 하이브리다이즈하는 영역을 포함하거나; 또는
    (III) 표적 핵산 상의, 경합 프로브와 하이브리다이즈하는 영역이, 형광 표지 검출 프로브와 하이브리다이즈하는 영역과 일치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    핵산 시료에의 경합 프로브의 첨가량이, 형광 표지 검출 프로브의 첨가량의 적어도 몰비로 10 배인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    핵산 시료에의 경합 프로브의 첨가량이, 형광 표지 검출 프로브의 첨가량의 적어도 몰비로 20 배인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    QP(Quenching 프로브/Primer) 법에 사용 가능한 형광 색소가, TAMRA(상표), BODIPY(등록 상표) FL, PACIFIC BLUE(상표) 및 CR6G(등록 상표)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 종의 형광 색소인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    핵산 시료가 생체에 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    염기 변이 뉴클레오티드가, 단일 염기 치환의 변이를 포함하는 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 기재된 방법에 사용 가능한 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브를 설계하는 방법으로서, 해당 방법은,
    (1') (a) ~ (c)에 따라, 대조 표적 반응 시료의 1차 미분 곡선이 피크(최대 값)을 가지는, 반면 비표적 반응 시료의 1차 미분 곡선이 피크를 실질적으로 가지지 않도록, 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브 각각의 염기 길이 및 염기 배열을 결정하는 것을 포함하는 상기 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 기재된 방법에 사용 가능한 형광 표지 검출 프로브 및 경합 프로브를 제조하는 방법으로서, 해당 방법은,
    (1") 제14항에 기재된 방법에 따라 설계된 각각의 염기 길이 및 염기 배열의 올리고 뉴클레오티드를 합성하는 것; 및
    (2") 형광 표지 검출 프로브의 올리고 뉴클레오티드를, QP법에 사용 가능한 형광 색소로 표지하는 것을 포함하는 상기 방법.
  16. 삭제
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