WO2011118603A1 - 競合プライマーによる標的塩基配列の検出方法 - Google Patents

競合プライマーによる標的塩基配列の検出方法 Download PDF

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base
competitive
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牧野　洋一
明男 山根
雅人 中山
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    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a target base sequence having a polymorphic base and a kit used in the method. More specifically, the present invention relates to a method for detecting a target base sequence with high accuracy by competing primers, and a kit used in the method.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2010-68490 filed in Japan on March 24, 2010, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • a single base difference in one gene is thought to cause the disease.
  • lifestyle-related diseases and cancer are thought to be affected by single base differences in multiple genes. Therefore, SNP analysis is considered to be extremely effective in drug development such as discovery of drug discovery targets or prediction of side effects. For this reason, analysis of SNPs is being promoted as a huge global project.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 So far, various methods for detecting minute differences in base sequences, especially differences in single bases have been studied (see Non-Patent Documents 1 and 2). However, in order to perform detection at a practical level, it is required to be excellent in all points such as low cost, simple method, short detection time, and accuracy of detection result. To date, however, no method is known to meet the above requirements.
  • the target gene fragment When detecting minute differences in genes, especially differences in single bases, the target gene fragment is generally contained only in a small amount. In this case, it is necessary to amplify the target gene in advance by some method. Examples of such a gene amplification method include a PCR (Polymerase Chain Reaction) method.
  • the TaqMan method using a probe with a fluorescent dye and a quencher (see Non-Patent Document 3) or mass spectrometry of DNA using a mass spectrometer is used.
  • MALDI-TOF / MS method (see Non-Patent Document 4) has been reported.
  • an Invader method (see Non-Patent Document 5) using an enzyme that recognizes and cleaves a DNA structure has been reported.
  • these methods are still expensive to implement and the probe design is complex.
  • Non-Patent Document 6 a method for simultaneously performing gene amplification and single nucleotide identification has been reported (see Non-Patent Document 6).
  • This method utilizes the fact that in the extension reaction of DNA polymerase, the extension reaction may or may not occur depending on whether or not the 3 ′ end of the primer is complementary to the template DNA in the sample (hereinafter referred to as a match). Is. That is, when a primer is designed so that the 3 ′ end of one primer has a base complementary to a single nucleotide polymorphism in a pair of primer sets used in the PCR reaction, the primer is perfectly matched with the template. In this case, an extension reaction occurs, and an amplification reaction is caused between the other primer.
  • the reaction is susceptible to the reaction conditions such as the amount of template, temperature, amount of primer, or concentration of dNTP as a reaction substrate. For this reason, it is not easy to always obtain reproducible data.
  • Non-Patent Document 7 a method of introducing an artificial mutation (a base mismatched with a template) near the 3 'end of a primer has been studied (see Non-Patent Document 7).
  • this method also requires a certain amount of effort for primer optimization, and the identification accuracy may be affected by the quality of the sample.
  • Patent Documents 1 to 4 a method of competing at least two kinds of primers labeled with a fluorescent dye or the like has been proposed (see Patent Documents 1 to 4).
  • the 3 'end of the primer or the vicinity of the end is aligned with the position of the base to be examined.
  • an extension reaction occurs.
  • a detection method using the fact that the extension reaction is unlikely to occur is called allele-specific PCR (ASP-PCR).
  • Non-Patent Document 8 When performing allele-specific PCR, the base discrimination accuracy when competing with two or more allele-specific primers and when each allele-specific primer is individually amplified may be higher when competing. I know (see Non-Patent Document 8). This is because when an allele different from the allele to be detected exists, a primer that matches the different allele binds preferentially to the target base sequence and suppresses the nonspecific extension reaction of the primer to be detected. Furthermore, efficient extension of primers from different alleles consumes materials necessary for the extension reaction, so that generation of primer dimers by primers that are mismatched to the allele to be detected can also be suppressed. Such a method of competing primers is called competitive oligonucleotide priming (COP). In Patent Documents 1 to 4, COP is used.
  • the competing primer having a small number of mismatch bases forms a double strand with the target nucleic acid. It is a method that utilizes the property of being easy to perform, and is an excellent method for simply detecting a single base mutation in a target nucleic acid. However, in this method, there is a possibility that a false positive is generated in the SNP analysis. This is thought to be due to the insufficient ability to suppress extension from competing primers with a large number of mismatched bases, since the competing primers are designed focusing on single nucleotide mutations in the target nucleic acid.
  • the allele-specific primer used in the allele-specific PCR is important for duplex stability with the target nucleic acid near the 3 ′ end, and a base other than the base to be identified is separated from the target nucleic acid near the 3 ′ end. Base identification can be further enhanced by setting so as not to be complementary.
  • a base for identifying the SNP is introduced at the 3 ′ end of the competitive primer, and further from the 3 ′ end.
  • An artificial mutation is introduced into any one or more of 2 to 5 bases.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a method for detecting a target base sequence with high discrimination accuracy while having the same simplicity as that of a conventional method, and a kit used for the method. With the goal.
  • the present inventors have found that the problem can be solved by examining the position of the mutation introduced into the competitive primer.
  • the present invention provides the following (1) to (14).
  • (1) A method for detecting a target base sequence having a polymorphic base wherein (a) a nucleic acid sample having a target nucleic acid comprising a base sequence containing the target base sequence is essentially complementary to the target base sequence At least one detection primer, at least one competitive primer that is essentially complementary to the target base sequence and that competitively anneals to the target nucleic acid with the detection primer, and at least one type And (b) using the target base sequence having a polymorphic base in the nucleic acid sample as a template, and competitively using the detection primer and the competitive primer on the target nucleic acid.
  • the extension product A or B wherein the detection primer is a match base complementary to a polymorphic base and a non-polymorphic base with respect to the target sequence And at least one mismatch base that is non-complementary to the base sequence, and the competitive primer is non-complementary to a mismatch base that is non-complementary to the polymorphic base and to a base other than the polymorphic base to the target sequence At least one mismatch base, and the position of the at least one mismatch base of the detection primer is less non-complementary to a base other than the polymorphic base of the competitive primer.
  • the common primer is capable of amplifying the target nucleic acid paired with the detection primer or the competitive primer, and a method for detecting a target base sequence .
  • the detection primer may have a match base complementary to the polymorphic base at the 3 ′ end or the second base from the 3 ′ end.
  • a mismatch base that is non-complementary to a base other than a polymorphic base is the detection primer.
  • the bases are located within 17 bases from the mismatch bases complementary to the polymorphic bases, and the mismatching bases are non-complementary to the polymorphic bases in the competitive primer.
  • the difference in chain length between the competitive primer and the detection primer may be within 16 bases.
  • the first mismatch base is located within 6 bases from the 3 ′ end, 2 mismatch bases are located 7 or more bases from the 3 ′ end to the 5 ′ end side, and the position of the first mismatch base of the detection primer is different from the position of the first mismatch base of the competitive primer,
  • the second mismatch base of the detection primer and the second mismatch base of the competitive primer may be different from each other.
  • the position of the second mismatch base of the detection primer and the competitive primer may be the same.
  • the steps (b) to (d) are performed by PCR, LAMP, NASBA, ICAN, TRC, SDA, TMA, SMAP, RPA, HDA It may be a step performed by one selected from the group consisting of: (8)
  • the method for detecting a target base sequence according to any one of (1) to (7) at least one of the detection primer, the competitive primer, or the common primer may be labeled.
  • the labeling substance used for the labeling may be at least one selected from the group consisting of a fluorescent dye and an energy absorbing substance.
  • the detection primer and the competitive primer are labeled with different types of labeling substances, respectively, and the step (e) The step of separately detecting the extension product from the detection primer and the extension product from the competitive primer may be used.
  • the step (e) is a step performed simultaneously with the steps (b) to (d), and is labeled.
  • This may be a step of detecting a state in which the extension product from the primer forms a double strand.
  • the step (e) is a step performed after the step (d), wherein the extension product has a melting curve or It may be a step of detecting using an amplification curve.
  • the step (e) may be a step of detecting using a QP (Quenching Probe / Primer) method. .
  • a kit for use in a method for detecting a target base sequence having a polymorphic base comprising at least one detection primer that is essentially complementary to the target base sequence; And at least one competitive primer that is complementary and anneals competitively with the detection primer to the target nucleic acid, and at least one common primer, the detection primer comprising a polymorphic base And at least one mismatch base that is non-complementary to a base other than the polymorphic base with respect to the target sequence, and the competitive primer is a mismatch base that is non-complementary to the polymorphic base. And at least one mismatch base that is non-complementary to a base other than a polymorphic base with respect to the target sequence, and that the detection primer has.
  • the position of the match base is different from the position of at least one mismatch base that is non-complementary to a base other than the polymorphic base of the competitive primer, and the common primer is paired with the detection primer or the competitive primer.
  • the target nucleic acid can be amplified, and the method comprises (a) adding the detection primer and the competitive primer to a nucleic acid sample having the target nucleic acid, and (b) Using the target base sequence having a polymorphic base as a template, annealing the detection primer and the competitive primer competitively to the target nucleic acid, performing an extension reaction, and synthesizing an extension product A; (c ) Annealing the extension product A obtained in the step (b) or the step (d) and the common primer to perform an extension reaction, (D) annealing the extension product B obtained in the step (c) and the detection primer or the competitive primer to synthesize the extension product A, and (e) the extension product A or Detecting B.
  • the target base sequence detection method of the present invention can be performed more simply.
  • the target base sequence detection method of the present invention is a method for detecting a target nucleic acid having a polymorphic base.
  • the target base sequence refers to a base sequence having a polymorphic base.
  • detecting a target base sequence means detecting whether or not the base sequence of a nucleic acid contained in a nucleic acid sample is the same base sequence as a known base sequence.
  • a nucleic acid having a polymorphism to be identified is referred to as a “target nucleic acid”.
  • the target nucleic acid is not particularly limited as long as it has a base sequence containing a polymorphic base and the base sequence has been clarified to such an extent that a primer capable of annealing with the target nucleic acid can be designed.
  • the polymorphic base possessed by the target base sequence may be an innate polymorphism such as SNP or an acquired polymorphism such as somatic mutation as long as it is a single nucleotide polymorphism.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • somatic mutation means a difference between cells of genes acquired in the same solid.
  • the mutation site means a site where the base is different in the sequence.
  • the mutation in the base sequence may include not only single base substitution but also substitution, deletion or insertion of a plurality of bases.
  • polymorphisms to be detected examples include genetic diseases, lifestyle-related diseases, various diseases such as cancer, gene polymorphisms related to drug metabolism, and the like.
  • the present invention relates to a gene polymorphism at position 1173 (1173C> T) in the intron 1 region of vitamin K epoxide reductase complex 1 (VKORC1), which is a gene related to the optimal dose of warfarin, and an oncogene. It is preferably used for detecting a mutation in the 12th or 13th codon of K-Ras.
  • the detection primer refers to a primer for detecting a target base sequence.
  • the detection primer has a match base complementary to the polymorphic base and at least one mismatch base other than the polymorphic base with respect to the target base sequence.
  • the number of mismatch bases that the detection primer has may be one or two or more. Preferably, it is 1 to 5, more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1 or 2.
  • the competitive primer is a primer that anneals competitively with the detection primer with respect to the region containing the polymorphic base in the target nucleic acid, and has a mismatch base that is non-complementary to the polymorphic base. Since the competitive primer has a mismatch base that is non-complementary to the polymorphic base, it does not form a base pair with the polymorphic base in the target nucleic acid when annealed to the target nucleic acid.
  • the competitive primer has at least one mismatch base other than the polymorphic base with respect to the target base sequence in addition to the mismatch base non-complementary to the polymorphic base.
  • the number of mismatched bases in the competitive primer may be one or two or more. Preferably, it is 1 to 5, more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1 or 2.
  • a match means a state in which a DNA base pair forming a double strand forms a Watson-Crick base pair, and a mismatch does not form a Watson-Crick base pair.
  • the mismatch base may be a natural base or an artificial base, but it must be different from the template base.
  • the position of at least one mismatch base that the detection primer has is different from the position of the mismatch base that the competitive primer has. Therefore, the base sequence differs by at least 3 bases between the detection primer and the competitive primer.
  • the position of the mismatched base refers to a position based on the base corresponding to the polymorphic base in the primer when the template and the primer form a double strand.
  • the polymorphic base detection accuracy can be improved by annealing both of the target nucleic acids competitively. This means that when there is an allele different from the allele to be detected (target nucleic acid in the present invention), a primer that can detect the target allele is used as a detection primer, and a primer that can detect a different allele is used as a competitive primer.
  • the competitive primer preferentially binds to the different alleles to suppress non-specific reaction of the detection primer. Further, since the extension from the competing primer proceeds efficiently due to the difference in stability near the 3 ′ end, the material necessary for the extension reaction is consumed, so that nonspecific amplification from the detection primer can also be suppressed.
  • the detection primer and the competitive primer are essentially complementary to the target base sequence.
  • being essentially complementary means that the oligonucleotide has a base sequence capable of forming a double-stranded state with a target nucleic acid having a specific sequence under the reaction conditions of the extension reaction. It does not necessarily have to be completely complementary, and may contain several mismatched base pairs.
  • the annealing regions may be different. From the viewpoint of competitively annealing to the target nucleic acid, it is preferable to design both primers so that the target nucleic acid and the competitive primer anneal in the same region as the region where the detection primer anneals.
  • the detection primer preferably has a base complementary to the polymorphic base at the 3 'end or the second base from the 3' end.
  • the competitive primer preferably has a non-complementary base to the polymorphic base at the 3 'end or the second base from the 3' end.
  • the detection primer for detecting this polymorphic base A is near the 3 ′ end.
  • the competitive primer can have a 5′-GCAG-3 ′ or 5′-GCAGGG sequence near the 3 ′ end.
  • the above example is an example, and the base to be mismatched can be selected from three types except for one base to be matched.
  • the position where the detection primer identifies the base of the template is more preferably the 3 'end or the second base from the 3' end, but it may be away from the 3 'end.
  • the base type of the base mismatched with the polymorphic base in the competitive primer base sequence is a base type that matches a polymorphism of a genotype other than the target base sequence.
  • the base sequence containing the polymorphic base A is used as the target base sequence, competition
  • any of A, G, and C may be selected as a non-complementary base to polymorphic base A, but it is preferable to select G that is complementary to the wild type.
  • one type of competitive primer may be used, or two or more types may be used.
  • a polymorphism having a plurality of genotypes such as K-ras described later, it is preferable to use a plurality of types of competing primers that match each genotype other than the genotype to be detected.
  • the common primer is capable of amplifying the target nucleic acid paired with the detection primer or the competitive primer, and has 10 to 30 bases on the 3 ′ end side of the extension product from the detection primer or the competitive primer. It has a sequence that is a match, and has the ability to extend in the PCR reaction using an extension product from a detection primer or a competitive primer as a template.
  • two or more types of common primers may be used, and two or more types of common primers may be in a competitive relationship. Two or more kinds of common primers having a competitive relationship may contain a polymorphic base sequence.
  • Mismatch bases that are non-complementary to the bases other than the polymorphic bases of the detection primer and competitive primer match bases that are complementary to the polymorphic bases in the detection primer, and non-complementary to polymorphic bases in the competitive primer It is preferable that any mismatched base is located within 17 bases, more preferably within 8 bases.
  • Each of the detection primer and the competitive primer may have a plurality of mismatch bases.
  • the first mismatch base is located within 6 bases from the 3 ′ end in the detection primer and the competitive primer, It is preferable that the 2 mismatch bases are located 7 or more bases from the 3 ′ end to the 5 ′ end. Further, the position of the first mismatch base of the detection primer is preferably different from the position of the first mismatch base of the competitive primer.
  • the second mismatch bases may have different positions from each other and may have different base types. That is, in the same position, the base species may be different.
  • “the second mismatch base of the detection primer and the second mismatch base of the competitive primer are different from each other” specifically means that the positions of the two are different or the positions of the two are different. It means the same and different base species.
  • the position of the second mismatch base in the detection primer and the competitive primer may be the same.
  • the second mismatch base is preferably 7 bases or more away from the 3 ′ end, and more preferably 9 bases or more away from the 3 ′ end.
  • the second mismatch base is arranged near the center of the primer because the efficiency of the amplification reaction from the detection primer can be increased.
  • the second mismatch base is preferably located at the 7th to 15th bases from the 3 ′ end, and is located at the 9th to 15th bases. It is more preferable.
  • the lengths of the detection primer and the competitive primer may affect the discrimination ability and reactivity.
  • a primer having a longer chain length tends to preferentially anneal to the target nucleic acid. Therefore, in order to detect the target base sequence with higher accuracy, the difference in chain length between the competitive primer and the detection primer is preferably within 16 bases, more preferably within 2 bases, and more preferably 1 base Is particularly preferable.
  • the competitive primer anneals in preference to the detection primer, and the annealing of the detection primer may be inhibited.
  • the chain length of the detection primer is long, the detection primer anneals in preference to the competitive primer, and the annealing of the competitive primer may be inhibited. For this reason, it is preferable that the chain length of a detection primer and a competition primer is comparable.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing one aspect of a conventional method for detecting a target base sequence.
  • a template S having a gene polymorphism (C> T) a template S having a gene polymorphism (C> T)
  • a detection primer primer A: equivalent to a forward primer
  • a competitive primer primer B: equivalent to a forward primer
  • Common primers corresponding to reverse primers
  • Primer A guanine as a base for detecting a polymorphic base at the 3 ′ end, and a mismatch base non-complementary to a base other than the polymorphic base at the second base from the 3 ′ end. Thymine has been introduced.
  • Primer B is a competitive primer.
  • primer B adenine as a mismatch base non-complementary to the polymorphic base at the 3 ′ end is non-complementary to a base other than the polymorphic base at the second base from the 3 ′ end.
  • thymine has been introduced.
  • the bases and introduction positions of the mutations introduced into the primers A and B are the same.
  • dNTP deoxynucleotide triphosphate
  • primer A and B primers A and B
  • detection primer or a competitive primer primers A and B
  • Round means two cycles in PCR.
  • 1 Round is an extension reaction after the detection primer or competing primer anneals with the template, and after denaturation, the extension product from the detection primer or competing primer and the common primer anneal, and the detection primer or competing primer It means a step of performing an extension reaction from a common primer using an extension product as a template.
  • the primer A has a higher efficiency of the extension reaction because the double strand formed with the template S is more stable than the primer B in the first round.
  • the difference between the specific extension efficiency from primer A and the nonspecific extension efficiency from primer B can be increased. This is because it can.
  • the extension product generated by the non-specific extension reaction in spite of a low frequency is replicated as a template for the common primer (template b) in the next cycle, and DNA containing a sequence complementary to the sequence of primer B (template) b ′) is synthesized.
  • Template a ′ or template b ′ is completely complementary to primer A or primer B, respectively, and is efficiently extended from the next round. Furthermore, in the next round, a mismatch base that is non-complementary to a base other than the polymorphic base of primer B is a match for template a ′. For this reason, primer B forms a double strand with template a ′ and undergoes an extension reaction. For this reason, after 2nd Round, the effect of the mismatch base introduced to increase the specificity of primer A and primer B is lost. Since the template a ′ increases exponentially every time Round is repeated, b and b ′ increase with the increase of the templates a and a ′ although the efficiency is lower than that of the specific extension reaction. Therefore, this method leaves room for improvement in terms of increasing the difference in extension efficiency between primer A and primer B relative to the template.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing one aspect of a conventional method for detecting a target base sequence.
  • primer A guanine is introduced at the 3 ′ end as a base for detecting a polymorphic base, and thymine is introduced as a mismatch base non-complementary to a base other than the polymorphic base at the second base from the 3 ′ end.
  • primer B adenine is introduced as a mismatch base non-complementary to the polymorphic base at the 3 ′ end, and cytosine is introduced as a mismatch base non-complementary to a base other than the polymorphic base at the second base from the 3 ′ end. Yes.
  • the introduction positions of the mutations introduced into the primers A and B are the same, but the bases are different.
  • the non-specific extension reaction to template a ′ is a mismatch of 2 bases at the 3 ′ end, and the effect of the mismatched base other than the position for detecting the polymorphic base persists, resulting in a non-specific reaction. Is suppressed.
  • the template a ′ continues to increase during the amplification process, it is necessary to suppress the non-specific extension reaction more effectively.
  • FIG. 3 and FIG. 4 show the case where the position of the mismatched base other than the base for detecting the polymorphism is different between the detection primer and the competitive primer in the present invention.
  • the configuration other than the primer is the same as that described with reference to FIG.
  • primer A has a match at the 3 ′ end to template S, but a mismatch at the second base from the 3 ′ end.
  • primer B is mismatched with respect to template S at the 3 'end and the 3rd base from the 3' end.
  • Primer B is mismatched with 3 bases at the 3 'end with respect to template a', and the nonspecific extension reaction is very effectively suppressed.
  • a mismatch base introduced in addition to a base for detecting a polymorphic base brings about a very large effect by changing the position between competing primers despite one base.
  • primer A has a match at the 3 ′ end to template S, but a mismatch at the second base from the 3 ′ end.
  • primer B is mismatched with template S at the 3 'end and the 5th base from the 3' end. Even in such a case, since the primer B has a mismatch between the 2 'base at the 3' end and the first base at the 5th base from the 3 'end with respect to the template a', the nonspecific reaction is effectively suppressed.
  • FIG. 5 shows the case where the base for detecting the polymorphic base is set to the second base from the 3 'end of the primer in the present invention.
  • the mismatch base introduced in addition to the base for detecting the polymorphic base is one base in each primer
  • primer B becomes a mismatch of 3 bases at the 3 ′ end with respect to the template a ′ and is non- Specific reactions are effectively suppressed.
  • FIG. 6 shows a case where three types of competitive primers are used in the present invention.
  • the configuration other than the primer is the same as that described with reference to FIG.
  • the mismatch site with the template S or template a ′ annealed by the detection primer and the competitive primer is underlined.
  • SNPs there are often two types of alleles, but in rare cases there are three types.
  • K-ras which is an oncogene.
  • the position where the K-ras mutation is detected is defined as the 3 ′ end of the primer.
  • Primer A detects cytosine bases
  • the 3 ′ end matches template S
  • thymine is introduced as a mismatched base with template S at the second base from the 3 ′ end.
  • Primer B detects a thymine base.
  • the 3 ′ end is mismatched with template S
  • thymine is introduced as a mismatched base with template S at the third base from the 3 ′ end.
  • Primer C detects a guanine base.
  • the 3 ′ end is mismatched with template S
  • thymine is introduced as a mismatched base with template S at the fourth base from the 3 ′ end.
  • primer D detects an adenine base.
  • the 3 ′ end is mismatched with template S, and thymine is introduced as a mismatched base with template S at the 5th base from the 3 ′ end.
  • each of the primers B, C, and D becomes a 3-base mismatch with the template a ′, and the nonspecific extension reaction from each primer is effectively suppressed. Therefore, in the present invention, even when competing for two or more types of allele-specific primers that compete with each other, nonspecific extension reaction can be performed by changing the position of the mutation to be introduced in addition to the base for identifying the mutation. Can be suppressed at the target level.
  • the effect of the present invention shown in FIG. 3 was simulated by calculation using Microsoft Excel. First, assuming that the SNP to be detected is cytosine or thymine, four types of primers were designed. The template and primer sequences are shown in Table 1.
  • Primer [1] is for C allele detection, the 3 ′ end is guanine, and the second base from the 3 ′ end is a thymine mismatched with the template.
  • Primer [2] is for T allele detection. The 3 ′ end is adenine, and the second base from the 3 ′ end is a thymine mismatched with the template in the same manner as primer [1].
  • Primer [3] is for T allele detection like primer [2], but the mismatched base introduced at the second base from the 3 ′ end is cytosine, and is different from primer [1].
  • Primer [4] is for T allele detection, and has a thymine as a mismatch base at the third base from the 3 ′ end so as to be different from the position at which the mismatch base was introduced in primer [1].
  • the initial template concentration (mold S) is 1.
  • the ratio of template S or extension product (template a ′, template b ′) forming a double strand with each primer is made equal.
  • the extension efficiency from the common primer is 1.
  • Table 2 assumes the primer extension efficiency when competing primer [1] with primer [2], primer [3] or primer [4]. Although extension efficiency is a rather bold assumption, the order of the number of mismatches and the efficiency of the extension reaction is a reasonable assumption. It is assumed that the mold S is a C allele. Double-stranded [1], [2], [3] and [4] correspond to primer [1], primer [2], primer [3] and primer [4], where S is template S, [ 1] 'is obtained by extending from the common primer using the extension product from primer [1] as a template, and [2]' is obtained by extending from the common primer using the extension product from primer [2] as a template. The same applies to [3] ′ and [4] ′ below. The upper part of the sequence shows the primer and the lower part shows the template sequence. In the primer, the base mismatched with the template is underlined.
  • Tables 3 to 8 show the calculation results up to 20 Round when the primer [1] is competed with the primer [2], the primer [3], or the primer [4].
  • the base mismatched with the template is shown in italics.
  • graphs showing the amount of product extended from the primer at each Round are shown in FIGS. 7A to 9B.
  • FIG. 7A shows the breakdown of the extension product template extended from primer [1]
  • FIG. 7B shows the extension product template breakdown extended from primer [2].
  • the identification accuracy is higher for the combination of primers [1] and [4] than for the combination of primers [1] and [2] and the combination of primers [1] and [3]. Therefore, it was confirmed that changing the position of the mismatch base introduced into the detection primer and the competitive primer in both directions leads to improvement in the identification accuracy.
  • the method for detecting a target base sequence of the present invention comprises: (a) at least one detection primer that is essentially complementary to the target base sequence in a nucleic acid sample having a target nucleic acid comprising a base sequence including the target base sequence. And at least one competitive primer that is essentially complementary to the target base sequence and that competitively anneals to the target nucleic acid with the detection primer, and at least one common primer And (b) using the target base sequence having a polymorphic base in the nucleic acid sample as a template, annealing the detection primer and the competitive primer competitively with the target nucleic acid, and performing an extension reaction.
  • a step of synthesizing the extension product A (c) annealing the extension product A obtained in the step (b) or the step (d) and the common primer, and extending And (d) annealing the extension product B obtained in the step (c) and the detection primer or the competitive primer to synthesize the extension product A, and (E) a step of detecting the extension product A or B.
  • each step will be described.
  • step (a) a nucleic acid sample having a target nucleic acid composed of a base sequence including a target base sequence, one kind of detection primer, at least one kind of competitive primer, and at least one kind of common primer And are added.
  • the nucleic acid sample is not particularly limited as long as it is a sample containing nucleic acid, and is preferably a sample obtained by extracting nucleic acid from animals, plants, microorganisms, cultured cells and the like. Extraction of nucleic acids from animals and the like can be performed by a known method such as a phenol / chloroform method.
  • the nucleic acid contained in a nucleic acid sample is a double stranded nucleic acid, it is preferable to make it a single stranded nucleic acid beforehand.
  • a detection primer and a competitive primer can be annealed to the single-stranded nucleic acid in the step (b) described later.
  • the extracted double-stranded nucleic acid can be made into a single strand by a known method such as application of heat energy.
  • the nucleic acid in the nucleic acid sample is not particularly limited as long as it is DNA or RNA, and may be natural or synthesized.
  • natural nucleic acids include genomic DNA, mRNA, rRNA, hnRNA and the like recovered from living organisms.
  • synthesized nucleic acids DNA synthesized by a known chemical synthesis method such as ⁇ -cyanoethyl phosphoramidite method, DNA solid phase synthesis method, nucleic acid synthesized by a known nucleic acid synthesis method such as PCR, Examples include cDNA synthesized by reverse transcription reaction.
  • oligonucleotide means not only natural and non-natural, but also one having the same function as deoxyribonucleotide (DNA) or ribonucleotide (RNA), and includes artificial nucleic acids such as PNA and LNA.
  • a primer is a short nucleic acid fragment that is in a double-stranded state with a template and has a role of supplying a 3 ′ hydroxyl group when DNA polymerase or reverse transcriptase synthesizes DNA.
  • step (b) a target base sequence having a polymorphic base in a nucleic acid sample is used as a template, and the target nucleic acid is annealed competitively with the detection primer and the competitive primer, and an extension reaction is performed. To synthesize extension product A.
  • reaction conditions for the detection primer or competing primer to anneal to the target nucleic acid are not particularly limited, and the normal conditions such as temperature, pH, salt concentration, buffer solution, etc. are considered in consideration of the Tm value of each primer. Under the conditions.
  • the extension reaction is a nucleic acid synthesis reaction performed using a reagent such as dNTP or DNA polymerase, and includes an extension reaction using reverse transcriptase using RNA as a template.
  • DNA polymerase is a general term for enzymes that synthesize a DNA strand having a base sequence complementary to a template DNA annealed with primers.
  • the DNA polymerase used in the present invention is not particularly limited, but it is preferable to use a thermostable DNA polymerase such as Taq DNA polymerase, Tth DNA polymerase, Vent DNA polymerase, etc., and a hot start function to prevent extension before the start of the test.
  • a DNA polymerase having it is particularly preferable to use a DNA polymerase having no 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity in order to identify the base near the 3 ′ end of the primer.
  • a DNA polymerase having no 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity in order to identify the base near the 3 ′ end of the primer.
  • the extension product A obtained in the step (b) or the step (d) and the common primer are annealed, an extension reaction is performed, and an extension product B is synthesized.
  • the extension product B obtained in the step (c) is annealed with the detection primer or the competitive primer to synthesize the extension product A.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • LAMP Long-Mediated Isothermal Amplification
  • NASBA Nucleic Acid Sequence Based Amplification
  • ICAN Isothermal and Chimerical primer-initiated Amplification of Nucleic acids
  • TRC Transcription Reverse -Translation Concerted
  • SDA String Displacement Amplification
  • TMA Transcribion Mediated
  • SMAP SMart Amplification Process
  • RPA Recombines polymerase amplification
  • HDA Helicase-dependent amplification
  • the optimal concentration of the detection primer, competing primer, or common primer can be determined as appropriate, but the concentration of the common primer should be set below the total concentration of the detection primer and competing primer. More preferably, it is 25% or less of the total concentration of the detection primer and the competitive primer. This is because, as PCR progresses, detection primers that match the template are preferentially consumed, and the relative concentration of competing primers that are mismatched with the template increases, thereby preventing the discrimination accuracy from falling. . By reducing the concentration of the common primer, the common primer is consumed together with the detection primer that matches the template, and the identification system can be maintained.
  • the extension product A or B is detected.
  • the method for detecting the extension product from the primer in step (e) is not particularly limited, and includes labeling of the primer with a fluorescent dye, electrophoresis, high performance liquid chromatography and mass spectrum, melting curve analysis, growth curve analysis, etc. Any method capable of analyzing nucleic acids can be mentioned.
  • the extension product By labeling the detection primer, the competitive primer, or the common primer with a labeling substance, the extension product can be detected using the labeling substance as an index.
  • a labeling substance include fluorescent dyes, energy absorbing substances, radioisotopes, chemiluminescent substances, enzymes, antibodies and the like.
  • the position at which the primer is labeled is not particularly limited, but a position that does not inhibit the extension reaction is preferable.
  • the method of distinguishing from which primer was labeled by labeling with a different fluorescent dye is preferable because it has little influence on specificity and is a simple method without the need to measure a melting curve.
  • Non-Patent Document 9 More preferred is a method of introducing fluorescein and acridine into the 5 ′ end of the primer.
  • this primer exists in a single-stranded state, even if it is irradiated with the excitation wavelength of fluorescein, it is quenched by acridine which is an energy absorbing substance, and fluorescence from fluorescein is not observed.
  • acridine which is also an intercalator, binds to a double-stranded nucleic acid, so that the distance from fluorescein is increased and fluorescence from fluorescein cannot be absorbed.
  • the primer for which the primer extension reaction has occurred emits fluorescence (see FIG. 10). Therefore, by making the fluorescent dyes for the detection primer and the competitive primer different, it is possible to determine which primer is the extension product.
  • a primer that detects a mutant allele is used as a detection primer
  • a primer that can detect a wild type allele is used as a competitive primer.
  • the detection primer and the competitive primer are labeled with different fluorescent dyes and the extension product of each primer is detected. Multiple polymorphisms can be detected.
  • the position at which the fluorescent dye is introduced is not particularly limited, but a position that does not inhibit the polymerase reaction is preferable because the competitive primer is labeled.
  • pyrene may be used instead of acridine. Since pyrene is also energy-absorbing and can bind to double strands, double-strand formation reactions can be examined in the same manner as acridine.
  • LUX trade name
  • Amplifluor trade name
  • UNI primer trade name
  • a suitable detection method using a fluorescent dye includes a detection method using a QP (Quenching Probe / Primer) method.
  • the QP method is a detection method that utilizes the fact that fluorescence is quenched when a guanine base is spatially close to a certain fluorescent dye.
  • the presence or absence of proximity between the detection primer and the target nucleic acid can be detected by labeling the detection primer of the present invention with a fluorescent dye that quenches upon proximity to the guanine base.
  • the guanine base may be a target nucleic acid or a detection primer, but is preferably a detection primer.
  • the fluorescent dye that quenches by the proximity to the guanine base it can be performed using a fluorescent dye usually used in the QP method.
  • a fluorescent dye usually used in the QP method for example, BODIPY FL (trade name, manufactured by Invitrogen), PACIC BLUE (trade name, Invitrogen), CR6G (trade name, manufactured by Invitrogen), TAMRA (trade name, manufactured by Invitrogen) and the like.
  • the length of the competing two primers is changed, and the length of the extension product is changed, so that it can be detected by the difference in the degree of migration.
  • ethidium bromide or cyber green is more preferable because it binds to double-stranded DNA and emits fluorescence.
  • Cyber Green is a fluorescent dye, it can be distinguished from which primer the product is extended by measuring the melting curve described later.
  • high-performance liquid chromatography can distinguish extension products from two primers.
  • the lengths of extension products from the two primers may be different, or the primers may be labeled with substances having different masses. The latter case is preferable because it has little influence on specificity.
  • the step (e) may be provided simultaneously with the nucleic acid amplification step comprising the steps (b) to (d), or may be performed after the nucleic acid amplification step.
  • Examples of the identification method during the nucleic acid amplification step include a method of measuring the double-stranded state of a labeled primer or its extension product.
  • This discrimination method utilizes the difference in ability of the competing primer forming a double strand with the template or the extension product from the competing primer to form a double strand.
  • the extension product from the primer may be measured for fluorescence at a temperature at which a double strand is formed. In this method, only the extended product from the competing primer can be detected, so that discrimination can be performed with higher accuracy.
  • Examples of the identification method after the nucleic acid amplification step include a method of measuring a melting curve. This is a method that utilizes the temperature dependence of the amplification product transitioning from double-stranded to single-stranded. In this method, it is possible to detect only the amplification product by the two competing primers, and therefore it is possible to identify with higher accuracy.
  • the detection method of the present invention can be used for a DNA sequence inspection instrument such as a real-time PCR apparatus.
  • a DNA sequence inspection instrument such as a real-time PCR apparatus.
  • the sample DNA is placed in a container to which the above-described reagents necessary for PCR and primers are added, and real-time PCR is performed to detect extension products from the detection primers. Scattering and contamination of the amplification product can be prevented by performing detection while sealing the sample DNA.
  • the target base sequence detection kit of the present invention is a kit used in the above method for detecting a target base sequence having a polymorphic base, and includes the detection primer, a competitive primer, and a common primer.
  • a cell destruction reagent for sample pretreatment, a reagent for detecting the label of the labeling substance, and the like may be combined.
  • VK1Mtg The four competitive primers (VK1Mtg, VK1Mat, VK1Mac, VK1Wat) and the common primer (VK1R2) shown in Table 9 were purchased from Greiner Japan from those synthesized by a conventional synthesis method.
  • the genomic DNA used as a template was purchased from Coriell.
  • position 1173 and the polymorphic base recognition site are shown in bold, and the mismatch base introduction site is underlined.
  • “Acridine” indicates acridine
  • 6-FAM indicates 6-fluorocein labeling
  • the numbers in the right column indicate sequence numbers corresponding to the sequences before labeling shown in the sequence listing.
  • FIG. 11 is a diagram showing the result of Comparative Example 1 as a negative first derivative curve of the melting curve.
  • the detection primer VK1Wat-Acridine
  • the energy absorbing substance acridine is intercalated into the double stranded nucleic acid, and the amount of energy absorbed by acridine is reduced.
  • the fluorescence intensity increases.
  • the melting curve is a curve obtained by measuring the fluorescence intensity until the double-stranded nucleic acid amplified by the PCR method is denatured into a single-stranded state by gradually raising the temperature from a low temperature.
  • the negative first derivative curve of the melting curve indicates the amount of fluorescence change with respect to temperature change, and the place where the change amount is maximum is Tm of double-stranded DNA.
  • Comparative Example 1 it has already been found that the extension product from VK1Wat-Acridine has the largest amount of change between the single-stranded state and the double-stranded state in the range of 83 ° C to 86 ° C. Therefore, when a peak is observed in the negative first derivative curve of the melting curve in the range of 83 ° C. to 86 ° C., it can be determined from VK1Wat-Acryline that an extension reaction has occurred. When the detection primer set and the competitive primer set of Comparative Example 1 were used, the same result was obtained regardless of which C allele or T allele was used as a template. This suggests that the extension reaction is not specific to the C allele in the above primer set.
  • Comparative Example 2 The same reaction and the same analysis as in Comparative Example 1 were performed except that VK1Wat-Acryline was used as a detection primer and VK1Mac was used as a competitive primer. The results are shown in FIG.
  • FIG. 12 is a diagram showing the result of Comparative Example 2 as a negative first derivative curve of the melting curve.
  • amplification from VK1 Wat-Aciline was predominantly observed when the C allele was used as a template.
  • a slight peak is seen when the T allele is used as a template. This suggests that the suppression of elongation from VK1Wat-Acridine is not sufficient when the T allele is used as a sample.
  • Example 1 The same reaction and the same analysis as in Comparative Example 1 were performed except that VK1Wat-Acryline was used as a detection primer and VK1Mtg was used as a competitive primer. The results are shown in FIG.
  • FIG. 13 is a diagram showing the result of Example 1 as a negative first derivative curve of a melting curve.
  • Example 2 The same reaction and the same analysis as in Comparative Example 1 were performed except that VK1Mtg-Acridine was used as a detection primer and VK1Wat was used as a competitive primer. The results are shown in FIG.
  • FIG. 14 is a diagram showing the result of Example 2 as a negative first derivative curve of the melting curve.
  • Example 2 it has already been found that the extension product from VK1Mtg-Acridine has the largest amount of change between the single-stranded state and the double-stranded state in the range of 83 ° C to 86 ° C. Therefore, when a peak is observed in the negative first derivative curve of the melting curve in the range of 83 ° C. to 86 ° C., it can be determined that the extension reaction has occurred from the fluorescently labeled VK1Mtg-Acridine.
  • the primer set of Example 2 is the same as the primer set of Example 1 except that a fluorescent label is introduced into the mutant primer, and the base sequence set is the same. Therefore, from the results of Examples 1 and 2, it became clear that the presence or absence of the extension reaction from the fluorescently labeled primer can be determined by fluorescent labeling of either VK1Wat or VK1Mtg. Therefore, by introducing fluorescent dyes having different fluorescence wavelengths into VK1Wat and VK1Mtg, extension reactions from the respective fluorescently labeled primers can be measured simultaneously.
  • VKORC1 vitamin K epoxide reductase complex 1
  • warfarin 1173C> T
  • Table 11 a detection primer (VK1Mtg-pyren) for newly identifying the VKORC1 gene polymorphism was prepared.
  • an amino-modifier C6 dA (Glen Research) was introduced into the second base adenine from the 5 'end, and 6-fluorocein (Glen Research) was introduced into the 5' end.
  • As a competitive primer and a common primer those purchased from Greiner Japan which were synthesized by a conventional synthesis method were used. A plurality of competitive primers were prepared with different mismatch base introduction positions. Others are the same as described in Comparative Example 1.
  • Example 3 The reaction mixture in which VK1ORC1 gene polymorphism C or T allele is used as a template, VK1Wat-pyrene as a detection primer, VK1M4t as a competitive primer, and VK1R2 as a common primer is mixed is as shown in Table 12.
  • the above reaction solution is set in a real-time PCR system (Roche, “LightCycler”), held at 95 ° C. for 1 minute to denature the DNA polymerase antibody, followed by two-step PCR at 58 ° C. for 20 seconds and 95 ° C. for 5 seconds.
  • the melting curve analysis was performed from 95 ° C. to 40 ° C.
  • template was made into negative control. The results are shown in FIG.
  • FIG. 15 is a diagram showing the result of Example 3 as a negative first derivative curve of a melting curve.
  • Example 4 The same reaction and the same analysis as in Example 3 were performed except that VK1M5t was used as a competitive primer. The results are shown in FIG.
  • FIG. 16 is a diagram showing the results of Example 4 as a negative first derivative curve of a melting curve.
  • the detection primer and competitive primer set of Example 4 were used, the same results as in Example 3 were obtained. Accordingly, even when the mismatched base of the competitive primer is located at the 5th base from the 3 'end, it is suggested that the C allele specificity is superior as in the case of being located at the 3rd base from the 3' end in Example 1. It was done.
  • Example 5 The same reaction and the same analysis as in Example 3 were performed except that VK1M8t was used as a competitive primer. The results are shown in FIG.
  • FIG. 17 is a diagram showing the result of Example 5 as a negative first derivative curve of the melting curve.
  • the detection primer set and the competitive primer set of Example 5 were used, the same results as in Example 3 were obtained. Therefore, even when the mismatching base of the competitive primer is located at the 8th base from the 3 ′ end, it is suggested that the C allele specificity is superior as in the case of being located at the 3rd base from the 3 ′ end in Example 1. It was done.
  • Example 6 The same reaction and the same analysis as in Example 3 were performed except that VK1Mtg-pyrene was used as a detection primer and VK1W4t was used as a competitive primer. The results are shown in FIG.
  • FIG. 18 is a diagram showing the result of Example 6 as a negative first derivative curve of the melting curve.
  • the detection primer and competitive primer set of Example 6 were used, the same results as in Example 2 were obtained. Therefore, it was suggested that even when a mismatch base was introduced at the fourth base from the 3 ′ end of the competitive primer in the primer set for detecting mutation, the T allele specificity was more excellent.
  • Example 7 The same reaction and the same analysis as in Example 6 were performed except that VK1W5t was used as a competitive primer. The results are shown in FIG.
  • FIG. 19 is a diagram showing the result of Example 7 as a negative first derivative curve of the melting curve.
  • Example 8 The same reaction and the same analysis as in Example 7 were performed except that VK1W8t was used as a competitive primer. The results are shown in FIG.
  • FIG. 20 is a diagram showing the result of Example 8 as a negative first derivative curve of the melting curve.
  • the detection primer set and the competitive primer set of Example 8 were used, the same results as in Example 6 were obtained. Therefore, it was suggested that even when a mutation was introduced at the 8th base from the 3 ′ end of the competitive primer in the primer set for detecting the mutation, the T allele specificity was more excellent.
  • the composition shown in Table 11 is a reaction mixture in which VK1ORC1 gene polymorphism C allele or T allele is used as a template, detection primer and competitive primer set shown in Table 13 is mixed, and VK1R2 is mixed as a common primer. It prepared so that it might become.
  • the above reaction solution is set in a real-time PCR system (Roche, “LightCycler”), kept at 95 ° C. for 1 minute to denature the DNA polymerase antibody, and then 2-step PCR at 62 ° C. for 20 seconds and 95 ° C. for 5 seconds.
  • the melting curve analysis was performed from 95 ° C. to 40 ° C.
  • template was made into negative control. The results are shown in FIGS.
  • 21 to 30 are graphs showing the results of Examples 9 to 18 as negative first derivative curves of melting curves.
  • the detection primer and competitive primer set of Examples 9 to 13 were used, the same results as in Example 3 were obtained, but when the detection primer and competitive primer set of Examples 14 to 18 were used. The same results as in Example 6 were obtained.
  • VKORC1 vitamin K epoxide reductase complex 1
  • warfarin 1173C> T
  • Table 14 a detection primer (VK1Wat-P-FAM1) for newly identifying the VKORC1 gene polymorphism was prepared.
  • amino-modifier C6 dC (Glen Research) was introduced into cytosine at the 4th base from the 5 ′ end, and fluorescein dT (Glen Research) was introduced into the 6th thymine from the 5 ′ end.
  • the introduced product was purchased from Nippon Bio Service Co., Ltd., and 1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester (Invitrogen) was used for pyrene modification to the amino group.
  • the competitive primer and the common primer shown in Table 14 those purchased from Greiner Japan which were synthesized by a conventional synthesis method were used. A plurality of competitive primers with different chain lengths were prepared.
  • the composition shown in Table 10 is a reaction mixture in which VKORC1 gene polymorphism C allele or T allele is used as a template, detection primer and competitive primer set shown in Table 15 is mixed, and VK1R2 is mixed as a common primer. It prepared so that it might become.
  • the reaction solution is set in a real-time PCR system (Roche, “LightCycler 480”), held at 95 ° C. for 1 minute to denature the DNA polymerase antibody, and then a two-step PCR at 64 ° C. for 30 seconds and 95 ° C. for 5 seconds. For 60 cycles.
  • the results obtained by reacting using the C allele as a template are shown in FIG.
  • Example 21 to 26 using a competitive primer 2 to 16 bases longer than the detection primer were more reactive than Example 27 using a competitive primer 20 bases longer than the detection primer.
  • Example 19 and Example 20 using a competitive primer having the same chain length as the detection primer or one base longer than Examples 21 to 26 using a competitive primer 2 to 16 bases longer than the detection primer was also confirmed to be excellent in reactivity.
  • VKORC1 vitamin K epoxide reductase complex 1
  • a detection primer VK1Wat-P-FAM2 to 8 for newly identifying a VKORC1 gene polymorphism was prepared.
  • amino-modifier C6 dC (Glen Research) was introduced into cytosine at the 4th base from the 5 ′ end, and fluorescein dT (Glen Research) was introduced into the 6th thymine from the 5 ′ end.
  • the introduced product was purchased from Nippon Bio Service Co., Ltd., and 1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester (Invitrogen) was used for pyrene modification to the amino group.
  • the competitive primer and common primer shown in Table 16 those purchased from Greiner Japan which were synthesized by a conventional synthesis method were used. A plurality of competitive primers were prepared with different positions for introducing the second mismatch base.
  • the composition shown in Table 10 is a reaction mixture in which VKORC1 gene polymorphism C allele or T allele is used as a template, detection primer and competitive primer set shown in Table 17 is mixed, and VK1R2 is mixed as a common primer. It prepared so that it might become.
  • the reaction solution is set in a real-time PCR system (Roche, “LightCycler 480”), held at 95 ° C. for 1 minute to denature the DNA polymerase antibody, and then a two-step PCR at 64 ° C. for 30 seconds and 95 ° C. for 5 seconds. For 60 cycles.
  • the results obtained by reacting using the C allele as a template are shown in FIG.
  • Examples 29 to 35 using a set of detection primer and competitive primer in which the second mismatch base is separated from the 3 ′ end by 7 bases or more are more reactive than Example 28 in which the second mismatch base is not introduced. It was confirmed that it was excellent in performance. In particular, it was confirmed that Examples 29 to 34 using a set of detection primer and competitive primer in which the second mismatch base was 9 bases or more away from the 3 ′ end were particularly excellent in reactivity.
  • the genotype identification accuracy is very excellent, and therefore it can be used in the field of clinical examination, particularly in the field of single nucleotide polymorphism and somatic mutation. It is.

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Abstract

　多型塩基を有する標的塩基配列を検出する方法であって、（ａ）標的塩基配列を含む塩基配列からなる標的核酸を有する核酸試料に、少なくとも１種の検出用プライマーと、少なくとも１種の競合プライマーと、少なくとも１種の共通プライマーと、を添加する工程と、（ｂ）前記標的核酸に、前記検出用プライマーと前記競合プライマーとを競合的にアニールさせ、伸長産物Ａを合成する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）または後記工程（ｄ）で得られた前記伸長産物Ａと前記共通プライマーをアニールさせ、伸長産物Ｂを合成する工程と、（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた伸長産物Ｂと前記検出用プライマーまたは前記競合プライマーをアニールさせ、伸長産物Ａを合成する工程と、（ｅ）前記伸長産物ＡまたはＢを検出する工程と、を有する。

Description

競合プライマーによる標的塩基配列の検出方法
多型塩基を有する標的塩基配列の検出方法及び前記方法に用いられるキットに関する。さらに詳述すると、プライマーを競合させることによって、高精度に標的塩基配列を検出する方法、及び前記方法に用いられるキットに関する。
本願は、２０１０年３月２４日に、日本に出願された特願２０１０－６８４９０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近時、世界的なヒトゲノム解析により、その約３１億個の塩基対の配列が明らかにされ、ヒトの遺伝子の数が約３～４万個であることが明らかとなった。
ヒトには個体間で塩基配列の違いが存在し、特定の集団人口の１％以上の頻度で存在するものを遺伝子多型と呼んでいる。その中でも遺伝子の塩基配列が一塩基だけ異なっている一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）は、種々の疾患と関連性があることが示唆されている。例えば、ヒトの遺伝子病は、一つの遺伝子中の一塩基の違いが病気の原因となると考えられている。また、生活習慣病やガンなどは、複数の遺伝子における一塩基の違いが影響していると考えられている。
したがって、ＳＮＰの解析は、創薬ターゲットの探索または副作用の予見などの医薬品の開発において、極めて有効であると考えられる。このため、ＳＮＰの解析は世界的な巨大プロジェクトとして押し進められている。
薬物の効果や副作用の程度に個人差があることの原因の一つとして、個々人の薬物代謝に関わる酵素群の違いが挙げられる。その違いも遺伝子上のわずかな違いによるものであることが最近明らかにされつつある。
そこで、あらかじめ患者の遺伝子を解析することによって、最適な薬剤を選択し患者に投与する方法が考えられている。さらに、単一遺伝子疾患のみならず多因子疾患についても、遺伝子診断の意義が急速に高まりつつある。
また、病原細菌やウイルスを標的とした薬物の効果は、同一種であっても、個体毎に異なることがあり、これらは個体毎の遺伝子の微細な違いによることが多い。このような外来因子である病原細菌やウイルスの遺伝子診断も、今後は検査対象が確実に増加することが予想される。
このようにポストゲノム時代の医療においては、ヒトや病原微生物の遺伝子の微細な違い、とりわけ一塩基の違いを検出できることは重要であり、今後もその重要性が増すと予想される。
これまでに、塩基配列における微細な違い、とりわけ一塩基の違いを検出する方法が種々検討されている（非特許文献１～２参照。）。
しかしながら、実用レベルでの検出を行うためには、低コスト、方法の簡便性、検出時間の短さ、検出結果の正確さなどの点がいずれも優れていることが要求される。しかしながら、現在までのところ、上記要求を満たす方法は知られていない。
　遺伝子の微細な違い、とりわけその一塩基の違いを検出する場合、目的とする遺伝子断片は試料中にわずかしか含まれていないのが一般的である。この場合、目的とする遺伝子を、何らかの方法によって予め増幅させておくことが必要となる。このような遺伝子増幅法としては、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　 Ｃｈａｉｎ　 Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が挙げられる。
一般的に、目的の遺伝子の一塩基の違いを検出するためには、遺伝子増幅の段階と、増幅させた遺伝子の一塩基の違いを調べる段階との二段階の工程を必要とする（非特許文献２参照。）。しかしながら、二段階の工程を必要とする方法は、工程が複数あるため、処理が煩雑となる。
このような二段階の工程の煩雑さを改善するため、例えば、蛍光色素とクエンチャーがついたプローブを用いるＴａｑＭａｎ法（非特許文献３参照。）や、質量分析計によるＤＮＡの質量分析を利用したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法（非特許文献４参照。）等が報告されている。また、遺伝子の増幅を必要としない方法として、ＤＮＡの構造を認識して切断する酵素を用いるＩｎｖａｄｅｒ法（非特許文献５参照。）が報告されている。しかしながら、これらの方法は依然として実施するコストが高く、またプローブの設計も複雑である。
一方、遺伝子の増幅と一塩基の識別とを同時に行う方法が報告されている（非特許文献６参照。）。この方法は、ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応において、プライマーの３’末端がサンプル中の鋳型ＤＮＡと相補的（以下、マッチ）であるか否かによって、伸長反応が起こったり起こらなかったりすることを利用するものである。すなわち、ＰＣＲ反応に用いられる一対のプライマーセットにおいて、一方のプライマーの３’末端が一塩基多型に相補的な塩基を有るようにプライマーを設計すると、プライマーが鋳型と完全にマッチである場合には、伸長反応が起こり、他方のプライマーとの間で増幅反応が引き起こされる。ところが、一方のプライマーと鋳型との間で一塩基のミスマッチがある場合には、そのプライマーからの伸長反応は起こりにくく、他方のプライマーとの間での増幅反応も起こりにくい。このようにして増幅反応による増幅産物の量によって、一塩基の識別を行うことができる。この方法によれば、増幅反応後にさらに操作を行って一塩基を識別する必要がない。
しかしながら、この方法は、反応条件、例えば、鋳型の量、温度、プライマーの量、または反応基質であるｄＮＴＰの濃度などにより、反応が影響を受けやすい。このため、常に再現性のあるデータを得ることが容易でない。
別の方法として、例えば、プライマーの３’末端付近に人工的な変異（鋳型とミスマッチである塩基）を導入する方法が検討されている（非特許文献７参照。）。しかしながら、この方法でも、プライマーの最適化に一定の労力を必要とし、識別精度も試料の品質によって影響を受けることがある。
これらの問題を解決するために、蛍光色素などで標識された少なくとも二種類のプライマーを競合させる方法が提案されている（特許文献１～４参照。）。
　特許文献１～３に提案されている様な、プライマーの３’末端または末端付近を調べたい塩基の位置に合わせ、サンプル中の標的核酸の塩基とマッチしたときは伸長反応が起こり、ミスマッチのときには伸長反応が起こりにくいことを利用した検出方法をアレル特異的ＰＣＲ（ＡＳＰ－ＰＣＲ）という。
アレル特異的ＰＣＲを行う際に、２つ以上のアレル特異的なプライマーを競合させた場合と各アレル特異的プライマーを個別に増幅させた場合での塩基識別精度は、競合させたほうが高いことが分かっている（非特許文献８参照。）。これは、検出したいアレルと異なるアレルが存在するとき、異なるアレルにマッチするプライマーが、標的塩基配列に優先的に結合し、検出したいプライマーの非特異伸長反応を抑えるためである。さらに、異なるアレルにマッチするプライマーからの伸長が効率よく進むことで、伸長反応に必要な材料が消費されるため、検出したいアレルにミスマッチであるプライマーによるプライマーダイマーの生成を抑制することもできる。このようにプライマーを競合させる方法を競合オリゴヌクレオチドプライミング（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｒｉｍｉｎｇ、ＣＯＰ）といい、特許文献１～４においては、ＣＯＰが用いられている。
特許文献１で提案されている方法は、標的核酸に対して、ミスマッチ塩基の数が異なる複数の競合プライマーを用いた時に、ミスマッチ塩基の数が少ない競合プライマーが標的核酸と２本鎖を形成しやすいという性質を利用した方法であり、標的核酸中の一塩基変異を簡便に検出する場合には優れた方法である。
しかしながら、この方法では、ＳＮＰ解析の際に擬陽性が出る可能性がある。これは、標的核酸中の一塩基変異にのみ着目して競合プライマーの設計を行っているため、ミスマッチ塩基の数が多い競合プライマーからの伸長を抑制する能力が不十分であるためと考えられる。
アレル特異的ＰＣＲに用いられるアレル特異的プライマーは、３’末端付近での標的核酸との２本鎖の安定性が重要であり、３’末端付近において、識別したい塩基以外の塩基が標的核酸と相補にならないように設定することでさらに塩基識別を高めることができる。
特許文献２で提案されているＳＮＰ検出方法においては、特許文献１で問題となっていた擬陽性を低減すべく、競合プライマーの３’末端にＳＮＰを識別する塩基を導入し、更に３’末端から２～５塩基のいずれか１つ以上に人工的な変異を導入している。
また、特許文献３で提案されている塩基多型の検出方法においては、競合プライマーの３’末端から５番目までの位置に人工的な変異を導入している。
特許文献２～３に提案されている方法は、競合プライマー間で同じ位置に同じ変異を導入したものであり、プライマーの３’末端付近が標的核酸とマッチであれば効率よく伸長反応が進み、ミスマッチ塩基が増えるほど伸長効率が落ちることを利用したものである。また、ミスマッチ塩基が増えることによってプライマーと標的核酸との２本鎖が全体として不安定になることも伸長効率の低下に関連している。
特許文献４で提案されている塩基多型の検出方法では、競合プライマー間で同じ位置に異なる変異を導入することが記載されている。
特許第２７６０５５３号公報 特開２００３－５２３７２号公報 特開２００５－２８７４９９号公報 特許第４２２８０４１号公報
Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ　ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｐｒｅｓｓ、１９９６年 Ａｈｍａｄｉａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第３２巻、第１１２２～１１３７頁、２００２年 Ｌｉｖａｋら、ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌ．、第５巻、第３５７～３６２頁、１９９５年 Ｇｒｉｆｆｉｎら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第１８巻、第７７～８４頁、２０００年 Ｒｙａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、第４巻、第１３５～１４４頁、１９９９年 Ｏｋａｙａｍａら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、第１１４巻、第１０５～１１３頁、１９８９年 Ｎｅｗｔｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、第１７巻、第２５０３～２５１６頁、１９８９年 Ｍｙａｋｉｓｈｅｖら、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．、第１１巻、第１６３～１６９頁、２００１年 Ｓｈｉｎｏｚｕｋａら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第１０巻、１３７７～１３７８頁、１９９４年
しかしながら、これらの方法でも、鋳型と３’末端付近がミスマッチとなる競合プライマーからの伸長を抑制する能力が依然として不十分である。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、従来の方法と同様の簡便さを持ちながら、識別精度の高い標的塩基配列の検出方法、及び前記方法に用いられるキットを提供することを目的とする。
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、競合プライマーに導入する変異の位置を検討することにより、課題を解決できることを見出した。
すなわち本発明は、下記（１）～（１４）を提供するものである。
（１）多型塩基を有する標的塩基配列を検出する方法であって、（ａ）標的塩基配列を含む塩基配列からなる標的核酸を有する核酸試料に、前記標的塩基配列に本質的に相補的な少なくとも１種の検出用プライマーと、前記標的塩基配列に本質的に相補的であり、かつ前記標的核酸に対して前記検出用プライマーと競合的にアニールする少なくとも１種の競合プライマーと、少なくとも１種の共通プライマーと、を添加する工程と、（ｂ）前記核酸試料中の多型塩基を有する標的塩基配列を鋳型として用い、前記標的核酸に、前記検出用プライマーと前記競合プライマーとを競合的にアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ａを合成する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）または後記工程（ｄ）で得られた前記伸長産物Ａと前記共通プライマーをアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ｂを合成する工程と、（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた伸長産物Ｂと前記検出用プライマーまたは前記競合プライマーをアニールさせ、伸長産物Ａを合成する工程と、（ｅ）前記伸長産物ＡまたはＢを検出する工程と、を有し、前記検出用プライマーは、多型塩基に相補的なマッチ塩基と、前記標的配列に対して多型塩基以外の塩基に非相補的な少なくとも１つのミスマッチ塩基とを有し、前記競合プライマーは、多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基と、前記標的配列に対して多型塩基以外の塩基に非相補的な少なくとも１つのミスマッチ塩基を有し、前記検出用プライマーが有する少なくとも１つのミスマッチ塩基の位置が、前記競合プライマーが有する多型塩基以外の塩基に非相補的な少なくとも１つのミスマッチ塩基の位置とは異なり、前記共通プライマーは、前記検出用プライマー又は前記競合プライマーと対になって前記標的核酸を増幅しうるものであることを特徴とする標的塩基配列の検出方法。
（２）前記（１）の標的塩基配列の検出方法において、前記検出用プライマーは、３’末端または３’末端から２塩基目に多型塩基に相補的なマッチ塩基を有してもよい。
（３）前記（１）又は（２）の標的塩基配列の検出方法においては、前記検出用プライマー及び前記競合プライマーにおいて、多型塩基以外の塩基に非相補的なミスマッチ塩基が、前記検出用プライマーでは多型塩基に相補的なマッチ塩基から、前記競合プライマーでは多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基からいずれも１７塩基以内に位置し、それぞれのプライマーでミスマッチ塩基の位置が異なってもよい。
（４）前記（１）～（３）の標的塩基配列の検出方法において、前記競合プライマーと前記検出用プライマーの鎖長の差は１６塩基以内であってもよい。
（５）前記（１）～（３）の標的塩基配列の検出方法においては、前記検出用プライマー及び前記競合プライマーにおいて、第１のミスマッチ塩基が、３’末端から６塩基以内に位置し、第２のミスマッチ塩基が、３’末端から７塩基以上５’ 末端側に位置し、前記検出用プライマーの第１のミスマッチ塩基の位置が、前記競合プライマーの第１のミスマッチ塩基の位置とは異なり、　前記検出用プライマーの第２のミスマッチ塩基と前記競合プライマーの第２のミスマッチ塩基が互いに異なっていてもよい。
（６）前記（５）の標的塩基配列の検出方法において、前記検出用プライマー及び前記競合プライマーが有する前記第２のミスマッチ塩基の位置が同じであってもよい。
（７）前記（１）～（６）の標的塩基配列の検出方法において、前記工程（ｂ）～（ｄ）が、ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＮＡＳＢＡ、ＩＣＡＮ、ＴＲＣ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＳＭＡＰ、ＲＰＡ、ＨＤＡよりなる群から選ばれる１つにより行われる工程であってもよい。
（８）前記（１）～（７）のいずれかの標的塩基配列の検出方法において、前記検出用プライマー、前記競合プライマー、または前記共通プライマーの少なくとも１つが標識されていてもよい。
（９）前記（８）の標的塩基配列の検出方法において、前記標識に用いられる標識物質が、蛍光色素及びエネルギー吸収性物質からなる群より選ばれる少なくとも１つであってもよい。
（１０）前記（８）又は（９）に記載の標的塩基配列の検出方法において、前記検出用プライマーと、前記競合プライマーとを、異なる種類の標識物質でそれぞれ標識し、前記工程（ｅ）が、前記検出用プライマーからの伸長産物と、前記競合プライマーからの伸長産物とを別個に検出する工程であってもよい。
（１１）前記（８）～（１０）のいずれかの標的塩基配列の検出方法において、前記工程（ｅ）は、前記工程（ｂ）～（ｄ）と同時に行われる工程であって、標識されたプライマーからの伸長産物が、２本鎖を形成している状態を検出する工程であってもよい。
（１２）前記（８）～（１０）のいずれかの標的塩基配列の検出方法において、前記工程（ｅ）は、前記工程（ｄ）後に行われる工程であって、前記伸長産物の融解曲線または増幅曲線を用いて検出する工程であってもよい。
（１３）前記（８）～（１２）のいずれかの標的塩基配列の検出方法において、前記工程（ｅ）は、ＱＰ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ　Ｐｒｏｂｅ／Ｐｒｉｍｅｒ）法、を用いて検出する工程であってもよい。
（１４）多型塩基を有する標的塩基配列を検出する方法に用いるキットであって、前記標的塩基配列に本質的に相補的な少なくとも１種の検出用プライマーと、前記標的塩基配列に本質的に相補的であり、かつ前記標的核酸に対して前記検出用プライマーと競合的にアニールする少なくとも１種の競合プライマーと、少なくとも１種の共通プライマーと、を含み、前記検出用プライマーは、多型塩基に相補的なマッチ塩基と、前記標的配列に対して多型塩基以外の塩基に非相補的な少なくとも１つのミスマッチ塩基とを有し、前記競合プライマーは、多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基と、前記標的配列に対して多型塩基以外の塩基に非相補的な少なくとも１つのミスマッチ塩基を有し、前記検出用プライマーが有する少なくとも１つのミスマッチ塩基の位置が、前記競合プライマーが有する多型塩基以外の塩基に非相補的な少なくとも１つのミスマッチ塩基の位置とは異なり、前記共通プライマーは、前記検出用プライマー又は前記競合プライマーと対になって前記標的核酸を増幅しうるものであり、前記方法は、（ａ）標的核酸を有する核酸試料に、前記検出用プライマーと前記競合プライマーとを添加する工程と、（ｂ）前記核酸試料中の多型塩基を有する標的塩基配列を鋳型として用い、前記標的核酸に、前記検出用プライマーと前記競合プライマーとを競合的にアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ａを合成する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）または後記工程（ｄ）で得られた前記伸長産物Ａと前記共通プライマーをアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ｂを合成する工程と、（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた伸長産物Ｂと前記検出用プライマーまたは前記競合プライマーをアニールさせ、伸長産物Ａを合成する工程と、（ｅ）前記伸長産物ＡまたはＢを検出する工程と、を有している。
本発明の標的塩基配列の検出方法によれば、従来の方法と同様の簡便さを持ちながら、一塩基多型および一塩基の体細胞変異を高精度に識別することができる。
また、本発明の標的塩基配列検出キットによれば、本発明の標的塩基配列の検出方法をより簡便に行うことをできる。
従来の標的塩基配列の検出方法の一態様を模式的に示した図である。 従来の標的塩基配列の検出方法の一態様を模式的に示した図である。 本発明の標的塩基配列の検出方法の一態様を模式的に示した図である。 本発明の標的塩基配列の検出方法の一態様を模式的に示した図である。 本発明の標的塩基配列の検出方法の一態様を模式的に示した図である。 本発明の標的塩基配列の検出方法の一態様を模式的に示した図である。 プライマー［１］と［２］を競合させた場合に各Ｒｏｕｎｄでプライマーから伸長される産物量を表す図である。 プライマー［１］と［２］を競合させた場合に各Ｒｏｕｎｄでプライマーから伸長される産物量を表す図である。 プライマー［１］と［３］を競合させた場合に各Ｒｏｕｎｄでプライマーから伸長される産物量を表す図である。 プライマー［１］と［３］を競合させた場合に各Ｒｏｕｎｄでプライマーから伸長される産物量を表す図である。 プライマー［１］と［４］を競合させた場合に各Ｒｏｕｎｄでプライマーから伸長される産物量を表す図である。 プライマー［１］と［４］を競合させた場合に各Ｒｏｕｎｄでプライマーから伸長される産物量を表す図である。 １本鎖状態と２本鎖状態を見分ける方法を模式的に示した図である。○；アクリジン、◇；フルオロセイン 比較例１の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。 比較例２の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。 実施例１の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。 実施例２の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。 実施例３の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。 実施例４の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。 実施例５の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。 実施例６の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。 実施例７の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。 実施例８の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。 実施例９の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。 実施例１０の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。 実施例１１の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。 実施例１２の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。 実施例１３の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。 実施例１４の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。 実施例１５の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。 実施例１６の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。 実施例１７の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。 実施例１８の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。 実施例１９～２７の結果を増幅曲線で示した図である。 実施例２８～３５の結果を増幅曲線で示した図である。
　本発明の標的塩基配列の検出方法は、多型塩基を有する標的核酸を検出する方法である。
　本発明において、標的塩基配列とは、多型塩基を有する塩基配列をいう。
本発明において、標的塩基配列を検出するとは、核酸試料中に含まれている核酸の塩基配列が、既知の塩基配列と同一の塩基配列であるか否かを検出することをいう。
　本明細書および特許請求の範囲において、識別対象である多型を有する核酸を「標的核酸」という。
標的核酸は、多型塩基を含有する塩基配列からなり、前記標的核酸とアニール可能なプライマーを設計できる程度に塩基配列が明らかにされているものであれば、特に限定されるものではない。
また、標的塩基配列が有する多型塩基は、一塩基多型であれば、ＳＮＰのような先天的な多型であってもよく、体細胞変異等の後天的な多型であってもよい。
ＳＮＰ（一塩基多型）とは、同一生物種の個体間のゲノム塩基配列中に一塩基の違いがあり、その変異が集団内で１％以上の頻度で見られるものと定義されている。
一方、体細胞変異とは同一固体内において後天的に生じた遺伝子の細胞間での違いを意味する。また、変異部位とは、配列中における塩基の相違する部位を意味する。塩基配列中の変異は一塩基置換のみならず複数の塩基が置換、欠失あるいは挿入されている場合がある。
検出の対象とする多型としては、たとえば、遺伝病、生活習慣病、がん等の各種疾患、薬物代謝に関連する遺伝子の多型等が挙げられる。本発明は、特に、ワルファリンの至適投与量に関連する遺伝子であるビタミンＫエポキシド還元酵素複合体１（ＶＫＯＲＣ１）のイントロン１領域の１１７３位における遺伝子多型（１１７３Ｃ＞Ｔ）や、がん遺伝子Ｋ－Ｒａｓの１２番目又は１３番目のコドンにおける変異の検出に好適に用いられる。
本発明において、検出用プライマーとは、標的塩基配列を検出するプライマーをいう。
検出用プライマーは、多型塩基に相補的なマッチ塩基と、前記標的塩基配列に対して、多型塩基以外に少なくとも１つのミスマッチ塩基とを有する。
検出用プライマーが有するミスマッチ塩基の数は、１つでもよく、２つ以上でもよい。好ましくは、１～５であり、より好ましくは、１～３であり、特に好ましくは１又は２である。
本発明において、競合プライマーとは、標的核酸中の多型塩基を含む領域に対して、前記検出用プライマーと競合的にアニールするプライマーであり、多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基を有する。競合プライマーは、多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基を有するため、標的核酸にアニールした際に、標的核酸中の多型塩基とは塩基対を形成しない。また、競合プライマーは、多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基に加えて、前記標的塩基配列に対して、多型塩基以外に少なくとも１つのミスマッチ塩基を有する。
競合プライマーが有するミスマッチ塩基の数は、１つでもよく、２つ以上でもよい。好ましくは、１～５であり、より好ましくは、１～３であり、特に好ましくは１又は２である。
尚、本発明において、マッチとは、２本鎖を形成しているＤＮＡ塩基対がワトソンクリック型塩基対を形成している状態を意味し、ミスマッチとはワトソンクリック型塩基対を形成していない状態を意味する。ワトソンクリック型塩基対とはデオキシリボ核酸の２本のポリヌクレオチド分子が、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）（もしくはウラシル（Ｕ））、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）という組を作り、水素結合で繋がったものをいう。ミスマッチ塩基は天然塩基でも人工塩基でも構わないが、鋳型の塩基と異なっている必要がある。
検出用プライマーが有する少なくとも１つのミスマッチ塩基の位置は、前記競合プライマーが有するミスマッチ塩基の位置とは異なる。従って、検出用プライマーと競合プライマーとの間では、塩基配列が少なくとも３塩基異なる。
ここで、ミスマッチ塩基の位置とは、鋳型とプライマーが２本鎖を形成したときに、プライマー中において多型塩基に対応する塩基を基準とした位置をいう。
標的核酸に対して両者を競合的にアニールさせることにより、多型塩基検出精度を向上させることができる。これは、検出したいアレル（本発明における標的核酸）と異なるアレルが存在するとき、目的のアレルを検出できるプライマーを検出用プライマーとし、異なるアレルを検出できるプライマーを競合プライマーとして用いた場合には、当該異なるアレルに競合プライマーが優先的に結合することにより、検出用プライマーの非特異反応を抑えるためである。また、３’末端付近の安定性の違いから競合プライマーからの伸長が効率よく進むことで、伸長反応に必要な材料が消費されるため、検出用プライマーからの非特異増幅を抑えることもできる。
本発明において、検出用プライマー及び競合プライマーは、標的塩基配列に本質的に相補的である。ここで、本発明において本質的に相補的であるとは、オリゴヌクレオチドが、伸長反応の反応条件下において、特定の配列を持つ標的核酸と２本鎖状態を形成することのできる塩基配列を持つことを意味し、必ずしも完全に相補的である必要はなく、いくつかのミスマッチ塩基対を含んでいてもよい。
また、検出用プライマー及び競合プライマーは、標的塩基配列中であれば、アニールする領域が異なっていてもよい。標的核酸に競合的にアニールさせる点からは、検出用プライマーがアニールする領域と同じ領域において、標的核酸と競合プライマーとがアニールするように、両プライマーを設計することが好ましい。
本発明において検出用プライマーは、３’末端、または３’末端から２塩基目に多型塩基に相補的な塩基を有することが好ましい。標的核酸に競合的にアニールさせる点から、競合プライマーは、３’末端、または３’末端から２塩基目に多型塩基に非相補的な塩基を有することが好ましい。
例えば、標的塩基配列が５’－ＡＴＧＣＡＴＧＣ－３’であり、５’末端から５塩基のＡが多型塩基であったときに、この多型塩基Ａを検出する検出用プライマーは３’末端付近の配列を５’－ＧＣＡＴ－３’または５’－ＧＣＡＴＧ－３’とすることができる。このとき競合プライマーは、３’末端付近の配列を５’－ＧＣＡＧ－３’ または５’－ＧＣＡＧＧとすることができる。前記の例は一例であり、ミスマッチにする塩基はマッチになる１種の塩基を除いて３種類の中から選ぶことができる。検出用プライマーが鋳型の塩基を識別する位置は３’末端、または３’末端から２塩基目がより好ましいが、３’末端から離れていてもよい。
　競合プライマー塩基配列中の、多型塩基とミスマッチにする塩基の塩基種は、標的塩基配列以外の遺伝子型の多型とマッチする塩基種とすることが好ましい。例えば、野生型がＣであり、変異型がＡである多型を検出する場合であって、変異型を検出する場合に、多型塩基Ａを含む塩基配列を標的塩基配列とする場合、競合プライマーは、多型塩基Ａと非相補的な塩基として、Ａ、Ｇ、Ｃのいずれを選択してもよいが、野生型と相補的であるＧを選択することが好ましい。
　本発明において、競合プライマーは、１種類を用いてもよく、２種類以上を用いてもよい。例えば、後述するＫ－ｒａｓのように、複数の遺伝子型がある多型の場合には、検出対象である遺伝子型以外の各遺伝子型にそれぞれマッチする複数種類の競合プライマーを用いることが好ましい。
本発明において共通プライマーとは、検出用プライマー又は競合プライマーと対になって標的核酸を増幅しうるものであり、検出用プライマー又は競合プライマーからの伸長産物の３’末端側の１０～３０塩基とマッチである配列を持ち、ＰＣＲ反応において検出用プライマー又は競合プライマーからの伸長産物を鋳型として伸長を行う能力を持つものをいう。本発明においては、２種類以上の共通プライマーを用いてもよく、２種類以上の共通プライマーが競合関係にあってもよい。競合関係にある２種類以上の共通プライマーは多型塩基配列を含んでいてもよい。
検出用プライマー及び競合プライマーが有する多型塩基以外の塩基に非相補的なミスマッチ塩基が、前記検出用プライマーでは多型塩基に相補的なマッチ塩基から、前記競合プライマーでは多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基から、いずれも１７塩基以内に位置することが好ましく、８塩基以内に位置することがより好ましい。
検出用プライマー及び競合プライマーは、それぞれ複数のミスマッチ塩基を有してもよい。検出用プライマー及び競合プライマーがそれぞれ２つのミスマッチ塩基を有している場合には、前記検出用プライマー及び前記競合プライマーにおいて、第１のミスマッチ塩基が、３’末端から６塩基以内に位置し、第２のミスマッチ塩基が、３’末端から７塩基以上５’ 末端側に位置していることが好ましい。
更に、検出用プライマーの第１のミスマッチ塩基の位置が、前記競合プライマーが有する第１のミスマッチ塩基の位置とは異なっていることが好ましい。
また、検出用プライマー及び競合プライマーにおいて、第２のミスマッチ塩基は、互いに位置が異なっていてもよく、塩基種が異なっていてもよい。
つまり、同じ位置の場合には、塩基種が異なっていてもよい。
　本発明において、「前記検出用プライマーの第２のミスマッチ塩基と前記競合プライマーの第２のミスマッチ塩基が互いに異なる」とは、具体的には、両者の位置が異なる場合、又は、両者の位置が同じであり、かつ塩基種が異なる場合を意味する。
本発明において、検出プライマーと競合プライマーにおける、第２のミスマッチ塩基の位置が同じであってもよい。
検出用プライマー及び競合プライマーにおいて、第２のミスマッチ塩基は、３’末端から７塩基以上離れていることが好ましく、３’末端から９塩基以上離れていることがより好ましい。
また、第２のミスマッチ塩基は、プライマーの中央付近に配置することが、検出プライマーからの増幅反応の効率を上げることができる点で好ましい。例えば、２０～２５塩基のプライマーを用いた場合には、第２のミスマッチ塩基は、３’末端から７～１５塩基目に位置していることが好ましく、９～１５塩基目に位置していることがより好ましい。
　検出プライマーおよび競合プライマーの長さは、識別能や反応性に影響を与える場合がある。例えば、鎖長が長いプライマーほど標的核酸に優先的にアニールする傾向にある。従って、より精度よく標的塩基配列を検出するためには、前記競合プライマーと前記検出用プライマーの鎖長の差は１６塩基以内であることが好ましく、２塩基以内であることがより好ましく、１塩基以内であることが特に好ましい。
例えば、鎖長に差があり競合プライマーの鎖長が長い場合には、競合プライマーが、検出用プライマーよりも優先してアニールし、検出プライマーのアニールが阻害される場合がある。逆に、検出プライマーの鎖長が長い場合には、検出プライマーが、競合プライマーよりも優先してアニールし、競合プライマーのアニールが阻害される場合がある。このため、検出プライマーと競合プライマーの鎖長は同程度であることが好ましい。
次に、本発明の標的塩基配列の検出方法について、図１～図６を用いてより詳細に説明する。
図１は、従来の標的塩基配列の検出方法の一態様を模式的に示した図である。
図１には反応組成物の一部として、遺伝子多型（Ｃ＞Ｔ）を有する鋳型Ｓ、検出用プライマー（プライマーＡ：フォワードプライマーに相当）、競合プライマー（プライマーＢ：フォワードプライマーに相当）及び共通プライマー（リバースプライマーに相当）が挙げられている。
検出用プライマー及び競合プライマーがアニールした鋳型Ｓとのミスマッチ部位に下線を付した。
プライマーＡは、検出用プライマーであり、プライマーＡにおいて、３’末端に多型塩基を検出する塩基としてグアニン、３’末端から２塩基目に多型塩基以外の塩基に非相補的なミスマッチ塩基としてチミンが導入されている。
また、プライマーＢは、競合プライマーであり、プライマーＢにおいて、３’末端に多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基としてアデニン、３’末端から２塩基目に多型塩基以外の塩基に非相補的なミスマッチ塩基としてチミンが導入されている。
ここで、プライマーＡ及びＢに導入された変異の塩基及び導入位置は同じである。
鋳型Ｓに、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼ及び共通プライマーと共に２種類のプライマー（プライマーＡ及びＢ）を同時に作用させることで、検出用プライマー又は競合プライマーと、共通プライマーとの間で遺伝子が増幅される。
ここで、本明細書中において、ＲｏｕｎｄとはＰＣＲにおける２サイクルをいう。例えば１Ｒｏｕｎｄとは、検出用プライマー又は競合プライマーが鋳型とアニールした後、伸長反応し、変性後に検出用プライマー又は競合プライマーからの伸長生成物と共通プライマーがアニールし、検出用プライマー又は競合プライマーからの伸長産物を鋳型として共通プライマーから伸長反応する工程を意味する。
図１において、１ｓｔ　Ｒｏｕｎｄ目ではプライマーＡはプライマーＢと比較して鋳型Ｓと形成した２本鎖がより安定であるために伸長反応の効率が高い。両方のプライマーの３’末端から２塩基目に鋳型Ｓとミスマッチになるチミンを導入することにより、プライマーＡからの特異的伸長効率とプライマーＢからの非特異的伸長効率の差を大きくすることができるためである。
しかし、低頻度ながらも非特異的伸長反応によって生じた伸長産物は、次のサイクルで共通プライマーの鋳型（鋳型ｂ）となって複製され、プライマーＢの配列に相補的な配列を含むＤＮＡ（鋳型ｂ’）が合成される。鋳型ａ’あるいは鋳型ｂ’は、それぞれプライマーＡあるいはプライマーＢと完全に相補的であり、次のＲｏｕｎｄからはいずれも効率よく伸長される。
さらに、次のＲｏｕｎｄにおいて、プライマーＢの多型塩基以外の塩基に非相補的なミスマッチ塩基は、鋳型ａ’に対してはマッチとなる。このため、プライマーＢは、鋳型ａ’と２本鎖を形成し、伸長反応する。このため２ｎｄ　Ｒｏｕｎｄ以降は、プライマーＡとプライマーＢの特異性を高めるために導入したミスマッチ塩基の効果がなくなってしまう。鋳型ａ’はＲｏｕｎｄを繰り返すごとに指数関数的に増加するため、特異的伸長反応に比べて効率は低いものの鋳型ａおよびａ’の増加に伴ってｂおよびｂ’が増加する。
従って、当該方法は、鋳型に対してプライマーＡとプライマーＢの伸長効率の差をいかに大きくするという点で改良の余地を残している。
従来の標的塩基配列の検出方法として、検出用プライマー及び競合プライマーの間で同じ位置に異なる変異を導入している場合を、図２を用いてより詳細に説明する。
図２は、従来の標的塩基配列の検出方法の一態様を模式的に示した図である。プライマーＡにおいて、３’末端に多型塩基を検出する塩基としてグアニン、３’末端から２塩基目に多型塩基以外の塩基に非相補的なミスマッチ塩基としてチミンが導入されている。また、プライマーＢにおいて、３’末端に多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基としてアデニン、３’末端から２塩基目に多型塩基以外の塩基に非相補的なミスマッチ塩基としてシトシンが導入されている。
ここで、プライマーＡ及びＢに導入された変異の導入位置は同じであるが、塩基は異なる。図１と比較すると、鋳型ａ’に対する非特異的伸長反応は３’末端が２塩基のミスマッチとなり、多型塩基を検出するための位置以外に導入したミスマッチ塩基の効果が持続し非特異的反応は抑制される。
しかしながら、鋳型ａ’は増幅の過程で増え続けるため、より効果的な非特異伸長反応の抑制が必要である。
　次に本発明の検出方法を図３～５を用いて説明する。
図３、図４は、本発明において、多型を検出する塩基以外に導入したミスマッチ塩基の位置が検出用プライマーと競合プライマー間で異なる場合である。プライマーの構成以外は、図１で説明したものと同様であるため説明を省略する。検出用プライマー及び競合プライマーがアニールした鋳型Ｓ又は鋳型ａ’とのミスマッチ部位に下線を付した。
図３において、プライマーＡは鋳型Ｓに対して３’末端はマッチであるが、３’末端から２塩基目がミスマッチである。一方、プライマーＢは鋳型Ｓに対して３’末端と３’末端から３塩基目がミスマッチである。この場合、２ｎｄ　Ｒｏｕｎｄ以降、プライマーＢは鋳型ａ’に対して３’末端で３塩基がミスマッチとなり、非特異伸長反応は非常に効果的に抑制される。多型塩基を検出する塩基以外に導入するミスマッチ塩基は、１塩基にもかかわらず競合するプライマー間で位置を変えることで、非常に大きな効果をもたらす。
　図４において、プライマーＡは鋳型Ｓに対して３’末端はマッチであるが、３’末端から２塩基目がミスマッチである。一方、プライマーＢは鋳型Ｓに対して３’末端と３’末端から５塩基目がミスマッチである。この様な場合でもプライマーＢは鋳型ａ’に対して３’末端の２塩基および３’末端から５塩基目の一塩基がミスマッチになるので非特異反応は効果的に抑制される。
　図５は、本発明において、多型塩基を検出する塩基をプライマーの３’末端から２塩基目に設定した場合を示したものである。この場合も多型塩基を検出するための塩基以外に導入したミスマッチ塩基がそれぞれのプライマーで一塩基であるにもかかわらずプライマーＢは鋳型ａ’に対して３’末端で３塩基のミスマッチとなり非特異反応は効果的に抑制される。
図６は、本発明において、競合プライマーを３種類用いた場合を示したものである。プライマーの構成以外は、図１で説明したものと同様であるため説明を省略する。検出用プライマー及び競合プライマーがアニールした鋳型Ｓ又は鋳型ａ’とのミスマッチ部位に下線を付した。
一般的なＳＮＰにおいてはアレルの種類は２種類であることが多いが、まれには３種類の場合がある。さらに、がん遺伝であるＫ－ｒａｓにおいては一箇所で可能性のある変異がすべて見出されている。このような場合、それぞれ４種類の塩基に対応する４種類のプライマーを競合させることが好ましい。
図６において、Ｋ－ｒａｓの変異を検出する位置をプライマーの３’末端とする。
プライマーＡはシトシン塩基を検出するもので、３’末端は鋳型Ｓとマッチであり、３’末端から２塩基目に鋳型Ｓとミスマッチな塩基としてチミンを導入している。
プライマーＢはチミン塩基を検出するもので、３’末端は鋳型Ｓとミスマッチであり、さらに３’末端から３塩基目に鋳型Ｓとミスマッチな塩基としてチミンを導入している。
プライマーＣはグアニン塩基を検出するもので、３’末端は鋳型Ｓとミスマッチであり、さらに３’末端から４塩基目に鋳型Ｓとミスマッチな塩基としてチミンを導入している。
同様にプライマーＤはアデニン塩基を検出するもので、３’末端は鋳型Ｓとミスマッチであり、さらに３’末端から５塩基目に鋳型Ｓとミスマッチな塩基としてチミンを導入している。
この場合、プライマーＢ、ＣおよびＤそれぞれは鋳型ａ’と３塩基ミスマッチになり、各プライマーからの非特異伸長反応が効果的に抑制される。
よって、本発明では競合する２種以上のアレル特異的なプライマーを競合させる場合においても、変異を識別する塩基以外に導入する変異の位置をそれぞれのプライマーで変えることにより、非特異伸長反応を実用的レベルで抑制することが可能となる。
　図３で示した本発明による効果について、マイクロソフト・エクセルを用いた計算によりシミュレーションを行った。まず、検出するＳＮＰがシトシンかチミンであるかを想定し、４種類のプライマーを設計した。鋳型およびプライマーの配列を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 太字：多型塩基位置　　　　下線：鋳型（Ｃアレル）とミスマッチな塩基
　プライマー［１］はＣアレル検出用であり、３’末端はグアニンで、３’末端から２塩基目は鋳型とミスマッチなチミンである。
　プライマー［２］はＴアレル検出用であり、３’末端がアデニンで３’末端から２塩基目はプライマー［１］と同様、鋳型とミスマッチなチミンである。
　プライマー［３］はプライマー［２］と同様Ｔアレル検出用だが、３’末端から２塩基目に導入したミスマッチになる塩基がシトシンであり、プライマー［１］とは異なる。
　プライマー［４］はＴアレル検出用であり、プライマー［１］のミスマッチ塩基を導入した位置とは異なるように３’末端から３塩基目にミスマッチ塩基としてチミンを入れたものである。
　シミュレーションに際し、以下のような設定を行った。
　　・　初期の鋳型濃度（鋳型Ｓ）を１とする。
　　・　鋳型Ｓあるいは伸長産物（鋳型ａ’、鋳型ｂ’）がそれぞれのプライマーと２本鎖を形成する割合を同等とする。
　　・　共通プライマーからの伸長効率は１とする。
表２はプライマー［１］とプライマー［２］、プライマー［３］またはプライマー［４］を競合させた場合のプライマー伸長効率を仮定したものである。伸長効率はかなり大胆な仮定であるが、それぞれのミスマッチの数と伸長反応の効率の順序は妥当な仮定である。鋳型ＳがＣアレルである場合を想定したものである。２本鎖の［１］、［２］、［３］および［４］はプライマー［１］、プライマー［２］、プライマー［３］、およびプライマー［４］に相当し、Ｓは鋳型Ｓ、［１］’はプライマー［１］からの伸長生成物を鋳型として共通プライマーから伸長してできたもの、［２］’はプライマー［２］からの伸長生成物を鋳型として共通プライマーから伸長してできたもの、以下［３］’および［４］’も同様である。配列の上段がプライマー、下段が鋳型の配列を示している。
尚、プライマーにおいて、鋳型とミスマッチな塩基に下線を付した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
表３～表８にプライマー［１］とプライマー［２］、プライマー［３］またはプライマー［４］とを競合させた場合の２０Ｒｏｕｎｄまでの計算結果を示した。尚、プライマーにおいて、鋳型とミスマッチな塩基を斜体で示した。
また、各Ｒｏｕｎｄでプライマーから伸長される産物量を表すグラフを図７Ａ～９Ｂに示した。図７Ａはプライマー［１］から伸長される伸長産物の鋳型の内訳を示し、図７Ｂはプライマー［２］から伸長される伸長産物の鋳型の内訳を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
図７Ａ及び７Ｂより、プライマー［１］と［２］の組み合わせでは、鋳型とプライマーがミスマッチの場合でも、高頻度で伸長が行われるため、プライマー［２］からの伸長産物量が多い。特に、［１］’とプライマー［２］が２本鎖を形成して伸長反応が起こってしまう（図７Ｂ；［１］’を鋳型とした伸長）と、次のＲｏｕｎｄからはプライマー［２］とマッチな鋳型ができてしまう（図７Ｂ；［２］’を鋳型とした伸長）ため、プライマー［２］からの伸長産物がさらに増えてしまう結果となる。また、［２］’は、プライマー［１］の鋳型にもなりうる（図７Ａ；［２］’を鋳型とした伸長）ため、プライマー［１］からの偽陽性の伸長産物量も多くなる。
図８Ａ及び８Ｂより、プライマー［１］と［３］の組み合わせでは、鋳型とプライマーがミスマッチの場合には、伸長反応がある程度抑制されるため、プライマー［３］からの伸長産物量は少ない。［１］’とプライマー［３］が２本鎖を形成して伸長反応が起こってしまう（図８Ｂ；［１］’を鋳型とした伸長）と、次のＲｏｕｎｄからはプライマー［３］とマッチな鋳型ができ（図８Ｂ；［３］’を鋳型とした伸長）、プライマー［３］からの伸長産物量がさらに増えてしまう。
図９Ａ及び９Ｂよりプライマー［１］と［４］の組み合わせでは、鋳型とプライマーがミスマッチの場合には、ほとんど伸長反応が起こらないため、［１］’を鋳型とするプライマー［４］からの伸長産物量（図９Ｂ；［１］’を鋳型とした伸長）はごくわずかである。よって、プライマー［１］からの伸長産物量が増えてきてもプライマー［４］からの伸長産物量はほとんど増えない。
シミュレーション結果より、識別精度は、プライマー［１］と［２］の組み合わせや、プライマー［１］と［３］の組み合わせよりも、プライマー［１］と［４］の組み合わせの方が高い。よって、検出用プライマー及び競合プライマーに導入するミスマッチ塩基の位置を双方で変えることが、識別精度の向上につながることが確認された。
本発明の標的塩基配列を検出する方法は、（ａ）標的塩基配列を含む塩基配列からなる標的核酸を有する核酸試料に、前記標的塩基配列に本質的に相補的な少なくとも１種の検出用プライマーと、前記標的塩基配列に本質的に相補的であり、かつ前記標的核酸に対して前記検出用プライマーと競合的にアニールする少なくとも１種の競合プライマーと、少なくとも１種の共通プライマーと、を添加する工程と、（ｂ）前記核酸試料中の多型塩基を有する標的塩基配列を鋳型として用い、前記標的核酸に、前記検出用プライマーと前記競合プライマーとを競合的にアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ａを合成する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）または後記工程（ｄ）で得られた前記伸長産物Ａと前記共通プライマーをアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ｂを合成する工程と、（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた伸長産物Ｂと前記検出用プライマーまたは前記競合プライマーをアニールさせ、伸長産物Ａを合成する工程と、（ｅ）前記伸長産物ＡまたはＢを検出する工程、を有する。
以下、各工程について説明する。
まず、工程（ａ）において、（ａ）標的塩基配列を含む塩基配列からなる標的核酸を有する核酸試料に、１種の検出用プライマーと、少なくとも１種の競合プライマーと、少なくとも１種の共通プライマーと、を添加する。
核酸試料とは、核酸を含有する試料であれば、特に限定されるものではなく、動物、植物、微生物、培養細胞等から核酸を抽出したサンプルであることが好ましい。動物等からの核酸の抽出は、フェノール／クロロホルム法等の公知の手法により行うことができる。なお、核酸試料中に含有される核酸が、２本鎖核酸である場合、あらかじめ１本鎖核酸にしておくことが好ましい。１本鎖核酸を用いることにより、後述する工程（ｂ）において、該１本鎖核酸に、検出用プライマー、競合プライマーをアニールさせることができる。抽出された２本鎖核酸の１本鎖化は、熱エネルギーを加える等の公知の手法により行うことができる。
核酸試料中の核酸とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであれば特に限定されず、天然のものであっても合成されたものであってもよい。天然の核酸としては、たとえば、生物から回収されたゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ等がある。また、合成された核酸として、β－シアノエチルホスフォロアミダイト法、ＤＮＡ固相合成法等の公知の化学的合成法により合成されたＤＮＡや、ＰＣＲ等の公知の核酸合成法により合成された核酸、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡ等がある。
　なお、本発明において、オリゴヌクレオチドとは天然、非天然に限らずデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）やリボヌクレオチド（ＲＮＡ）と同様の機能を有するものをいい、ＰＮＡやＬＮＡなどの人工核酸も含まれるものとする。
　本発明において、プライマーとは、鋳型と２本鎖状態になり、ＤＮＡポリメラーゼや逆転写酵素が　ＤＮＡを合成する際に３’水酸基を供給する役割をもつ短い核酸の断片である。
次に、工程（ｂ）において、核酸試料中の多型塩基を有する標的塩基配列を鋳型として用い、前記標的核酸に、前記検出用プライマーと前記競合プライマーとを競合的にアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ａを合成する。
検出用プライマーまたは競合プライマーが、標的核酸にアニールする反応条件は、特に限定されるものではなく、各プライマーのＴｍ値等を考慮した上で、温度、ｐＨ、塩濃度、緩衝液等の通常の条件下で行うことができる。
　本発明において伸長反応とは、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ等の試薬を用いて行われる核酸合成反応であり、ＲＮＡを鋳型とする逆転写酵素による伸長反応も含まれる。
ＤＮＡポリメラーゼとはプライマーがアニールした鋳型ＤＮＡと相補的な塩基配列を持つＤＮＡ鎖を合成する酵素の総称である。
本発明に用いられるＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定されないが、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましく、試験開始前の伸長を防ぐためにホットスタート機能を持つＤＮＡポリメラーゼを使用することがより好ましい。さらに、本発明においては、プライマーの３’末端近傍で塩基を識別するため、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼを使用するのが特に好ましい。
　また、この伸長反応を行う際の反応条件等の具体的な方法については、実験医学第８巻第９号（羊土社、（１９９０））、ＰＣＲテクノロジー・ストックトン・プレス（ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　ｐｒｅｓｓ）（１９８９）等の文献に記載された公知の方法に従い行うことができる。
次に、工程（ｃ）において、前記工程（ｂ）または後記工程（ｄ）で得られた前記伸長産物Ａと前記共通プライマーをアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ｂを合成し、工程（ｄ）において、前記工程（ｃ）で得られた伸長産物Ｂと前記検出用プライマーまたは前記競合プライマーをアニールさせ、伸長産物Ａを合成する。これらの工程により標的核酸が増幅される。
上記核酸増幅工程としては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｂａｓｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃａｌ ｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅｖｅｒｓｅ－Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＳＭＡＰ（ＳＭａｒｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓ）、ＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｓ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＨＤＡ（Ｈｅｌｉｃａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などが挙げられる。
例示した上記核酸増幅工程において、等温増幅反応が用いられる場合には常法に従う。
ＰＣＲ反応において、検出用プライマー、競合プライマー、または共通プライマーの濃度としては、適宜最適な濃度を検討することができるが、共通プライマーの濃度を検出用プライマーと競合プライマーの合計濃度以下に設定することが好ましく、さらに好ましくは検出用プライマーおよび競合プライマーの合計濃度の２５％以下である。これは、ＰＣＲが進んでいくと鋳型とマッチである検出用プライマーが優先的に消費され、鋳型とミスマッチである競合プライマーの相対濃度が上がってしまい識別精度が落ちてしまうのを防ぐためである。共通プライマーの濃度を低くすることで、鋳型とマッチである検出用プライマーの消費とともに共通プライマーも消費され、識別制度を維持することができる。
次に、工程（ｅ）において、前記伸長産物ＡまたはＢを検出する。
工程（ｅ）におけるプライマーからの伸長産物の検出方法は、特に限定するものではなく、蛍光色素等によるプライマーの標識、電気泳動、高速液体クロマトグラフィーやマススペクトル、融解曲線分析、増殖曲線分析など、核酸を分析できるあらゆる方法が挙げられる。
検出用プライマー、競合プライマー、又は共通プライマーを、標識物質により標識しておくことにより、標識物質を指標として伸長産物を検出することができる。このような標識物質としては、例えば、蛍光色素、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素、抗体等が挙げられる。プライマーに標識する位置については、特に限定するものではないが、伸長反応を阻害しないような位置が好ましい。
プライマーを異なる蛍光色素で標識していずれのプライマーから増幅したものかを区別する方法は、特異性に与える影響も少なく、融解曲線を測定する必要もなく簡便な方法であるため好ましい。
より好ましくは、プライマーの５’末端にフルオロセインとアクリジンを導入する方法が挙げられる（非特許文献９参照）。このプライマーは１本鎖状態で存在する場合、フルオロセインの励起波長を照射してもエネルギー吸収性物質であるアクリジンによって消光されてフルオロセインからの蛍光は観察されない。
一方、２本鎖を形成している場合、インターカレーターでもあるアクリジンは２本鎖核酸に結合するため、フルオロセインとの距離が離れフルオロセインからの蛍光を吸収することができなくなる。よってプライマー伸長反応が生じたプライマーのみ蛍光を発光することになる（図１０参照。）。
従って、検出用プライマー及び競合プライマーの蛍光色素を異なるものにすることにより、いずれのプライマーからの伸長生成物であるかを判断することができる。
よって例えば、本発明の検出方法において、野生型と変異型の２種類からなる多型のうち、変異型アレルを検出するプライマーを検出用プライマーとし、野生型アレルを検出し得るプライマーを競合プライマーとして用い、かつ、検出用プライマーと競合プライマーをそれぞれ異なる蛍光色素で標識し、各プライマーの伸長産物をそれぞれ検出することにより、試料中の１つの多型の有無を検出することができるだけでなく、試料中の複数の多型を検出することができる。
蛍光色素を導入する位置については、特に限定するものではないが、競合プライマーに標識するため、ポリメラーゼ反応を阻害しないような位置が好ましい。
また、アクリジンの代わりにピレンを用いてもよい。ピレンもまたエネルギー吸収性を有し、２本鎖に結合できるため、アクリジンと同様に２本鎖形成反応を調べることができる。
このほか、２つ以上のアレル特異的プライマーのどれから伸長が起こったかを検出する方法としては、ＬＵＸ（商標名）プライマー（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）やＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（商標名）ＵＮＩプライマー（商標名）（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）など、プライマーの１本鎖状態と２本鎖状態を判別することができる方法があり（Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ、第４４巻、第５４８７～５５０２頁、２００５年）、いずれの方法も適用可能である。
蛍光色素を用いた好適な検出方法としては、ＱＰ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ　Ｐｒｏｂｅ／Ｐｒｉｍｅｒ）法を用いた検出方法が挙げられる。
ＱＰ法は、ある種の蛍光色素に、グアニン塩基が空間的に近接することにより、蛍光が消光することを利用した検出方法である。
本発明の検出用プライマーを、グアニン塩基との近接により消光する蛍光色素で標識することにより、検出用プライマーと、標的核酸との近接の有無を検出することができる。該グアニン塩基を有するのは、標的核酸であっても、検出用プライマーであってもよいが、検出用プライマーであることが好ましい。
前記グアニン塩基との近接により消光する蛍光色素としては、ＱＰ法に通常使用される蛍光色素を用いて行うことができ、たとえば、ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ（商品名、インビトロジェン社製）、ＰＡＣＦＩＣ　ＢＬＵＥ（商品名、インビトロジェン社製）、ＣＲ６Ｇ（商品名、インビトロジェン社製）、ＴＡＭＲＡ（商品名、インビトロジェン社製）等が挙げられる。
電気泳動で検出する場合、競合する二つのプライマーの長さを変えておき、伸長生成物の長さを変えることによって泳動度の差により検出することができる。ただし、プライマーの長さを変えることによって特異性に影響が出ないようにすることが重要である。
電気泳動による検出に用いる試薬としては二本鎖ＤＮＡに結合して蛍光を発するので、臭化エチジウムやサイバーグリーンがより好ましい。
　また、サイバーグリーンは蛍光色素であるため、後述する融解曲線を測定することによっていずれのプライマーから伸長した生成物かを区別することができる。
高速液体クロマトグラフィーでも同様に二つのプライマーからの伸長生成物を区別することができる。
また、質量分析法を利用する場合は二つのプライマーからの伸長生成物の長さが異なるようにしてもよいし、プライマーを質量が異なる物質で標識してもよい。後者の場合、特異性に与える影響が少なく好ましい。
　前記工程（ｅ）は、前記工程（ｂ）～（ｄ）からなる核酸増幅工程と同時に設けられてもよく、核酸増幅工程後に行われてもよい。
核酸増幅工程中の識別方法としては、標識されたプライマー、またはその伸長産物の２本鎖状態を測定する方法が挙げられる。この識別方法は、鋳型と２本鎖を形成している競合するプライマーまたは競合するプライマーからの伸長産物が２本鎖を形成する能力差を利用している。
また、プライマーからの伸長産物は２本鎖を形成する温度下で蛍光測定してもよい。この方法では、競合するプライマーから伸長した産物だけを検出することができるので、さらに高精度に識別が可能である。
核酸増幅工程後の識別方法としては、融解曲線を測定する方法が挙げられる。これは、増幅生成物が２本鎖から１本鎖に遷移する温度依存性を利用する方法である。この方法では、競合する２つのプライマーによる増幅産物だけを検出することができるので、さらに高精度に識別が可能である。
本発明の検出方法をリアルタイムＰＣＲ装置のようなＤＮＡ配列検査器具に用いることができる。この場合、上述したＰＣＲに必要な試薬と、プライマーとを添加した容器内に検体ＤＮＡを入れ、リアルタイムＰＣＲを行い、検出用プライマーからの伸長産物の検出を行う。検体ＤＮＡを入れた後、密閉したまま検出を行うことで増幅産物の飛散や汚染を防ぐことができる。
本発明の標的塩基配列検出キットは、多型塩基を有する標的塩基配列を検出する上記方法に用いるキットであり、上記検出用プライマーと競合プライマーと共通プライマーとを含むことを特徴とする。
その他、試料前処理用の細胞破壊試薬や、標識物質の標識を検出するための試薬等を組み合わせてもよい。
　このように、本発明の標的塩基配列の検出方法に必要な試薬等をキット化することにより、より簡便かつ短時間で一塩基多型の識別をすることができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
比較例１～２及び実施例１～２では、ワルファリンの至適投与量に関連する遺伝子であるビタミンＫエポキシド還元酵素複合体１（ＶＫＯＲＣ１）のイントロン１領域の１１７３位における遺伝子多型（１１７３Ｃ＞Ｔ）を識別対象とした。
表９に示されるように、ＶＫＯＲＣ１の上記遺伝子多型を検出する２種類の検出用プライマー（ＶＫ１Ｗａｔ－Ａｃｒｉｄｉｎｅ及びＶＫ１Ｍｔｇ－Ａｃｒｉｄｉｎｅ）及び共通プライマー（ＶＫ１Ｒ２）を作製した。検出用プライマーとしては、５’末端にアクリジンホスホロアミダイト（グレンリサーチ社）を用いてアクリジンを導入し、さらにその５’末端に６－フルオロセイン（グレンリサーチ社）を導入したものを日本バイオサービス社から購入した。表９に示される４種の競合プライマー（ＶＫ１Ｍｔｇ、ＶＫ１Ｍａｔ、ＶＫ１Ｍａｃ、ＶＫ１Ｗａｔ）および共通プライマー（ＶＫ１Ｒ２）については、常法の合成方法で合成したものをグライナージャパンから購入した。鋳型となるゲノムＤＮＡとしてはＣｏｒｉｅｌｌ社から購入したものを用いた。
表９中、１１７３位及び多型塩基認識部位を太字で示し、ミスマッチ塩基導入部位に下線を付した。また、「Ａｃｒｉｄｉｎｅ」はアクリジンを、「６－ＦＡＭ」は６－フルオロセイン標識を、右欄の数字は配列表中に示した標識前の配列に対応する配列番号を、それぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（比較例１）
鋳型として、ＶＫ１ＯＲＣ１の遺伝子多型であるＣアレル、またはＴアレルを、検出用プライマーとしてＶＫ１Ｗａｔ－Ａｃｒｉｄｉｎｅ及び競合プライマーとしてＶＫ１Ｍａｔを、共通プライマーとしてＶＫ１Ｒ２を混合した反応液を表１０記載の組成となるように調製した。上記反応液をリアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ製、「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ」）にセットし、９５℃で１分間保持し、ＤＮＡポリメラーゼの抗体を変性させた後、６２℃２０秒、９５℃５秒の２ステップＰＣＲを５５サイクル行い、９５℃から４０℃まで融解曲線解析を行った。なお、鋳型に蒸留水（Ｄ．Ｗ．）を用いたものをネガティブコントロールとした。結果を図１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
図１１は、比較例１の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
検出用プライマー（ＶＫ１Ｗａｔ－Ａｃｒｉｄｉｎｅ）が、２本鎖を形成すると、エネルギー吸収物質であるアクリジンが２本鎖核酸にインターカレートし、アクリジンによるエネルギー吸収量が小さくなるため、６－フルオロセインからの蛍光強度が大きくなる。
融解曲線とは、温度を低温から徐々に上げることにより、ＰＣＲ法により増幅された２本鎖核酸が１本鎖状態に変性するまでの蛍光強度を測定して得られる曲線をいう。融解曲線の負の一次微分曲線は温度変化に対する蛍光変化量を示すもので、変化量が最大のところが２本鎖ＤＮＡのＴｍとなる。
比較例１において、ＶＫ１Ｗａｔ－Ａｃｒｉｄｉｎｅからの伸長産物は、８３℃から８６℃の範囲で１本鎖状態と２本鎖状態の変化量が最も多いことが既に分かっている。よって、融解曲線の負の一次微分曲線において８３℃から８６℃の範囲でピークが見られる場合には、ＶＫ１Ｗａｔ－Ａｃｒｉｄｉｎｅから伸長反応が起きたと判断することができる。
比較例１の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、Ｃアレル、またはＴアレルのどちらを鋳型として用いても同様の結果が得られた。これは、上記プライマーセットでは、伸長反応がＣアレル特異的でないことを示唆している。
（比較例２）
検出用プライマーとしてＶＫ１Ｗａｔ－Ａｃｒｉｄｉｎｅ及び競合プライマーとしてＶＫ１Ｍａｃを用いた以外は、比較例１と同様の反応及び同様の解析を行った。結果を図１２に示す。
図１２は、比較例２の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
比較例２の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、Ｃアレルを鋳型として用いたときのＶＫ１Ｗａｔ－Ａｃｒｉｄｉｎｅからの増幅が優位に観察された。しかしながら、Ｔアレルを鋳型として用いたときにわずかなピークが見られる。これは、ＴアレルをサンプルとしたときＶＫ１Ｗａｔ－Ａｃｒｉｄｉｎｅからの伸長抑制は十分ではないことを示唆している。
（実施例１）
検出用プライマーとしてＶＫ１Ｗａｔ－Ａｃｒｉｄｉｎｅ及び競合プライマーとしてＶＫ１Ｍｔｇを用いた以外は、比較例１と同様の反応及び同様の解析を行った。結果を図１３に示す。
図１３は、実施例１の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
実施例１の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、Ｃアレルを鋳型として用いたときのＶＫ１Ｗａｔ－Ａｃｒｉｄｉｎｅからの増幅が優位に観察された。さらに、比較例２の結果に比べＴアレルを鋳型として用いたときのＶＫ１Ｗａｔ－Ａｃｒｉｄｉｎｅからの増幅が抑えられていることから、上記プライマーセットでは、Ｃアレル特異性がより優れていることを示唆している。
（実施例２）
検出用プライマーとしてＶＫ１Ｍｔｇ－Ａｃｒｉｄｉｎｅ及び競合プライマーとしてＶＫ１Ｗａｔを用いた以外は、比較例１と同様の反応及び同様の解析を行った。結果を図１４に示す。
図１４は、実施例２の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
実施例２において、ＶＫ１Ｍｔｇ－Ａｃｒｉｄｉｎｅからの伸長産物は、８３℃から８６℃の範囲で１本鎖状態と２本鎖状態の変化量が最も多いことが既に分かっている。よって、融解曲線の負の一次微分曲線において８３℃から８６℃の範囲でピークが見られる場合には、蛍光標識されたＶＫ１Ｍｔｇ－Ａｃｒｉｄｉｎｅから伸長反応が起きたと判断することができる。
実施例２の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、Ｔアレルを鋳型として用いたときのＶＫ１Ｍｔｇ－Ａｃｒｉｄｉｎｅからの増幅が優位に観察された。これは、上記プライマーセットでは、伸長反応がＴアレル特異的であることを示唆している。
実施例２のプライマーセットは、実施例１のプライマーセットとは蛍光標識が変異型プライマーに導入されていることのみが異なるだけで塩基配列のセットとしては同じである。よって、実施例１及び２の結果から、ＶＫ１Ｗａｔ及びＶＫ１Ｍｔｇのどちらを蛍光標識しても、蛍光標識されたプライマーからの伸長反応の有無を判断できることが明らかとなった。
従って、ＶＫ１Ｗａｔ及びＶＫ１Ｍｔｇに互いに蛍光波長の異なる蛍光色素を導入することにより、各蛍光標識プライマーからの伸長反応を同時に測定することができる。
実施例３～５では、上記と同様、ワルファリンの至適投与量に関連する遺伝子であるビタミンＫエポキシド還元酵素複合体１（ＶＫＯＲＣ１）のイントロン１領域の１１７３位における遺伝子多型（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出対象とし、競合プライマーの多型塩基以外に導入するミスマッチ塩基の位置が検出精度に与える影響を調べた。
表１１に示されるように、新たにＶＫＯＲＣ１の遺伝子多型を識別する検出用プライマー（ＶＫ１Ｍｔｇ－ｐｙｒｅｎ）を作製した。検出用プライマーとしては、５’末端から２塩基目のアデニンにＡｍｉｎｏ－ｍｏｄｉｆｅｒ　Ｃ６　ｄＡ（グレンリサーチ社）を導入し、さらにその５’末端に６－フルオロセイン（グレンリサーチ社）を導入したものを日本バイオサービス社から購入し、１－ピレンブタノイックアシッドサクシンイミジルエステル（インビトロジェン社）を用いてアミノ基へピレン修飾を行ったものを用いた。
競合プライマーおよび共通プライマーとしては、常法の合成方法で合成したものをグライナージャパンから購入したものを用いた。競合プライマーについては、ミスマッチ塩基の導入位置を変えたものを複数作製した。他は、比較例１の記載と同様である。
表１１中、多型塩基認識部位を太字で示し、ミスマッチ塩基導入部位に下線を付し、ピレン修飾した塩基は二重下線を付した。また、「ｐｙｒｅｎｅ」はピレンを、「６－ＦＡＭ」は６－ＦＡＭ標識を、右欄の数字は配列表中に示した標識前の配列に対応する配列番号を、それぞれ示す。尚、用いたテンプレートは表９記載の配列と同様のものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
（実施例３）
鋳型として、ＶＫ１ＯＲＣ１の遺伝子多型であるＣアレルまたは、Ｔアレルを、検出用プライマーとしてＶＫ１Ｗａｔ－ｐｙｒｅｎｅ及び競合プライマーとしてＶＫ１Ｍ４ｔを、共通プライマーとしてＶＫ１Ｒ２を混合した反応液を表１２記載の組成となるように調製した。上記反応液をリアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ製、「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ」）にセットし、９５℃で１分間保持し、ＤＮＡポリメラーゼの抗体を変性させた後、５８℃２０秒、９５℃５秒の２ステップＰＣＲを５５サイクル行い、９５℃から４０℃まで融解曲線解析を行った。なお、鋳型に蒸留水（Ｄ．Ｗ．）を用いたものをネガティブコントロールとした。結果を図１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
図１５は、実施例３の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
実施例３の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、実施例１と同様の結果が得られた。したがって競合プライマーのミスマッチ塩基が３’末端から４塩基目に位置する場合でも実施例１の３’末端から３塩基目に位置する場合と同様に、Ｃアレル特異性がより優れていることが示唆された。
（実施例４）
競合プライマーとしてＶＫ１Ｍ５ｔを用いた以外は、実施例３と同様の反応及び同様の解析を行った。結果を図１６に示す。
図１６は、実施例４の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
実施例４の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、実施例３と同様の結果が得られた。したがって競合プライマーのミスマッチ塩基が３’末端から５塩基目に位置する場合でも実施例１の３’末端から３塩基目に位置する場合と同様に、Ｃアレル特異性がより優れていることが示唆された。
（実施例５）
競合プライマーとしてＶＫ１Ｍ８ｔを用いた以外は、実施例３と同様の反応及び同様の解析を行った。結果を図１７に示す。
図１７は、実施例５の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
実施例５の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、実施例３と同様の結果が得られた。したがって競合プライマーのミスマッチ塩基が３’末端から８塩基目に位置する場合でも実施例１の３’末端から３塩基目に位置する場合と同様に、Ｃアレル特異性がより優れていることが示唆された。
（実施例６）
検出用プライマーとしてＶＫ１Ｍｔｇ－ｐｙｒｅｎｅ及び競合プライマーとしてＶＫ１Ｗ４ｔを用いた以外は、実施例３と同様の反応及び同様の解析を行った。結果を図１８に示す。
図１８は、実施例６の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
実施例６の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、実施例２と同様の結果が得られた。したがって変異を検出するプライマーセットにおいて競合プライマーの３’末端から４塩基目にミスマッチ塩基を導入しても、Ｔアレル特異性がより優れていることが示唆された。
（実施例７）
競合プライマーとしてＶＫ１Ｗ５ｔを用いた以外は、実施例６と同様の反応及び同様の解析を行った。結果を図１９に示す。
図１９は、実施例７の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
実施例７の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、実施例６と同様の結果が得られた。したがって変異を検出するプライマーセットにおいて競合プライマーの３’末端から５塩基目に変異を導入してもＴアレル特異性がより優れていることが示唆された。
（実施例８）
競合プライマーとしてＶＫ１Ｗ８ｔを用いた以外は、実施例７と同様の反応及び同様の解析を行った。結果を図２０に示す。
図２０は、実施例８の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
実施例８の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、実施例６と同様の結果が得られた。したがって変異を検出するプライマーセットにおいて競合プライマーの３’末端から８塩基目に変異を導入してもＴアレル特異性がより優れていることが示唆された。
（実施例９～１８）
鋳型として、ＶＫ１ＯＲＣ１の遺伝子多型であるＣアレル、またはＴアレルを、プライマーとして、表１３に示す検出用プライマー及び競合プライマーのセットを、共通プライマーとしてＶＫ１Ｒ２を混合した反応液を表１１記載の組成となるように調製した。上記反応液をリアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ製、「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ」）にセットし、９５℃で１分間保持し、ＤＮＡポリメラーゼの抗体を変性させた後、６２℃２０秒、９５℃５秒の２ステップＰＣＲを５５サイクル行い、９５℃から４０℃まで融解曲線解析を行った。なお、鋳型に蒸留水（Ｄ．Ｗ．）を用いたものをネガティブコントロールとした。結果を図２１～３０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
図２１～３０は、実施例９～１８の結果を融解曲線の負の一次微分曲線で示した図である。
実施例９～１３の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、実施例３と同様の結果が、実施例１４～１８の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、実施例６と同様の結果が得られた。
実施例９～１３から、検出用プライマーが有するミスマッチ塩基及び競合プライマーが有するミスマッチ塩基が、多型塩基にマッチな塩基から１７塩基以内に位置する場合には精度良く検出できることが確認された。
また、実施例３～８から、アニール温度が低い条件下においても８塩基以内に位置する場合には精度良く検出できることが確認された。
実施例１９～２７では、上記と同様、ワルファリンの至適投与量に関連する遺伝子であるビタミンＫエポキシド還元酵素複合体１（ＶＫＯＲＣ１）のイントロン１領域の１１７３位における遺伝子多型（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出対象とし、競合プライマーと検出用プライマーの鎖長の差が検出精度に与える影響を調べた。
表１４に示されるように、新たにＶＫＯＲＣ１の遺伝子多型を識別する検出用プライマー（ＶＫ１Ｗａｔ－Ｐ－ＦＡＭ１）を作製した。検出用プライマーとしては、５’末端から４塩基目のシトシンにＡｍｉｎｏ－ｍｏｄｉｆｅｒ　Ｃ６　ｄＣ（グレンリサーチ社）を導入し、さらに５’末端から６塩基目のチミンにフルオロセインｄＴ（グレンリサーチ社）を導入したものを日本バイオサービス社から購入し、１－ピレンブタノイックアシッドサクシンイミジルエステル（インビトロジェン社）を用いてアミノ基へピレン修飾を行ったものを用いた。
表１４に示される競合プライマーおよび共通プライマーとしては、常法の合成方法で合成したものをグライナージャパンから購入したものを用いた。競合プライマーについては、鎖長を変えたものを複数作製した。
表１４中、１１７３位及び多型塩基認識部位を太字で示し、ミスマッチ塩基導入部位に下線を付した。また、「ＦＡＭｄＴ」はフルオロセインｄＴを、「ＰｙｒｅｎｄＣ」はピレン標識を行ったＡｍｉｎｏ－ｍｏｄｉｆｅｒ　Ｃ６　ｄＣを、右欄の数字は配列表中に示した標識前の配列に対応する配列番号を、それぞれ示す。尚、用いたテンプレートは表９記載の配列と同様のものである。
（実施例１９～２７）
鋳型として、ＶＫＯＲＣ１の遺伝子多型であるＣアレル、またはＴアレルを、プライマーとして、表１５に示す検出用プライマー及び競合プライマーのセットを、共通プライマーとしてＶＫ１Ｒ２を混合した反応液を表１０記載の組成となるように調製した。上記反応液をリアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ製、「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０」）にセットし、９５℃で１分間保持し、ＤＮＡポリメラーゼの抗体を変性させた後、６４℃３０秒、９５℃５秒の２ステップＰＣＲを６０サイクル行った。鋳型としてＣアレルを用いて反応させて得られた結果を図３１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
図３１に示すように、実施例１９～２７の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、遺伝子多型を精度よく検出できることが確認された。
検出用プライマーよりも２塩基～１６塩基長い競合プライマーを用いた実施例２１～２６は、検出プライマーより２０塩基長い競合プライマーを用いた実施例２７よりも反応性に優れていることが確認された。
更に、検出用プライマーと同じ鎖長、または１塩基長い競合プライマーを用いた実施例１９及び実施例２０は、検出用プライマーよりも２塩基～１６塩基長い競合プライマーを用いた実施例２１～２６よりも反応性に優れていることが確認された。
実施例２８～３５では、上記と同様、ワルファリンの至適投与量に関連する遺伝子であるビタミンＫエポキシド還元酵素複合体１（ＶＫＯＲＣ１）のイントロン１領域の１１７３位における遺伝子多型（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出対象とし、競合プライマーと検出用プライマーに導入した第２のミスマッチ塩基が検出精度に与える影響を調べた。
表１６に示されるように、新たにＶＫＯＲＣ１の遺伝子多型を識別する検出用プライマー（ＶＫ１Ｗａｔ－Ｐ－ＦＡＭ２～８）を作製した。検出用プライマーとしては、５’末端から４塩基目のシトシンにＡｍｉｎｏ－ｍｏｄｉｆｅｒ　Ｃ６　ｄＣ（グレンリサーチ社）を導入し、さらに５’末端から６塩基目のチミンにフルオロセインｄＴ（グレンリサーチ社）を導入したものを日本バイオサービス社から購入し、１－ピレンブタノイックアシッドサクシンイミジルエステル（インビトロジェン社）を用いてアミノ基へピレン修飾を行ったものを用いた。
表１６に示される競合プライマーおよび共通プライマーとしては、常法の合成方法で合成したものをグライナージャパンから購入したものを用いた。競合プライマーについては、第２のミスマッチ塩基の導入位置を変えたものを複数作製した。
表１６中、１１７３位及び多型塩基認識部位を太字で示し、ミスマッチ塩基導入部位に下線を付した。また、「ＦＡＭｄＴ」はフルオロセインｄＴを、「ＰｙｒｅｎｄＣ」はピレン標識を行ったＡｍｉｎｏ－ｍｏｄｉｆｅｒ　Ｃ６　ｄＣを、右欄の数字は配列表中に示した標識前の配列に対応する配列番号を、それぞれ示す。尚、用いたテンプレートは表９記載の配列と同様のものである。
（実施例２８～３５）
鋳型として、ＶＫＯＲＣ１の遺伝子多型であるＣアレル、またはＴアレルを、プライマーとして、表１７に示す検出用プライマー及び競合プライマーのセットを、共通プライマーとしてＶＫ１Ｒ２を混合した反応液を表１０記載の組成となるように調製した。上記反応液をリアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ製、「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０」）にセットし、９５℃で１分間保持し、ＤＮＡポリメラーゼの抗体を変性させた後、６４℃３０秒、９５℃５秒の２ステップＰＣＲを６０サイクル行った。鋳型としてＣアレルを用いて反応させて得られた結果を図３２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
図３２に示すように、実施例２８～３５の検出用プライマー及び競合プライマーのセットを用いた場合には、遺伝子多型を精度よく検出できることが確認された。
第２のミスマッチ塩基が、３’末端から７塩基以上離れている検出プライマー及び競合プライマーのセットを用いた実施例２９～３５は、第２のミスマッチ塩基が導入されていない実施例２８よりも反応性に優れていることが確認された。
中でも第２のミスマッチ塩基が、３’末端から９塩基以上離れている検出プライマー及び競合プライマーのセットを用いた実施例２９～３４は、特に反応性に優れていることが確認された。
本発明の競合プライマーによる標的塩基配列の検出方法によれば、遺伝子型の識別精度が非常に優れているため、臨床検査等の分野、特に一塩基多型や体細胞変異の分野において利用が可能である。

Claims (14)

  1. 多型塩基を有する標的塩基配列を検出する方法であって、
    　（ａ）標的塩基配列を含む塩基配列からなる標的核酸を有する核酸試料に、
    前記標的塩基配列に本質的に相補的な少なくとも１種の検出用プライマーと、
    前記標的塩基配列に本質的に相補的であり、かつ前記標的核酸に対して前記検出用プライマーと競合的にアニールする少なくとも１種の競合プライマーと、
    少なくとも１種の共通プライマーと、を添加する工程と、
    　（ｂ）前記核酸試料中の多型塩基を有する標的塩基配列を鋳型として用い、前記標的核酸に、前記検出用プライマーと前記競合プライマーとを競合的にアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ａを合成する工程と、
    　（ｃ）前記工程（ｂ）または後記工程（ｄ）で得られた前記伸長産物Ａと前記共通プライマーをアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ｂを合成する工程と、
    　（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた伸長産物Ｂと前記検出用プライマーまたは前記競合プライマーをアニールさせ、伸長産物Ａを合成する工程と、
    （ｅ）前記伸長産物ＡまたはＢを検出する工程と、を有し、
    前記検出用プライマーは、多型塩基に相補的なマッチ塩基と、前記標的配列に対して多型塩基以外の塩基に非相補的な少なくとも１つのミスマッチ塩基とを有し、
    前記競合プライマーは、多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基と、前記標的配列に対して多型塩基以外の塩基に非相補的な少なくとも１つのミスマッチ塩基を有し、
    前記検出用プライマーが有する少なくとも１つのミスマッチ塩基の位置が、前記競合プライマーが有する多型塩基以外の塩基に非相補的な少なくとも１つのミスマッチ塩基の位置とは異なり、
    前記共通プライマーは、前記検出用プライマー又は前記競合プライマーと対になって前記標的核酸を増幅しうるものであることを特徴とする標的塩基配列の検出方法。
  2. 前記検出用プライマーは、３’末端または３’末端から２塩基目に多型塩基に相補的なマッチ塩基を有することを特徴とする請求項１に記載の標的塩基配列の検出方法。
  3. 　前記検出用プライマー及び前記競合プライマーにおいて、
    多型塩基以外の塩基に非相補的なミスマッチ塩基が、前記検出用プライマーでは多型塩基に相補的なマッチ塩基から、前記競合プライマーでは多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基から、いずれも１７塩基以内に位置し、それぞれのプライマーでミスマッチ塩基の位置が異なることを特徴とする請求項１又は２に記載の標的塩基配列の検出方法。
  4. 　前記競合プライマーと前記検出用プライマーの鎖長の差は１６塩基以内であることを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の標的塩基配列の検出方法。
  5. 　前記検出用プライマー及び前記競合プライマーにおいて、
    　第１のミスマッチ塩基が、３’末端から６塩基以内に位置し、
    第２のミスマッチ塩基が、３’末端から７塩基以上５’末端側に位置し、
    前記検出用プライマーの第１のミスマッチ塩基の位置が、前記競合プライマーの第１のミスマッチ塩基の位置とは異なり、
    　前記検出用プライマーの第２のミスマッチ塩基と前記競合プライマーの第２のミスマッチ塩基が互いに異なることを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の標的塩基配列の検出方法。
  6. 前記検出用プライマー及び前記競合プライマーが有する前記第２のミスマッチ塩基の位置が同じであることを特徴とする請求項５に記載の標的塩基配列の検出方法。
  7. 　前記工程（ｂ）～（ｄ）が、ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＮＡＳＢＡ、ＩＣＡＮ、ＴＲＣ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＳＭＡＰ、ＲＰＡ、ＨＤＡよりなる群から選ばれる１つにより行われる工程であることを特徴とする請求項１～６のいずれか一項に記載の標的塩基配列の検出方法。
  8. 　前記検出用プライマー、前記競合プライマー、または前記共通プライマーの少なくとも１つが標識されていることを特徴とする請求項１～７のいずれか一項に記載の標的塩基配列の検出方法。
  9. 前記標識に用いられる標識物質が、蛍光色素及びエネルギー吸収性物質からなる群より選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項８に記載の標的塩基配列の検出方法。
  10. 　前記検出用プライマーと、前記競合プライマーとを、異なる種類の標識物質でそれぞれ標識し、前記工程（ｅ）が、前記検出用プライマーからの伸長産物と、前記競合プライマーからの伸長産物とを別個に検出する工程であることを特徴とする請求項８又は９に記載の標的塩基配列の検出方法。
  11. 　前記工程（ｅ）は、前記工程（ｂ）～（ｄ）と同時に行われる工程であって、標識されたプライマーからの伸長産物が、２本鎖を形成している状態を検出する工程であることを特徴とする請求項８～１０のいずれか一項に記載の標的塩基配列の検出方法。
  12. 前記工程（ｅ）は、前記工程（ｄ）後に行われる工程であって、前記伸長産物の融解曲線または増幅曲線を用いて検出する工程であることを特徴とする請求項８～１０のいずれか一項に記載の標的塩基配列の検出方法。
  13. 　前記工程（ｅ）は、ＱＰ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ　Ｐｒｏｂｅ／Ｐｒｉｍｅｒ）法、を用いて検出する工程であることを特徴とする請求項８～１２のいずれか一項に記載の標的塩基配列の検出方法。
  14. 多型塩基を有する標的塩基配列を検出する方法に用いるキットであって、
    前記標的塩基配列に本質的に相補的な少なくとも１種の検出用プライマーと、
    前記標的塩基配列に本質的に相補的であり、かつ前記標的核酸に対して前記検出用プライマーと競合的にアニールする少なくとも１種の競合プライマーと、
    少なくとも１種の共通プライマーと、を含み、
    前記検出用プライマーは、多型塩基に相補的なマッチ塩基と、前記標的配列に対して多型塩基以外の塩基に非相補的な少なくとも１つのミスマッチ塩基とを有し
    前記競合プライマーは、多型塩基に非相補的なミスマッチ塩基と、前記標的配列に対して多型塩基以外の塩基に非相補的な少なくとも１つのミスマッチ塩基を有し、
    前記検出用プライマーが有する少なくとも１つのミスマッチ塩基の位置が、前記競合プライマーが有する多型塩基以外の塩基に非相補的な少なくとも１つのミスマッチ塩基の位置とは異なり、
    　前記共通プライマーは、前記検出用プライマー又は前記競合プライマーと対になって前記標的核酸を増幅しうるものであり、
    前記方法は、
    　（ａ）標的核酸を有する核酸試料に、前記検出用プライマーと前記競合プライマーとを添加する工程と、
    　（ｂ）前記核酸試料中の多型塩基を有する標的塩基配列を鋳型として用い、前記標的核酸に、前記検出用プライマーと前記競合プライマーとを競合的にアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ａを合成する工程と、
    　（ｃ）前記工程（ｂ）または後記工程（ｄ）で得られた前記伸長産物Ａと前記共通プライマーをアニールさせ、伸長反応を行い、伸長産物Ｂを合成する工程と、
    　（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた伸長産物Ｂと前記検出用プライマーまたは前記競合プライマーをアニールさせ、伸長産物Ａを合成する工程と、
    　（ｅ）前記伸長産物ＡまたはＢを検出する工程と、を有していることを特徴とする標的塩基配列検出キット。
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