JP4228041B2

JP4228041B2 - 塩基多型の検出方法

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Publication number: JP4228041B2
Application number: JP2003193557A
Authority: JP
Inventors: 利哉青野; 聡子吉賀; 裕宝田
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2003-07-08
Filing date: 2003-07-08
Publication date: 2009-02-25
Anticipated expiration: 2023-07-08
Also published as: JP2005027518A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸配列の変異または多型の検出方法及びそれに用いられるプライマーに関する。本発明は、遺伝病の診断、塩基多型解析等に際して特に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
本発明において、変異及び塩基多型とは野生型とは異なる塩基配列を有することをいう。一般に頻度が１％未満のものを変異、１％以上のものを多型と呼び分けることがあるが、ここでは厳密な使い分けを意図するものではない。遺伝子の塩基多型は薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において個体間変動の原因として重要な役割を果たし、体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知られている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マーカーとしての働きもする。それゆえ、これら突然変異の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとって特に推奨される（ＧｒａｍおよびＢｒｓｅｎ，ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｎｓｅｎｓｕｓＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＰｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．ＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ，Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ，１９９０，第８７頁；Ｂａｌａｎｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第３６巻、第５５１頁、（１９８９））。
【０００３】
また、原因となる変異型遺伝子の同定に続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所望される。また、遺伝子の点突然変異により引き起こされる遺伝病が種々知られており、それらの中には、遺伝子のどの部位がどのように点突然変異することにより遺伝病が引き起こされるかわかっているものも少なくない。
【０００４】
しかしながら、点突然変異や一塩基多型の検出は３０億塩基対中のわずか一塩基の違いを検出する必要があることから、非常に高い特異性が要求される。また、Ａｌｕ反復配列に代表されるゲノム上の繰り返し配列や特殊な構造の近傍に存在する場合や、薬剤代謝に重要な役割を有するチトクロームＣ遺伝子など、偽遺伝子（ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅ）の存在が確認されている場合もある。
【０００５】
従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）、ＴａｑＭａｎプローブ法（ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．第６巻、第９８６頁（１９９６））、ＲＦＬＰ（制限酵素切断長多型）法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第７２巻、第１２６２頁（１９８３））、ＡＳＰ（アレル特異的プライマー）法（ＷＯ０１／４２４９８）、ＡＳＯ（アレル特異的オリゴプローブ）法（Ｎａｔｕｒｅ第３２４巻、第１６３頁（１９８６））、一塩基伸長法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第９４巻、第１０７５６頁（１９９７））、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２４４巻，第３６７頁（１９９７））、Ｉｎｖａｄｅｒ法（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．第１７巻、第２９２頁（１９９９））などが知られている。
【０００６】
核酸配列決定法、ＴａｑＭａｎプローブ法、ＲＦＬＰ法、ＡＳＯ法、一塩基伸長法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法などのあらかじめ変異や多型を含む領域を核酸増幅反応で増幅しておいてから検出する手法においては、特異的な増幅産物の確保は、バックグラウンドを低減させ鮮明なシグナルを得る上で非常に重要である。原理的には増幅反応なしでも変異や多型の検出が可能とされているＩｎｖａｄｅｒ法においても、実用的には感度が不足とされることも多く、あらかじめ増幅することが必要な際には他法と同様に特異性が重要である。またアレル毎の核酸増幅プライマーの特異性により変異や多型の検出を行うＡＳＰ法においては増幅反応における特異性の確保が特に重要である。
【０００７】
一般に特異性とは陰性を陰性と判定する能力と定義され、核酸増幅反応を利用した変異や多型の解析における特異性の向上とは、非特異的増幅の抑制ととらえることができる。特異性を向上させる手段としては、増幅条件（アニール温度を高める、サイクル数の減少、酵素量の減量、酵素の種類変更、ｄＮＴＰ濃度の減少、Ｍｇ濃度の減少、鋳型ＤＮＡ濃度の減少など）の至適化、プライマーのデザイン変更、抗体やアプタマーを利用したホット・スタート法の利用、特異性が高まるとされる修飾オリゴヌクレオチド（ＰＮＡやＬＮＡなど）の利用などが知られている。これらの手段は非特異増幅の抑制に有効な場合もあるものの、効果が十分でなかったり特異的な増幅まで抑制されることが多い。
【０００８】
一方、核酸増幅反応のプライマーの５’末端側に必ずしも鋳型核酸とは相補的ではない塩基を付加しても増幅反応に著しい悪影響は与えない場合があることが知られている。例えばプライマーの５’末端に所望の制限酵素認識配列を付加することで増幅産物に制限酵素切断末端を持たせる方法がＶａｌｌｅｔｔｅらにより報告されている（例えば非特許文献１参照）。またｍＲＮＡを鋳型とした逆転写反応用のオリゴｄＴプライマーの５’末にＧＧＣＣの４塩基を付加する方法がＣｏｏｐｅｒらにより報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００９】
また変異を検出する方法において５’末に配列を付加する方法としては、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄらが変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＤＧＧＥ）法において増幅産物の末端部に融解温度（Ｔｍ）の高いドメインを持たせるためにＧＣクランプとよばれるＧＣ含量の非常に高い配列を付加する方法を報告している（例えば、非特許文献３参照）。またＧｅｒｍｅｒらは２６塩基対のＧＣ−テイルを付加することで増幅産物のＴｍを人為的に高くして多型を検出する方法を報告している（例えば、非特許文献４参照）。しかしながらこれらの変異や多型の検出方法における５’末への配列の付加は増幅産物のＴｍ変化を目的としたもので、増幅反応時の核酸増幅プライマーへの配列付加による特異性の向上に言及したものではない。
【００１０】
【非特許文献１】
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．第１７巻、第７２３頁（１９８９年）
【非特許文献２】
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ第９巻、第６０頁（１９９０）
【非特許文献３】
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８６巻、第２３２頁（１９８９年）
【非特許文献４】
ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ第９巻、第７２頁（１９９９年）
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記のような課題を解決して、明確かつ再現性よく核酸配列中の変異や多型を検出するために、増幅反応時の特異性を向上させることができる方法及びそのための試薬を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、変異あるいは多型を解析するための核酸増幅プライマーにおいて、その５’末に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列を付加することにより、厳密な反応条件の制御を行わなくとも、非特異的アニールを抑制して特異性を向上させることができることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
５’末に配列の付加されていない従来の核酸増幅プライマーにおいては、プライマーと標的核酸（初期鋳型）とのＴｍ値と、プライマーと増幅産物（中後期鋳型）とのＴｍ値が等しい。したがって、アニール温度を上げることで増幅反応初期の非特異増幅を抑制しようとすると、中後期に渡って特異的な増幅も抑制される。一方低いアニール温度では特異的な増幅反応の抑制を無くすことはできるが、非特異増幅の回避が非常に困難である。
【００１４】
これに対して、核酸増幅プライマーの５’末への配列付加することにより、プライマーと鋳型核酸間でアニールする塩基数が増加する。このとき配列付加プライマーと標的核酸(初期鋳型)とのアニール反応においては、付加配列は積極的には関与しないため、Tm値はほとんど変動しない。一方、プライマーと増幅産物(中後期鋳型)とのアニール反応においては付加配列がすべてアニールに関与するためTm値が上昇する。この差を利用し高めのアニール温度を選択することで、特異的な増幅を維持しつつ、非特異的な増幅の排除が可能となる。その結果厳密な反応条件の制御を行わなくとも、容易に増幅反応の特異性を向上させることができる。
【００１５】
核酸配列決定法、ＴａｑＭａｎプローブ法、ＲＦＬＰ法、ＡＳＯ法、一塩基伸長法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法などのあらかじめ変異や多型を含む領域を核酸増幅反応で増幅しておいてから検出する手法においては、本発明の５’末に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列を付加された核酸増幅プライマーを用いることで、後の検出反応に影響を与えることなく特異的な増幅産物を確保することが可能である。アレル毎のプライマーの特異性により変異や多型の検出を行うＡＳＰ法では本発明の利用は特に有用である。上述の他の検出法であれば特異性が確保できない際に、プライマーのデザイン（増幅配列）変更するという選択肢もあるのに対し、ＡＳＰ法では変異や多型の位置とプライマーの配列の関係があらかじめ定まっているため、プライマーのデザイン変更における自由度が低い。したがって十分な特異性が確保できなかったプライマーの５’に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列を付加することで容易に特異性の向上が図れることにより、より多くの変異や多型をＡＳＰ法を使用して検出することが可能となる。
【００１６】
本発明は以下のような構成からなる。
［１］核酸試料中に含まれる塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、該反応に使用される少なくともひとつのプライマーの５’側に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が付加されていることを特徴とする塩基多型の検出方法。
【００１７】
［２］［１］に記載される塩基多型の検出法であって、該付加されている配列の長さが２〜４０であることを特徴とする塩基多型の検出方法。
【００１８】
［３］［１］に記載される塩基多型の検出法であって、該付加されている配列が、配列表・配列番号７〜１６から選択される配列を含むことを特徴とする塩基多型の検出方法。
【００１９】
［４］［１］〜［３］に記載される塩基多型の検出法であって、該付加される配列が相互に相同的ではないことを特徴とする塩基多型の検出方法。
【００２０】
［５］核酸試料中に含まれる塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、該方法が、
（ａ）試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマーを同時に又は別々に、ＤＮＡポリメラーゼと共に作用させる工程、
（ｂ）該プライマーが伸長されたか否かによって、その核酸試料中に含まれる塩基多型を検出する工程
を含み、該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、且つ該各プライマーの中の少なくともひとつのプライマーの５’側に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が付加されていることを特徴とする塩基多型の検出方法。
【００２１】
［６］核酸試料中に含まれる塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、該方法が、
（ａ）試料中に含まれる特定の一塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマーを同時に又は別々に、ＤＮＡポリメラーゼと共に作用させる工程、
（ｂ）該プライマーが伸長されたか否かによって、その核酸試料中に含まれる塩基多型を検出する工程
を含み、該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、該各プライマーの３’末端より３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されており、且つ該各プライマーの中の少なくともひとつのプライマーの５’側に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が付加されていることを特徴とする、［５］に記載の塩基多型の検出方法。
【００２２】
［７］該プライマーの３’末端より３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されている［６］に記載の塩基多型の検出方法。
【００２３】
［８］核酸試料中に含まれる塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、該方法が、
（ａ）試料中に含まれる特定の一塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマーを同時に又は別々に、ＤＮＡポリメラーゼと共に作用させる工程、
（ｂ）該プライマーが伸長されたか否かによって、その核酸試料中に含まれる塩基多型を検出する工程
を含み、該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、該各プライマーの３’末端より番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されており、且つ該相補的でない塩基は、各プライマーにおいて異なる塩基であり、且つ該各プライマーの中の少なくともひとつのプライマーの５’側に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が付加されていることを特徴とする、［５］に記載の塩基多型の検出方法。
【００２４】
［９］該プライマーの３’末端より３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換され、且つ該相補的でない塩基は、各プライマーにおいて異なる塩基とする、［５］に記載の塩基多型の検出方法。
【００２５】
［１０］各プライマーの５’側に付加される染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が２から４０塩基の長さであることを特徴とする、［５］〜［９］のいずれかに記載の塩基多型の検出方法。
【００２６】
［１１］各プライマーの５’側に付加される染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が、配列表・配列番号７〜１６の中から選択される配列を含むことを特徴とする、［５］〜［９］のいずれかに記載の塩基多型の検出方法。
【００２７】
［１２］２つ以上のプライマーの５’側に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列を付加する際、付加される配列が相互に相同的ではないことを特徴とする、［５］〜［９］のいずれかに記載の塩基多型の検出方法。
【００２８】
［１３］核酸を増幅させる方法が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰおよびＩＣＡＮからなる群から選ばれたいずれかの方法である［１］〜［１２］のいずれかに記載の塩基多型の検出方法。
【００２９】
［１４］該各プライマーが伸長されたか否かを、野生型用プライマー及び変異型用プライマーからなる群の少なくとも１種から伸長した産物の配列に特異的な検出用プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことによって検出する、［５］〜［１３］のいずれかに記載の塩基多型の検出方法。
【００３０】
［１５］該各プライマーの少なくとも１つまたは検出用プローブが、予め標識されている［５］〜［１４］のいずれかに記載の塩基多型の検出方法。
【００３１】
［１６］該各プライマーの少なくとも１つまたは検出用プローブが、酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団からなる群から選ばれる少なくとも１種によって標識されている［１５］に記載の塩基多型の検出方法。
【００３２】
［１７］（ａ）工程を単一の容器で行い、該各プライマーが伸長されたか否かを、野生型用プライマー及び変異型用プライマーからなる群の少なくとも１種から伸長した産物配列に特異的な検出用プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことによって検出する、［５］に記載の塩基多型の検出方法。
【００３３】
［１８］野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む塩基多型検出用試薬キットであって、該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が、塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、且つ該各プライマーの中の少なくともひとつのプライマーが、その５’側に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が付加されていることを特徴とする、検出用試薬キット。
【００３４】
［１９］野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む塩基多型検出用試薬キットであって、該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が、塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、該各プライマーの３’末端より３番目から５’端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の塩基と相補的でない塩基に置換され、且つ該各プライマーの中の少なくともひとつのプライマーが、その５’末側に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が付加されている［１８］に記載の検出用試薬キット。
【００３５】
［２０］該各プライマーの３’末端より３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されている、［１９］に記載の検出用試薬キット。
【００３６】
［２１］野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む塩基多型検出用試薬キットであって、該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が、塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、該各プライマーの３’末端より３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の塩基と相補的でない塩基に置換され、且つ該相補的でない塩基は各プライマーで異なる塩基であり、且つ該各プライマーの中の少なくともひとつのプライマーが、その５’側に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が付加されている［１８］に記載の検出用試薬キット。
【００３７】
［２２］該各プライマーの３’末端より３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されて、且つ該相補的でない塩基は、各プライマーにおいて異なる塩基とした、［２１］に記載の検出用試薬キット。
【００３８】
［２３］該各プライマーの５’側に付加される染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が２から４０塩基の長さである、［１８］〜［２２］のいずれかに記載の検出用試薬キット。
【００３９】
［２４］該各プライマーの５’側に付加される染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が、配列表・配列番号７〜１６の中から選択される配列を含む、［１８］〜［２２］のいずれかに記載の検出用試薬キット。
【００４０】
［２５］該各プライマーの２つ以上の５’側に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列を付加する際、付加される配列が相互に相同的ではない、［１８］〜［２２］のいずれかに記載の検出用試薬キット。
【００４１】
［２６］野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及び検出用プローブを含む塩基多型検出用試薬キットであって、該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が、塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、且つ該各プライマーの中の少なくともひとつのプライマーが、その５’側に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が付加されているキット。
【００４２】
［２７］野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及び検出用プローブを含む塩基多型検出用試薬キットであって、該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が、塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、該各プライマーの３’末端より３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の塩基と相補的でない塩基に置換され、且つ該各プライマーの中の少なくともひとつのプライマーが、その５’側に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が付加されている［２６］に記載の検出用試薬キット。
【００４３】
［２８］該各プライマーの３’末端より３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されている、［２７］に記載のキット。
【００４４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片は、目的の遺伝子の情報を担う塩基多型部位を含む標的核酸であれば、特に制限されない。該標的核酸の例としては、Ａｌｕ配列、蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。より具体的には、遺伝病を含む各種疾患、薬物代謝、生活習慣病（高血圧、糖尿病等）に関連する遺伝子が挙げられる。例えば、高血圧としてＡＣＥ（ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＣｏｎｖｅｒｔｉｎｇＥｎｚｙｍｅ）遺伝子が挙げられる。
【００４５】
本発明において、染色体又はその断片を単に核酸ということがある。変異型核酸とは、野生型核酸のうち少なくとも１つ、好ましくは１つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレオチドに置換されているものや、野生型核酸の一部に挿入、欠失配列等を含む核酸のことであり、どの部位のヌクレオチドが変異しているかが解明されているものである。このような塩基多型により体質等が異なっていることが解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸がこのような予想される変異を有しているか否かを検査する方法である。
【００４６】
核酸を複製する場合、一本鎖に変性した標的核酸にプライマー、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とＤＮＡポリメラーゼを作用させることで、標的核酸を鋳型としてプライマー伸長反応が起こり核酸配列の相補鎖が合成される。
本発明において、野生型用プライマーとは、通常の表現型を有している塩基多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するプライマーであって、変異型用プライマーとは、野生型とは異なる配列を有している塩基多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するプライマーである。
【００４７】
本発明において、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片が増幅されたか否かによって、その核酸試料中に含まれる塩基多型を検出する方法とは、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片を含む核酸試料に、野生型用プライマーと及び１種又は２種の変異型用プライマー（フォワードプライマーに相当）を同時にまたはそれぞれ別々に用いて、リバースプライマーと共に増幅反応を行うことにより多型を検出する方法である。
【００４８】
本発明におけるプライマーの長さとしては、標的核酸と相補的な配列は好ましくは１３〜３５塩基であり、より好ましくは１６塩基以上であり、また、３０塩基以下が好ましい。一方、５’末に付加される染色体又はその断片と完全には相補的でない配列は、２〜４０塩基であることが好ましく、より好ましくは３０塩基以下、さらに好ましくは２０塩基以下、特に好ましくは１０塩基以下である。付加される配列中、染色体又はその断片と相補的でない塩基の割合は、１０％以上、好ましくは２５％以上、さらに好ましくは５０％以上である。また付加される配列中の塩基の種類は特に限定されるものではないが、より少ない塩基数の付加で高い特異性向上効果を得るためには、グアニン（Ｇ）および／またはシトシン（Ｃ）塩基の利用が望ましい。グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）塩基の合計量は付加される配列中で６０％以上であることが好ましく、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくはすべてがグアニン（Ｇ）および／またはシトシン（Ｃ）である。
【００４９】
好ましく付加される配列の例としては、配列表・配列番号７〜１６から選択される配列を含むことが好ましく、さらには他の配列を含んでいても良い。
また、付加される配列はプライマー毎に異なり、相互に相同的ではない場合であっても良い。付加された配列が相互に相同的な２種以上のプライマーを用いた場合には、同一の反応容器内で核酸増幅反応を行ったときに、付加された配列に他方の伸長または増幅反応物がハイブリダイズしてしまうため、特異性を低下させることがある。
【００５０】
本発明において、プライマーと１種又は２種の変異型用プライマーをリバースプライマーと組み合わせた上で、試料に別々、又は同時に作用させる。いずれの場合においても、少なくともひとつのプライマーの５’末に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が付加されていても良いし、反応液中のすべてのプライマーに付加されていても良い。
【００５１】
本発明において、プライマーは３’末端より２番目の塩基が塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応していることが好ましい。
さらには、上記プライマーの３’末端より３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されていることが好ましく、さらには相補的でない塩基は３’末端から３〜７番目に有するよう設計されていることが好ましい。
なお、相補的でない塩基は３’末端から３番目に有するよう設計されていることが特に好ましい。
また、より特異性を高めるため、プライマー中の該相補的でない塩基は各プライマーにおいて異なる塩基とすることもできる。
【００５２】
本発明において、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片の増幅方法は、基本的には、従来の方法を用いて行うことができる。通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼ、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを作用させ、適当な温度条件で保温することにより増幅される。
ＡＳＰ法の場合は、野生型用プライマーと、１種又は２種の変異型用プライマーを同時又はそれぞれ別個に用いて作用させることで、標的核酸を鋳型としてフォワードプライマーとリバースプライマーの間で増幅される。
【００５３】
核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ：Ｎａｔｕｒｅ第３５０巻、第９１頁（１９９１））、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（ＳｔｒａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｒｅｓｅａｒｃｈ第２０巻、第１６９１頁（１９９２））、ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第３１巻、第３２７０頁（１９９３））などが挙げられる。
【００５４】
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各プライマーと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各プライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２ⁿ倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。
【００５５】
上記のような核酸増幅法を利用した方法では、野生型核酸を増幅できる野生型用プライマーと、変異型核酸を増幅できる変異型用プライマーをそれぞれ別個又は同時に用いて遺伝子増幅法を行う。
【００５６】
野生型用プライマーを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が野生型であれば反応が起きるが、変異型では反応が起きない。逆に、変異型用プライマーを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が変異型であれば反応が起きるが、野生型であれば反応は起こらない。従って、一つの試料を二つに分け、一方は野生型用プライマーを用いて反応を行い、他方は変異型用プライマーを用いて反応を行い、反応が起ったか否かを調べることにより、試料核酸が野生型であるか変異型であるかを明確に知ることができる。
また、一つの試料に野生型用プライマーと変異型プライマーの両方を添加して用いてどのプライマーの伸張または増幅反応が起こったかを調べることにより、試料核酸が野生型であるか変異型であるかを明確に知ることもできる。
【００５７】
特に、ヒトを始め、高等生物は、１種類の遺伝子について、父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子をそれぞれ１つずつ有しているが、この方法によれば、試料遺伝子が野生型のホモか、変異型のホモか、あるいは、両方のヘテロかを区別することもできる。すなわち、ヘテロの場合には、野生型遺伝子と変異型遺伝子が共に存在するから野生型用プライマーを用いた場合も変異型用プライマーを用いた場合も反応が起きる。
【００５８】
ＤＮＡポリメラーゼ
本発明の伸長反応又は増幅反応に使用されるＤＮＡポリメラーゼとしては、通常該反応に使用されるＤＮＡポリメラーゼが使用できる。好ましい例としては、ピロコッカス・スピーシーズ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）ＫＯＤ１株、サーマス・アクエティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）、もしくはハイパーサーモフィリック・アーカエバクテリウム（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。
【００５９】
本発明のプライマーを使用することにより、伸長又は増幅反応時の温度、濃度等の条件を極めて厳密に制御する必要がなくなり、より緩和な条件で反応を行っても、正確な検出を行うことが可能となる。
例えば、伸長又は増幅反応において、プライマーを標的にアニールさせる温度は、これまでの方法では、±０．１℃の精度で制御する必要がある場合も少なくなかったが、本発明のプライマーを使用した場合±１℃以上の誤差があっても検出結果の正確性には影響を受けない。
また反復配列や偽遺伝子中に存在する変異や多型であってもわずかな差違を利用して明確に検出することが可能となる。
【００６０】
検出
上記伸長反応又は増幅反応によって得られた産物から、塩基多型を検出する方法としては、通常使用される検出方法を用いることができる。
例えば、該検出は、該各プライマーを、予め酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識しておき、伸長又は増幅反応後に該標識を検出することによって、行うことができる。または、リバースプライマーを標識しておいてもよい。
【００６１】
酵素としてはアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
蛍光物質としては、ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが挙げられる。
ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。
放射性物質としては、³²Ｐ、³⁵Ｓなどが挙げられる。
発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。
該標識は、プライマーの伸長反応に影響を与えることがなければプライマーのどの位置に結合させてもよい。好ましくは、５’部位である。
【００６２】
検出方法としては、例えば、野生型用プライマー及び変異型用プライマーによって伸長、増幅された産物を特異的に捕捉することができる野生型検出プローブ及び変異型検出プローブを、公知の方法に従い、マイクロタイタープレートなどの固相に結合させる。次に、伸長又は増幅した産物を変性させ、該検出プローブが結合したマイクロタイタープレートに添加する。野生型用プライマーによって伸長、増幅された産物は野生型検出プローブにのみ結合し、変異型検出プローブには結合しない。また、変異型用プライマーによって、伸長、増幅された産物は多型検出プローブにのみ結合し、野生型検出プローブには結合しない。その後、プライマーに結合している標識を検出することによって、試料に含まれている染色体又はＤＮＡ断片の塩基多型を検出することができる。本発明の方法では、塩基多型部位に加えて、人為的ミスマッチの部位においても野生型用プライマーと変異型用プライマーで異なっているため、塩基多型部位のみ相違している場合と比較して、より明確にそれぞれの伸長／増幅産物を検出することが可能である。
したがって、試料を野生型用、変異型用の２つに分けることなく両プライマーで同時に増幅反応を行い、特異的に検出プローブで測り分けることも容易である。
野生型用プライマーと変異型用プライマーに異なる標識を用いた場合には、１つのプレートのウエルで行うことができる。
【００６３】
また、特開２００３−１３５０６９号公報に記載されるように、アビジン結合磁性粒子を用いて、未反応のオリゴヌクレオチド量を測定することで、該オリゴヌクレオチドが反応したか否かを検出してもよい。
【００６４】
キット
本発明において、キットとしては、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマー、リバースプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及び必要により検出プローブを含む塩基多型検出用試薬キットを含むものであり、少なくともひとつのプライマーの５’末に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が付加されているという特徴を有する。また、好ましくは該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が、塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、さらに加えて、該各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の塩基と相補的でない塩基に置換されていることが好ましい。
【００６５】
また、該各プライマーまたはプローブは、上述したような酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識されていてもよい。
【００６６】
【実施例】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１ＡＰＯＥ（ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ）遺伝子の塩基多型（Ｃｙｓ１１２Ａｒｇ）の検出
（１）ＡＰＯＥ遺伝子のＣｙｓ１１２Ａｒｇ塩基多型を検出するプライマーの合成
配列番号１〜６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１〜６と示す）の合成をＤＮＡ合成受託会社（プロリゴ・ジャパン株式会社）に委託した。オリゴ１、４は野生型（Ｔ）増幅用プライマーで３’末端より２番目に野生型（Ｔ）のヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｇ→Ｔ）を有し、ＦＩＴＣ標識されている。オリゴ２、５は変異型（Ｃ）増幅用プライマーで３’末端より２番目に変異型（Ｃ）のヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｇ→Ｔ）を有し、テキサスレッド標識されている。オリゴ３，６は野生型／変異型共通の配列を有するアンチセンス鎖に設定されたリバースプライマーで、オリゴ１〜４と組み合わせて増幅反応のプライマーとして使用され、ビオチン標識されている。
【００６７】
（２）ＰＣＲ法によるＡＰＯＥ遺伝子多型の解析
ａ）ＰＣＲ法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトＡＰＯＥ遺伝子多型を解析した。
【００６８】
試薬−１（オリゴ１、２、３）
以下の試薬を含む２５μｌ溶液を調製した。
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１５ｐｍｏｌ
オリゴ２５ｐｍｏｌ
オリゴ３５ｐｍｏｌ
×１０緩衝液２．５ μｌ
２ｍＭｄＮＴＰ２．５ μｌ
２５ｍＭＭｇＣｌ₂ １．５ μｌ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ１．３Ｕ
抽出ＤＮＡ溶液１００ｎｇ
【００６９】
試薬−２（オリゴ４、５、６）
以下の試薬を含む２５μｌ溶液を調製した。
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ４５ｐｍｏｌ
オリゴ５５ｐｍｏｌ
オリゴ６５ｐｍｏｌ
×１０緩衝液２．５ μｌ
２ｍＭｄＮＴＰ２．５ μｌ
２５ｍＭＭｇＣｌ₂ １．４ μｌ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ１．３Ｕ
抽出ＤＮＡ溶液１００ｎｇ
【００７０】
増幅条件−１（オリゴ１、２、３）
９５℃・５分
９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃、３０秒（３５サイクル）
７２℃・２分。
【００７１】
増幅条件−２（オリゴ４、５、６）
９５℃・５分
９５℃・３０秒、６５℃・３０秒、７２℃、３０秒（４０サイクル）
７２℃・２分。
【００７２】
ｂ）アビジン結合磁性粒子による検出
ａ）の増幅反応液１０ μｌを５００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、２ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１．２５ μｇアビジン結合磁性粒子（Ｇｅｎｏｖｉｓｉｏｎ製）の溶液４０μｌに加えて、室温にて１５分間反応させた。これによって、増幅されたヒトＡＰＯＥ遺伝子断片および、ビオチン標識オリゴふくれ落ち度がアビジン結合磁性粒子に捕捉される。次に、磁性粒子を磁石で分離し、未反応蛍光標識オリゴヌクレオチドが含まれる情勢を７．５ｍＭＮａＯＨ１００ μｌと混和する。室温で１０分間放置後に暗室中で蛍光プレートリーダー（大日本製薬社製）で蛍光強度量を測定した。所要時間は約３０分であった。得られた蛍光強度から以下の計算式を用いて試料の蛍光強度量を算出した。
ＦＬ（試料の蛍光強度）＝ＦＬｂ−ＦＬｓ
ＦＬｂ＝ＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ（抽出ＤＮＡ溶液が未添加）の蛍光強度
ＦＬｓ＝各試料の蛍光強度
【００７３】
【表１】

【００７４】
上記のように、プライマーの5'末に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列を付加したオリゴ4、5、6の組合せでは特異的なシグナルを減少させることなく、非特異的なシグナルの抑制することで顕著に特異性を向上させることができ、塩基多型を容易かつ明確に判定することができた。
なお、実施例で反応の温度制御は±０．１℃で行われたが、オリゴ4、5、6の組合せでは非特異的反応はほとんど起こらず、温度制御の正確さが低下した場合であっても十分な検出が行えることが分かった。
【００７５】
【発明の効果】
上述したように、本発明により、試料核酸中の塩基多型を容易かつ高い特異性で明確に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、偽陽性が生じないので、遺伝子増幅法の条件をそれほど厳密にしなくても再現性良く結果が得られ、機種の違い等によって判定結果が異なることはなくなった。また、本発明の方法によれば、従来法では困難であったホモ接合とヘテロ接合の識別も可能になった。
【配列表】

Claims

核酸試料中に含まれる塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、該方法が、
（ａ）試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマーを同時に又は別々に、ＤＮＡポリメラーゼと共に作用させる工程、
（ｂ）該プライマーが伸長されたか否かによって、その核酸試料中に含まれる塩基多型を検出する工程
を含み、該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、且つ該各プライマーの中の少なくともひとつのプライマーの５’側に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が付加されており、さらに該各プライマーの３’末端より３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されていることを特徴とする塩基多型の検出方法。
該各プライマーの３’末端より３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換され、且つ該相補的でない塩基は、各プライマーにおいて異なる塩基とする、請求項１に記載の塩基多型の検出方法。
各プライマーの５’側に付加される染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が２から４０塩基の長さであることを特徴とする、請求項１に記載の塩基多型の検出方法。
各プライマーの５’側に付加される染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が、配列表・配列番号７〜１６の中から選択される配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の塩基多型の検出方法。
２つ以上のプライマーの５’側に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列を付加する際、付加される配列が相互に相同的ではないことを特徴とする、請求項１に記載の塩基多型の検出方法。
２つ以上のプライマーの５’側に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列を付加する際、
（１）付加される配列が４０塩基以下の長さであり、かつ、
（２）グアニンおよびシトシン塩基の合計量が付加される配列中で６０％以上であり、かつ、
（３）付加される配列が相互に相同的ではない、
ことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の塩基多型の検出方法。
核酸を増幅させる方法が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰおよびＩＣＡＮからなる群から選ばれたいずれかの方法である請求項１〜６のいずれかに記載の塩基多型の検出方法。
該各プライマーが伸長されたか否かを、野生型用プライマー及び変異型用プライマーからなる群の少なくとも１種から伸長した産物の配列に特異的な検出用プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことによって検出する、請求項１〜７のいずれかに記載の塩基多型の検出方法。
該各プライマーの少なくとも１つまたは検出用プローブが、予め標識されている請求項１〜８のいずれかに記載の塩基多型の検出方法。
該各プライマーの少なくとも１つまたは検出用プローブが、酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団からなる群から選ばれる少なくとも１種によって標識されている請求項９に記載の塩基多型の検出方法。
（ａ）工程を単一の容器で行い、該各プライマーが伸長されたか否かを、野生型用プライマー及び変異型用プライマーからなる群の少なくとも１種から伸長した産物配列に特異的な検出用プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことによって検出する、請求項１に記載の塩基多型の検出方法。
野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む塩基多型検出用試薬キットであって、該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が、塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、該各プライマーの３’末端より３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されており、且つ該各プライマーの中の少なくともひとつのプライマーが、その５’側に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が付加されていることを特徴とする、検出用試薬キット。
野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む塩基多型検出用試薬キットであって、該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が、塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、該各プライマーの３’末端より３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の塩基と相補的でない塩基に置換され、且つ該相補的でない塩基は各プライマーで異なる塩基であり、且つ該各プライマーの中の少なくともひとつのプライマーが、その５’側に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が付加されている請求項１２に記載の検出用試薬キット。
該各プライマーの３’末端より３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されて、且つ該相補的でない塩基は、各プライマーにおいて異なる塩基とした、請求項１３に記載の検出用試薬キット。
該各プライマーの５’側に付加される染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が２から４０塩基の長さである、請求項１２〜１４のいずれかに記載の検出用試薬キット。
該各プライマーの５’側に付加される染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が、配列表・配列番号７〜１６の中から選択される配列を含むことを特徴とする請求項１２〜１４のいずれかに記載の検出用試薬キット。
該各プライマーの２つ以上の５’側に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列を付加する際、付加される配列が相互に相同的ではない、請求項１２〜１４のいずれかに記載の検出用試薬キット。
野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及び検出用プローブを含む塩基多型検出用試薬キットであって、該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が、塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、該各プライマーの３’末端より３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されており、且つ該各プライマーの中の少なくともひとつのプライマーが、その５’側に染色体又はその断片と完全には相補的でない配列が付加されているキット。