CN112481382B - 一种用于检测jak2基因的引物组合物和探针、试剂盒以及方法 - Google Patents

一种用于检测jak2基因的引物组合物和探针、试剂盒以及方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供一种用于检测JAK2基因的引物组合物和探针，其特征在于，所述引物组合物包括用于检测突变型基因的引物对，以及用于检测野生型基因的引物对；所述用于检测突变型基因的引物对含有Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.2所示序列的下游引物；所述用于检测野生型基因的引物对含有Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.3所示序列的下游引物；所述探针为Seq ID No.4所示序列；其中，各引物5’端的M为不与JAK2基因互补的核酸序列，用于增加各引物的GC含量。本申请用于检测JAK2基因的引物组合物和探针，增强了引物和扩增模板的特异性结合，当M被引入扩增模板时，引物和JAK2基因互补区域的Tm值升高，能够实现有效退火，从而提高了检测JAK2基因突变的灵敏度。

Description

一种用于检测JAK2基因的引物组合物和探针、试剂盒以及方法
技术领域
本申请涉及基因突变检测领域，具体涉及一种用于检测JAK2基因的引物组合物和探针、试剂盒以及方法。
背景技术
骨髓增殖肿瘤(myeloproliferative meoplasm，MPNs)是一组起源于多功能造血干细胞的恶性肿瘤，其特征为一系或多系骨髓造血细胞异常克隆性增殖，包括真性红细胞增多症(polycythemia，PV)、原发性血小板增多症(essential thrombocthemia,ET)以及原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis,PMF)等。
Janus kinase(JAKs)是一类非受体型酪氨酸蛋白激酶家族，目前有JAK1、JAK2、JAK3、TYK2四个成员。JAK激酶具有高度同源的结构域：在羧基端有一个处于活化状态的激酶结构域(JAK同源性的JH1结构域)和一个催化“非活化状态激酶”的伪激酶结构域(JH2结构域)。研究表明，JH2伪激酶结构域有野生型JAK2和JAK2V617F突变型两种。JAK2V617F突变是14外显子的鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T)，致使JAK2的JH2伪激活结构域1849位置的核苷酸发生改变，从而导致第617位密码子的缬氨酸被苯丙氨酸替换。缬氨酸变为苯丙氨酸后降低了JH2伪激酶结构域对JAK2激酶结构域的负调控作用，自动激活JAK2激酶结构域，使得细胞因子信号转导通路过度活化，从而引起含有JAK2V617F突变的细胞对造血细胞因子的刺激敏感性增加，导致红细胞、白细胞、血小板等血细胞异常增殖的发生，从而导致骨髓增殖性肿瘤的发生。
有报道指出，在大多数BCR-ABL1基因阴性的MPNs患者中JAK2V617F突变检测呈阳性，其中，95％以上的PV患者，65％以上的PMF患者中JAK2V617F突变检测均呈阳性。
针对JAK2基因突变情况，常用的检测方法为测序法。但是测序方法价格昂贵，过程复杂，耗时时间长，不利于临床快速诊断。JAK2基因突变还可以通过扩增受阻突变PCR(ARMS-PCR)方法检测，扩增受阻突变PCR可在理想PCR条件下检测到单基因突变，可区分JAK2V617F突变个体是纯合子还是杂合子，是检测MPNs病人有无突变的可靠方法，但是此方法的缺点是灵敏度低，仅为1％-2％。
因此，如何提高检测灵敏度是检测JAK2基因突变的难点。
发明内容
本申请的目的是提供一种用于检测JAK2基因的引物组合物和探针，用于检测JAK2基因的试剂盒以及方法。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请的第一方面公开了一种用于检测JAK2基因的引物组合物和探针，用于检测JAK2基因的引物组合物包括用于检测突变型基因的引物对，以及用于检测野生型基因的引物对；用于检测突变型基因的引物对含有Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.2所示序列的下游引物；用于检测野生型基因的引物对含有Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.3所示序列的下游引物；用于检测JAK2基因的探针为Seq ID No.4所示序列；
Seq ID No.1：5’-M-TGTGATCCTGAAACTGAATTT-3’
Seq ID No.2：5’-M-TGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG-3’
Seq ID No.3：5’-M-TGGTTTTAAATTATGGAGTATGTT-3’
Seq ID No.4：5’-TGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGG-3’；
其中，各引物5’端的M为不与JAK2基因互补的核酸序列，用于增加各引物的GC含量；用于检测JAK2基因的探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光猝灭基团。
需要说明的是，本申请通过同时在突变型基因和野生型基因的引物的5’端引入额外的游离碱基，用于增加各引物的GC含量，当游离的碱基被引入扩增模板时，能够提高引物和JAK2基因互补区域的Tm值，从而能够实现在PCR扩增初期，通过增加退火温度增强引物和扩增模板的特异性结合，降低野生型基因和突变型基因之间的交叉扩增反应，因而大大提高了检测JAK2基因突变的灵敏度，减少JAK2基因检测结果的假阳性率。
本申请的一个实现方式中，M基团为CGCG，也即：
Seq ID No.1：5’-CGCGTGTGATCCTGAAACTGAATTT-3’
Seq ID No.2：5’-CGCGTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG-3’
Seq ID No.3：5’-CGCGTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTT-3’。
本申请的第二方面公开了一种用于检测JAK2基因的试剂盒，试剂盒包括上述用于检测JAK2基因的引物组合物和探针。本申请的一个实现方式中，试剂盒还包括质控品，质控品含有野生型基因组DNA和突变型基因组DNA；
优选地，质控品含有浓度为3×103copies/μL野生型基因组DNA和浓度为3×103copies/μL突变型基因组DNA。
本申请的一种实现方式中，试剂盒还包括内参引物对和内参探针，内参引物对含有Seq ID No.5所示序列的上游引物和Seq ID No.6所示序列的下游引物，内参探针为SeqID No.7所示序列；
Seq ID No.5：5’-CACTGGGTCCAGCGAGAAG-3’
Seq ID No.6：5’-TCTTCCAGAAGCCCTTCAGC-3’
Seq ID No.7：5’-CCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGT-3’；
其中，内参探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光猝灭基团，内参探针和用于检测JAK2基因的探针5’端标记的荧光报告基团不同。本申请的一种实现方式中，试剂盒还包括定量标准品，定量标准品含有野生型质粒和突变型质粒；
优选地，定量标准品含有浓度为1×101copies/μL、1×102copies/μL、1×103copies/μL、1×104copies/μL野生型质粒和浓度为1×101copies/μL、1×102copies/μL、1×103copies/μL、1×104copies/μL突变型质粒。
本申请的一种实现方式中，试剂盒还包括PCR缓冲液、扩增酶和dNTPs。
本申请的一种实现方式中，试剂盒的PCR扩增程序为：95℃预变性10分钟，然后进入45个循环：94℃变性15秒、60℃退火与延伸60秒，在退火与延伸时进行荧光收集。
需要说明的是，本申请试剂盒的扩增程序退火温度为60℃，在第一轮扩增时，退火温度比引物和JAK2基因互补区域的Tm值高10度左右，可大大减少引物和JAK2基因模板间的非特异性结合，引物和JAK2基因模板基本不发生错配，增强了PCR扩增反应的特异性；第三轮扩增时，游离的碱基被引入扩增模板，引物和扩增模板完全互补，提高了引物和JAK2基因互补区域的Tm值，此时，退火温度仅比引物和JAK2基因互补区域的Tm值高2-3度左右，从而能够实现引物和JAK2基因模板的有效退火。
本申请的第三方面公开了一种用于检测JAK2基因的方法，使用上述试剂盒，上述方法包括：
提取全血样本DNA；
将全血样本DNA和试剂盒中的试剂混匀，并进行PCR扩增；
根据突变型基因和野生型基因的扩增情况，确定全血样本DNA的突变情况。
值得说明的是，本申请的检测方法，是对全血样本中的DNA进行提取，样本易于获得和保存；此外，通过本申请试剂盒的引物组合物和探针，使用相应的扩增程序能够增加PCR扩增的特异性，降低野生型基因和突变型基因之间的交叉扩增反应，并在退火阶段实现引物和JAK2基因模板的有效退火，因而大大提高了检测JAK2基因突变的灵敏度，减少JAK2基因检测结果的假阳性率。
本申请的一种实现方式中，根据突变型基因和野生型基因的扩增情况，确定全血样本DNA的突变情况具体为：
根据试剂盒中的JAK2基因定量标准品绘制标准曲线；
分别获取突变型基因和野生型基因的扩增曲线，通过标准曲线以及突变型基因和野生型基因的扩增曲线的Ct值，对全血样本DNA中的JAK2基因的突变率进行定量。
需要说明的是，根据JAK2基因定量标准品得到标准曲线后，可以根据突变型JAK2基因和野生型JAK2基因扩增曲线的Ct值，对全血样本DNA中JAK2基因的突变率进行定量计算。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请通过同时在突变型基因和野生型基因的引物对的5’端引入额外的游离碱基，增加各引物的GC含量，提高了引物对和JAK2基因互补区域的Tm值，从而能够在PCR扩增初期增强扩增反应的特异性，降低野生型基因和突变型基因之间的交叉扩增反应，并在引物5’端的M引入扩增模板后，实现引物和JAK2基因模板的有效退火，因而大大提高了检测JAK2基因突变的灵敏度，减少JAK2基因检测结果的假阳性率。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本申请作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本实施例提供一种用于检测JAK2基因的引物组合物和探针，通过同时在突变型基因和野生型基因的引物对的5’端引入额外的游离碱基，增加各引物的GC含量，提高了引物对和JAK2基因互补区域的Tm值，从而能够在PCR扩增初期增强扩增反应的特异性，降低野生型基因和突变型基因之间的交叉扩增反应，并在引物5’端的M引入扩增模板后，实现引物和JAK2基因模板的有效退火，因而大大提高了检测JAK2基因突变的灵敏度，减少JAK2基因检测结果的假阳性率。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
一、材料和方法
1、样本处理
本实施例使用的待测样本采用德国QIAGEN公司生产的核酸提取试剂盒提取样本的DNA以得到待测样本。本实施例中QIAGEN核酸提取试剂盒也可用其他品牌试剂盒代替，使用其他品牌试剂盒只需保证核酸提取质量即可。
2、主要试剂和仪器
a、试剂
本实施例提供的用于检测JAK2基因的试剂盒包括用于检测JAK2基因的引物组合物和探针，内参引物对和内参探针，质控品，定量标准品，阴性对照品，PCR缓冲液，扩增酶，MgCl2和dNTPs。其中，PCR缓冲液，扩增酶，MgCl2和dNTPs按照本领域技术人员熟知的途径自制或外购得到。
本实施例质控品含有浓度为3×103copies/μL野生型基因组DNA和浓度为3×103copies/μL突变型基因组DNA；定量标准品含有浓度为1×101copies/μL、1×102copies/μL、1×103copies/μL、1×104copies/μL野生型质粒和浓度为1×101copies/μL、1×102copies/μL、1×103copies/μL、1×104copies/μL突变型质粒。
本实施例采用TE缓冲溶液作为阴性对照品。
b、仪器
本实施例采用的实时荧光PCR分析仪型号为Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM，并采用仪器自带的Rotor-Gene Q Series Software对PCR扩增曲线进行分析。
本实施例采用HEX通道也即Yellow通道采集内标基因的PCR扩增信号，采用FAM通道也即Green通道采集JAK2基因的PCR扩增信号。
3、设计引物对及探针
本实施例根据野生型JAK2基因和突变型JAK2基因分别设计引物组合物和探针，根据内参基因设计内参引物和探针。本实施例采用人的ABL基因作为内参基因。本实施例涉及的引物和探针均为赛默飞世尔科技Invitrogen产品。
本实施例用于检测JAK2基因的引物组合物包括用于检测突变型基因的引物对，以及用于检测野生型基因的引物对；用于检测突变型基因的引物对含有Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.2所示序列的下游引物；用于检测野生型基因的引物对含有SeqID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.3所示序列的下游引物；用于检测JAK2基因的探针为Seq ID No.4所示序列；
Seq ID No.1：5’-M-TGTGATCCTGAAACTGAATTT-3’
Seq ID No.2：5’-M-TGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG-3’
Seq ID No.3：5’-M-TGGTTTTAAATTATGGAGTATGTT-3’
Seq ID No.4：5’-TGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGG-3’；
其中，各引物5’端的M为不与JAK2基因互补的核酸序列，用于增加各引物的GC含量；用于检测JAK2基因的探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光猝灭基团。
本实施例内参引物对含有Seq ID No.5所示序列的上游引物和Seq ID No.6所示序列的下游引物，内参探针为Seq ID No.7所示序列；
Seq ID No.5：5’-CACTGGGTCCAGCGAGAAG-3’
Seq ID No.6：5’-TCTTCCAGAAGCCCTTCAGC-3’
Seq ID No.7：5’-CCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGT-3’；
其中，内参探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光猝灭基团，内参探针和用于检测JAK2基因的探针5’端标记的荧光报告基团不同。
4、野生型反应液和突变型反应液
本实施例野生型反应液的组分名称和组分终浓度如表1所示，突变型反应液的组分名称和组分终浓度如表2所示，将待测样本分别和野生型反应液以及突变型反应液混合，得到待测样本的野生型PCR反应液和突变型PCR反应液，以进行实时荧光PCR检测，进而获得待测样本的野生型扩增曲线和突变型扩增曲线。
具体地，待测样本的野生型PCR反应液或突变型PCR反应液按照下述所示方式混合，其中，待测样本5μl，野生型反应液或突变型反应液19.8μl，扩增酶0.2μl。
表1野生型反应液
组份名称 野生型反应液各组份终浓度
PCR缓冲液 1×
dNTP 0.2mM
<![CDATA[MgCl<sub>2</sub>]]> 0.0625mM
用于检测野生型基因的上游引物 0.4μM
用于检测野生型基因的下游引物 0.3μM
用于检测JAK2基因的探针 0.2μM
内参基因 <![CDATA[Ct值25-37.79；500copies-10<sup>6</sup>copies*]]>
JAK2内参上游引物 0.125μM
JAK2内参下游引物 0.125μM
JAK2内参探针 0.125μM
无核酸酶水 -
*注：拷贝数以Ct值45为1copy换算出。
表2突变型反应液
组份名称 突变型反应液各组份终浓度
PCR缓冲液 1×
dNTP 0.2mM
<![CDATA[MgCl<sub>2</sub>]]> 0.0625mM
用于检测突变型基因的上游引物 0.4μM
用于检测突变型基因的下游引物 0.3μM
用于检测JAK2基因的探针 0.2μM
内参基因 <![CDATA[Ct值25-37.79；500copies-10<sup>6</sup>copies*]]>
用于检测内参基因的上游引物 0.125μM
用于检测内参基因的下游引物 0.125μM
内参探针 0.125μM
无核酸酶水 -
*注：拷贝数以Ct值45为1copy换算出。
5、PCR扩增程序
本实施例试剂盒的PCR扩增程序为：95℃预变性10分钟，然后进入45个循环：94℃变性15秒、60℃退火与延伸60秒，在退火与延伸时进行荧光收集。
6、建立标准曲线
本实施例对定量标准品的PCR扩增曲线进行分析，并获得不同浓度的野生型质粒PCR扩增曲线以及突变型质粒PCR扩增曲线的Ct值，根据扩增曲线的Ct值和野生型质粒或突变型质粒浓度的关系，建立野生型标准曲线以及突变型标准曲线。
7、空白限实验
本实施例空白限实验是基于“CLSI/NCCLS EP17-2A”标准，[Clinical andLaboratory Standards Institute(CLSI)/National Committee for ClinicalLaboratory Standards(NCCLS)]，检测样本为健康人全血，携带野生型JAK2基因，共检测30个样本，每批次每个样本进行120个测试，共检测3个批次。
8、最低检测限实验
本实施例最低检测限实验是基于“CLSI/NCCLS EP17-2A”标准，共使用3种MPN全血样本DNA，这3种样本DNA分别使用野生型DNA样本进行稀释，最终稀释为6个低水平突变率的样本进行重复测试。
具体地，采用突变率分别为0.006％、0.012％、0.024％、0.048％、0.096％以及0.192％的六个样本各重复检测25次，统计各突变比例可检测出突变的次数百分比，即重复检测25次有多少次检测出突变，例如有20次检测出突变，即可检测出突变的次数百分比为80％。
进一步，根据突变比例和检测出的次数百分比2组数据进行线性回归分析，以突变率为横坐标，以检测出突变次数的百分比为纵坐标作图，确定检出次数百分比为95％对应的突变比例，即LOD。
9、线性检测实验
本实施例线性检测是基于“CLSI/NCCLS EP06AE”标准，使用11个不同水平突变率的5种阳性突变样本DNA，具体地，配置突变率分别为0.195％、0.390％、0.781％、1.563％、3.125％、6.25％、12.5％、25％、50％、75％和100％的11个突变样本DNA，进行实时荧光PCR检测，并根据样本检测到的实际突变率以及理论突变率之间的关系得到本实施例试剂盒检测的线性效果。
10、重复性实验
本实施例重复性实验是根据“CLSI/NCCLS EP5-A2”标准，使用11种不同突变率的样本DNA，具体地，配置突变率分别为0％、0.050％、0.1％、0.5％、1％、2％、5％、10％、20％、50％和70％的11个突变样本DNA，得到样本S1-S11，每种突变率样本DNA每天检测2次，每次检测进行2个重复，共经历27天，每种突变率样本共检测108次。
11、干扰物质检测实验
本实施例干扰物质的检测是基于“CLSI/NCCLS EP7-A2”标准，在DNA提取与纯化过程中，共引入17种可以存在于全血中并影响PCR过程的物质，包括二甲磺酸丁酯、氢溴酸西酞普兰、盐酸帕罗西汀、盐酸舍曲林、盐酸氟西汀、对乙酰氨基酚(扑热息痛)、胆红素、人类血红蛋白、K2-EDTA、甘油三酯、赖诺普利脱水、羟基脲、阿司匹林、水杨酸、噻替派、阿纳格雷、干扰素α-2b。
二、结果和分析
1)、建立标准曲线
根据不同浓度定量标准品PCR扩增曲线的Ct值进行统计分析，以PCR扩增曲线的Ct值为纵坐标，以定量标准品浓度的对数为横坐标，建立野生型标准曲线和突变型标准曲线，并得到野生型标准曲线和突变型标准曲线符合要求的斜率范围为[-3.81，-0.37]，R值>0.98。根据标准曲线和样本的野生型扩增曲线以及突变型扩增曲线，能够实现对样本的突变率进行检测。
2)、空白限实验结果
本实施例对30个健康人全血样本DNA进行3个批次的重复检测实验，每个批次检测的突变率均为零。
3)、线性检测实验结果
根据11个梯度变化的低水平突变率的样本检测结果，可知突变样本的理论突变率和使用本实施例试剂盒检测到的实际突变率线性关系良好。
表3线性检测实验结果
理论突变率 实际突变率
100.000％ 99.980％
75.000％ 69.694％
50.000％ 46.463％
25.000％ 23.231％
12.500％ 11.616％
6.250％ 5.809％
3.125％ 2.904％
1.563％ 1.452％
0.781％ 0.726％
0.390％ 0.363％
0.195％ 0.181％
4)、重复性实验结果
本实施例重复性实验检测结果如表4所示，由此可知，在一定突变水平范围内的突变样本，使用本实施例试剂盒检测结果重复性良好。
表4重复性实验结果
Figure BDA0002826066540000101
5)、最低检测限实验结果
本实施例试剂盒检测到的LOD为JAK2基因突变率0.042％。
6)、干扰物质检测实验结果
本实施例引入的二甲磺酸丁酯、氢溴酸西酞普兰、盐酸帕罗西汀、盐酸舍曲林、盐酸氟西汀、对乙酰氨基酚(扑热息痛)、胆红素、人类血红蛋白、K2-EDTA、甘油三酯、赖诺普利脱水、羟基脲、阿司匹林、水杨酸、噻替派、阿纳格雷、干扰素α-2b对样本突变率的检测不产生干扰影响。
7)、检测结果要求
根据上述检测实验结果，本实施例试剂盒对质控品、阴性对照品和样本的检测结果要求分别如表5、表6和表7所示。
表5质控品检测结果要求
Figure BDA0002826066540000111
表6阴性对照品检测结果要求
Figure BDA0002826066540000112
表7样本检测结果要求
检测内容 检测参数 范围/值
总拷贝数 拷贝数范围 ≥10000
Cut-off值 突变率 0.042％
LOD 突变率 0.042％
最低突变率 突变率 0.042％
最高突变率 突变率 100％
Yellow通道(野生型反应液) Ct值范围 25-37.79
Yellow通道(突变型反应液) Ct值范围 25-37.79
以上应用了具体个例对本申请进行阐述，只是用于帮助理解本申请，并不用以限制本申请。对于本申请所属技术领域的技术人员，依据本申请的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (10)

1.一种用于检测JAK2基因的引物组合物和探针，其特征在于，所述用于检测JAK2基因的引物组合物包括用于检测突变型基因的引物对，以及用于检测野生型基因的引物对；所述用于检测突变型基因的引物对含有Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.2所示序列的下游引物；所述用于检测野生型基因的引物对含有Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.3所示序列的下游引物；所述用于检测JAK2基因的探针为Seq ID No.4所示序列；
Seq ID No.1：5’- M-TGTGATCCTGAAACTGAATTT -3’
Seq ID No.2：5’- M-TGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG -3’
Seq ID No.3：5’- M-TGGTTTTAAATTATGGAGTATGTT -3’
Seq ID No.4：5’- TGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGG -3’；
其中，各引物5’端的M为不与JAK2基因互补的核酸序列，用于增加各引物的GC含量；所述探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光猝灭基团；
所述M为CGCG。
2.一种用于检测JAK2基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组合物和探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括质控品，所述质控品含有野生型基因组DNA和突变型基因组DNA。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述质控品含有浓度为3×103copies/µL野生型基因组DNA和浓度为3×103 copies/µL突变型基因组DNA。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，所述试剂盒包括内参引物对和内参探针，所述内参引物对含有Seq ID No.5所示序列的上游引物和Seq ID No.6所示序列的下游引物，所述内参探针为Seq ID No.7所示序列；
Seq ID No.5：5’- CACTGGGTCCAGCGAGAAG -3’
Seq ID No.6：5’- TCTTCCAGAAGCCCTTCAGC -3’
Seq ID No.7：5’- CCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGT -3’；
所述内参探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光猝灭基团，所述内参探针和所述用于检测JAK2基因的探针5’端标记的荧光报告基团不同。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，用于检测JAK2基因的内标探针的5’端采用HEX荧光基团修饰，3’端采用BHQ1荧光淬灭基团修饰；用于检测JAK2基因的探针的5’端采用FAM荧光基团修饰，3’端采用BHQ1荧光淬灭基团修饰。
7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括定量标准品，所述定量标准品含有野生型质粒和突变型质粒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述定量标准品含有浓度为1×101copies/µL、1×102copies/µL、1×103 copies/µL、1×104 copies/µL野生型质粒和浓度为1×101 copies/µL、1×102copies/µL、1×103 copies/µL、1×104 copies/µL突变型质粒。
9.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于实时荧光PCR反应的试剂。
10.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的PCR扩增程序为：95℃预变性10分钟，然后进入45个循环：94℃变性15秒、60℃退火与延伸60秒，在退火与延伸时进行荧光收集。
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