CN116024360B - 一种用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物组合及其应用。所述引物组合包括特异引物，所述特异引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.102所示的序列。本发明创造性地设计了用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物组合，对靶标进行超多重PCR扩增富集以及基于基因测序平台(Illumina)进行序列读取，实现精准灵敏地鉴定结核分枝杆菌复合群及检测耐药基因突变，检测成本低、检测周期短、灵敏度高、特异性好，且可有效排除同义突变或沉默突变，鉴别耐药突变的同时又可分析异质性突变比例，能够相对真实地反应样本耐药异质性。
Description
技术领域
本发明属于高通量测序及基因检测技术领域，涉及一种用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物组合及其应用。
背景技术
结核分枝杆菌复合群在分裂繁殖过程中自发发生极少量基因突变，某些突变会导致对抗结核药物天然耐药。因为天然耐药菌株的存在，当单用某种抗结核药物治疗时，只能杀灭对抗结核药物敏感的结核分枝杆菌复合群，而不能杀灭天然耐药的菌株，使其得以保留繁殖为优势菌群，导致敏感性结核演变为耐药性结核。常用的抗结核药物除一线药物(利福平、异烟肼、乙胺丁醇和吡嗪酰胺)外，还包括氟喹诺酮类药物(左氧氟沙星、莫西沙星)、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、利奈唑胺等二线抗结核药物。据世界卫生组织报告，敏感结核病的标准疗程为6个月的一线药物联合治疗，副作用小、花费较低，但利福平耐药结核和耐多药结核(至少对异烟肼和利福平同时耐药)需要至少9到20个月的疗程，且需使用副作用更大的药物，花费至少升高20倍。因此，及时、准确地检测结核分枝杆菌复合群及其药物敏感性对结核病的治疗和控制至关重要。
结核分枝杆菌复合群的诊断、治疗、监测及控制均依赖于快速准确全面的检测，包括结核分枝杆菌复合群的鉴定及药物敏感性检测。临床上常用的结核病实验室诊断方法包括病原学诊断方法(如涂片显微镜检查与培养)、分子生物学方法等。涂片镜检操作简单、价格低廉，但敏感性不高。培养是结核病诊断的金标准，但其培养周期长(2-8周)，不能为临床提供快速的检测结果，且对生物安全的要求较高，难以在普通的实验室开展。
CN104561245A公开了一种结核分枝杆菌复合群快速鉴定方法及试剂盒，通过序列比对，设计了用于检测结核分枝杆菌复合群的荧光探针及扩增引物，并基于实时荧光定量PCR平台，通过非对称扩增PCR技术和探针熔解曲线分析技术，检测rrs基因上分枝杆菌属和结核分枝杆菌复合群特异的SNP位点，从而达到鉴定分枝杆菌属细菌，但此方法在检测到同义突变或沉默突变时可能被错误报告为耐药性，检测到耐药突变位点也难以报告耐药比例。
CN110499377A公开了一种检测结核分枝杆菌及其耐药基因的引物及探针、试剂盒及应用，试剂盒包括：扩增反应液、酶混合液、及芯片，所述扩增反应液中包含所述的引物，所述芯片包括壳体和固定在所述壳体内部用于检测结核分枝杆菌及其耐药基因的试纸条；所述试纸条包括设置在背光板上的依次搭接的样品垫、标记垫、固相载体和吸水纸；所述固相载体上交联有所述探针。此试剂盒所需检测条件简单，检测速度快，检测成本低，此发明能检测结核分枝杆菌复合群的核酸且不与非结核分枝杆菌发生交叉反应，包含两种耐药突变检测，但此方法不能有效排除同义突变或沉默突变。
综上所述，目前结核分枝杆菌复合群鉴定方法存在操作复杂、安全性低和周期长等问题。如何提供一种便捷、安全且有效排除同义突变或沉默突变的鉴定结核分枝杆菌复合群及检测耐药基因突变的方法，已成为目前高通量测序及基因检测技术领域亟待解决的问题之一。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物组合及其应用，解决了目前结核分枝杆菌复合群鉴定方法存在的操作复杂、安全性低和周期长等问题，实现精准灵敏地鉴定结核分枝杆菌复合群及检测耐药基因突变，检测成本低、检测周期短、灵敏度高、特异性好，且可有效排除同义突变或沉默突变，鉴别耐药突变的同时又可分析异质性突变比例，能够相对真实地反应样本耐药异质性。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物组合，所述引物组合包括特异引物；所述特异引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.102所示的序列。
SEQ ID NO.1：TGGCGAAAGTCCCGTACAA。
SEQ ID NO.2：GACTTTCGGACCCGGGATAGCGTG。
SEQ ID NO.3：CGAGCCGGCGTCCTGGCAT。
SEQ ID NO.4：CGTAGATCTTTTGCAAATGCCGG。
SEQ ID NO.5：GCGATCAACGCACTGATCG。
SEQ ID NO.6：GCGATTCGATTGACGTCAT。
SEQ ID NO.7：GCCAATACCAAACCCGGGTG。
SEQ ID NO.8：TGTCGGCGACCGCTTTGGGAA。
SEQ ID NO.9：GCTTCGCCGCGATGACCGTTGT。
SEQ ID NO.10：CACCGTGTAGGGGCCGACC。
SEQ ID NO.11：TGACGCATTCGCCGGAGACCTTT。
SEQ ID NO.12：AGGGAGGCCGCGACATGCGGAA。
SEQ ID NO.13：GTTCGGGTGGTCGACAATGCG。
SEQ ID NO.14：GAGATCTCACGCGCCAACGTCGGG。
SEQ ID NO.15：CAACGCGCGACACCTCTTTA。
SEQ ID NO.16：GTGTCTCGTGGCCATCGCCGGCC。
SEQ ID NO.17：TTCCATACCGGCCGCGGTGATCT。
SEQ ID NO.18：GCAGTGCCGGTAACACGAAGATGA。
SEQ ID NO.19：GGTCCGCAGCTCATGGGAG。
SEQ ID NO.20：GCACACCGCCCGGTGGCTGGG。
SEQ ID NO.21：ACATTGCCGCCGTTGCCGCCG。
SEQ ID NO.22：TTCTCCGCGTCCGCCAATGGCGCG。
SEQ ID NO.23：CCGACGCCGCCGCCAGCATCGGT。
SEQ ID NO.24：ACGGGCGTGTGACCTTTCATCAGC。
SEQ ID NO.25：CGTCGCTGACTCGTTCGTAGCGC。
SEQ ID NO.26：ATCGTGATTACGCATAGCGTGTAA。
SEQ ID NO.27：TCCCCGCATACGTAAGGAGCGT。
SEQ ID NO.28：CGTCGGCGACGCCACCGTGGTGTC。
SEQ ID NO.29：TGACCCACGGCCCCGGCGC。
SEQ ID NO.30：GGCGATGGCCTGCATCCATGGC。
SEQ ID NO.31：GCGCCGCTGCAGGTCGTACGGCA。
SEQ ID NO.32：TGATTGCGGTGCCGACCTCGTTGT。
SEQ ID NO.33：CCGGTCCAGGTTGAAGCGT。
SEQ ID NO.34：GTCGTCTTGCGCTACGACTTGCAA。
SEQ ID NO.35：AGCTCGACGAACGCCTCCTT。
SEQ ID NO.36：CCGACGAGGCCTGGCAGCCCG。
SEQ ID NO.37：CCGATCGTCGACCAACTGCCTT。
SEQ ID NO.38：CCTGGCCGAACATGGCCCATTGA。
SEQ ID NO.39：CCAGAGCCGACCGCCGTCGTT。
SEQ ID NO.40：AGCGTGGCGGGCGCGAACATGTCGG。
SEQ ID NO.41：TGCCACCGTAATCGGTATCG。
SEQ ID NO.42：GATGATCGATGGCGCCGGCG。
SEQ ID NO.43：ACTTTGAATTCGAGGCCGG。
SEQ ID NO.44：CCGACTTGGTGCCCATCTTCG。
SEQ ID NO.45：TCCGGCAGGGCGATCTCGTCG。
SEQ ID NO.46：ATCATGAAGCTGCGACTGACCC。
SEQ ID NO.47：CTTGCGAGAGCGCGATTTCC。
SEQ ID NO.48：AGAGCAGGTGTGCGCGGACC。
SEQ ID NO.49：TGGCCCGCACCGCCGCCAACCA。
SEQ ID NO.50：TGGCGTTGGCGGTAGCGGTGGCG。
SEQ ID NO.51：CGCGCCGCCCGTGCTGCT。
SEQ ID NO.52：CGCAGCCCGTGCATCTTGGCC。
SEQ ID NO.53：ACGAGGCCACCGCGTTTGCC。
SEQ ID NO.54：GGTCGGCCCGGGTGATGGTATG。
SEQ ID NO.55：ACATGAATACTTCGGACGAGCG。
SEQ ID NO.56：GCGGGCAACGGCCTCGCGCATG。
SEQ ID NO.57：CCAACTGGGCCACCAACGGGAT。
SEQ ID NO.58：TGACATGGCTGAATTGAACGTTGA。
SEQ ID NO.59：CTCCAACGCGCCACTGGCGG。
SEQ ID NO.60：GTTTGGTTTGCGCTTCTCTACA。
SEQ ID NO.61：GTATCATCGTCGGGTCACCCG。
SEQ ID NO.62：GACCCGCCGGTGAAGCTCAGC。
SEQ ID NO.63：TTGGGCGGACGGCGCGAGGTA。
SEQ ID NO.64：GCCAGCCGTATCCGGTCGCCGG。
SEQ ID NO.65：ACGCCGACATCGAGGGAGAT。
SEQ ID NO.66：GCTCCGCCGATGCCTGACGCCA。
SEQ ID NO.67：TCGGTGCGCCGCTGGCGG。
SEQ ID NO.68：CCCGTACACGCACAGGTATTTG。
SEQ ID NO.69：TCGGTGCGGTAGATGACGTGGC。
SEQ ID NO.70：TCATCGACACCGGGCCCGACGG。
SEQ ID NO.71：TGGGCGGCCAGCGCGTCGATAC。
SEQ ID NO.72：GGACTGGAGATCGCCGGCTAC。
SEQ ID NO.73：CCCGGGACAGGCCGGCGATCAGC。
SEQ ID NO.74：CTGGACCGGCTCCGCCGGCGCGAA。
SEQ ID NO.75：ATCGCGGCCGGCGGCCCGA。
SEQ ID NO.76：CGGCGACGTTCTGCTGTCGCA。
SEQ ID NO.77：AAGGAAGTACAGGACCACGC。
SEQ ID NO.78：TTCCCCGCGAATGCGGGGATGAT。
SEQ ID NO.79：GATCCCGATACTGCCAAGGA。
SEQ ID NO.80：GATCGCCGTGATGCTGTTCTTCGT。
SEQ ID NO.81：TGGCCGCCGATTGTGCGCCCG。
SEQ ID NO.82：GCAGGATGTCGCGGCGATCACC。
SEQ ID NO.83：CTGTCCTACCGAGCGGCCCGCA。
SEQ ID NO.84：AGCGTCTGGGTAACACCTTTCG。
SEQ ID NO.85：TTGCGAATGTCGCACCGAAGG。
SEQ ID NO.86：ACGTGTCCAGTCAAAGCTGGT。
SEQ ID NO.87：GGCTGCAGCATGGCCCGGG。
SEQ ID NO.88：AGCTGCCATAGATCGCCTCG。
SEQ ID NO.89：GGCGATTCGCTACCTGAACC。
SEQ ID NO.90：CAGCAAGGCGTCGAGATCAAGTG。
SEQ ID NO.91：GCCGCGGCCATACACGCCTGG。
SEQ ID NO.92：CATGCGTGACAGCGTGCTGCTG。
SEQ ID NO.93：GGCGGCGCGCTGCCCGGACCGTC。
SEQ ID NO.94：GAAGCCGCGGTGGTTGCGGCAC。
SEQ ID NO.95：CTACCAGGCTTCTGTAATCGTGT。
SEQ ID NO.96：CGATCCAGGCGTTCATCTTCTCGA。
SEQ ID NO.97：TTGTTCATGTCCGCGCCGGTG。
SEQ ID NO.98：GCAACTCGTATGACGCCGCGATGC。
SEQ ID NO.99：GCTGGCACGGAAGGGGCTCT。
SEQ ID NO.100：GACAAGCGCGGCCGGTTTGAT。
SEQ ID NO.101：GATCGGCTACAGACGTCAAC。
SEQ ID NO.102：CCTGCAGAGATATAGAGCTT。
本发明创造性地设计了用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物组合，对靶标进行超多重PCR扩增富集以及基于基因测序平台(Illumina)进行序列读取，实现精准灵敏地鉴定结核分枝杆菌复合群及检测耐药基因突变，检测成本低、检测周期短、灵敏度高、特异性好，且可有效排除同义突变或沉默突变，鉴别耐药突变的同时又可分析异质性突变比例，能够相对真实地反应样本耐药异质性。
优选地，所述特异引物的5’端连接有公共序列。
优选地，所述公共序列的核酸序列包括SEQ ID NO.103所示的序列。
SEQ ID NO.103：GACTGCCGCTGGTTGGATG。
优选地，所述引物组合还包括接头引物和封闭引物。
优选地，所述接头引物包括Illumina平台测序接头。
优选地，所述接头引物的3’端连接有所述公共序列。
优选地，所述封闭引物的核酸序列包括SEQ ID NO.104所示的序列。
SEQ ID NO.104：CATCCAACCAGCGGCAGTC。
第二方面，本发明提供了第一方面所述的用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物组合在制备用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的产品中的应用。
第三方面，本发明提供了一种用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物组合。
第四方面，本发明提供了一种第一方面或第二方面所述的用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物组合在结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测中的应用。
第五方面，本发明提供了一种非疾病诊断和/或治疗为目的的结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的方法，，所述方法包括以下步骤：
(1)利用第一方面或第二方面所述的用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物组合对模板DNA进行超多重PCR扩增，获得超多重PCR文库；
(2)纯化步骤(1)获得的超多重PCR文库，混合纯化后的各文库；
(3)对步骤(2)纯化后的文库进行高通量测序，根据测序结果进行结果判定。
优选地，所述PCR引物、Illumina测序接头和封闭引物的混合比例为(1-10):(1-5):1。
上述(1-10)中的具体点值可以选择1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等。
上述(1-5)中的具体点值可以选择1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5等。
优选地，所述超多重PCR扩增的扩增程序为：
(1)93-95℃，3-10min；(2)93-95℃，10-50s；50-70℃，0.5-3min；20-50个循环；(3)93-95℃，10-50s；50-70℃，0.5-3min；20-50个循环；(4)60-72℃，1-10min；(5)降温至4℃。
上述93-93中的具体点值可以选择93、94、95等。
上述3-10中的具体点值可以选择3、4、5、6、7、8、9、10等。
上述10-50中的具体点值可以选择10、15、20、25、30、40、45、46、48、50等。
上述50-70中的具体点值可以选择50、54、58、60、62、68、70等。
上述20-50中的具体点值可以选择20、25、30、35、40、46、48、50等。
上述60-72中的具体点值可以选择20、25、30、35、40、46、48、50等。
上述1-10中的具体点值可以选择1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明创造性地设计了用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物组合，对靶标进行超多重PCR扩增富集以及基于基因测序平台(Illumina)进行序列读取，实现精准灵敏地鉴定结核分枝杆菌复合群及检测耐药基因突变，检测成本低、检测周期短、灵敏度高、特异性好，且可有效排除同义突变或沉默突变，鉴别耐药突变的同时又可分析异质性突变比例，能够相对真实地反应样本耐药异质性。
附图说明
图1为1×104浓度精密性参考品扩增子均一性图；
图2为1×103浓度精密性参考品扩增子均一性图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
培养物结核鉴定。
用本试剂盒检测结核分枝杆菌PCR检测试剂盒用国家参考品(购自中国食品药品检定研究所)中的最低检出量参考品(S1，1×103个菌/mL、S2，1×102个菌/mL、S3，1×101个菌/mL、S4，1×10个菌/mL)。参考品提取核酸(模板DNA)后，进行文库构建及测序。检测结果如表1所示。
表1
| 浓度(个菌/mL) | 来源 | 重复1检出序列数 | 重复2检出序列数 | 重复3检出序列数 |
| 1×103 | 最低检出量参考品S1 | 2016 | 2263 | 2864 |
| 1×102 | 最低检出量参考品S2 | 200 | 179 | 124 |
| 1×101 | 最低检出量参考品S3 | 17 | 18 | 9 |
| 1×100 | 最低检出量参考品S4 | 0 | 1 | 0 |
结果显示：该引物组对不同浓度下的结核分枝杆菌复合群检测，均一性良好，最低浓度10菌/mL可稳定检出，表明本发明设计用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物能够精准灵敏地鉴定结核分枝杆菌复合群。
实施例2
培养物耐药突变检测。
用本试剂盒检测结核分枝杆菌利福平耐药基因检测试剂用国家参考品(购自中国食品药品检定研究所)中的单细胞耐药菌(SRD，1×105个菌/mL)、混合菌液参考品(SR)、敏感性参考品和结核分枝杆菌异烟肼耐药基因检测试剂用国家参考品(购自中国食品药品检定研究所)中的单细胞耐药菌(SID，1×105个菌/mL)、混合菌液参考品(SI)、敏感性参考品。
单细胞耐药菌进行梯度稀释，混合菌液参考品与敏感性参考品分别按(1：99、3：97、5：95、10：90、25：75、50：50、75：25、90：10、95：5、97：3、99：1)的比例混合，稀释或混合后进行核酸提取，对提取的核酸进行文库构建及测序，单细胞耐药菌梯度稀释检测结果如表2所示。
表2
结果显示：该引物组对不同浓度下的结核分枝杆菌复合群耐药突变检测良好，最低浓度500菌/mL可稳定检出耐药突变，表明本发明设计用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物能够精准稳定地检测耐药突变。
混合菌液参考品与敏感性参考品按比例混合检测结果如表3所示：
表3
结果显示：该引物组检测结核分枝杆菌复合群耐药突变位点，耐药菌占比低于3％可能无法检出耐药突变，耐药菌占比5％及以上可稳定检出耐药突变，耐药菌占比95％及以上时可能无法检出敏感菌(即检测结果显示为均质突变)，检出突变频率可相对准确的反映耐药菌比例，表明本发明设计用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物能够鉴别耐药突变的同时又可分析异质性突变比例，能够相对真实地反应样本耐药异质性。
实施例3
用本试剂盒检测结核分枝杆菌利福平耐药基因检测试剂用国家参考品(购自中国食品药品检定研究所)中的精密性参考品(J，1×106个菌/mL)和结核分枝杆菌异烟肼耐药基因检测试剂用国家参考品(购自中国食品药品检定研究所)中的精密性参考品(J，1×106个菌/mL)。精密性参考品进行梯度稀释，形成1×104菌/mL和1×103菌/mL稀释液，稀释后进行核酸提取，对提取的核酸分别进行3个平行的文库构建及测序。扩增子均一性分析结果如图1和图2所示。
结果显示：该引物组对不同浓度下的结核分枝杆菌复合群各耐药位点扩增均一性良好。
综上所述，本发明创造性地设计了用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物组合，对靶标进行超多重PCR扩增富集以及基于基因测序平台(Illumina)进行序列读取，实现精准灵敏地鉴定结核分枝杆菌复合群及检测耐药基因突变，检测成本低、检测周期短、灵敏度高、特异性好，且可有效排除同义突变或沉默突变，鉴别耐药突变的同时又可分析异质性突变比例，能够相对真实地反应样本耐药异质性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (6)
1.一种用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括特异引物；
所述特异引物的核酸序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.102所示；
所述特异引物的5’端连接有公共序列；所述公共序列的核酸序列如SEQ ID NO.103所示；
所述引物组合还包括接头引物和封闭引物；
所述接头引物为Illumina平台测序接头，所述接头引物的3’端连接有所述公共序列；所述封闭引物的核酸序列如SEQ ID NO.104所示。
2.权利要求1所述的用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物组合在制备用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的产品中的应用。
3.一种用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物组合。
4.一种非疾病诊断和/或治疗为目的的结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）利用权利要求1所述的用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物组合对模板DNA进行超多重PCR扩增，获得超多重PCR文库；
（2）纯化步骤（1）获得的超多重PCR文库，混合纯化后的各文库；
（3）对步骤（2）纯化后的文库进行高通量测序，根据测序结果进行结果判定。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述特异引物、接头引物和封闭引物的混合比例为(1-10):(1-5):1。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述超多重PCR扩增的扩增程序为：
（1）93-95℃，3-10 min；（2）93-95℃，10-50 s；50-70℃，0.5-3 min；20-50个循环；（3）93-95℃，10-50 s；50-70℃，0.5-3 min；20-50个循环；（4）60-72℃，1-10 min；（5）降温至4℃。
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