CN105331709B - 用于检测结核分枝杆菌pncA基因突变的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于检测结核分枝杆菌pncA基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测结核分枝杆菌pncA基因‑12T>C、‑11A>G、‑7T>C、c.3G>A、c.233G>A、c.408InsA、c.538‑561del和+1‑+18del突变的试剂；该试剂盒能够简便、快捷、准确的测定患者pncA基因的突变位点，从而用于耐吡嗪酰胺结核患者的诊断和治疗中。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测导致结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药基因pncA基因突变热点区7个突变的试剂盒，属于结核病耐药基因突变检测技术领域。
背景技术
结核病是结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病。自柯赫(Koch)发现结核杆菌以来，结核病一直威胁人类健康，而且治疗结核病的疫苗、药物和诊断技术一直是人类不断寻求解决的目标。近年来，近年，抗生素滥用、环境污染和艾滋病等原因导致，结核病有卷土重来，发病率和死亡率明显回升趋势，已经成为与疟疾和AIDS并成为传染病的三大杀手之一。更为严峻的是，结核杆菌对现有的药物变得更耐药。仍然是发展中国家较为严重的传染病之一。根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)统计表明，在2011年，全球有870万活动性结核病新发病例(其中13%涉及同时感染人类免疫缺陷病毒)和140万例死亡，包括HIV感染患者中的43万例死亡，有31万耐多药结核病首发病例，由至少对异烟肼及利福平耐药的微生物所致。这些患者60%以上在中国、印度、俄罗斯联邦、巴基斯坦以及南非。共有84个国家报告了广泛耐药结核病病例，撒哈拉以南非洲有最高的人均活动性结核病发生率，主要由于HIV的流行所致。病例绝对数最多者来自亚洲，印度和中国在全球具有最重的疾病负担。目前，我国是当前全球结核病高发国家之一，结核病耐药情况相当严重，非结核分枝杆菌病也呈现逐年增加的趋势。我国现有活动性肺结核病患者451万，菌检阳性肺结核患者病人196万，每年死亡人数约13万结核杆菌总耐药率为27.8%，初始耐药率为18.6%，获得性耐药率为46.5%，耐多药率为10.7%，其中异烟肼、利福平和链霉素耐药情况较为严重。
吡嗪酰胺常常会与利福平和异烟肼等一线药物联合使用治疗结核病，可以使患者的治疗周期9-12月缩短至6个月，可以高效杀死体内耐酸环境中（pH≥ 5.5）的菌体，而其它的药物难以杀死这类菌。在pncA基因编码的吡嗪酰胺酶作用下，细胞内的吡嗪酰胺转变为吡嗪酸（ pyrazinoic acid，POA），通过被动扩散和外排作用到达细胞膜表面，质子化的吡嗪酸促使细胞质酸化形成电势差，影响细胞的跨膜运输pncA基因突变引起吡嗪酰胺耐药，该基因长度为561 bp，编码吡嗪酰胺酶，耐吡嗪酰胺菌株中该基因发生突变的频率为68%-95%。
结核分枝杆菌抵制药物活性的机制，大致通过低细胞膜的通透性和外排泵机制，产生降解或灭活酶类，药物靶位的改变。或者结核杆菌无法通过质粒的介导从其他细菌获得耐药性，因此染色体介导的耐药性是MTB产生耐药的主要基础。目前对MTB耐药分子机制的研究主要集中在药物的作用靶位及其相关基因的突变上。因此，新的耐药基因位点的发现对于快速、高通量、简便检测提供了有效的手段和策略。
经文献检索，未见与本发明检测突变位点相同的公开报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测结核分枝杆菌pncA基因突变的方法。
本发明提供了用于检测结核耐吡嗪酰胺药物pncA基因7个突变位点（-12T>C、-11A>G、-7T>C、c.3G>A、c.233G>A、c.408InsA、c.538-561del和+1-+18del）的试剂盒。
本发明通过检测来自耐吡嗪酰胺结核菌株的样本中是否存在pncA基因的7个突变，从而判断该患者耐吡嗪酰胺药物的耐药分子机制，其中-12T>C，-11A>G，-7T>C，c.3G>A，c.233G>A，c.408InsA，c.538-561del和+1-+18del突变为pncA基因的突变，这些突变分别导致pncA基因编码区上游第七位、第十一位和第十二位碱基（-12T>C，-11A>G，-7T>C），编码区第3位和第233位碱基（c.3G>A，c.233G>A）发生改变，c.408InsA和c.538-561del和+1-+18del导致移码突变。这些突变影响了pncA基因表达，改变了该基因的氨基酸组成，或延长或缩短该基因编码蛋白，从而发挥其抗吡嗪酰胺的作用，进而使该菌株产生耐药。
发明人用候选基因筛查的方法，在中国16株耐吡嗪酰胺结核菌株中进行检测，在六株耐药结核菌种发现与耐吡嗪酰胺相关的pncA基因新突变7个，其中5个为新突变（-12T>C、-11A>G、-7T>C、c.408InsA、c.538-561del和+1-+18del），该突变的频率为43.7%，这说明在耐吡嗪酰胺的结核菌株中，pncA基因突变具有较高的发生频率，因此pncA基因突变可以作为临床吡嗪酰胺耐药菌株耐药分子机制的诊断依据。并且目前，在国际和国内均未见其中5个突变的报道。
本发明用于检测pncA基因7个突变（-12T>C，-11A>G，-7T>C，c.3G>A，c.233G>A，c.408InsA，c.538-561del和+1-+18del）的试剂盒，包括用于检测pncA基因的7个突变所需的试剂和能选用的用于扩增pncA基因的试剂和PCR引物。
用于检测pncA基因7个突变（-12T>C，-11A>G，-7T>C，c.3G>A，c.233G>A，c.408InsA，c.538-561del和+1-+18del）的试剂盒，包括以下一种或几种试剂的组合：
（1）从待检样品中提取DNA的试剂；
（2）用于扩增结核菌样本DNA的pncA基因7个突变的PCR引物和相关的PCR反应试剂；
（3）PCR产物纯化试剂；
（4）对PCR产物进行直接测序的试剂。
用于检测pncA基因7个突变（-12T>C，-11A>G，-7T>C，c.3G>A，c.233G>A，c.408InsA，c.538-561del和+1-+18del）的试剂盒，所用的PCR引物为：
pncA-F：5’-TGTCGCTCACTACATCACC-3’
pncA-R：5’-TCGTAGGTCATAGCGTAGG-3’
用于检测pncA基因7个突变（-12T>C，-11A>G，-7T>C，c.3G>A，c.233G>A，c.408InsA，c.538-561del和+1-+18del）的试剂盒，所述检测PCR扩增产物的试剂选自测序检测试剂、限制性内切酶长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂、探针杂交检测试剂及SNP分型检测试剂。
采用PCR扩增-直接测序的方法来检测样本的突变情况，具体操作步骤如下：
（1）采集待测个体的样本，为培养的结核菌样本，提取全基因组DNA；
（2）以提取的DNA为模板，以本发明设计的针对pncA基因编码区及上下游区域的引物进行DNA序列的扩增，得到相应的PCR扩增产物；
（3）将得到的PCR产物纯化后，进行直接测序分析，将所测得的序列与pncA基因及其上下游的正常序列进行比对，确定7个突变是否存在；
（4）根据以上实验结果分析患者是否为pncA基因突变导致的耐吡嗪酰胺结核分枝杆菌菌株；
（5）按照正常编码序列阅读框对突变序列进行翻译，进一步确定错义突变和移码突变的存在。
发明人在收集耐药结核分枝杆菌进行实验的过程中，收集到16株耐吡嗪酰胺的结核菌株，在取得患者同意的前提下，对患者感染的结核分枝杆菌进行基因检测。同时，我们还收集了患者的基本信息和临床信息，详细询问了其感染和发病过程，建立了结核分枝杆菌耐药株的样本库。将灭活的结核分枝杆菌冻存于-80 ℃冰箱。用柱吸附的方法提取结核菌的基因组DNA，保存于-40℃冰箱，每份DNA样本具有对应的患者资料和耐药信息。用引物设计软件Primer5和Oligo6设计PCR扩增引物，包括了结核菌pncA基因编码区上游161位碱基到编码区下游321位碱基的DNA片段，用于PCR扩增。PCR扩增产物直接用PCR引物进行正反向测序（测序所用仪器为ABI公司3730型DNA测序仪）。将得到的序列与GenBank中的序列进行比对，确定pncA基因突变的存在。
pncA基因突变的核苷酸或氨基酸序列如下：
pncA基因突变的核苷酸和氨基酸序列中，用方框标出的是突变的碱基或氨基酸，用开放框标出的是移码突变后的氨基酸，用横线标出的是起始密码子；位于pncA基因编码序列前的第7（T>C），11（A>G）和12（T>C）位碱基的突变，使pncA基因上游的调控序列发生变化，导致pncA蛋白的转录和翻译发生改变，进而引起吡嗪酰胺的耐药；位于pncA基因编码区的突变（c.3G>A，c.233G>A，c.408InsA，c.538-561del和+1-+18del）导致该基因编码的蛋白氨基酸组成、结构或长度发生了变化，从而改变了该蛋白的功能。pncA基因突变的检测能够用遗传领域的任意一种点突变检测方法进行，如PCR（聚合酶链反应）-RFLP法（限制性内切酶片段多态性）、PCR-测序法、DNA探针杂交法、位点特异性PCR法、PCR-dHPLC（变性高效液相色谱）、及PCR-SSCP（单链构象多态性）法等。
上述方法中得到的PCR产物还能用其他方法进行检测，如DNA杂交探针法。所用探针能是与突变pncA基因核苷酸序列杂交，也可以有两个探针分别与正常或突变的pncA基因核苷酸序列杂交。探针能够选择同位素标记、有色物质标记或荧光物质标记。此外，还能够用位点特异的PCR引物、限制性内切酶或单链构象多态性的方法确定突变。
上述方法中使用的PCR引物依据已知的核苷酸序列进行设计，通常长度为18-25个碱基，GC含量在±45-55%，用引物设计软件Primer5和Oligo6设计PCR扩增引物，本发明中设计的PCR扩增引物序列为：
上游引物：5’-TGTCGCTCACTACATCACC-3’
下游引物：5’-TCGTAGGTCATAGCGTAGG-3’；
本发明提供的检查pncA基因7个突变的试剂盒，试剂盒内应装有用于检测pncA基因突变的试剂，同时提供的是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。如采用PCR-直接测序法检测pncA基因7个突变的试剂盒，含有扩增引物、dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液及测序所需试剂的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性成分，如扩增引物为本发明中所述的一对引物pncA-F和pncA-R，所述用于PCR反应的DNA聚合酶是能够进行PCR扩增的酶。
本发明的优点在于：
1、试剂盒能够简便、快捷、准确的测定患者pncA基因的突变位点，从而用于耐吡嗪酰胺结核患者的诊断和治疗中；
2、能够用于在结核患者中大规模筛查吡嗪酰胺耐药率，为诊断结核分枝杆菌患者的感染菌株是否具有吡嗪酰胺耐药性提供服务及参考；
3、为耐吡嗪酰胺的结核患者进行基因筛查提供准确和简单的方法；并为将来利用这一突变作为检测靶点针对耐药结核病进行治疗奠定坚实的基础。
附图说明：
图1为结核分枝杆菌pncA基因c.3G>A、c.233G>A突变的序列图；
图2为结核分枝杆菌pncA基因c.408InsA突变的的序列图；
图3为结核分枝杆菌pncA基因-12T>C、-11A>G、-7T>C突变的的序列图；
图4为结核分枝杆菌pncA基因c.538-561del和+1-+18del突变的的序列图；
图5为pncA基因PCR产物电泳检测示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1：采集检测样本
收集到16株耐吡嗪酰胺结核菌株，临床患者均为肺结核患者，经药敏吡嗪酰胺（PZA量 1 μg/ml）试验检测结果可知，共获取16株耐吡嗪酰胺结核菌株。耐吡嗪酰胺患者平均年龄为40岁。男性患者占比68.75%%（11/16），年龄介于15～69岁，平均年龄为40.3岁；女性患者占比31.25%（5/16），年龄介于21～49岁，平均年龄39.4岁。
实施例2：基因组DNA的提取
1、采用一次性接种环刮取结核菌菌培养菌落置于1.5 ml EP管中（尽量不要刮取到培养基）；
2、向菌体沉淀物的离心管中加入500μl细胞悬浮液（先检查是否已加入Lysozyme），使用移液器或漩涡振荡器彻底悬浮结核菌细胞沉淀，37℃温浴30 min每隔5-10min颠倒混匀数次。12 000 rpm（～13 400×g）离心2 min，尽量吸净上清；
3、向菌体沉淀中加入225μl缓冲液A，振荡至菌体彻底悬浮；
4、向管中加入10μl蛋白酶K溶液，颠倒混匀；
5、加入25μl裂解缓冲液S，颠倒混匀；57℃水浴放置20 min，其间颠倒混匀数次。
6、加入250μl缓冲液B，振荡5 s充分混匀；
7、加250μl无水乙醇，充分振荡混匀15 s，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离心以去除管内壁的水珠；
8、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中）12000 rpm（～13 400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
9、向吸附柱中加入500μl缓冲液C，12 000 rpm（～13 400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
10、向吸附柱中加入700μl漂洗液W2（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000 rpm（～13 400×g）离心30 s，倒掉废液，吸附柱放入收集管中；
11、向吸附柱中加入500μl漂洗液W2，12 000 rpm（～13 400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中，然后12 000 rpm（～13 400×g）离心2 min，将吸附柱置于一个新的1.5 ml离心管中，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
12、将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加135μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12 000 rpm（～13 400×g）离心2 min，将溶液收集到离心管中，冻于-40℃，待实验研究使用。
实施例3：PCR扩增，电泳结果
以提取的结核分枝杆菌全基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增基因为pncA基因，所用引物5’-TGTCGCTCACTACATCACC-3’和5’-TCGTAGGTCATAGCGTAGG-3’。
PCR扩增体系：2×PCR预混液25 μL（含rTaq酶，TAKARA），正反向引物各1 μM，模板DNA 50 ng，加入21 μL去离子水。
PCR反应条件为：94度变性5分钟，然后35个循环的（94度变性30秒，50度退火30秒，72度延伸1分30秒），最后终末72度延伸5分钟。扩增产物长度为867 bp，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，选用DL2000型号DNA marker作为PCR扩增产物对照，配制胶浓度为1.5%的琼脂糖凝胶，120伏恒压条件下，电泳20-30分钟。电泳结束后将琼脂糖凝胶放入EB染液中染色5-10分钟，置于紫外灯下观察电泳条带并进行记录。电泳结果见图5。
实施例4：测序结果
PCR产物送测序公司进行序列测定，测序引物为5’-TGTCGCTCACTACATCACC-3’，测序后经与结核分枝杆菌标准株序列进行对比，发现突变位点-12T>C、-11A>G、-7T>C、c.3G>A、c.233G>A、c.408InsA、c.538-561del和+1-+18del，突变图谱见图1、2、3、4。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 用于检测结核分枝杆菌pncA基因突变的试剂盒
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
tgtcgctcac tacatcacc 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tcgtaggtca tagcgtagg 19
Claims (2)
1.一种用于检测结核分枝杆菌pncA基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测结核分枝杆菌pncA基因-12T>C、-11A>G、-7T>C、c.3G>A、c.233G>A、c.408InsA、c.538-561del和+1-+18del突变的试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示的引物。
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| CN102174652A (zh) * | 2011-02-28 | 2011-09-07 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性检测方法 |
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