CN105331623A - 结核分枝杆菌rpoB突变基因及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了结核分枝杆菌rpoB突变基因及其用途，该突变基因与正常rpoB基因相比，具有c.1843G>A突变位点；本发明用候选基因筛查的方法，对中国33株耐利福平结核菌株中进行检测，首次发现该基因突变位点，在耐利福平的结核菌株中rpoB基因突变c.1843G>A具有一定的发生频率，因此rpoB基因突变c.1843G>A可以作为临床利福平耐药菌株耐药分子机制的诊断依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种结核分枝杆菌rpoB突变基因，以及用于检测导致结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变c.1843G>A的试剂盒，属于结核病耐药基因突变检测技术领域。
背景技术
结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）引起的慢性传染病。主要累及脏器为肺，此外还会侵犯皮肤、骨骼等全身多个组织和器官。目前，我国结核病患者数居世界第二位，而耐药率居全球第一。约2/3的结核病患者处于发生耐多药结核病（multi-drugresistancetuberculosis，MDR-TB）至少对利福平（rifampicin，RFP）和异烟肼（Isoniazid，INH）同时耐药的危险之中）。据报道我国每年新发耐多药结核病患者多达15万，给结核病患者治愈带来巨大挑战。而耐利福平MTB菌株的传播往往是结核病短程化疗失败的主要原因之一。
自1971年发现利福平具有全效能杀结核分枝杆菌复合物以来，利福平一直是结核病化疗方案中的一个关键药物。目前研究表明利福平对生长和静止期的结核菌具有很强的杀伤效果，该药物的应用使临床治愈结核病患者周期由12-18月缩减至9个月。利福平通过与RNA聚合酶的β亚基结合，干扰RNA链的开始和延伸，阻止RNA的合成。而编码结核分枝杆菌RNA聚合酶的β亚基的基因为rpoB基因，该基因的突变直接影响利福平治疗结核患者的效果。该基因热点突变区域（突变发生率为90-95%）主要集中在长81bp（对应编码507-533位氨基酸）的核心区域-耐利福平决定区（rifampicinresistance-determiningregion，RRDR），包括点突变或短的插入、缺失突变等，使DNA依赖性RNA聚合酶B亚单位酶活性改变，利福平不能与RNA聚合酶B亚单位结合而表现为耐药。
进入21世纪以来，由于抗生素滥用、环境污染和艾滋病患者增多等原因，结核作为机会性致病菌，其发病率呈现逐年增多的趋势。因此对结核患者早期进行诊断，并且对耐药结核患者的具体耐药机制进行确诊，提前调整对该类患者的临床用药，将大大缩短临床诊断时间，有助于早期发现其耐药机制，特别是对一些耐多药患者进行突变热点的基因诊断，从而采取有效的临床治疗措施，将大大提高该类患者的治愈率。利福平与异酰肼搭配治疗方案是临床常用治疗结核病患者主要手段，也是一线常规用药，因此对结核杆菌耐利福平rpoB基因的突变热点区进行基因检测，将有利于临床快速诊断和治疗。
经文献检索，未见与本发明检测突变位点相同的公开报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法，该结核分枝杆菌rpoB突变基因具有c.1843G>A突变位点，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。
本发明另一目的是提供用于检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的试剂盒，该试剂盒包括用于检测结核分枝杆菌rpoB基因c.1843G>A突变的试剂。
所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的引物。
本发明通过检测来自耐利福平结核菌株的样本中是否存在rpoB基因的c.1843G>A突变（根据大肠杆菌该基因位点定位），从而判断该患者耐利福平药物的耐药分子机制。其中c.1843G>A突变位点为rpoB基因的突变，该突变导致rpoB基因第615位的缬氨酸（Val）突变为甲硫氨酸（Met）。这个氨基酸的改变，影响了药物利福平转化为活性物质成分，发挥其抗结核分枝杆菌的作用，从而使该菌株产生耐药。
发明人用候选基因筛查的方法，在中国33株耐利福平结核菌株中进行检测，在一株耐药结核菌种发现与耐利福平相关的rpoB基因新突变c.1843G>A；该突变的频率为3.03%，这说明在耐利福平的结核菌株中，rpoB基因突变c.1843G>A具有一定的发生频率，因此rpoB基因突变c.1843G>A可以作为临床利福平耐药菌株耐药分子机制的诊断依据。并且目前，在国际和国内均未见该突变的报道。
本发明用于检测rpoB基因突变c.1843G>A的试剂盒，包括用于检测rpoB基因的突变c.1843G>A所需的试剂和能选用的用于扩增rpoB基因的试剂和PCR引物。
用于检测rpoB基因突变c.1843G>A的试剂盒，包括以下一种或几种试剂的组合：
（1）从待检样品中提取DNA的试剂；
（2）用于扩增结核菌样本DNA的rpoB基因c.1843G>A突变的PCR引物和相关的PCR反应试剂；
（3）PCR产物纯化试剂；
（4）对PCR产物进行直接测序的试剂。
用于检测rpoB基因突变c.1843G>A的试剂盒，所用的PCR引物为：
rpoB-F：5’-CAAGGAGTTCTTCGGCACC-3’
rpoB-R：5’-CGTCCATGTAGTCCACCTC-3’
用于检测rpoB基因突变c.1843G>A的试剂盒，所述检测PCR扩增产物的试剂选自测序检测试剂、限制性内切酶长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂、探针杂交检测试剂及SNP分型检测试剂。
采用PCR扩增-直接测序的方法来检测样本的突变情况，具体操作步骤如下：
（1）采集待测个体的样本，为培养的结核菌样本，提取全基因组DNA
（2）以提取的DNA为模板，以本发明设计的针对rpoB基因c.1843G>A突变的引物进行突变区段DNA序列的扩增，得到相应的PCR扩增产物；
（3）将得到的PCR产物纯化后，进行直接测序分析，将所测得的序列与rpoB基因的正常序列进行比对，确定c.1843G>A突变是否存在；
（4）根据以上实验结果分析患者是否为rpoB基因突变c.1843G>A导致的耐利福平结核分枝杆菌菌株；
（5）按照正常编码序列阅读框对突变序列进行翻译，进一步确定p.V615M突变的存在。
发明人在收集耐药结核分枝杆菌进行实验的过程中，收集到33株耐利福平的结核菌株，在取得患者同意的前提下，对患者感染的结核分枝杆菌进行基因检测。同时，我们还收集了患者的基本信息和临床信息，详细询问了其感染和发病过程，建立了结核分枝杆菌耐药株的样本库。将灭活的结核分枝杆菌冻存于-80℃冰箱。用柱吸附的方法提取结核菌的基因组DNA，保存于-40℃冰箱，每份DNA样本具有对应的患者资料和耐药信息。用引物设计软件Primer5和Oligo6设计PCR扩增引物，包括了结核菌rpoB基因1263位到1705位碱基的DNA片段，用于PCR扩增。PCR扩增产物直接用PCR引物进行正向测序（测序所用仪器为ABI公司3730型DNA测序仪）。将得到的序列与GenBank中的序列（序列号：KC692347.1）进行比对，确定rpoB基因突变c.1843G>A的存在，按照开放阅读框进行翻译，确定氨基酸突变p.V615M的存在。
rpoB基因c.1843G>A突变的核苷酸和氨基酸序列如下：
rpoB基因c.1843G>A突变的核苷酸和氨基酸序列中，用方框标出的是突变的碱基和氨基酸，突变前第615位氨基酸是缬氨酸，突变后为甲硫氨酸。该突变位于rpoB基因编码序列的第1843位碱基，由野生型的鸟嘌呤（G）变为胞嘧啶（C），该突变使野生型的rpoB蛋白的第615位缬氨酸突变成甲硫氨酸，导致rpoB蛋白的功能发生改变，进而引起利福平的耐药。rpoB基因突变c.1843G>A的检测能够用遗传领域的任意一种点突变检测方法进行，如PCR（聚合酶链反应）-RFLP法（限制性内切酶片段多态性）、PCR-测序法、DNA探针杂交法、位点特异性PCR法、PCR-dHPLC（变性高效液相色谱）、及PCR-SSCP（单链构象多态性）法。
上述方法中得到的PCR产物还能用其他方法进行检测，如DNA杂交探针法。所用探针能是与突变rpoB基因核苷酸序列杂交，也可以有两个探针分别与正常或突变的rpoB基因核苷酸序列杂交。探针能够选择同位素标记、有色物质标记或荧光物质标记。此外，还能够用位点特异的PCR引物、限制性内切酶或单链构象多态性的方法确定突变。
上述方法中使用的PCR引物依据已知的核苷酸序列进行设计，通常长度为18-25个碱基，GC含量在±45-55%，用引物设计软件Primer5和Oligo6设计PCR扩增引物，本发明中设计的PCR扩增引物序列为：
上游引物：5’-CAAGGAGTTCTTCGGCACC-3’
下游引物：5’-CGTCCATGTAGTCCACCTC-3’
本发明提供的检查rpoB基因c.1843G>A突变的试剂盒，试剂盒内应装有用于检测rpoB基因c.1843G>A突变的试剂，同时提供的是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。如采用PCR-直接测序法检测rpoB基因c.1843G>A突变的试剂盒，含有扩增引物、dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液及测序所需试剂的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性成分，如扩增引物为本发明中所述的一对引物rpoB-F和rpoB-R，所述用于PCR反应的DNA聚合酶是能够进行PCR扩增的酶。
本发明的优点在于：
1、试剂盒能够简便、快捷、准确的测定患者rpoB基因的突变位点，从而用于耐利福平结核患者的诊断和治疗中；
2、能够用于在结核患者中大规模筛查利福平耐药率，为诊断结核分枝杆菌患者的感染菌株是否具有利福平耐药性提供服务及参考；
3、为耐利福平的结核患者进行基因筛查提供准确和简单的方法；并为将来利用这一突变作为检测靶点针对耐药结核病进行治疗奠定坚实的基础。
附图说明
图1为结核分枝杆菌rpoB基因突变c.1843G>A的序列图；
图2为rpoB突变基因电泳检测示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1：采集检测样本
收集到33株耐利福平结核菌株，临床患者均为肺结核患者，经药敏利福平（RIF1.0μg/ml）试验检测结果可知，共获取33株耐异利福平结核菌株。耐利福平患者平均年龄为41.3岁。男性患者占比63.64%（21/33），年龄介于20～80岁，平均年龄为46.2岁；女性患者占比36.36%（12/33），年龄介于14～55岁，平均年龄32.7岁。
实施例2：基因组DNA的提取
1、采用一次性接种环刮取结核菌菌培养菌落置于1.5mlEP管中（尽量不要刮取到培养基）；
2、向菌体沉淀物的离心管中加入500μl细胞悬浮液（先检查是否已加入Lysozyme），使用移液器或漩涡振荡器彻底悬浮结核菌细胞沉淀，37℃温浴30min每隔5-10min颠倒混匀数次。12000rpm（～13400×g）离心2min，尽量吸净上清；
3、向菌体沉淀中加入225μl缓冲液A，振荡至菌体彻底悬浮；
4、向管中加入10μl蛋白酶K溶液，颠倒混匀；
5、加入25μl裂解缓冲液S，颠倒混匀；57℃水浴放置20min，其间颠倒混匀数次。
6、加入250μl缓冲液B，振荡5s充分混匀；
7、加250μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离心以去除管内壁的水珠；
8、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中）12000rpm（～13400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
9、向吸附柱中加入500μl缓冲液C，12000rpm（～13400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
10、向吸附柱中加入700μl漂洗液W2（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（～13400×g）离心30s，倒掉废液，吸附柱放入收集管中；
11、向吸附柱中加入500μl漂洗液W2，12000rpm（～13400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。然后12000rpm（～13400×g）离心2min。将吸附柱置于一个新的1.5ml离心管中，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
12、将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加135μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm（～13400×g）离心2min，将溶液收集到离心管中，冻于-40℃，待实验研究使用。
实施例3：PCR扩增，电泳结果
以提取的结核分枝杆菌全基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增基因为RpoB基因，所用引物5’-CAAGGAGTTCTTCGGCACC-3’和5’-CGTCCATGTAGTCCACCTC-3’。
PCR扩增体系：2×PCR预混液25μL（含rTaq酶，TAKARA），正反向引物各1μM，模板DNA50ng，加入21μL去离子水。
PCR反应条件为：94度变性5分钟，然后35个循环的（94度变性30秒，50度退火30秒，72度延伸30秒），最后终末72度延伸5分钟。扩增产物长度为443bp，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，选用DL2000型号DNAmarker作为PCR扩增产物对照，配制胶浓度为1.5%的琼脂糖凝胶，120伏恒压条件下，电泳20-30分钟。电泳结束后将琼脂糖凝胶放入EB染液中染色5-10分钟，置于紫外灯下观察电泳条带并进行记录。电泳结果见图2。
实施例4：测序结果
PCR产物送测序公司进行序列测定，测序引物为5’-CAAGGAGTTCTTCGGCACC-3’，测序后经与结核分枝杆菌标准株序列进行对比，发现突变位点c.1843G>A，突变序列见序列表，突变图谱见图1。
序列表
<110>昆明理工大学
<120>结核分枝杆菌rpoB突变基因及其用途
<160>3
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
caaggagttcttcggcacc19
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
cgtccatgtagtccacctc19
<210>3
<211>3537
<212>DNA
<213>Mycobacteriumtuberculosis
<400>3
atgctggaaggatgcatcttggcagattcccgccagagcaaaacagccgctagtcctagt60
ccgagtcgcccgcaaagttcctcgaataactccgtacccggagcgccaaaccgggtctcc120
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gtcgtcgtcgcgcaagaaagcggcgtcatcgaggaggtgtcggccgactacatcactgtg1980
atgcacgacaacggcacccggcgtacctaccggatgcgcaagtttgcccggtccaaccac2040
ggcacttgcgccaaccagtgccccatcgtggacgcgggcgaccgagtcgaggccggtcag2100
gtgatcgccgacggtccctgtactgacgacggcgagatggcgctgggcaagaacctgctg2160
gtggccatcatgccgtgggagggccacaactacgaggacgcgatcatcctgtccaaccgc2220
ctggtcgaagaggacgtgctcacctcgatccacatcgaggagcatgagatcgatgctcgc2280
gacaccaagctgggtgcggaggagatcacccgcgacatcccgaacatctccgacgaggtg2340
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cacggcgaatccggcaaggtgatcggcattcgggtgttttcccgcgaggacgaggacgag2580
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cacagcggctggaaggtcgacgccgccaagggggttccggactgggccgccaggctgccc2880
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caggaggccgagctgcagggcctgttgtcgtgcacgctgcccaaccgcgacggtgacgtg3000
ctggtcgacgccgacggcaaggccatgctcttcgacgggcgcagcggcgagccgttcccg3060
tacccggtcacggttggctacatgtacatcatgaagctgcaccacctggtggacgacaag3120
atccacgcccgctccaccgggccgtactcgatgatcacccagcagccgctgggcggtaag3180
gcgcagttcggtggccagcggttcggggagatggagtgctgggccatgcaggcctacggt3240
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ttcaaggtgctgctcaaagaactgcagtcgctgtgcctcaacgtcgaggtgctatcgagt3420
gacggtgcggcgatcgaactgcgcgaaggtgaggacgaggacctggagcgggccgcggcc3480
aacctgggaatcaatctgtcccgcaacgaatccgcaagtgtcgaggatcttgcgtaa3537
Claims (3)
1.一种结核分枝杆菌rpoB突变基因，其特征在于：该突变基因具有c.1843G>A突变位点，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。
2.权利要求1所述的结核分枝杆菌rpoB突变基因在制备用于检测耐利福平结核分枝杆菌试剂盒中的应用，所述试剂盒包括用于检测结核分枝杆菌rpoB基因c.1843G>A突变的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的引物。
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN110777154A (zh) * | 2019-07-19 | 2020-02-11 | 华大生物科技（武汉）有限公司 | 用于结核分枝杆菌耐药检测的突变基因、及其检测方法和试剂盒 |
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-
2015
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