CN101250592A - 丙型肝炎病毒(hcv)一步荧光定量rt-pcr检测方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及丙型肝炎病毒(HCV)一步实时荧光定量RT－PCR检测方法以及试剂盒组成。首先，检索到人体丙型肝炎病毒基因组全序列，并对检索所得HCV各个亚型序列进行同源性比对，再针对其保守基因序列设计出一对特异性引物和一条用荧光染料标记的探针，采用实时荧光定量PCR方法扩增目的基因。在一适当波长下检测反应始终扩增产物荧光强度，Ct值为0或大于27：丙型肝炎病毒呈阴性；Ct值小于26：则呈阳性，病人丙型肝炎病毒感染。此外，本发明采用改进的Trizol法结合特异性硅基质核酸吸附柱来提取HCV RNA，同时，利用一步荧光定量RT－PCR技术对丙型肝炎病毒进行检测。在核酸提取结束后直接在体系中加入RT－PCR反应液，cDNA的合成与PCR反应在同一管中进行，不用增加额外的步骤。

Description

丙型肝炎病毒(HCV)一步荧光定量RT-PCR检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种快速定量检测不同基因分型丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)血清RNA的一步荧光定量RT-PCR检测方法及其试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)为黄病毒科丙型肝炎病毒属，通过血液、肾移植、静脉注射毒品、性、母婴等途径传播。HCV主要的复制部位是肝脏，慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)，严重危害患者的生命健康。在被特异性检测之前，HCV一直被称为输血后非甲非乙型肝炎因子，直到1989年才应用分子克隆技术首次得以确认。HCV为单股正链RNA病毒，大小为30～38nm，有脂质包膜，目前，其复制的分子机制尚不完全清楚，对HCV引起急性肝损伤的机制也知之甚少。由于HCV感染的严格宿主限制性，仅感染人和黑猩猩，动物感染模型较难建立。在细胞培养时，变异快，病毒的产量非常低。同时HCV似乎具有很强的躲避免疫攻击的能力。因此，目前尚未能开发出有效的疫苗和治疗方案。由HCV病毒引起的肝脏疾病，在全球分布广泛，慢性丙型肝炎患者超过1.7亿，接近全球人口大得3％，许多患者长期无症状直至严重肝损害后才出现临床表现，丙型肝炎已成为威胁人类身体健康的世界性医学难题。应引起社会各界的高度重视，必须加强预防，减少发病，控制流行。

近几年的临床经验表明，干扰素对抗HCV病毒效果显著优于HBV，因此，准确检测丙型肝炎患者血清中HCV RNA的含量变化，对临床疗效的观察显得非常重要。HCV的基因组长9.4Kb，含一个大的开放阅读框(ORF)几乎占据整个基因组，其5’端为非编码序列，高度保守，因此可作为靶序列应用PCR技术扩增以检测HCV含量。

丙型肝炎病毒传统的检测方法一般为酶联免疫法(ELISA)，但该方法工作量大、耗时长，给丙型肝炎病毒的检测带来诸多不便。随着分子生物学技术的飞速发展，人们已经将实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescence polymerase chain reaction)广泛应用于临床检验，包括病毒、细菌等多种病原微生物的检测以及多种病毒、细菌耐药性的检测等。实时荧光定量PCR(real-time fluorescence polymerase chain reaction)是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，在一适当波长下实时在线监控反应过程，利用探针在无特异性PCR发生时，荧光信号不变，当有特异性PCR发生时，探针会在PCR过程中被切断而引起荧光信号的增长。荧光信号伴随着PCR的过程进行，伴随PCR产物增长而增长，当荧光强度达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的依据，再结合相应的软件可对结果进行分析，计算出待测样品的初始模板量。实时荧光定量PCR技术具有以下优点：(1)PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性；(2)仪器自动分析，效率高、无后续处理；(3)独特的定量原理，即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量，定量范围宽，无须稀释样品，结果重现性好；(4)所有试剂均是一次扩增，毋须开盖，不产生污染。由于试剂盒的灵敏度问题，目前尚无法对献血员处于窗口期的HCV感染者采用PCR法检测，这是值得完善的环节。而临床所用的试剂盒大多为两步法，耗时长，不利于临床操作。

由于细胞、组织和血清中含有较难去除的RNA酶，因此HCV RNA提取的纯度对检测结果影响较大。目前常用方法有Trizol裂解法、SiO₂吸附法及纯化层析法。Trizol裂解法和SiO₂吸附法步骤烦琐，易受外界环境污染，而国外主要采用Qiagene层析柱的方法进行提取，但由于其成本太高，仅限于科研。

结合市场需求，本发明采用改进的Trizol法结合特异性硅基质核酸吸附柱来提取HCVRNA，同时，利用一步荧光定量RT-PCR技术对丙型肝炎病毒进行检测。在核酸提取结束后直接在体系中加入RT-PCR反应液，cDNA的合成与PCR扩增反应在同一管中进行，不用增加额外的步骤。该操作在不影响灵敏度、准确度的情况下，不仅缩短了操作时间、减少了污染、降低了劳动强度，而且也直接降低了临床样品PCR诊断的成本，延续了荧光定量PCR检测方法的快速简便性能，不仅可用于HCV定量检测，也可作为临床实验室对HCV感染的辅助诊断方法和临床治疗效果的监测手段，具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种精确简便的用于定量检测丙型肝炎病毒血清RNA含量的方法；另一目的在于提供一种用于该方法的试剂盒。

本发明的技术特征在于在对现有各个亚型HCV RNA序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出一对特异性引物和一条特异性荧光探针，采用Trizol法结合特异性硅基质核酸吸附柱来提取HCV RNA，同时，利用一步荧光定量RT-PCR技术对丙型肝炎病毒进行检测。在核酸提取结束后直接在体系中加入RT-PCR反应液，cDNA的合成与PCR反应在同一管中进行，不用增加额外的步骤。该操作在不影响灵敏度、准确度的情况下，不仅缩短了操作时间、减少了污染、降低了劳动强度，而且也直接降低了临床样品PCR诊断的成本，延续了荧光定量PCR检测方法的快速简便性能，不仅可用于HCV定量检测，也可作为临床实验室对HCV感染的辅助诊断方法和临床治疗效果的监测手段，具有潜在的应用价值。

本发明的技术特征在于，在按下述方法设计的探针和相应引物存在下，在荧光定量PCR仪中，对从血清样品提取的丙型肝炎病毒RNA进行RT-PCR扩增，实现丙型肝炎病毒基因分型检测：

1、所述的探针和特异性引物设计方法如下：

1)同源性比对：从GeneBank数据库中调出丙型肝炎病毒各亚型基因序列。

2)通过比对选取高度保守序列。

3)以保守序列为基准设计一对特异性引物及一条荧光探针。

2.引物和荧光探针设计原则：

1)特异性引物和荧光探针的长度：每条引物长度为18～25个碱基，荧光探针长度为20～30个碱基。

2)特异性引物和荧光探针中GC％要求在40～60％，理论Tm＞50℃。

3)特异性引物和荧光探针自身、引物和探针之间的3’端尽可能避免碱基配对。

4)引物和荧光探针自身、引物和探针之间尽可能避免6对以上的连续碱基配对。

5)选用的引物和荧光探针要求设计在人丙型肝炎病毒(HCV)基因中的保守区，只对人丙型肝炎病毒特异，和其他物种无交叉反应。荧光探针位于一对引物之间的区域。扩增目的基因长度最好介于50～150bp。

3.丙型肝炎病毒特异性扩增基因序列为：

ccatggcgtt agtatgagtg tcgtgcagcc tccaggaccc cccctcccgg    132

gagagccata gtggtctgcg gaaccggtga gta                      165

丙型肝炎病毒荧光检测试剂盒扩增序列全长83 bp，位于GeneBank中HCV DNA序列的第83-165位，属5’端非编码区，为单拷贝序列。

针对丙型肝炎病毒特异性扩增序列设计的引物与探针序列为：

PHCV1上游引物：5‘ccatggcgttagtaygagtgtcg          3’    23bp

PHCV2下游引物：5‘tactcaccggttccgcagac             3’    20bp

FPHCV荧光探针：5‘FAM-cccctcccgggagaccatag-YAMARA  3’    21bp

4.试剂盒组成：

一对特异性引物PHCV、一条特异性荧光探针FPHCV、Taq酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、丙型肝炎病毒强阳性对照、阴性对照、临界阳性指控品对照血清、HCV定量标准品、核酸提取裂解液(LB)、漂洗液(WB)、核酸吸附柱、洗脱液(EB)、和实时荧光定量RT-PCR反应液(mix)。

5、丙型肝炎病毒核酸裂解液LB的配制：

异硫腈酸胍    60g

盐酸胍        20g

十二烷基肌胺酸钠   0.66g

0.5M柠檬酸钠       34ul

1M醋酸钠           122ul

Triton X-100       200ul

DEPC水定容至50mL，45℃、超声助溶，0.44um过滤除菌。加入100mL重蒸酚，调节pH至6.5。

6、漂洗液WB的配制：

分析纯异丙醇，需RNA专用。

5.洗脱液EB的配制：

pH为8.0的DEPC水。

6.一步荧光定量RT-PCR Buffer的配制：

Tris-HCl(pH 8.4)    30mM

KCl                 50mM

MgCl₂               2mM

甲酰胺              1.5％

DTT                 5mM

dNTP                0.5mM

PHCV1/2             各0.3pM

FPHCV               0.5pM

配制成RT-PCR反应液，每人份23.5ul，于-20℃保存。

7.丙型肝炎病毒核酸RNA的提取：

a)取血清样品100ul，加入裂解液LB 500ul，温和颠倒混匀，静置5min。

b)加入氯仿100ul，温和颠倒混匀至白色靡状液体。

c)室温离心12,000rpm，3min。

d)在内套管中加入等体积(约250μl)漂洗液WB。小心吸取离心后的上层液体约250μl(注意不要搅动界面层)至内套管中，立即吹打混匀数次，静置2min。

e)13,000rpm离心30s，弃废液。

f)在内套管中直接加入漂洗液WB 250μl，静置1min，13,000rpm离心2min，弃废液。

g)加入500ul 75％乙醇漂洗离心柱，静置1min。

h)13,000rpm离心30s，弃废液。

i)13,000rpm离心2min。(如吸附柱内仍有残留液体，可加大转速，延长离心时间。)

j)将离心柱置于一干净无RNase污染的离心管中，并加入适量洗脱液EB，静置2min，13,000rpm离心30s，所得液体即为目的产物，可用于下一步实验。

8.逆转录及实时荧光定量PCR扩增(每人份30ul体系)

取5ul提取的核酸作为RT-PCR反应模板，同时加入25ul RT-PCR反应液至八联管中进行RT-PCR扩增。

a)一步实时荧光定量RT-PCR反应液的配制：

一步RT-PCR Buffer     23.5ul

Taq酶(2.5U/μl)v      0.5μl

RNA酶抑制剂(40U/μl)  0.5μl

M-MLV逆转录酶         0.4ul

                                          

反应液体积：          25μl

b)一步实时荧光定量RT-PCR反应程序：

①42℃               40min

②96℃               5min

③93℃               45s

④60℃               1min

⑤Go to 2，15 cycles

⑥93℃               30s

⑦60℃               45s

⑧Go to 5 30 cycles，

在第七步采集荧光。

⑨End

c)检测：

本发明使用ABI Prism 7300实时荧光定量PCR仪进行检测。

d)结果判断：

定性分析：

检测探针FPHCV标记的荧光染料度，Ct值0或大于27：丙型肝炎病毒阴性；Ct值小于26：丙型肝炎病毒阳性，病人丙型肝炎病毒感染。

定量分析：

对于1×10³≤测定拷贝数＜1×10⁸拷贝/ml的样本，报告相应的测定结果。

对于测定拷贝数≥1×10⁸拷贝/ml的样本，所测结果仅供参考。(报告上注明≥1×10⁸拷贝/ml，如需确定量，可根据所测结果将该标本用阴性血清稀释至10⁵～10⁶拷贝/ml后复测。)

对于测定拷贝数＜1×10³拷贝/ml的样本，所测结果仅供参考，报告上注明＜1×10³拷贝/ml或低于试剂盒检测下限。

对于HCV扩增阴性的标本(Ct值无数值)，报告上注明＜1×10³拷贝/ml或低于试剂盒检测下限。

具体实施方式：

实施例1----丙型肝炎病毒一步实时荧光定量RT-PCR检测方法及其试剂盒

1、丙型肝炎病毒一步实时荧光定量RT-PCR诊断试剂盒组成：

一对特异性引物PHCV、一条特异性荧光探针FPHCV、Taq酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、丙型肝炎病毒强阳性对照、阴性对照、临界阳性指控品对照血清、HCV定量标准品、核酸提取裂解液(LB)、漂洗液(WB)、核酸吸附柱、洗脱液(EB)、和一步实时荧光定量RT-PCR Buffer。

2.丙型肝炎病毒特异性扩增基因序列为：

ccatggcgtt agtatgagtg tcgtgcagcc tccaggaccc cccctcccgg    132

gagagccata gtggtctgcg gaaccggtga gta                      165

通过基因序列分析，我们选择其中的保守序列设计出一对特异性引物和一条特异性荧光探针。一对引物设计的Tm值接近，相差不到2℃。

针对丙型肝炎病毒特异性扩增序列设计的引物与探针序列为：

PHCV1上游引物：5‘ccatggcgttagtaygagtgtcg            3’    23bp

PHCV2下游引物：5‘tactcaccggttccgcagac               3’    20bp

FPHCV荧光探针：5‘FAM-cccctccccgggagagccatag-TAMARA  3’    21bp

丙型肝炎病毒荧光检测试剂盒扩增序列全长83 bp，位于GeneBank中HCV DNA序列的第83-165位，属5’端非编码区，为单拷贝序列。

3、丙型肝炎病毒核酸裂解液LB的配制：

异硫腈酸胍          60g

盐酸胍              20g

十二烷基肌胺酸钠    0.66g

0.5M柠檬酸钠    34ul

1M醋酸钠        122ul

Triton X-100    200ul

DEPC水定容至50mL，45℃、超声助溶，0.44um过滤除菌。加入100mL重蒸酚，调节pH至6.5。

4、漂洗液WB的配制：

含有分析纯异丙醇，需RNA专用。

5.洗脱液EB的配制：

含有pH为8.0的DEPC水。

6.一步RT-PCR Buffer的配制：

Tris-HCl(pH 8.4)    30mM

KCl                 50mM

MgCl₂               2mM

甲酰胺              1.5％

DTT                 5mM

dNTP                0.5mM

PHCV1/2             各0.3pM

FPHCV               0.5pM

配制成RT-PCR反应液，每人份23.5ul，于-20℃保存。

7.丙型肝炎病毒核酸RNA的提取：

a)取血清样品100ul，加入裂解液LB 500ul，温和颠倒混匀，静置5min。

b)加入氯仿100ul，温和颠倒混匀至白色靡状液体。

c)室温离心 12,000rpm，3min。

d)在内套管中加入等体积(约250μl)漂洗液WB。小心吸取离心后的上层液体约250μl(注意不要搅动界面层)至内套管中，立即吹打混匀数次，静置2min。

e)13,000rpm离心30s，弃废液。

f)在内套管中直接加入漂洗液WB 250μl，静置1min，13,000rpm离心2min，弃废液。

g)加入500ul 75％  醇漂洗离心柱，静置1min。

h)13,000rpm离心30s，弃废液。

i)13,000rpm离心2min。(如吸附柱内仍有残留液体，可加大转速，延长离心时间。)

j)将离心柱置于一干净无RNase污染的离心管中，并加入适量洗脱液EB，静置2min，13,000rpm离心30s，所得液体即为目的产物，可用于下一步实验。

8.逆转录及实时荧光定量PCR扩增(每人份30ul体系)

取5ul提取的核酸作为RT-PCR反应模板，同时加入25ul RT-PCR反应液至八联管中进行RT-PCR扩增。

c)一步实时荧光定量RT-PCR反应液的配制：

一步RT-PCR Buffer      23.5ul

Taq酶(2.5U/μl)        0.5μl

RNA酶抑制剂(40U/μl)   0.5μl

M-MLV逆转录酶          0.4ul

                                         

反应液体积：           25μl

d)一步实时荧光定量RT-PCR反应程序：

⑨42℃                40min

⑩96℃                5min

93℃                45s

60℃                1min

Go to 2，15 cycles

93℃                30s

60℃                45s

Go to 5 30 cycles，

在第七步采集荧光。

⑩End

c)检测：

本发明使用ABI Prism 7300实时荧光定量PCR仪进行检测。

d)结果判断：

定性分析：

检测探针FPHCV标记的荧光染料度，Ct值0或大于27：丙型肝炎病毒阴性；

Ct值小于26：丙型肝炎病毒阳性，病人丙型肝炎病毒感染。

定量分析：

对于1 ×10³≤测定拷贝数＜1×10⁸拷贝/ml的样本，报告相应的测定结果。

对于测定拷贝数≥1×10⁸拷贝/ml的样本，所测结果仅供参考。(报告上注明≥1×10⁸拷贝/ml，如需确定量，可根据所测结果将该标本用阴性血清稀释至10⁵～10⁶拷贝/ml后复测。)

对于测定拷贝数＜1×10³拷贝/ml的样本，所测结果仅供参考，报告上注明＜1×10³拷贝/ml或低于试剂盒检测下限。

对于HCV扩增阴性的标本(Ct值无数值)，报告上注明＜1×10³拷贝/ml或低于试剂盒检测下限。

实施例2----临床检测

用上述方法对136例临床样品进行检测，其中丙肝患者29例，检出阳性率22.1％，准确率96.7％，并且能够对丙型肝炎病毒进行准确定量分析，远远优于酶联免疫。本发明具有特异性好，灵敏度高，定量精确，快速简便，可重复性高，可对丙型肝炎病毒进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统ELISA(酶联免疫吸附试验)诊断方法。采用硅基质核酸吸附柱提取RNA，保证了模板的纯度。同时，利用一步荧光定量RT-PCR技术对丙型肝炎病毒进行检测。在核酸提取结束后直接在体系中加入RT-PCR反应液，cDNA的合成与PCR反应在同一管中进行，不用增加额外的步骤。该操作在不影响灵敏度、准确度的情况下，不仅缩短了操作时间、减少了污染、降低了劳动强度，而且也直接降低了临床样品PCR诊断的成本，延续了荧光定量PCR检测方法的快速简便性能，不仅可用于HCV定量检测，也可作为临床实验室对HCV感染的辅助诊断方法和临床治疗效果的监测手段，具有潜在的应用价值。

序列表

<110>扬子江药业集团北京海燕药业有限公司

<120>丙型肝炎病毒一步实时荧光定量RT-PCR检测方法及其试剂盒

<160>4

<210>1

<211>83

<212>RNA

<213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)

<400>1

ccatggcgtt agtatgagtg tcgtgcagcc tccaggaccc cccctcccgg     132

gagagccata gtggtctgcg gaaccggtga gta                       165

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(23)

<223>根据丙型肝炎病毒核苷酸序列比较设计，用于检测丙型肝炎病毒的特异性引物序列；

<400>2

ccatggcgtt agtaygagtg tcg                                  23

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(20)

<223>根据丙型肝炎病毒核苷酸序列比较设计，用于检测丙型肝炎病毒的特异性引物序列；

<400>3

tactcaccgg ttccgcagac                                         20

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(21)

<223>根据丙型肝炎病毒核苷酸序列比较设计，用于检测丙型肝炎病毒的特异性荧光探针序列

     5’端连有荧光基团FAM，3’端连有泯灭基团TAMARA

<400>4

cccctcccgg gagagccata g                                       21

Claims (11)

1、一种丙型肝炎病毒一步实时荧光定量RT-PCR检测方法以及试剂盒。本法考察了人体丙型肝炎病毒基因组全序列，并对检索所得HCV各个亚型序列进行同源性比较，针对其保守基因序列设计出一对特异性引物和一条特异性荧光探针，采用实时荧光定量PCR方法扩增目的基因。在一适当波长下检测反应始终荧光强度，Ct值为0或大于27：丙型肝炎病毒呈阴性；Ct值小于26：则呈阳性，病人丙型肝炎病毒感染。本发明具有特异性好，灵敏度高，定量精确，快速简便，可重复性高，可对丙型肝炎病毒进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法和ELISA(酶联免疫吸附试验)诊断方法。

2、本试剂盒采用改进的Trizol法结合特异性硅基质核酸吸附柱来提取HCV RNA，同时，利用一步荧光定量RT-PCR技术对丙型肝炎病毒进行检测。在核酸提取结束后直接在体系中加入RT-PCR反应液，cDNA的合成与PCR扩增反应在同一管中进行，不用增加额外的步骤。该操作在不影响灵敏度、准确度的情况下，不仅缩短了操作时间、减少了污染、降低了劳动强度，而且也直接降低了临床样品PCR诊断的成本，延续了荧光定量PCR检测方法的快速简便性能，从而实现对丙型肝炎病毒的定性定量检测。按照权利要求1所述的丙型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增基因序列的反应体系为：

3、丙型肝炎病毒核酸裂解液LB的配制：

异硫腈酸胍        60g

盐酸胍            20g

十二烷基肌胺酸钠  0.66g

0.5M柠檬酸钠      34ul

1M醋酸钠          122ul

Triton X-100      200ul

DEPC水定容至50mL，45℃、超声助溶，0.44um过滤除菌。加入100mL重蒸酚，调节pH至6.5。

4.漂洗液WB的配制：

含有分析纯异丙醇，需RNA专用。

5、洗脱液EB的配制：

含有pH为8.0的DEPC水。

6、一步荧光定量RT-PCR Buffer的配制：

DEPC水

Tris-HCl(pH 8.4)    30mM

KCl                 50mM

MgCl₂               2mM

甲酰胺              1.5％

DTT                 5mM

dNTP                0.5mM

PHCV1/2             各0.3pM

FPHCV               0.5pM

配制成RT-PCR反应液，每人份23.5ul，于-20℃保存。

7、丙型肝炎病毒核酸RNA的提取：

a)取血清样品100ul，加入裂解液LB 500ul，温和颠倒混匀，静置5min。

b)加入氯仿100ul，温和颠倒混匀至白色靡状液体。

c)室温离心 12,000rpm，3min。

d)在内套管中加入等体积(约250μl)漂洗液WB。小心吸取离心后的上层液体约250μl(注意不要搅动界面层)至内套管中，立即吹打混匀数次，静置2min。

e)13,000rpm离心30s，弃废液。

f)在内套管中直接加入漂洗液WB 250μl，静置1min，13,000rpm离心2min，弃废液。

g)加入500ul 75％乙醇漂洗离心柱，静置1min。

h)13,000rpm离心30s，弃废液。

i)13,000rpm离心2min。(如吸附柱内仍有残留液体，可加大转速，延长离心时间。)

j)将离心柱置于一干净无RNase污染的离心管中，并加入适量洗脱液EB，静置2min，13,000rpm离心30s，所得液体即为目的产物，可用于下一步实验。

8.逆转录及实时荧光定量PCR扩增(每人份30ul体系)

取5ul提取的核酸作为RT-PCR反应模板，同时加入25ul RT-PCR反应液至八联管中进行RT-PCR扩增。

a)一步实时荧光定量RT-PCR反应液的配制：

一步RT-PCR Buffer     23.5ul

Taq酶(2.5U/μl)       0.6μl

RNA酶抑制剂(40U/μl)  0.5μl

M-MLV逆转录酶         0.4ul

                                          

反应液体积：          25μl

b)一步实时荧光定量RT-PCR反应程序：

①42℃                 40min

②96℃                 5min

③93℃                 45s

④60℃                 1min

⑤Go to 2，15 cycles

⑥93℃                 30s

⑦60℃                 45s

⑧Go to 5  30 cycles，

  在第七步采集荧光。

⑨End

c)检测：

本发明使用ABI Prism 7300实时荧光定量PCR仪进行检测。

d)结果判断：

定性分析：

检测探针FPHCV标记的荧光染料度，Ct值0或大于27：丙型肝炎病毒阴性；Ct值小于26：丙型肝炎病毒阳性，病人丙型肝炎病毒感染。

定量分析：

对于1×10³≤测定拷贝数＜1×10⁸拷贝/ml的样本，报告相应的测定结果。

对于测定拷贝数≥1×10⁸拷贝/ml的样本，所测结果仅供参考。(报告上注明≥1×10⁸拷贝/ml，如需确定量，可根据所测结果将该标本用阴性血清稀释至10⁵～10⁶拷贝/ml后复测。)

对于测定拷贝数＜1×10³拷贝/ml的样本，所测结果仅供参考，报告上注明＜1×10³拷贝/ml或低于试剂盒检测下限。

对于HCV扩增阴性的标本(Ct值无数值)，报告上注明＜1×10³拷贝/ml或低于试剂盒检测下限。

9、按照权利要求1所述的丙型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：试剂盒包括以下成分：一对特异性引物PHCV、一条特异性荧光探针FPHCV、Taq酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、丙型肝炎病毒强阳性对照、阴性对照、临界阳性指控品对照血清、HCV定量标准品、核酸提取裂解液(LB)、漂洗液(WB)、核酸吸附柱、洗脱液(EB)、和一步实时荧光定量RT-PCR Buffer。

10、按照权利要求3所述的丙型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：丙型肝炎病毒特异性扩增基因序列为：

ccatggcgtt agtatgagtg tcgtgcagcc tccaggaccc cccctcccgg    132

gagagccata gtggtctgcg gaaccggtga gta                      165

丙型肝炎病毒荧光检测试剂盒扩增序列全长83bp，位于GeneBank中HCV DNA序列的第83-165位，属5’端非编码区，为单拷贝序列。

11、按照权利要求4所述的丙型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：针对丙型肝炎病毒特异性扩增序列设计的引物与探针序列为：

PHCV1上游引物：5‘ccatggcgttagtaygagtgtcg           3’    23bp

PHCV2下游引物：5‘tactcaccggttccgcagac              3’    20bp

FPHCV荧光探针：5‘FAM-cccctcccgggagagccatag-TAMARA  3’    21bp