CN101407846B - 肠道病毒核酸荧光定量rt-pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种肠道病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒及检测方法，所述荧光定量RT-PCR检测试剂盒的上下游引物和特异性探针序列如下：上游引物EV(YG)F：5’-GGCTGCGYTGGCGGCC-3’下游引物EV(YG)R：5’-CCAAAGTAGT CGGTTCCGC-3’特异性探针EV(YG)PB：5’-CTCCGGCCCCTGAATGCGG-3’本发明方法对肠道病毒的检测有高度的特异性，与其他非肠道病毒如甲肝，麻疹，风疹，腮腺炎，乙脑，登革热，腺病毒等均无交叉反应；本发明方法检测的灵敏度达0.1TCID₅₀，可直接从疑似患者的脑脊液、疱疹液和粪便等标本中检测肠道病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右，非常适用于如手足口病等由肠道病毒感染引起突发疫情的实验室早期诊断。

Description

肠道病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒

(一)技术领域

本发明涉及一种肠道病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒及检测方法，可应用于肠道病毒引起暴发疫情的实验室应急检测。 

(二)背景技术

肠道病毒(EV)属于小RNA病毒科，根据血清学可以分为脊灰病毒、柯萨奇、埃可病毒和肠道病毒68～71型，共67个血清型。肠道病毒可引发众多疾病，并可暴发流行，导致死亡，严重危害人类健康。随着脊髓灰质炎病毒的消灭，由肠道病毒引发的一些新型传染病也时有流行，因此对肠道病毒的实验室诊断日显重要，但传统的血清中和试验不仅繁琐、费时，而且无法对所有的血清型进行鉴定，更不能对一些抗原变异株或新型别进行鉴定。近年发展起来的荧光定量PCR技术，实行完全闭管式操作，通过检测反应体系中的荧光强度动态变化对目的核酸进行实时定量分析，该方法准确、快速、灵敏、简便。 

肠道病毒所有67个血清型基因组5’端非编码区基因非常保守，其中部分基因几乎是所有血清型肠道病毒所共有。 

(三)发明内容

本发明目的是提供一种适合所有67种肠道病毒感染实验室应急检测的荧光RT-PCR检测试剂盒及检测方法。 

本发明采用的技术方案是： 

肠道病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，所述荧光定量RT-PCR检测 试剂盒的上下游引物和特异性探针序列如下： 

上游引物EV(YG)F：5’-GGCTGCGYTGGCGGCC-3’ 

下游引物EV(YG)R：5’-CCAAAGTAGTCGGTTCCGC-3’ 

特异性探针EV(YG)PB：5’-CTCCGGCCCCTGAATGCGG-3’ 

引物EV(YG)F序列中，碱基Y为C或T的兼并碱基，此处为引物的突变位点，就是说该处有些病毒是C，有些是T。而在引物的合成工艺过程中，其合成原理是到这个位点时，原料各加一半也就是加一半C，加一半T。 

此外本试剂盒中还包括dNTP，MgCl₂，RNase抑制剂，AMV逆转录酶，Taq酶等，这些组分对于本领域技术人员来说属于公知常识，可根据需要选用。 

本发明还涉及一种肠道病毒的荧光定量RY-PCR检测方法，所述方法包括： 

(1)根据所有肠道病毒基因组的5′端非编码区通用保守序列，设计引物和探针序列如下： 

EV(YG)F：5’-GGCTGCGYTGGCGGCC-3’ 

EV(YG)R：5’-CCAAAGTAGTCGGTTCCGC-3’ 

EV(YG)PB：5’-CTCCGGCCCCTGAATGCGG-3’ 

引物EV(YG)F中，Y为C或T的兼并碱基。 

(2)提取待测样品RNA，以待测样品RNA为模板、在包括步骤(1)所述引物和探针序列的RT-PCR反应体系中进行RT-PCR反应； 

(3)对RT-PCR反应产物进行荧光检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度判断结果，若RT-PCR反应产物的荧光检测结果 呈阳性，则待测样品含有肠道病毒核酸。 

本发明关键在于引物和探针序列的设计，RT-PCR反应体系组成、反应条件选择和反应结果判断均可按本领域常规方法进行。 

所述RT-PCR反应体系每25μL组成如下： 

优选的，所述荧光定量RT-PCR反应体系终浓度组成如下： 

RT-PCR缓冲液                 终浓度为1× 

Ex Taq HS                     0.1U/μL 

RT Enzyme Mix II              0.1U/μL 

上游与下游引物               各1.2μM 

探针                         0.6μM 

模板RNA                      10～10⁵ng/μL 

余量为DEPC水。 

所述RT-PCR缓冲液为one step RT-PCR缓冲液，其终浓度为1×，是指缓冲液各组分在反应体系中的终浓度与1×one step RT-PCR缓冲液中各组分的浓度相同。通常采用反应体系1/2体积的2×one stepRT-PCR缓冲液。1×one step RT-PCR缓冲液的组成参见Takara公司的one stepPrime Script RT-PCR(Perfect Real time)，Code：DRR064A。 

优选的，所述荧光定量RT-PCR反应条件为：42℃30min，95℃2min进行逆转录，然后95℃ 5s，51℃ 35s，在51℃进行单点荧光检测，共进行40个循环。 

所述样品RNA提取可按常规方法进行，如采用德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或其它试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。 

肠道病毒是最常见的感染人类的病毒，所致疾病种类多，临床表现多 样，疾病谱从无症状、呼吸道感染到心肌炎、慢性心血管疾病、脊髓灰质炎、麻痹症、脑膜炎或脑膜脑炎、新生儿疾病、糖尿病、病毒感染后疲劳综合征、胸肌痛、疱疹性咽峡炎、手足口病、眼病、胃肠道疾病等，肠道病毒又是通过粪-口和呼吸道等较易播散的途径而传染。 

对肠道病毒引起的爆发疫情尽早作出实验室确诊是及时采取防控措施与对诊治疗的关键。肠道病毒检测传统的方法是采用细胞培养进行病毒分离，然后用肠道病毒组合血清进行型别鉴定，该方法虽然正确可靠，但繁杂耗时，不适应早期应急诊断。近年来，随着分子生物学技术的发展，采用RT-PCR技术对肠道病毒进行诊断国内外已有报导，它具有灵敏度高，特异性强，所需时间短等优点，目前已在肠道病毒的核酸检测中得到应用，但其检测时间仍需6～7h，且容易由于PCR扩增产物污染而产生假阳性。近年发展起来的荧光定量PCR技术，实行完全闭管式操作，通过检测反应体系中的荧光强度动态变化对目的核酸进行实时定量分析，该方法比常规病毒学方法更加准确、快速、灵敏、简便，并且减少了污染的环节，但该方法对引物和探针的设计也提出了更高的要求。 

本申请发明人从美国的NCBI基因库上下载了世界各地的肠道病毒毒株，包含肠道病毒所有67个血清型别。对其进行了同源性比较，在所有肠道病毒基因组5′端非编码通用保守基因区设计若干对引物与Taqman探针，对该区域进行特异性扩增，从中筛选出最佳的引物和探针，并对荧光RT-PCR方法进行优化，验证其敏感性、特异性和重复性。经若干肠道病毒标准毒株与近期爆发疫情疑似患者临床样本的检测比较，该方法具有高特异性，与其他非肠道病毒如甲肝，麻疹，风疹，腮腺炎，乙脑，登革热，腺病毒等均无交叉反应，而且比常规RT-PCR法更敏感、快速和简便。 肠道病毒的RT-PCR检测敏感度在1.0TCID₅₀左右，从病毒核酸提取、RT-PCR反应与电泳，整个过程大约需6～7h左右，而采用本方法从核酸提取至完成检测，仅需3h左右，能同时完成多个疑似患者临床样本的高通量检测，敏感度达0.1 TCID₅₀，比普通PCR的灵敏度高10倍左右，可直接从患者的脑脊液、粪便、疱疹液等临床样本中检测肠道病毒核酸。用建立的新方法，对近期浙江省疑似肠道病毒爆发疫情疑似患者100份临床样本进行实验室早期快速诊断，获得了令人满意的结果，为该病及时采取控制措施发挥了很好的作用。 

本发明的有益效果主要体现在：本发明方法对肠道病毒的检测有高度的特异性，与其他非肠道病毒如甲肝，麻疹，风疹，腮腺炎，乙脑，登革热，腺病毒等均无交叉反应；本发明方法检测的灵敏度达0.1TCID₅₀，可直接从疑似患者的脑脊液、疱疹液和粪便等标本中检测肠道病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右；本发明方法是一种快速检测肠道病毒特异、敏感的方法，非常适用于如手足口病等由肠道病毒感染引起突发疫情的实验室早期诊断。 

(四)附图说明

图1为荧光RT-PCR法检测肠道病毒的灵敏度；A～E分别代表不同的病毒浓度；从A至E依次为1000、100、10、1、0.1TCID₅₀； 

图2为荧光RT-PCR法检测手足口病疑似患者临床样本中肠道病毒核酸；A：肠道病毒阳性对照，B至H：手足口病疑似患者临床样本的检测。 

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1： 

1材料与方法 

1.1病毒株与临床标本： 

肠道病毒EV71、柯萨奇A组(CA)CA4、CA16、CA21、柯萨奇B5、E6、E30、POLIO1型、POLIO3型等病毒株来源于中国医学科学院、北京生物制品研究所和浙江省疾病预防控制中心分离株。临床样本来源于近期浙江省肠道病毒爆发疫情疑似患者的脑脊液、疱疹液、粪便等，样本采集后带冰运送到实验室。 

1.2引物与探针 

从美国的NCBI基因库上下载了世界各地的肠道病毒毒株，包含肠道病毒所有67个血清型别。对其进行了同源性比较，在所有肠道病毒基因组5′端非编码通用保守基因区设计引物与Taqman探针，序列如下： 

EV(YG)F：5’-GGCTGCGYTGGCGGCC-3’ 

EV(YG)R：5’-CCAAAGTAGTCGGTTCCGC-3’ 

EV(YG)PB：5’-CTCCGGCCCCTGAATGCGG-3’ 

引物和探针委托上海基康生物工程有限公司合成。 

1.3病毒定量标准与病毒RNA的提取： 

以肠道病毒POLIO3型为标准毒株，用人横纹肌瘤细胞(RD)进行病毒效价滴定(115.2TCID₅₀/ml)后作为参考株，将其稀释至1000、100、10、1、0.1、0.01TCID₅₀每个反应管。病毒RNA的提取采用德国QIAGEN公司的Reansy Mini Kit，按试剂盒说明书提取，得到病毒RNA(10²ng/μL)，备用。 

1.4荧光RT-PCR反应体系和条件的优化： 

试剂盒：选用Takara公司的one step Prime Script RT-PCR(Perfect Real time)，Code：DRR064A，按说明书操作，反应体系为25μl，其中2×onestep RT-PCR缓冲液12.5ul，Ex Taq HS(5U/μl)0.5ul，RT Enzyme Mix II(5U/μl)0.5ul，上游与下游引物(20μmol/L)各0.6μl，探针(20μmol/L)0.3μl，模板RNA8μl，DEPC水补足25μl。反应条件为42℃30min，95℃2min进行逆转录，然后95℃5s，51℃35s，在51℃进行单点荧光检测，共进行40个循环，结果判断：选择荧光检测模式FAM，荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物浓度从0.10～1.00μM，探针浓度从0.10～0.50μM，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值(ΔRn)选择最佳引物和探针浓度。 

1.5RT-PCR反应： 

肠道病毒RT-PCR引物序列： 

EV1：5’-AAGCACTTCTGTTTCCC-3’ 

EV2：5’-ATTCAGGGGCCGGAGGA-3’。 

扩增片断297bp。采用TAKARA公司one step RT-kit(code：DRR024A)，按试剂盒说明书操作，反应体系为25μl，其中10×RT-PCR缓冲液2.5ul，MgCl₂25ul(25mM)，dNTP混合物(各10mM)2.5μl，RNase抑制剂(40U/μl)0.5μl，AMV酶(5U/μl)0.5ul，Taq酶(5U/μl)0.5ul，上游与下游引物(20μM)各0.5μl，模板RNA8μl，DEPC水4.5μl。反应条件为50℃30min，95℃3min进行逆转录，然后95℃20s，50℃25s，72℃30s进行扩增，40个循环后转入72℃10min，取8μl产物电泳后判断有无特异性条带(297bp)。

1.6荧光RT-PCR特异性、敏感性和重复性试验 

选择肠道病毒EV71型毒株，柯萨奇A组CA4、CA16、CA21、柯萨奇B5、艾柯病毒E6、E30、POLIO1型、POLIO3型和近期手足口爆发疫情疑似患者的脑脊液、疱疹液和粪便等临床样本，对上述病毒株和样本分别提取核酸，用肠道病毒荧光RT-PCR方法进行检测，验证方法的特异性；对已标定TCID₅₀的肠道病毒POLIO3型(115.2TCID₅₀/ml)稀释后分别提取RNA，平行进行荧光RT-PCR与RT-PCR反应，比较其灵敏度。此外，对每一个浓度的病毒稀释液作5次重复检测，得到的Ct值计算标准差，验证方法的重复性。 

2结果 

2.1荧光RT-PCR反应体系及条件 

采用TAKARA公司的一步法荧光RT-PCR试剂盒，总反应体系为25μl。矩阵法优选后引物最佳浓度均为0.48μM，探针最佳浓度为0.24μM，模板RNA8μl，最后用DEPC水补至25μl。用MJ Research Option2荧光检测系统进行检测，反应参数为：42℃30min逆转录，95℃变性2min，以95℃5s，51℃35s扩增40个循环，在51℃进行单点荧光检测，可获得最低Ct值和最高荧光强度。 

2.2特异性试验 

本发明建立的荧光RT-PCR方法对肠道病毒具有较好的特异性，对所检的肠道病毒如EV71、CA16、CA4、CA21、E6、E30、COXB5、POLIO1型、POLIO3型等均显示阳性反应，近期流行的手足口病患者的疱疹液也显示阳性反应。而与其他非肠道病毒如甲肝，麻疹，风疹，腮腺炎，乙脑，登革热，腺病毒等均无交叉反应。 

2.3敏感性试验

对肠道病毒POLIO3型毒株，采用RD细胞进行病毒效价测定(115.2TCID₅₀/ml)，然后稀释成1000、100、10、1、0.1、0.01TCID₅₀，提取病毒RNA，分别用荧光RT-PCR与常规RT-PCR方法进行检测，结果荧光RT-PCR方法检测敏感性达到0.1TCID₅₀，RT-PCR方法检测敏感性达1.0TCID₅₀，荧光RT-PCR方法比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍左右(见图1)。 

2.4重复性试验 

肠道病毒EV71毒株按10倍梯度稀释成3个不同的浓度，对每一个浓度的样本作5个重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0.10～0.31之间，具有较好的重复性(表1)。 

表1荧光RT-PCR法检测肠道病毒的重复性试验 

2.5临床样本的检测 

从近期浙江省各地报告的手足口爆发疫情疑似患者的脑脊液、粪便和疱疹液共100份临床样本中直接提取病毒RNA，用本发明肠道病毒荧光RT-PCR方法和普通RT-PCR方法同时检测肠道病毒核酸，结果肠道病毒荧光RT-PCR方法检测出肠道病毒核酸阳性34份，普通RT-PCR法检测出EV71核酸阳性30份，本发明肠道病毒荧光RT-PCR方法比普通RT-PCR法检测肠道病毒的阳性率高。本发明肠道病毒荧光RT-PCR方法用于临床样本检测的验证在4个平行实验室进行，均获得了满意的结果，图2显示的是部分临床样本的检测图谱。

序列表_ST25 

SEQUENCE LISTING 

<110>浙江省疾病预防控制中心 

<120>肠道病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒及检测方法 

<130> 

<160>3 

<170>PatentIn version3.4 

<210>1 

<211>16 

<212>DNA 

<213>Unknown 

<220> 

<223>人工序列 

<400>1 

<210>2 

<211>19 

<212>DNA 

<213>Unknown 

<220> 

<223>人工序列 

<400>2 

<210>3 

<211>19 

<212>DNA 

<213>Unknown 

<220> 

<223>人工序列 

<400>3 

Claims (1)

1.肠道病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述荧光定量RT-PCR检测试剂盒的上下游引物和特异性探针序列如下：

EV(YG)F：5’-GGCTGCGYTGGCGGCC-3’

EV(YG)R：5’-CCAAAGTAGT CGGTTCCGC-3’

EV(YG)PB：5’-CTCCGGCCCCTGAATGCGG-3’

引物EV(YG)F序列中，Y为C或T的兼并碱基。

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