CN101570797A - 一种检测黄热病病毒的荧光定量rt-pcr试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测黄热病病毒的荧光定量RT－PCR试剂盒，包括RT－PCR缓冲液，逆转录反应酶混合物和DEPC水，正向引物5’－GTTAGAGRAGAGCCTCCAGGGAA－3’；反向引物5’－AGCAAACTGTGCTCRCAGACC－3’；荧光探针5’－FAM－TGACGCCWGGGAAAGACCGG－BHQ1－3’，R代表A或G，W代表A或T。应用该试剂盒检测黄热病病毒，提取待测样品的RNA，在反应管中加入反应物扩增，结果判定。本发明在22株黄热病病毒完全保守的3－UTR位点设计了引物和探针，建立了黄热病病毒的荧光定量RT－PCR检测方法，可应用在临床、口岸检验黄热病病毒。

Description

一种检测黄热病病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒及其检测方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，特别涉及一种检测黄热病病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒、该试剂盒的检测方法及该试剂盒在临床、口岸检验黄热病病毒的应用。

背景技术

黄热病(yellow fever)是黄病毒科、黄病毒属的黄热病病毒(yellow fever virus，YFV)引起的急性传染病，经蚊媒传播，主要流行于非洲和中、南美洲，3-4月份的病例较多。临床特征有发热、剧烈头痛、黄疸、出血和蛋白尿等。每年全世界至少有20万黄热病病例，造成3万人死亡，其中90％病例来源于非洲。现今对于黄热病都还没有特效药物及其他治疗方法，主要仍采用对症处理及支持疗法。因此早期快速诊断是控制病情，提高治愈率，避免临床误诊贻误治疗时机的关键。

黄热病预防接种证书是世界卫生组织唯一要求的国际旅行预防接种证书，可见世界卫生组织对黄热病这种烈性传染病的重视程度。我国部分地区的地理、气候、传播媒介-蚊、传染源-猴等条件与非洲、中、南美洲相似，但至今尚无本病流行或确诊病例的报道。虽然我国至今尚无黄热病流行或确诊病例的报告，但随着全球经济的发展，国际间的人群交往更为便利，全球贸易一体化和都市化生活等趋势使得病毒和传播媒介更易在各个国家之间传播。所以有必要建立黄热病病毒的快速分子生物学检测方法，在国境口岸对出入境人群和媒介生物进行早期快速的检测和监控，防止该传染病在口岸的传入，做到及时预防、控制疾病的传播，对保障我国的经济发展和人民身体健康有着重要的意义。

目前国内对黄热病病毒的研究较少，仅建立了该病毒的组织培养和RT-PCR检测方法。国外对黄热病病毒的诊断方法主要包括组织培养、血清学诊断和新发展的分子生物学方法。黄热病病毒的组织培养要求实验室的生物安全等级高，需在BSL-3实验室进行，病毒分离、鉴定的时间较长，且检测灵敏度不高；血清学方法主要包括(1)补体结合试验：主要检测补体结合抗体，阳性反应出现较迟，临床实验室较少采用；(2)中和试验：方法很复杂，一般不应用于临床；(3)血凝抑制试验，需采集双份血清标本，以第二份血清的抗体效价呈4倍以上升高为近期感染指标。此外，尚有报道采用捕获ELISA、间接免疫荧光等方法检测特异性抗体。但由于黄病毒不同毒株间存在广泛血清学交叉反应，会影响血清学诊断结果的特异性。

分子生物学方法与组织培养、血清学诊断相比，具有检测灵敏度高、特异性强和检测时间短等优点。黄热病病毒的分子生物学方法主要包括RT-PCR和实时荧光RT-PCR。Deubel等(Deubel V，Huerre M，Cathomas G，et al.Moleculardetection and characterization of yellow fever virus in blood and liver specimens of anon-vaccinated fatal human case(对没有接种黄热病疫苗的死亡病例的血液和肝脏标本进行黄热病分子检测和特征描述).J Med Virol.1997，53(3)：212-217.)针对YFV的NS5和3’UTR设计了半巢式RT-PCR所需的三条引物，鉴定了黄热病死亡病例；Ayers等(Ayers M，Adachi D，Johnson G，et al.A single tube RT-PCRfor the detection of mosquito-borne flaviviruses(单管RT-PCR检测蚊虫传播的黄病毒).J Virol Methods，2006，135：235-239)分析了黄热病属的5种病毒的NS5区域保守性，建立了这些病毒的一管RT-PCR方法；Drosten等(Drosten C，GottigS，Schilling S et al.Rapid detection and quantification of RNA of Ebola and Marburgviruses，Lassa virus，Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，Rift valley fever virus，Dengue virus，and Yellow fever virus by real-time reverse transcription-PCR(埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、克罗米亚-刚果出血热病毒、裂谷热病毒、登革病毒和黄热病病毒的快速实时荧光RT-PCR检测和定量).J Clin Microbiol，2002，40(7)：2323-2330)建立了黄热病等七种病毒性出血热的实时荧光RT-PCR方法；Bae等(Bae HG，Nitsche A，Teichmann A，et al.Detection of yellow fever virus：a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay(黄热病病毒的检测：实时荧光定量PCR与传统的平板方法的比较).J Virol Methods，2003，110：185-191.)分析了黄热病病毒的实时RT-PCR和传统的平板方法之间的一致性；Chao等(Chao DY，Davis BS，Chang GJ et al.Development of multiplexreal-time reverse transcriptase PCR assays for detecting eight medically importantflaviviruses in mosquitoes(多重实时荧光RT-PCR技术同时检测八种蚊虫传播的黄病毒).J Clin Microbiol，2007，45(2)：584-589.)建立了八种黄病毒科病毒的多重实时荧光RT-PCR方法。

以上方法仅对GenBank中部分的黄热病病毒序列进行分析，引物和探针对应的核酸不在完全保守的区域；目前，从世界范围来看，黄热病的实时荧光PCR技术主要应用于实验室研究，还没有应用于临床、口岸检验的试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于克服了上述技术缺点，在22株黄热病病毒完全保守的3-UTR位点设计了引物和探针，建立了黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法，提供了一种检测黄热病病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒及检测方法和应用。

为实现本发明的目的，采用如下的技术方案：

本发明的检测黄热病病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒，包括RT-PCR缓冲液和逆转录反应酶混合物，还包括：

正向引物：5’-GTTAGAGRAGAGCCTCCAGGGAA-3’；

反向引物：5’-AGCAAACTGTGCTCRCAGACC-3’；

荧光探针：5’-FAM-TGACGCCWGGGAAAGACCGG-BHQ1-3’；

其中，R代表A或G；W代表A或T。

上述引物、探针是用Lasergene软件包中的SeqMan程序分析从Genbank上获得的22株黄热病病毒核苷酸序列，选择有核苷酸高度保守的3端非编码区3-UTR，用Primer Express2.0软件设计得到的特异性引物和探针，该引物和探针在黄热病病毒基因组上的定位依据的是GenBank序列号为NC_002031的毒株序列。相关信息详见表1。

表1

其中，R代表A或G；W代表A或T。

应用上述试剂盒检测黄热病病毒可按如下步骤进行：

(1)待测样品RNA的提取；

(2)荧光定量核酸扩增体系：在反应管中加入正向引物、反向引物、荧光探针、RT-PCR缓冲液、逆转录反应酶混合物和步骤(2)得到的RNA，混合均匀；

(3)荧光定量核酸扩增：将步骤(2)得到的混合溶液置于荧光定量PCR仪上反应；

(4)结果判定：无Ct值或Ct＞45，且无明显扩增曲线，判定为阴性；Ct≤40，并有明显扩增曲线，判定为阳性；40＜Ct≤45，重做，若重做结果有明显扩增曲线，则为阳性，否则为阴性。

待测样品可有两种类型：(1)人体血清标本，直接提取病毒RNA后进行荧光RT-PCR操作；(2)传播媒介标本-蚊虫，通常研磨后再提取病毒RNA后进行荧光RT-PCR操作，涉及蚊虫研磨的前处理，用Hank’s液做为研磨液，研磨待测样品，至待测样品的组织碎片消失，得到研磨混合液。

优选的，正向引物的终浓度为500nM。

优选的，反向引物的终浓度为750nM。

优选的，荧光探针的终浓度为250nM。

优选的，扩增条件为在荧光定量仪上45℃，10分钟进行逆转录反应，95℃热启动10分钟后，进入扩增循环：95℃5秒，60℃20秒循环45次。

上述试剂盒可以应用在临床、口岸检验黄热病病毒方面。

本发明在22株黄热病病毒完全保守的3-UTR位点设计了引物和探针，建立了黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒，该试剂盒可应用于临床、口岸中黄热病病毒的检验。

附图说明

图1是确定最佳引物浓度的一个优选实施例的实验结果图；

图2是确定最佳探针浓度的一个优选实施例的实验结果图；

图3是标准曲线图的一个优选实施例的结果图；

图4是本发明试剂盒的重复性的一个优选实施例的实验结果图；

图5是检测模拟染毒蚊标本的一个优选实施例的实验结果图；

图6是黄热病病毒RNA模板系列稀释RT-PCR扩增的一个优选实施例的产物电泳图；

图7是检测黄热病疫苗中RNA的一个优选实施例的实验结果图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：阳性对照RNA模板的制备

根据黄热病病毒(GenBank序列号：NC_002031)的序列，扩增包含荧光RT-PCR检测片段序列的大小为606bp的DNA片段，克隆于pGEM-T easy载体上，用质粒DNA提取试剂盒纯化质粒DNA，测序证实插入片段的方向。使用与载体配对的通用性引物扩增T7启动子和插入的黄热病序列，随后用MAXIscript T7 Kit进行体外转录，生成目的RNA，然后用TURBO DNase进行DNase处理，去除未转录完的PCR扩增模板，最后用乙醇沉淀，纯化RNA产物，即为阳性对照RNA模板，保存于-70℃超低温冰箱待用。

取5μl体外转录模板RNA，稀释150倍，测定OD₂₆₀值为0.157，根据公式“RNA浓度(ng/μl)＝OD₂₆₀×稀释倍数×40”计换算得到：RNA模板原液浓度为942ng/μl。

再根据单链RNA的拷贝数的计算公式“拷贝数(copies/ml)＝RNA浓度(g/ml)×6.02×10²³(copies/mol)/(340×单链RNA碱基数(g/mol))”计算得到：体外转录模板RNA原液的拷贝数约为1.93×10¹²copies/μl。

实施例2：扩增程序的确定

RT-PCR反应选用的试剂盒为Ag-Path-ID^TM One step RT-PCR Kit(美国Ambion公司产品)，扩增和检测在Roche Lightcycler1.5实时荧光定量PCR仪器上进行。

根据引物、探针的具体特性，仪器上的反应程序在退火延伸条件选择上试验了3种温度和2种时间：逆转录反应条件为45℃10分钟，95℃热启动10分钟后，进入45次二步法PCR循环：95℃5秒→(58/60/62)℃(20/30)秒；各种试剂的加样量分别为每个反应管中含2×RT-PCR缓冲液10μl，10μM的正向引物YFV-FP 1μl，10μM的反向引物YFV-RP 1μl，5μM探针YFV-probe 1μl，25×RT-PCR Enzyme Mix 0.8μl，RNA的量为5μl，用试剂盒提供的水补足到反应总体积20μl，荧光信号采集设在退火延伸阶段。

结果均可见阳性扩增曲线，但考虑到使引物扩增有更好的特异性和缩短反应时间，最后确定扩增程序为：45℃10分钟，95℃10分钟，95℃5秒→60℃20秒45次循环。

实施例3：最佳引物浓度的确定

应用以上扩增程序，先固定探针终浓度为250nM，正、反向引物浓度在250nM、500nM、750nM之间选择。按表2所列浓度加上、下游引物终浓度选择合适的引物浓度。

表2

如图1所示，是最佳引物浓度的确定的实验结果图。以Ct值最小，扩增曲线也较明显的曲线所对应的引物浓度为最佳浓度，见图1。最终确定YFV-FP终浓度500nM，YFV-RP终浓度为750nM。

实施例4：最佳探针浓度的确定

应用以上扩增程序，根据选择好的最佳正、反向引物浓度YFV-FP终浓度500nM，YFV-RP终浓度为750nM，进一步进行探针浓度的确定，在62.5nM、125nM、250nM、500nM、750nM之间选择。图2是最佳探针浓度的确定的实验结果图。以Ct值最小，扩增曲线也最明显的曲线所对应的探针浓度为最佳浓度，见图2。探针浓度由低到高的荧光RT-PCR的Ct值分别为17.48、18.15、18.83、19.89和20.16，各种Ct值基本一致，以750nM终浓度荧光强度最高，同时终浓度250nM也有较高的荧光强度，最终确定YFV探针终浓度250nM。

实施例5：灵敏度、检测限及标准曲线

体外转录的黄热病病毒RNA阳性模板用水进行10倍系列稀释(1.93×10¹¹、1.93×10¹⁰、1.93×10⁹、1.93×10⁸、1.93×10⁷、1.93×10⁶、1.93×10⁵、1.93×10⁴、1.93×10³、1.93×10²、1.93×10¹、1.93×10⁰copies/μl)，经优化好的反应体系检测，结果发现1.93×10¹copies/μl和1.93×10⁰copies/μl的RNA模板虽然有明显的扩增曲线，但Ct值已经大于40，即最低可检测到1.93×10⁰copies/μl稀释度的RNA，最低检测限约为2copies/反应。线性范围有10个数量级(1.93×10²～1.93×10¹¹copies/μl)，根据此10个稀释度模板RNA的检测结果由软件自动生成标准曲线，得标准曲线Y＝-3.419X+45.09，斜率为-3.419，见图3，图3是黄热病病毒荧光RT-PCR检测的标准曲线，根据“E＝10^-1/斜率，％效率＝(E-1)×100％”计算，PCR扩增效率为96.1％。

实施例6：重复性测试

体外转录黄热病病毒RNA模板用水稀释成1.93×10¹⁰、1.93×10⁷、1.93×10³copies/μl高、中、低三种浓度，每种浓度重复检测4次，用优化好的反应体系进行，结果见图4。由图4可见，三组实验结果均具有很好的重复性，组内扩增曲线Ct值差异很小，其均值及标准偏差见表3，表3为实时荧光RT-PCR方法检测黄热病病毒的重复性，数据表明组内扩增曲线Ct值差异很小。

表3

实施例7：模拟染毒蚊标本的检测

从国境口岸监测采集的蚊子，每份各50只，分别每份加5μl、10μl、50μl和150μl浓度为6.4×10⁹copies/μl的黄热病病毒RNA模板，用本发明的检测黄热病病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒检测，按如下步骤：

(1)待测样品的前处理：按每份加1ml Hank’s液进行研磨处理，至所述的待测样品的组织碎片消失，得到研磨混合液。

(2)待测样品RNA的提取：取140μl研磨液用QIAamp Viral RNA Kit提取RNA。

(3)荧光定量核酸扩增体系：在反应管中加入正向引物、反向引物、荧光探针、RT-PCR缓冲液、逆转录反应酶混合物、DEPC水和步骤(2)得到的RNA，混合均匀；其中，正向引物：5’-GTTAGAGRAGAGCCTCCAGGGAA-3’；

反向引物：5’-AGCAAACTGTGCTCRCAGACC-3’；荧光探针：5’-FAM-TGACGCCWGGGAAAGACCGG-BHQ1-3’。其中，R代表A或G；W代表A或T。正向引物的终浓度为500nM。反向引物的终浓度为750nM。荧光探针的终浓度为250nM。

(4)荧光定量核酸扩增：将步骤(3)得到的混合溶液置于荧光定量PCR仪上反应；45℃，10分钟进行逆转录反应，95℃热启动10分钟后，进入扩增循环：95℃5秒，60℃20秒循环45次。

(5)结果判定：无Ct值或Ct＞45，且无明显扩增曲线，判定为阴性；Ct≤40，并有明显扩增曲线，判定为阳性；40＜Ct≤45，重做，若重做结果有明显扩增曲线，则为阳性，否则为阴性。

结果见图5，5μl、10μl、50μl和150μl RNA对应的荧光RT-PCR的Ct值分别为16.02、15.69、15.06和14.47。4组实验的Ct值均≤40，即4份模拟黄热病病毒感染蚊子标本均能扩增到黄热病病毒核酸。

实施例8：灵敏度和特异性测试

用荧光RT-PCR方法检测与黄热病病毒传播途径类似的1型登革病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、基孔肯雅病毒等蚊媒病毒，结果均为阴性，说明本方法有较好的特异性。

为研究荧光定量PCR法与常规PCR在检验黄热病病毒的灵敏度，利用相同的模板，即体外转录黄热病病毒RNA 3-UTR阳性模板用水进行10倍系列稀释(1.93×10¹¹、1.93×10¹⁰、1.93×10⁹、1.93×10⁸、1.93×10⁷、1.93×10⁶、1.93×10⁵、1.93×10⁴、1.93×10³、1.93×10²、1.93×10¹、1.93×10⁰copies/μl)，用

OneStepRT-PCR Kit进行常规RT-PCR，与荧光RT-PCR反应体系一样，10μM正向引物YFV-FP 1μl，10μM反向引物YFV-RP 1.5μl，模板RNA同样加5μl，反应总体积20μl，其余试剂按试剂盒说明，除了逆转录和热启动时间稍长，反应条件也与荧光RT-PCR方法基本一致：50℃30分钟，95℃15分钟；95℃5秒→60℃20秒45次循环。扩增产物经2.0％琼脂糖在1×TAE中电泳80伏40分钟后，利用凝胶成像系统照相，结果见图6，图中可见当RNA浓度为1.93×10⁰copies/μl时已不能得到目的扩增片段，灵敏度约比荧光RT-PCR方法低10倍。图6为黄热病病毒RNA模板系列稀释RT-PCR扩增产物电泳图，模板RNA浓度(单位copies/μl)分别为：1：1.93×10¹¹；2：1.93×10¹⁰；3：1.93×10⁹；4：1.93×10⁸；5：1.93×10⁷；6：1.93×10⁶；7：1.93×10⁵；8：1.93×10⁴；9：1.93×10³；10：1.93×10²；11：1.93×10¹；12：1.93×10⁰；M：100bp Marker。

实施例9：应用本发明试剂盒检测黄热病病毒核酸

黄热病疫苗由广东局保健中心提供。取140μl黄热病疫苗用QIAamp ViralRNA Kit提取RNA，按优化好的程序进行检测，结果表明黄热病疫苗标本能扩增到特异性的黄热病病毒核酸，结果见图7，图7检测得到的Ct值为23.65，Ct值≤40，为阳性结果。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110>广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>一种检测黄热病病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒及其检测方法和应用

<160>3

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

GTTAGAGRAG AGCCTCCAGG GAA                                       23

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

AGCAAACTGT GCTCRCAGAC C                                         21

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

TGACGCCWGG GAAAGACCGG                                           20

Claims (7)

1.一种检测黄热病病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒，包括RT-PCR缓冲液和逆转录反应酶混合物，其特征在于，还包括：

正向引物：5’-GTTAGAGRAGAGCCTCCAGGGAA-3’；

反向引物：5’-AGCAAACTGTGCTCRCAGACC-3’；

荧光探针：5’-FAM-TGACGCCWGGGAAAGACCGG-BHQ 1-3’；

其中，R代表A或G；W代表A或T。

2.一种检测黄热病病毒的荧光定量RT-PCR的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)待测样品RNA的提取；

(2)荧光定量核酸扩增体系：在反应管中加入如权利要求1所述的正向引物、反向引物、荧光探针、RT-PCR缓冲液、逆转录反应酶混合物和所述步骤(1)得到的RNA，混合均匀；

(3)荧光定量核酸扩增：将所述的步骤(2)得到的混合溶液置于荧光定量PCR仪上反应；

(4)结果判定：无Ct值或Ct＞45，且无明显扩增曲线，判定为阴性；Ct≤40，并有明显扩增曲线，判定为阳性；40＜Ct≤45，重做，若重做结果有明显扩增曲线，则为阳性，否则为阴性。

3、根据权利要求2所述的检测黄热病病毒的荧光定量RT-PCR的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的正向引物的终浓度为500nM。

4、根据权利要求2所述的检测黄热病病毒的荧光定量RT-PCR的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的反向引物的终浓度为750nM。

5、根据权利要求2所述的检测黄热病病毒的荧光定量RT-PCR的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的荧光探针的终浓度为250nM。

6、根据权利要求2所述的检测黄热病病毒的荧光定量RT-PCR的方法，其特征在于，所述的步骤(3)的扩增条件为在荧光定量仪上45℃，10分钟进行逆转录反应，95℃热启动10分钟后，进入扩增循环：95℃5秒，60℃20秒循环45次。

7、权利要求1所述的试剂盒在临床、口岸检验黄热病病毒的应用。

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