CN102952900A - 检测黄热病毒的试剂及检测黄热病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测黄热病毒的试剂，它包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP；引物基因序列如下：外引物F3，TGGGAGAGGAGATTCACGT；外引物B3，TCAAGCCGCCAAATAGCC；内引物FIP，CCACGCCTTTCATGGTCTGAGTTTACCAGTGGCACAAAGAGG；内引物BIP，AGACACCGCCTGGGATTTYAGGCAGAGCCAAACACCGTATG。本发明的引物与其它物种的核酸序列无同源，保证了检测方法的特异性。利用上述引物建立的恒温扩增检测黄热病毒的方法具有操作简便，高效、快速、特异的优点；该方法的建立，填补了黄热病毒恒温核酸扩增检测方法的空白，对样本的检测只需1小时左右即可完成，对防止国境口岸防御黄热病毒的传入具有重要意义。

Description

检测黄热病毒的试剂及检测黄热病毒的方法

技术领域

本发明涉及检测黄热病毒的试剂及黄热病毒的检测方法，尤其涉及利用等温扩增技术检测黄热病毒的方法。

背景技术

黄热病毒(Yellow fever virus，YF)属于黄病毒科(Flaviridae)黄病毒属(Flavivirus)成员，是引起人类黄热病的病原体，该病主要流行于非洲及南美洲，经蚊传播的急性传染病，属于国际检疫、监控的3种传染病之一。人对该病毒普遍敏感，不分年龄、性别和种族。黄热病一般呈散发，如果媒介蚊虫大量繁殖，感染能在人群中引起流行，在某些暴发疫情中病死率可高达20％-40％，危害极大。WHO原希望到2015年能在全球彻底消灭黄热病，但根据2009年的估计材料，全球每年仍可出现20.6万病例，其中四分之一病例死亡。随着我国改革开放以及对外交流的增多，特别是我省对外贸易的不断增加，不能排除该病毒随外来人员或媒介传人我国的可能，所以，黄热病毒的检疫需要快速敏感的检测手段。

一般来说，用动物或细胞培养分离病毒最为可靠，但费时，费力，常用的血清学方法对少量病毒抗原的检测敏感度不够高。这些方法已经愈来愈跟不上人类对致病微生物快速、简易、高特异性的鉴定要求。由于核酸检测技术具有快速、灵敏等优势，已经成为了目前病原检测最常用的方法之一。特别是PCR技术，能对微量样本进行快速扩增，但由于PCR反应分为解链、退火和延伸三个阶段而且只有延伸阶段进行DNA扩增，其扩增效率和速度受到很大影响，而且特异性、操作的简易性都存在不足之处，特别是对试剂、昂贵仪器的严格要求和必须专业人员操作等因素，大大地限制了其在基层单位和现场检测中的应用。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)依赖于4条能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，不需要热变性的DNA作为模板，在恒温下就可进行高效、快速、高特异地扩增靶序列。因此该方法具有很高的推广应用价值，不仅适合于科研工作，还可以作为设备条件相对较差的基层单位相关人员进行常规和应急检测的工具。除了进行DNA检测之外，在反应体系中加入逆转录酶后，还可以通过RT-LAMP(逆转录-环介导的等温扩增)方法从模板RNA开始进行检测。逆转录和等温扩增在相同温度下一步完成，很大程度上提高了检测的灵敏度并节省了反应时间。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种检测黄热病毒的试剂，可以用于快速准确地检测黄热病毒，从而能够建立适于口岸卫生检疫的黄热病毒检测方法。为此，本发明采用以下技术方案：它包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP；引物基因序列如下：

外引物F3:TGGGAGAGGAGATTCACGT；

外引物B3:TCAAGCCGCCAAATAGCC；

内引物FIP:

CCACGCCTTTCATGGTCTGAGTTTACCAGTGGCACAAAGAGG；

内引物BIP:

AGACACCGCCTGGGATTTYAGGCAGAGCCAAACACCGTATG。

本发明另一个目的是提供一种恒温扩增检测黄热病毒的方法，可以快速准确地检测黄热病毒。为此，本发明采用以下技术方案：

所述方法的反应体系为25μl：20mmol/l Tris-HCl，10mmol/l KCl，10mmol/l(NH4)₂SO4，8mmol/l MgSO₄，0.1％Tween-20，外引物与内引物浓度比例为1:8，外引物F3与B3均为5pmol/l，内引物BIP与FIP 40pmol/l，0.8mol/l甜菜碱，dNTP 1.4mmol/l，10UAMV逆转录酶，8U Bst-DNA聚合酶，5μlRNA模板，补足DEPC-H₂O至25μl。反应温度选择63℃。

所述方法的步骤为：将阴性对照、阳性对照和待测样本分别按上述反应体系孵育63℃1小时进行反应，其中阴性对照采用双蒸水，阳性对照采用黄热病毒疫苗株；反应结束后，进行以下三种试验中的至少一种：

1）、取扩增产物观察电泳结果，阳性对照孔产生阶梯状的条带，阴性对照孔则没有条带产生，检测样本孔中如产生阶梯状条带则含有黄热病毒，反之没有黄热病毒；

2）、反应结束后，反应管离心6000rpm，3分钟，观察结果，阳性对照管可见白色沉淀，阴性对照管没有产生沉淀，样本管中如产生白色沉淀则含有黄热病毒，反之没有黄热病毒；

3）、在反应体系中加入1.25μl荧光染料SYBR Green I，紫外灯下观察荧光强度的变化，阳性对照产生强烈绿色荧光，阴性对照荧光强度没有变化，样本管中如产生强烈绿色荧光则含有黄热病毒，反之没有黄热病毒。

本发明从GenBank下载黄热病毒序列，共选择33株1940年～2010年黄热病毒以及疫苗株黄热病毒的E基因序列，用DNAStar软件对黄热病毒E基因序列进行比对，根据目标基因中的6个特异性区域设计处上述4条引物，引物与GenBank数据库进行BLAST检索，和其它物种的核酸序列无同源，保证了检测方法的特异性。利用上述引物建立的恒温扩增检测黄热病毒的方法具有操作简便，高效、快速、特异的优点；该方法的建立，填补了黄热病毒恒温核酸扩增检测方法的空白，对样本的检测只需1小时左右即可完成，对防止国境口岸防御黄热病毒的传入具有重要意义。

附图说明

图1为黄热病毒等温扩增的特异性试验结果，M为marker,1为阴性对照，2为阳性对照，3为黄热疫苗株，4为乙脑病毒，5为登革热病毒。

图2为黄热病毒不同温度条件等温扩增试验结果，1为63℃，2为61.2℃、3为64.9℃、4为59.4℃、5为66.2℃、6为58.0℃、7为57.1℃。

图3为黄热病毒等温扩增的灵敏度试验结果,1为marker，2为6.6ng，3为6.6×10^-1ng，4为6.6×10^-2ng，5为6.6×10^-3ng，6为6.6×10^-4ng，7为6.6×10^-5ng，8为6.6×10^-6ng。

具体实施方式

实施例1黄热病毒的检测

1．引物设计

从GenBank下载代表性的黄热病毒序列，共选择33株1940年～2010年黄热病毒以及疫苗株黄热病毒的E基因序列，用DNAStar软件对黄热病毒E基因序列进行比对，根据目标基因中的6个特异性区域设计4条引物，设计一套引物（F3,B3，FIP，BIP），分别是外引物B3、外引物F3、内引物FIP、内引物BIP。引物基因序列如下：

外引物F3:TGGGAGAGGAGATTCACGT；

外引物B3:TCAAGCCGCCAAATAGCC；

内引物FIP:

CCACGCCTTTCATGGTCTGAGTTTACCAGTGGCACAAAGAGG；

内引物BIP:

AGACACCGCCTGGGATTTYAGGCAGAGCCAAACACCGTATG。

2.病毒RNA的提取

将黄热病毒减毒活疫苗按照说明书要求用生理盐水溶解，吸取200μl按试剂盒说明书用Roche试剂盒High Pure Viral Nucleic Acid Kit提取病毒RNA，溶于100μl无RNase水中，－70℃保存。

3.RT-LAMP的反应体系与反应条件

RT-LAMP反应体系如下：20mmol/l Tris-HCl，10mmol/l KCl，10mmol/l(NH4)₂SO4，8mmol/l MgSO4，0.1％Tween-20，外引物与内引物浓度比例为1:8，外引物F3与B3均为5pmol/l，内引物BIP与FIP 40pmol/l，0.8mol/l甜菜碱，dNTP 1.4mmol/l，10UAMV逆转录酶，8U Bst-DNA聚合酶，5μlRNA模板，补足DEPC-H₂O至25μl，混匀，在63℃恒温反应1h后80℃5min终止反应。

4．反应温度的优化

进行Real-time RT-LAMP时在反应体系中加入1.25μl SYBR Green I。采用MJ Research Opticon 2荧光定量PCR仪，温度梯度57.1～67℃56s，读板4s，反应时间共1h。比较不同温度对反应的影响，见图2，在61-65℃之间，63℃为最佳的反应扩增温度。

5．特异性试验

由于黄热病毒基因序列与其他种属病毒基因序列差异较大，黄热病毒为虫媒病毒黄病毒科黄病毒属病，将登革病毒、乙型脑炎病毒等黄病毒属病毒与黄热病毒疫苗用DNA抽提试剂盒根据说明书提取DNA，扩增反应体系为20mmol/lTris-HCl，10mmol/l KCl，10mmol/l(NH4)₂SO4，8mmol/l MgSO4，0.1％Tween-20，外引物与内引物浓度比例为1:8，外引物F3与B3均为5pmol/l，内引物BIP与FIP40pmol/l，0.8mol/l甜菜碱，dNTP 1.4mmol/l，10U AMV逆转录酶，8U Bst-DNA聚合酶，5μlRNA模板，补足DEPC-H₂O至25μl，混匀，在63℃恒温反应1h后80℃5min终止反应。反应电泳结果见图1。反应结果说明除黄热病毒核酸出现典型的阶梯状条带的阳性结果外，阴性对照、登革病毒与乙型脑炎病毒核酸的检测结果均为阴性；反应结束后，反应管离心6000rpm，3分钟，观察结果，黄热病毒疫苗管中可见白色沉淀，登革病毒、乙型脑炎病毒及阴性对照管没有产生沉淀；在反应体系中加入1.25μl荧光染料SYBR Green I，紫外灯下观察荧光强度的变化，黄热病毒疫苗管产生强烈绿色荧光，登革病毒、乙型脑炎病毒及阴性对照荧光强度没有变化，显示了该方法具有很好的特异性。

6．灵敏度试验，参照图3。

将提取的黄热病毒RNA，通过GE公司NanoVue微型光度计测量提取的黄热病毒RNA浓度为0.033μg/ul。将黄热病毒基因组RNA进行10倍递进稀释，取2μl作为模板加入反应液中，在63℃恒温条件下，反应60min。取2μl反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，2-7泳道均出现梯状条带，表示出现有Lamp扩增反应。可以判定本方法的检测极限约为6.6×10^-5ng。

实施例2，出入境发热人员黄热病毒的检测

采用机场口岸入境的发热病人血清23人份，利用RNA抽提试剂盒根据说明书提取DNA，RT-LAMP反应体系如下：20mmol/l Tris-HCl，10mmol/l KCl，10mmol/l(NH4)₂SO4，8mmol/l MgSO₄，0.1％Tween-20，外引物与内引物浓度比例为1:8，外引物F3与B3均为5pmol/l，内引物BIP与FIP 40pmol/l，0.8mol/l甜菜碱，dNTP 1.4mmol/l，10UAMV逆转录酶，8U Bst-DNA聚合酶，5μlRNA模板，补足DEPC-H₂O至25μl。以灭菌双蒸水为阴性对照，以黄热病毒疫苗株为阳性对照。反应程序为63℃，60分钟。23例发热病人血清样本反应结果离心6000rpm，3分钟未见沉淀，加入荧光染料SYBR Green I紫外灯下没有绿色荧光产生，产物电泳没有出现特异的阶梯状条带，黄热病毒检测结果为阴性。

<110>  浙江国际旅行卫生保健中心

 

<120>  检测黄热病毒的试剂及检测黄热病毒的方法

 

<130> 

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

tgggagagga gattcacgt                                                  19

 

 

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

tcaagccgcc aaatagcc                                                   18

 

 

<210>  3

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

ccacgccttt catggtctga gtttaccagt ggcacaaaga gg                        42

 

 

<210>  4

<211>  41

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

Claims (2)

1.一种等温扩增检测黄热病毒的试剂，其特征在于：它包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP；引物基因序列如下：

外引物F3:TGGGAGAGGAGATTCACGT；

外引物B3:TCAAGCCGCCAAATAGCC；

内引物FIP:

CCACGCCTTTCATGGTCTGAGTTTACCAGTGGCACAAAGAGG；

内引物BIP:

AGACACCGCCTGGGATTTYAGGCAGAGCCAAACACCGTATG。

2.一种等温扩增检测黄热病毒的方法，其特征在于：

反应体系如下：20mmol/l Tris-HCl，10mmol/l KCl，10mmol/l(NH₄)₂SO₄，8mmol/l MgSO₄，0.1％Tween-20，权利要求1所述的外引物F3与外引物B3浓度均为5pmol/l，权利要求1所述的内引物BIP与内引物FIP浓度均为40pmol/l，0.8mol/l甜菜碱，dNTP 1.4mmol/l，10U AMV逆转录酶，8U Bst-DNA聚合酶，5μl RNA模板，补足DEPC-H₂O至25μl；

所述方法的步骤为：将阴性对照、阳性对照和待测样本分别按上述反应体系孵育63℃1小时进行反应，其中阴性对照采用双蒸水，阳性对照采用黄热病毒疫苗株；反应结束后，进行以下三种试验中的至少一种：

1）、取扩增产物观察电泳结果，阳性对照孔产生阶梯状的条带，阴性对照孔则没有条带产生，检测样本孔中如产生阶梯状条带则含有黄热病毒，反之没有黄热病毒；

2）、反应结束后，反应管离心6000rpm，3分钟，观察结果，阳性对照管可见白色沉淀，阴性对照管没有产生沉淀，样本管中如产生白色沉淀则含有黄热病毒，反之没有黄热病毒；

3）、在反应体系中加入1.25μl荧光染料SYBR Green I，紫外灯下观察荧光强度的变化，阳性对照产生强烈绿色荧光，阴性对照荧光强度没有变化，样本管中如产生强烈绿色荧光则含有黄热病毒，反之没有黄热病毒。