KR102168400B1 - 실시간 중합효소 연쇄반응과 융해곡선 분석법을 이용한 구강암 관련 hpv 스크리닝 및 16번 타입 정성 검사 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 구강암 관련 인유두종바이러스(HPV) 검출용 조성물 및 이를 이용한 인유두종바이러스 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 구강암의 발병과 밀접하게 관련된 HPV 타입 6, 31, 33, 35, 52 및 58번으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 HPV 검출용 조성물 및 이를 이용한 HPV 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물 또는 방법을 이용하면 구강암과 관련성이 높은 인유두종바이러스(HPV) 타입 16, 31, 33, 35, 52 및 58번으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 대한 정성분석; 및 구강암과 관련된 가장 중요한 HPV 타입 16번에 대한 정성 및 정량 분석을 동시에 수행할 수 있으므로, 매우 높은 신뢰성으로 신속하고 용이하게 구강암 임상진단이 가능하다.

Description

실시간 중합효소 연쇄반응과 융해곡선 분석법을 이용한 구강암 관련 HPV 스크리닝 및 16번 타입 정성 검사 방법{Screening and qualitative methods of HPV types and type 16 related to oral cencer using Real-time PCR and Melting Curve Analysis}
본 발명은 구강암 관련 인유두종바이러스(HPV) 검출용 조성물 및 이를 이용한 인유두종바이러스 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 구강암의 발병과 밀접하게 관련된 HPV 타입 6, 31, 33, 35, 52 및 58번으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 HPV 검출용 조성물 및 이를 이용한 HPV 검출방법에 관한 것이다.
구강암은 입 안에 발생하는 악성종양으로 편평상피세포암, 소타액선암, 육종, 림프종, 흑색종 등이 있으며 이중 구강 내 평편상피세포암이 약 90%로 가장 높음 발별율을 보인다. 세계보건기구에 따르면 매년 전 세계적으로 60만명 이상의 구강암 환자가 발생하고 있으며 30만명에 달하는 사망자가 나오고 있다. 구강암은 발병 후 5년 안에 40% 정도가 사망할 정도로 치염적인 암이며 초기증상이 뚜렷하지 않아 조기진단이 어려우며, 조기진단으로 초기에 발견할 경우 80% 이상의 치료율을 기대할 수 있다.
20년 전까지 구강암의 최대 유발 요인은 흡연과 음주였으나, 구강성교가 원인으로 추정되는 구강암 발병 환자가 최근 10년 사이에 급속도로 증가하고 있으며 그 원인은 자궁경부암의 원인으로 밝혀진 인유두종바이러스(HPV)로 확인되었다. 인유두종바이러스(HPV)는 자궁경부암의 중요한 원인 인자로 알려져 있으며, 현재까지 알려진 100여종의 바이러스 타입이 알려진 가운데 16번 타입과 18번 타입이 전 세계적으로 70% 이상의 자궁경부암에서 발견된다. 이외에도 발암성 인유두종바이러스 타입으로는 31번, 33번, 35번, 39번, 45번, 51번, 52번, 56번, 58번, 59번, 66번, 68번, 69번, 73번 등이 이에 속하며 16번과 18번을 포함한 발암성 인유두종바이러스는 자궁경부암 환자의 99.7% 이상에서 발견된다고 보고되어 있다.
2005년 시행한 국제암연구기관(IARC)의 메타분석 결과, 구강암의 35.6%에서 인유두종바이러스(HPV)가 발견되었으며 그 중 87%가 16번 타입으로 확인되었다. 연구에 따르면 미국에서 발견되는 구강암 환자의 65~70%에서 인유두종바이러스(HPV)가 발견되었으며 2020년에는 인유두종바이러스(HPV)와 관련된 가장 흔한 암으로 구강암이 자궁경부암을 앞지를 것으로 예상되고 있다. 제28회 국제 HPV 학회 발표에 따르면 구강암과 구인두암이 HPV 16번 타입에 속하는 알파속 9 유전자형(type 16, 31, 33, 35, 52, 58)과 밀접한 관련이 있다는 연구결과가 발표되었으며, 구강암과 HPV 16번 타입과의 깊은 연관성을 보고하고 있는 문헌들이 검색이 되고 있다(Oral Oncology 69 (2017) 56?61).
인유두종바이러스(HPV)로 인한 암환자는 화학적 치료 및 방사선 치료 효율이 좋고 암의 전이와 재발율이 낮은 특성을 보이며 바이러스 음성 암환자와는 다른 임상적 양상을 보이기 때문에 구강암의 새로운 원인 인자로 인식되는 인유두종바이러스(HPV)에 대한 진단의 중요성이 강조되고 있다.
본 발명은 상기한 배경에서 안출된 것으로서, 본 발명자는 구강암의 발병과 관련된 인유두종바이러스(HPV) 타입 16번, 31번, 33번, 35번, 52번 및 58번에 대한 스크리닝과 동시에 타입 16번을 단독으로 정성 및 정량하기 위해 암유발과 관련이 깊은 E6E7 유전자를 기반으로 특이적인 프라이머 세트와 형광 프로브를 설계하였고, 상기 프라이머, 프로브 및 이를 포함하는 조성물 또는 키트를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응과 융해곡선 분석법을 실시함으로써 구강암과 관련된 인유두종바이러스(HPV)를 높은 특이도 및 민감도로 스크리닝 할 수 있을 뿐만 아니라, HPV 타입 16번의 단독 정성분석을 동시에 진행할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 및 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 인유두종바이러스(HPV) 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인유두종바이러스 검출용 조성물을 포함하는 구강암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 및 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 인유두종바이러스(HPV) 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 임상시료로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 얻어진 DNA를 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 및 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 유전자를 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 분석하여 인유두종바이러스(HPV)를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 및 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 인유두종바이러스(HPV) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 인유두종바이러스 검출용 조성물을 포함하는 구강암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 및 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 인유두종바이러스(HPV) 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 임상시료로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 얻어진 DNA를 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 및 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 유전자를 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 분석하여 인유두종바이러스(HPV)를 검출하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 및 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 인유두종바이러스(HPV) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어인 “프라이머”란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP (deoxynucleoside triphospate)의 존재하에서 DNA합성을 개시할 수 있다.
프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명에서 상기 서열번호 1 내지 4로 표현되는 각 프라이머는 각각 서열 상동성이 95% 이상인 염기서열을 포함하는 개념이다. 예를 들어, 프라이머가 20bp인 경우, 20bp 중 2개 이상 틀리면 용융 온도(melting temperature)의 감소가 5도 이상이 되므로 결과가 좋지 않게 나타나지만, 1개만 틀릴 경우에는 PCR 과정에서 열처리(annealing) 온도를 약간 내려 실험 할 경우 동등한 결과를 얻을 수 있기 때문이다.
본 발명에서 사용된 용어 "인유두종바이러스(HPV)"는 8kb로 이루어진 환상의 이중나선 바이러스로서, 유전자의 발현 시기에 따라 크게 초기 유전자 (early gene)와 후기 유전자(late gene)로 구분된다. 약 4.5kb의 초기 유전자인 E1, E2, E3, E4, E5, E6 및 E7에 대해서 각각 그 기능이 공지되어 있고, 2.5kb인 후기 유전자는 L1, L2는 각각 주외피 단백질 및 부외피 단백질을 코딩하는 유전자로 알려져 있다. 최근 분자 생물학적 기법이 발달함에 따라 HPV의 게놈 염기서열이 밝혀지고 있는데, HPV 는 E6, E7 및 L1 유전자의 ORF (Open Reading Frame) 서열의 차이에 따라 여러 타입으로 구분되고 있다. 즉, ORF의 뉴클레오티드 서열이 10% 다른 경우에는 새로운 타입(type)으로 정의되고, 2% 이상 10% 미만으로 다른 경우에는 아형 (subtype)으로, 2% 미만의 차이를 보이는 경우에는 변이체 (variant)로 정의된다. 이와 같은 구분에 따라 현재까지 HPV는 120여 종 이상의 타입이 알려져 있다. 바람직하게 본 발명의 HPV 검출용 조성물은 상기 E6, E7 유전자를 검출함으로써 HPV를 검출할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 1로 표시되는 프라이머는 HPV 타입 16 및 35의 E6E7 유전자 부위를 특이적으로 증폭할 수 있으며, 상기 서열번호 2로 표시되는 프라이머는 HPV 타입 31, 33 및 58번의 E6E7 유전자 부위를 특이적으로 증폭할 수 있으며, 상기 서열번호 3으로 표시되는 프라이머는 HPV 타입 52번의 E6E7 유전자 부위를 특이적으로 증폭할 수 있다. 상기 서열번호 4로 표시되는 프라이머는 상기 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 각 정방향 프라이머에 공통적으로 역방향(reverse) 프라이머로서 작용할 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 조성물은 각각이 검출할 수 있는 구강암 관련 HPV 타입만을 특이적으로 증폭하며, 구강암과 관련이 없는 타입의 HPV 및 다양한 구강 상재균의 유전자도 전혀 증폭하지 않는 것을 확인하여 그 특이도가 매우 우수함을 확인하였다.
더 나아가, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 1 내지 4의 프라이머를 모두 포함하는 조성물은 상호간에 간섭작용을 일으키지 않고 구강암과 관련이 있는 HPV 타입 16번, 31번, 33번, 35번, 52번 및 58번만을 매우 높은 특이도로 모두 검출할 수 있는 것으로 확인이 되었다.
따라서, 본 발명의 상기 HPV 검출용 조성물은 검출하고자 하는 HPV 타입에 따라 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머를 조합하여 활용할 수 있다. 즉, 서열번호 1 및 4; 서열번호 2 및 4; 서열번호 3 및 4; 서열번호 1, 2 및 4; 서열번호 1, 3 및 4; 서열번호 2, 3 및 4; 또는 서열번호 1, 2, 3 및 4를 포함하는 조성물로 조합하여 HPV를 검출할 수 있다.
가장 바람직하게는 본 발명의 상기 HPV 검출용 조성물은 구강암의 발병과 매우 높은 관련성을 갖는 HPV 타입 16번, 31번, 33번, 35번, 52번 및 58번을 동시에 검출할 수 있도록 서열번호 1 내지 4를 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 조성물은 구강암의 발명과 매우 밀접한 관련성을 갖는 HPV 타입 16, 31, 33, 35, 52 및 58번으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 하기 때문에 구강암에 걸렸거나 또는 구강암 발병 가능성이 있는 개체를 정확하게 구분할 수 있는 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 상기 조성물은 서열번호 5의 프로브가 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 상기 프로브는 해당 염기서열의 5'과 3'말단에 각각 검출에 이용되는 표지를 포함 할 수 있으며, 이러한 표지로는 형광단 또는 소광체가 각각 5'과 3' 말단에 표지될 수 있다. 이에 따라, 프로브에 형광단과 소광체가 서로 결합한 형태로 존재할 때에는 상호 간섭에 따라 발광이 억제되고, 중합효소 연쇄반응을 통하여 프로브가 분해가 이루어지면 프로브에 표지된 형광단과 소광체간의 간섭이 사라져 발광을 하게 된다. 이와 같은 반응으로 시료로부터 HPV 유무를 판단 할 수 있다. 상기 5'말단에 표지될 수 있는 형광단은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 형광물질이 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 플루오레세인, 6-카르복시플루오레세인, 핵사크로로-6-카르복시플루오레세인, 테트라크로로-6-카르복시플루오레세인, VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노 나프탈렌-1-술폰산, 쿠마린 및 이의 유도체, 시아닌-5, 루시퍼 옐로우, 텍사스 레드, 테트라메틸로다민, 야키마 옐로우, 칼 플루오르레드 610 등이 사용될 수 있다. 상기 3' 말단에 표지될 수 있는 소광체 또한 당해 분야에서 통상적으로 사용이 되는 소광제는 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 테트라메틸로다민, 6-카르복시테트라메틸-로다민, BHQ-1, 2, 3, 4'-벤조산, 4-다이메틸아미노페닐 아조페닐-4'-말레이미드 등이 사용될 수 있다. 이처럼 형광물질이 표지된 프로브를 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하고 증폭된 산물을 실시간으로 모니터링 할 수 있어 DNA 와 RNA의 정확한 정량이 가능하고, 또한 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하며 정확한 진단이 가능하다는 이점을 갖는다.
본 발명에서 상기 서열번호 5의 프로브는 HPV 타입 16번에 상보적인 서열을 포함하여 HPV 타입 16에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 HPV 검출용 조성물에 상기 서열번호 5의 프로브가 추가될 경우 HPV 타입 16에 대한 추가적인 정성 및 정량이 가능할 수 있다.
바람직하게는, 상기 서열번호 5의 프로브가 HPV 타입 16번에 특이적인 서열을 포함하고 있기 때문에 HPV 타입 16번을 증폭할 수 있는 서열번호 1의 프라이머를 포함하는 조성물에 상기 서열번호 5의 프로브가 추가될 수 있다. 즉, 서열번호 1 및 4의 프라이머; 서열번호 1, 2 및 4의 프라이머; 서열번호 1, 3 및 4의 프라이머; 또는 서열번호 1, 2, 3 및 4의 프라이머를 포함하는 조성물에 상기 서열번호 5의 프로브가 추가되는 것이 바람직하다.
서열번호 1 및 4의 프라이머; 서열번호 1, 2 및 4의 프라이머; 서열번호 1, 3 및 4의 프라이머; 또는 서열번호 1, 2, 3 및 4의 프라이머를 포함하는 조성물에 상기 서열번호 5의 프로브가 추가된 조성물은 HPV 타입 16, 31, 33, 35, 52 및 58번으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 구강암 발병과 가장 밀접한 관련을 갖는 타입 16의 존재 유무 및 그 양까지 동시에 검출할 수 있다.
본 발명의 상기 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 이러한 핵산 서열은 프라이머 또는 프로브의 기본 성질을 변화시키지 않는 범위에서 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속,철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명의 조성물은 또한 위양성 및 위음성을 최소화 하기 위하여 내재 표준물질로서 추가적인 프라이머 서열 또는 프로브 서열을 추가로 포함할 수도 있다. 본 발명의 HPV 검출용 조성물을 이용하는 경우, 단일 반응용기 (tube) 내에서 목적 유전자와 내재 표준물질의 증폭 여부를 실시간으로 검출할 수 있다.
그 외에도 본 발명의 HPV 검출용 조성물은 증폭 반응에 필요한 구성요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 포함될 수 있는 구성 요소는, 증폭 반응에 있어서 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질이라면 제한 없이 사용가능하며, 예를 들면 완충용액, DNA 중합 효소, dNTP 및 멸균 증류수 등이 있으나, 상기 예들에 의해 추가될 수 있는 구성요소가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 검출은 융해곡선 분석법(Melting curve analysis)에 의한 것일 수 있다. 상기 용어 "융해(melting)"은 이중 가닥의 DNA를 단일 가닥의 DNA로 해리시키는 것을 말한다. 융해는 이중 가닥의 DNA를 포함하는 시료를 가온하여 수행될 수 있다. 융해는 예를 들면 50℃ 내지 95℃에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 1 내지 4의 프라이머 및 서열번호 5의 프라이머를 포함하는 조성물은 융해곡선 분석법에 활용되어 HPV 타입 16, 31, 33, 35, 52 및 58번으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 정성 검출이 가능한 것을 확인하였다.
한편, 본 발명의 일실시예에 따르면 본 발명의 상기 프라이머 및 프로브 세트는 구강암을 유발하지는 않지만, 자궁경부암의 발병과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려진 HPV 타입 18 등에는 전혀 결합하지 않으며, 오로지 구강암 유발과 관련된 타입 16, 31, 33, 35, 52 및 58번의 인유두종바이러스를 매우 높은 특이도와 민감도로 검출할 수 있기 때문에 구강암 진단 및 구강암 발병 가능성 예측 분야에서 매우 유용하게 활용이 될 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 구강암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 및 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 인유두종바이러스(HPV) 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 키트는 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 및 서열번호 4의 프라이머 이외에 PCR 조성물에 사용되는 성분을 사용할 수 있으며, 이러한 조성물의 성분의 비제한적인 예로는 반응용 완충용액, dNTP, Mg2+이온, DNA 중합효소가 포함될 수 있다.
상기 반응용 완충용액은 1∼10mM TrisHCl, 10∼40mM KCl(pH 9.0)을 사용할 수 있으며, 상기 dNTP는 dATP, dTTP, dGTP, dCTP 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 키트에는 실험상의 편의, 안정화 및 반응성 향상을 위해 안정화제 및/또는 비반응성 염료 등를 포함할 수 있다.
상기 비반응성 염료 물질이란 중합효소연쇄반응에 영향을 미치지 않는 물질로부터 선택되어져야 하며, 중합효소연쇄반응 산물을 이용한 분석이나 식별을 위해 사용되는 것을 목적으로 한다. 이러한 조건을 만족시키는 물질로는 로다민, 탐라, 락스, 브로모페놀 블루, 크실렌 시아놀, 브로모크레졸 레드, 크레졸 레드 등의 수용성 염료로 사용될 수 있다. 상기 비반응성 염료 물질은 조성물 전체 중량 대비 0.0001∼0.01중량%의 함량으로 포함될 수 있으며, 0.001∼0.005중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 조성물 전체 중량 대비 0.01중량% 초과의 함량으로 첨가되는 경우 중합효소연쇄반응 시 고농도의 수용성 염료가 반응 저해제로 작용될 수 있는 문제점이 있다.
또한, 상기 다가알코올류는 본 발명의 키트 구성성분을 보다 안정화시키기 위한 안정화 물질로 사용될 수 있으며, 글루코스, 글리세롤, 만니톨, 갈락시톨, 글루시톨, 솔비톨 중 하나 이상의 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 다가알코올류는 10∼500mM의 함량으로 포함될 수 있으며, 50∼300mM의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 만일, 다가알코올류가 500mM를 초과하게 되면 수용성 중합체 자체의 용해도로 인해 수용액으로 용해하기 어려우며, 높은 점도로 인해 충분한 혼합이 이루어지기 어렵고, 부피가 필요 이상으로 커지며, 중합효소연쇄반응을 위해 멸균 증류수로 용해시 용해가 쉽게 되지 않는다. 또한, 중합효소연쇄반응시 고농도의 수용성 중합체가 반응 저해제로 작용할 수 있는 문제점이 있다. 그리고, 10mM 미만이면 대상효소와 표면 물분자를 충분히 코팅하여 보호할 수 없기 때문에 효율적인 효소의 안정화 효과를 기대하기 어려우며 또한, 용액의 점도가 너무 낮아 튜브 바닥면 전체에 넓게 퍼지면서 이상적인 형태로 건조되지 못하는 문제점과 효소가 충분히 보호되지 못하는 문제점이 있다. 본 발명에서는 다가알코올류 이외에도 안정화 물질로서 젤라틴, 소형청 알부민, Thesit, PEG-8000을 사용하는 것이 가능하다.
상기 키트 구성성분은 액상 형태로 제공될 수 있으며, 안정성, 보관의 간편성 및 장기 보관성을 증가시키기 위하여 건조된 상태인 것이 바람직하다. 상기 건조는 일반적인 상온건조, 가온건조, 동결건조, 감압건조와 같은 공지의 건조 방법에 의해 수행될 수 있으며, 조성물의 성분이 손실되지 않는 한, 임의의 건조 방법은 모두 사용가능하다.
본 발명에서는 또한 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다. 또한, 본 발명에 이용되는 중합효소는 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 전술한 바와 같이 서열번호 5의 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 임상시료로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 얻어진 DNA를 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 및 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 유전자를 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 분석하여 인유두종바이러스(HPV)를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계에서 임상시료란 HPV의 서열이 포함되어 있을 것이라고 예상되는 시료라면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 개체로부터 수득한 타액 또는 구강 내에서 채취된 샘플일 수 있으며, 상기 DNA를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. etal., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. etal., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology,John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)).
본 발명에서 상기 개체란 인간을 포함하는 영장류, 말, 양, 돼지, 염소, 개 고양이, 설치류 및 다양한 종류의 조류를 모두 포함하는 개념이며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
상기 (b) 단계에서 증폭은 당업계에 잘 알려져 있는 것으로 표적 핵산을 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이 적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증가시키는 과정을 의미한다. 본 발명에서 상기 증폭은 당업계에서 통상적으로 사용될 수 있는 핵산 서열을 증폭시킬 수 있는 방법이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 PCR 반응일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 실시간 중합효소 연쇄반응 (real time PCR)일 수 있다.
이러한 실시간 중합효소 연쇄반응 분석은 시판되고 있는 실시간 중합효소 연쇄반응 기기를 사용하여 수행될 수 있는 바, 실시간 중합효소 연쇄반응 기기는 예를 들어, SLAN real time PCR detectionsystem(LG 생명과학, 한국), LightCycler 96/480 (Roche, Germany), ABI 7500 fast/7500/PRISMTM 7000/7700(Applied Biosystems,USA), iCyclerTM/CFX96TM(Bio-Rad, USA), Rotor-GeneTM(Corbett, Australia), OpticonTM(PharmaTech, USA) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 증폭이 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR)인 경우에는 상기 (b) 단계 이후에 상기 증폭산물을 융해(melting)시켜 융해곡선(melting curve)을 얻는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 (b) 단계의 프라이머 세트는 전술한 바와 같으며, 그를 구성하는 각 프라이머 사이에 간섭현상 없이 상기의 HPV 유전자를 실시간 중합효소 연쇄반응에 의하여 성공적으로 증폭하는데 사용할 수 있다.
따라서 상기 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시하는 경우, 매우 신뢰성 있고, 신속하게 구강암과 관련이 깊은 HPV 타입 16번, 31번, 33번, 35번, 52번 및 58번으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 정성 검출이 가능하다.
본 발명의 상기 (c) 단계에서 증폭 산물을 분석하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 제한없이 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 증폭이 일반적인 중합효소 연쇄반응인 경우에는 전기영동을 통해 아가로스겔 상에서 증폭 산물의 유무를 확인할 수 있으며, 상기 증폭이 실시간 중합효소 연쇄반응인 경우에는 상기 융해곡선을 분석하여 해당 melting peak를 분석함으로써 증폭 산물의 유무를 확인할 수 있다.
한편, 본 발명의 상기 HPV를 검출하는 방법은 상기 (b) 단계에서 서열번호 5의 프로브를 추가로 포함하여 유전자를 증폭하며, 상기 (c) 단계에서 HPV 타입 16번의 정성 또는 정량 분석을 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법일 수 있다.
이 경우, 상기 임상시표에서 구강암과 관련이 깊은 HPV 타입 16번, 31번, 33번, 35번, 52번 및 58번으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 정성 검출과 동시에 타입 16번에 대한 단독 정성 및 정량 검출이 가능할 수 있다. 이러한 스크리닝 정성분석 및 16번 타입 단독 정성 또는 정량분석을 융해곡선 분석법을 활용하여 동시에 확인함으로써 더욱 정밀하게 구강암 관련 HPV에 대한 임상진단 결과를 확인할 수 있 점에서 매우 유용하다.
상기한 바와 같이, 구강암과 관련된 인유두종바이러스(HPV) 타입들만 특이적으로 검출하면서, 실시간 중합효소 연쇄반응 방법 및 융해곡선 분석법에 의해 우수한 민감도로 각각의 미생물을 검출할 수 있는 조성물은 현재까지 보고된 바가 없다.
본 발명에 따른 조성물 또는 방법을 이용하면 구강암과 관련성이 높은 인유두종바이러스(HPV) 타입 16, 31, 33, 35, 52 및 58번으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 대한 정성분석; 및 구강암과 관련된 가장 중요한 HPV 타입 16번에 대한 정성 및 정량 분석을 동시에 수행할 수 있으므로, 매우 높은 신뢰성으로 신속하고 용이하게 구강암 임상진단이 가능하다.
도 1은 본 발명의 조성물의 검출 민감도를 확인하고자 인유두종 바이러스 16번 타입(HPV type 16) E6E7 gene clone에 대한 농도별 실시간 중합효소 연쇄반응 결과를 나타내고(A), 결과의 직선성을 확인한 결과(B) 이다.
도 2는 본 발명의 조성물을 이용하여 구강암 관련 인유두종바이러스(HPV) 각 타입에 대한 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행한 후 EvaGreen 형광물질을 이용하여 융해곡선을 분석(A)하고, 이에 따른 melt peak를 도출한 결과(B)이다.
도 3 내지 도 6은 임상샘플에서 수득된 DNA를 본 발명의 조성물을 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 진행하고(A), EvaGreen 형광물질을 이용하여 융해곡선을 도출한 결과(B)이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험준비>
1. 프라이머 및 프로브의 제작
본 발명에서 사용하는 프라이머와 프로브는 미국립보건원 산하 NCBI에서 운영하는 유전자 은행(www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록되어 있는 Genebank 염기서열을 Hitachi 소프트웨어사의 DNAsis프로그램을 이용하여 분석한 다음 그 염기서열을 결정하고, 이를 다시 BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)로 분석하여 구강암 관련 인유두종바이러스(HPV) 타입(타입 16, 31, 33, 35, 52 및 58번)만을 증폭할 수 있는 프라이머 염기서열임을 확인하였다.
인유두종바이러스(HPV) 타입 30개의 E6E7 염기서열을 다중염기서열계층분석 프로그램인 MultAlin(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)을 이용하여 분석한 결과 구강암 관련 인유두종바이러스 타입 이외의 다른 타입들은 설계된 프라이머와 프로브의 염기서열과 상보적이지 않음을 확인하였다.
본 발명에서 설계된 프라이머 및 프로브의 서열을 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
Figure 112018090413684-pat00001
Figure 112018090413684-pat00002
또한, 본 발명에서 사용하는 프라이머와 프로브는 Genebank의 entrez에서 인유두종바이러스(HPV)의 암 유발과 관련이 깊은 E6E7 유전자 서열를 확인한 후 다중핵산염기서열 분석 프로그램 clustal W2를 이용하여 보존 부위를 분석한 다음 그 염기서열을 결정하고, 이를 다시 BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)로 분석하여 구강암 관련 인유두종바이러스(HPV) 타입(타입 16, 31, 33, 35, 52 및 58번)만을 증폭할 수 있는 프라이머 염기 서열임을 확인하였다.
2. 프라이머의 합성
상기 “실험준비 1”에서 분석한 프라이머는 molecular cloning 3판(sambrook과 rusell, cold spring harborlaboratory press, New York, USA, 2001년)의 10.42에 기술된 올리고뉴클레오타이드 합성 방법을 이용하여 바이오니아사(bioneer, 한국)에 의뢰하여 합성하였다.
3. 미생물로부터 DNA의 추출
구강 상재 미생물들을 상업적으로 입수하였으며, ExgeneTM Cell SV DNA 추출 키트(진올바이오테크놀러지, 한국)를 이용하여 제조회사의 지시에 따라 유전체 DNA를 추출하였다. 추출한 유전체 DNA는 NanoDrop 2000 (Thermo Scientific co., USA) spectrophotometer를 이용하여 측정하였다.
4. 구강암 관련 인유두종바이러스(HPV) gene cloning 및 plasmid DNA의 추출
구강임상샘플에서 ExgeneTM Clinic SV DNA 추출 키트(진올바이오테크놀러지, 한국)를 이용하여 제조회사의 지시에 따라 유전체 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 인유두종바이러스 타입 16번, 18번, 31번, 33번, 35번, 45번, 52번 및 58번의 E6E7부위를 증폭 가능한 각각의 프라이머셋으로 증폭한 후, 증폭산물을 이용하여 염기서열분석, 클로닝서비스 및 플라스미드 DNA 추출 서비스(코스모진텍, 한국)를 의뢰하였다. 확인된 각 타입의 플라스미드 DNA는 NanoDrop 2000 (Thermo Scientific co., USA) spectrophotometer를 이용하여 측정하였다.
<실시예 1>
프라이머의 특이도 확인
상기 실험준비 단계에서 제작한 서열번호 1 내지 4로 표시되는 프라이머의 인유두종바이러스(HPV) 타입 16번, 31번, 33번, 35번, 52번 및 58번에 대한 특이성을 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 진행하였다.
인유두종바이러스(HPV)의 프라이머 특이도 검증에 사용된 PCR 반응용액은 각각 2ul(1ng/ul)의 template DNA, 0.5ul(10pmol/ul)씩의 서열번호 1 내지 4의 프라이머, 0.4ul(1 unit)의 SolgTM h-Taq DNA Polymerase(Solgent co., Korea), 2ul(15 mM MgCl2 용액이 포함된 10X 농도)의 h-Taq reaction buffer(Solgent co., Korea), 오염 방지를 위한 0.1ul(0.1 unit)의 SolGentTM Uracil-DNA Glycosylase(Solgent co., Korea), 1ul(dATP, dCTP, dGTP 각각 2mM과 dUTP 6mM)의 dNTP(Solgent co., Korea) 혼합액에 DNase, RNase free water(Sigma-Aldrich co., USA)를 넣어 총 반응용액이 20ul가 되도록 하였다. PCR 반응은 Peltier thermal cycler(Model PTC-100 DNA EngineTM, MJ Research Inc., USA) 기기를 사용하여 50℃에서 5분간 Uracil-DNA Glycosylase를 반응시켜 오염 방지 단계 후에 94℃에서 10분간 초기 변성(pre-denature) 및 Hot start Taq의 활성 단계를 거치고, 94℃에서 20초간 변성과 72℃ 40초간 결합(annealing) 및 신장(extension)하는 과정을 40회 반복하였고 마지막으로 72℃에서 5분간 신장(post-extension)하였다. 증폭된 PCR 반응산물은 Mupid-2plus 전기영동장치(Mupid, Japan)를 이용하여 증폭반응 유무 및 증폭된 DNA 크기를 확인하였다.
이에 대한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 구강암과 관련된 인유두종바이러스(HPV) 타입(타입 16, 31, 33, 35, 52 및 58번)을 특이적으로 검출할 수 있는 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트는 인유두종바이러스(HPV) 16번, 31번, 33번, 35번, 52번 및 58번에 대하여 특이적으로 미생물을 검출하였으며 다른 인유두종바이러스(HPV) 타입(HPV 타입 18 및 45)과 구강 상재 미생물들에 대해서는 어떠한 반응도 나타내지 않아 그 특이도가 매우 우수함을 확인할 수 있었다.
Figure 112018090413684-pat00003
특히, 상기 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 서열번호 1 내지 4로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 조성물의 경우, 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머쌍 각각이 검출할 수 있는 HPV 타입들을 모두 검출할 수 있는 것으로 확인이 되었다.
즉, 서열번호 1 내지 4의 프라이머를 혼합하여 증폭반응에 적용한다고 하더라도 상호간에 간섭작용 없이 각 프라이머가 검출할 수 있는 HPV 타입을 매우 우수한 특이도로 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 2>
검출 민감도 평가
실시간 중합효소 연쇄반응의 검출 민감도를 확인하기 위해 상기 “실험준비. 4”에서 제작한 인유두종바이러스(HPV) 각 타입별 플라스미드 DNA를 1ng/ul농도부터 시작하여 10배씩 serial dilution한 시료를 대상으로 형광 증폭 곡선을 확인하였다.
실시간 중합효소 연쇄반응의 반응용액은 인유두종바이러스(HPV)의 스크리닝 및 16번 타입의 정성반응을 확인하기 위해 2ul(1ng/ul)의 template DNA, 0.5ul(10pmol/ul)씩의 서열번호 1 내지 4의 프라이머 및 0.2ul(10pmol/ul)의 서열번호 5의 프로브, 0.2ul의 20X EvaGreen(바이오팩트, Korea), 0.4ul(1 unit)의 SolgTM h-Taq DNA Polymerase(Solgent co., Korea), 2ul(15 mM MgCl2 용액이 포함된 10X 농도)의 h-Taq reaction buffer(Solgent co., Korea), 오염 방지를 위한 0.1ul(0.1 unit)의 SolGentTM Uracil-DNA Glycosylase(Solgent co., Korea), 1ul(dATP, dCTP, dGTP 각각 2mM과 dUTP 6mM)의 dNTP(Solgent co., Korea) 혼합액에 DNase, RNase free water(Sigma-Aldrich co., USA)를 넣어 총 반응용액이 20ul가 되도록 하였다. PCR 반응은 Real-time PCR Thermal Cycler(Model CFX96 Real-time PCR Detection system, Bio-Rad Inc., USA) 기기를 사용하여 50℃에서 5분간 Uracil-DNA Glycosylase를 반응시켜 오염 방지 단계 후에 94℃에서 10분간 초기 변성(pre-denature) 및 Hot start Taq의 활성 단계를 거치고, 94℃에서 20초간 변성과 72℃ 40초간 결합(annealing) 및 신장(extension)하는 과정을 40회 반복하였다. 이후 융해곡선 분석법을 위해 65℃에서 95℃까지 0.2도씩 증가하면서 형광값을 측정하는 Melting curve 분석 단계를 수행하였다. 형광값은 70℃에서 측정하도록 하였으며, 데이터 분석은 Bio-Rad CFX Manager 2.1 을 이용하였다. Cycle threshold(Ct)는 알려진 숫자의 DNA 농도의 대수증폭기로 시작하여 반응 유무에 따르는 정성분석을 하였다.
이에 대한 결과를 도 1 및 표 4에 나타내었다.
Figure 112018090413684-pat00004
도 1 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 구강암과 관련된 HPV를 31.3 copy까지 검출할 수 있어 그 민감도가 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다.
한편, 상기 실험방법과 동일한 방법으로 유전자 증폭반응을 진행하되, EvaGreen을 이용한 융해곡선 분석법을 수행하여 HPV 타입 31, 33, 35, 52 또는 58번에 대한 검출 민감도를 평가해 본 결과 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 상기 HPV타입들에 대한 본 발명의 조성물의 민감도가 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112018090413684-pat00005
<실시예 3>
융해곡선 분석법의 정성검사 평가
서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트 및 서열번호 5의 프로브가 혼합된 본 발명의 조성물이 실시간 중합효소 연쇄반응 및 EvaGreen을 이용한 융해곡선 분석법을 수행하였을 때, 구강암 관련 인유두종바이러스(HPV) 타입들에 대한 스크리닝 정성반응이 가능한지를 확인하기 위해 상기의 실시예 2의 실시간 중합효소 연쇄반응 반응용액과 동일한 조성으로 구강암과 관련된 각 HPV 타입 gene clone에 대한 검출 실험을 하였다.
본 실험에서 구강암 관련 HPV 타입에 대한 융해곡선분석법의 melt peak 결과는 82℃이며, 비특이반응이나 dimer에 의한 반응은 melt peak값이 다르거나 형광강도가 낮다. 따라서 분석결과에서 melt peak 값이 82℃일 때 스크리닝 양성으로, 다른 온도의 melt peak 또는 None의 결과를 보이면 스크리닝 음성으로 처리하였다.
이에 대한 결과를 도 2 및 표 6에 나타내었다.
Figure 112018090413684-pat00006
도 2 및 표 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트 및 서열번호 5의 프로브가 혼합된 본 발명의 조성물을 이용하여 수행된 실시간 중합효소 연쇄반응의 융해곡선 분석 결과, melt peak 82℃에서 구강암과 관련된 HPV 타입 16, 31, 33, 35, 52 및 58이 검출이 되는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명의 조성물을 이용하여 HPV 타입 18 gene clone에 대한 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과 melt peak가 80℃로 확인이 되었고, HPV 타입 45에 대해서는 melt peak가 나오지 않아 본 발명의 조성물이 구강암과 관련이 없는 HPV 타입에 대해서는 비특이적인 증폭반응을 일으키지 않는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 4>
실시간 중합효소 연쇄반응 및 융해곡선 분석법의 임상샘플 적용 평가
서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트 및 서열번호 5의 프로브가 혼합된 본 발명의 조성물이 실시간 중합효소 연쇄반응 및 EvaGreen 형광물질을 이용한 융해곡선 분석법을 수행하였을 때, 임상샘플에서도 구강암과 관련된 HPV 타입을 검출할 수 있는지를 확인하고자 상기의 실시예 2의 실시간 중합효소 연쇄반응 반응용액과 동일한 조성으로 실험을 진행하되 임상샘플에서 수득된 DNA를 증폭 대상으로 하였다.
상기 임상샘플은 치과에 방문하는 환자들 중 충치 또는 치주질환 등 구강질환과 관련된 미생물의 농도가 높은 환자들을 대상으로 구강 가글링을 통한 타액 샘플을 채취하여 보관한 임상샘플을 사용하였다.
이에 대한 결과를, 도 3 내지 6 및 하기 표 7에 나타내었다.
Figure 112018090413684-pat00007
상기 표 5 및 도 3을 참고하면, 임상샘플 #1에서는 서열번호 5로 표시되는 프로브에 의해 HPV 타입 16이 존재하는 것이 정성적으로 확인이 되었으며, 융해곡선에서도 melt peak가 82℃에서 형성이 되는 것으로 확인되어, 구강암의 발병과 가장 밀접한 관련이 있는 HPV 타입 16이 임상샘플 #1에 포함이 되어 있는 것으로 판단할 수 있었다. 마찬가지로, 상기 표 5 및 도 4를 참고하면 임상샘플 #2에서도 임상샘플 #1과 동일한 결과가 나타났다.
한편, 상기 표 5 및 도 5를 참고하면, 임상샘플 #3에서는 서열번호 5로 표시되는 프로브에 의한 Cy5 형과 CT 값이 검출이 되지 않아 HPV 타입 16이 샘플 내에 포함이 되어 있지는 않지만, 융해곡선에서 melt peak가 82℃에서 형성이 되는 것으로 보아 HPV 타입 16을 제외한, HPV 타입 31, 33, 35, 52 및 58로 이루어진 군에서 적어도 하나의 HPV 타입이 임상샘플 #3 포함이 되어 있음을 알 수 있었다.
다른 한편, 상기 표 5 및 도 6을 참고하면, 임상샘플 #4에서는 서열번호 5로 표시되는 프로브에 의한 Cy5 형과 CT 값이 검출이 되지 않아 HPV 타입 16이 샘플 내에 포함이 되어 있지 않을 뿐만 아니라, 융해곡선에서 melt peak도 형성이 되지 않는 것으로 나타나 임상샘플 #4에는 구강암과 관련된 HPV 타입이 포함이 되어 있지 않은 것으로 판단할 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이, 서열번호 1 내지 4로 표시되는 프라이머 및 서열번호 5로 표시되는 프로브를 포함하는 본 발명의 조성물은 구강암 유발과 관련된 HPV 타입에 대한 정성적인 검사가 가능할 뿐만 아니라, 가장 강력한 구강암 유발 인자인 HPV 타입 16에 대한 정성 검사 및 정량검사가 가능한 것을 확인할 수 있었다.
특히, 본 발명의 조성물은 각각의 프라이머가 상호간에 간섭반응을 일으키지 않고 매우 높은 민감도와 특이도로 구강암 관련 HPV 타입을 검출할 수 있기 때문에 신속하고 정확한 결과를 필요로 하는 구강암 진단 분야에서 매우 효율적으로 활용이 될 수 있을 것으로 판단할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물 또는 방법을 이용하면 구강암과 관련성이 높은 인유두종바이러스(HPV) 타입 16, 31, 33, 35, 52 및 58번으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 대한 정성분석; 및 구강암과 관련된 가장 중요한 HPV 타입 16번에 대한 정성 및 정량 분석을 동시에 수행할 수 있으므로, 매우 높은 신뢰성으로 신속하고 용이하게 구강암 임상진단이 가능하여 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.
<110> HEO, DAE WOOK HEO, JUNG UK KIM, SUNG HYUN <120> Screening and qualitative methods of HPV types and type 16 related to oral cencer using Real-time PCR and Melting Curve Analysis <130> NP18-0034 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for HPV type 16 and 35 <400> 1 tgtcaaaagc cgctgtgtcc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for HPV type 31, 33 and 58 <400> 2 tgtcaaagac cgttgtgtcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for HPV type 52 <400> 3 tgtcaaacgc cattatgtcc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for HPV <400> 4 tcmtcctcmt ctgagctgtc 20 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HPV type 16 <400> 5 atcatcaaga acacgtagag aaacccagct 30

Claims (12)

  1. 서열번호 1 내지 4의 프라이머를 포함하는 타입 16, 31, 33, 35, 52 및 58번 인유두종바이러스(HPV) 검출용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 5의 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 인유두종바이러스 타입 16, 31, 33, 35, 52 및 58번으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 정성 검출; 및 타입 16번의 정성 및 정량 검출이 동시에 가능한 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출은 융해곡선 분석법(Melting curve analysis)에 의한 것임을 특징으로 하는 조성물.
  7. 삭제
  8. 서열번호 1 내지 4의 프라이머를 포함하는 타입 16, 31, 33, 35, 52 및 58번 인유두종바이러스(HPV) 검출용 키트.
  9. (a) 인체로부터 채취된 임상시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 얻어진 DNA를 서열번호 1 내지 4의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 유전자를 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭 산물을 분석하여 타입 16, 31, 33, 35, 52 및 58번 인유두종바이러스(HPV)를 검출하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 증폭은 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR)이며 상기 (b) 단계 이후에 상기 증폭산물을 융해(melting)시켜 융해곡선(melting curve)을 얻는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 서열번호 5의 프로브를 추가로 포함하여 유전자를 증폭하며, 상기 (c) 단계에서 인유두종바이러스 타입 16의 정성 또는 정량 분석을 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 임상시료는 구강에서 수득한 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
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